Summary
模拟烧伤和感染临床情况的模型对于进一步烧伤研究是必要的。本协议展示了一种与人类相当的简单且可重复的大鼠烧伤感染模型。这有助于研究烧伤后烧伤和感染，以开发新的局部抗生素治疗。
Abstract
烧伤诱导方法在大鼠模型中的描述不一致。代表临床情况的统一烧伤创面模型对于进行可重复的烧伤研究是必要的。本协议描述了一种简单且可重复的方法，可在大鼠中产生~20%的总体表面积（TBSA）全层烧伤。在这里，将22.89cm2 （直径5.4cm）铜棒在水浴中加热97°C以诱导烧伤。具有高导热性的铜棒能够将热量散发到皮肤组织中的更深处，从而产生全层灼伤。组织学分析显示表皮减毒，真皮和皮下组织的全层厚度存在凝血损伤。此外，该模型代表了在烧伤后住院烧伤患者中观察到的临床情况，例如免疫失调和细菌感染。该模型可以概括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的全身性细菌感染。综上所述，本文提出了一种易于学习且稳健的大鼠烧伤模型，该模型模拟了包括免疫失调和细菌感染在内的临床情况，对于开发用于烧伤创面和感染的新型外用抗生素具有相当大的实用性。
Introduction
烧伤是最具破坏性的创伤形式之一，即使在专门的烧伤中心，死亡率也达到 12%1，2，3。根据最近发表的报告，美国每年有~486，000名烧伤患者需要医疗护理，其中近3，500人死亡1，2，3，4，5，6。烧伤对患者的免疫系统构成重大挑战，并形成明显的开放性伤口，愈合缓慢，使他们容易受到皮肤、肺部和全身性院内机会性细菌的定植。免疫失调与细菌感染相结合与烧伤患者的发病率和死亡率增加有关7。
动物烧伤和感染模型对于研究皮肤损伤和烧伤创伤相关免疫抑制后细菌感染的发病机制至关重要。这些模型能够设计和评估治疗烧伤患者细菌感染的新方法。大鼠和人类具有先前记录的相似的皮肤生理和病理特征8。此外，与较大的动物模型相比，大鼠的体型更小，使它们更容易处理、更实惠、更容易采购和维护。
这些特征使大鼠成为研究烧伤和感染的理想模式动物9。不幸的是，烧伤诱导技术不一致，并且通常描述最少10，11，12，13，14。本协议旨在开发一种简单，具有成本效益和可重复的程序，用于在模拟临床场景的大鼠模型中创建一致的全层烧伤损伤，并可用于评估免疫抑制和细菌感染。
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Protocol
所有程序均由北卡罗来纳大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并按照其既定指南进行。使用7-9周龄的雄性和雌性Sprague Dawley大鼠（250-300g）进行实验。所有动物均被饲养在12 h：12 h明暗循环中，可随意获取食物 和水。在研究开始之前，请务必与您的机构兽医合作制定镇痛计划。
1.为大鼠准备烧伤
- 在烧伤前24小时准备动物烧伤。
- 在诱导室中用5%异氟醚在100%氧气中麻醉大鼠5分钟（流速：2L / min），直到呼吸减慢。
- 一旦大鼠被深度麻醉（对四肢的脚趾捏没有反应），将大鼠移到俯卧位的加热垫上，并将异氟醚在氧气中减少到1.5%，以便通过鼻锥维持。
- 为防止麻醉后和手术过程中角膜干燥，请使用棉头涂抹器在双眼角膜上涂抹眼睛润滑剂。
- 使用电动剪剃除大鼠的背部区域（见 材料表），并在从肩胛骨到尾巴底部的大矩形中尽可能多地去除毛发（图2A）。
- 用浸有生理盐水的纸巾清洁剃须区域，以擦去松散的毛发。使用棉头涂抹器将脱毛化妆水涂抹在剃须区域，并保持~3分钟。
注意：使用参考脱毛化妆水超过3分钟会在皮肤上引起红色皮疹。 - 用湿纱布海绵擦拭该区域两次，以去除化妆水并防止皮肤刺激。
- 关闭异氟醚，取出鼻锥，将大鼠放入恢复笼中。
注意：在恢复笼中放一个加热垫。 - 将回收的动物转移到干净的外壳笼中进行第二天的燃烧程序（大鼠从麻醉中恢复可能需要~10-15分钟）。
2.诱导大鼠烧伤
- 在燃烧当天，将水浴温度设置为97°C，并放置所有四根铜棒（每根420克; 图1）在燃烧实验前1小时在水浴中，让棒均匀升温。
注意：杆必须浸入水中。实验前使用温度计检查数字温度显示的准确性。 - 如第1节所述麻醉大鼠。
- 一旦大鼠对所有肢体的脚趾捏没有反应，将其放在俯卧位的加热垫上，氧气中含有1.5%异氟醚以进行维持（图2A）。
- 通过腹膜内（腹腔内）途径注射吗啡（20 mg / kg体重）以进行疼痛管理6.
- 检查水浴中的水温。设置计时器并戴上耐热手套。
- 从水浴中取出一根加热的铜棒，将其触摸在大鼠的背部区域7秒以诱导烧伤。
注意：水浴和动物之间保持最小距离（10-15厘米），以尽量减少热量损失，并且在诱导灼伤时不要对杆施加压力（即必须通过重力保持接触）。 - 施用四次烧伤，每个烧伤部位使用一根杆，一个接一个，以产生大约20%TBSA全接触烧伤（图2B）。
- 烧伤后，通过腹腔注射乳酸林格氏溶液（0.1mL/g 体重）使动物复苏。
注意：使用体温调节的乳酸铃声溶液来复苏大鼠。 - 关闭异氟醚，取出鼻锥，将大鼠放在加热垫上进行恢复。
3.细菌接种物和感染的制备
- 在烧伤实验前 2 天，在 Muller Hinton 琼脂 （MHA） 平板上划线铜 绿假单胞 菌 PAO1 和 金黄色葡萄球菌s ATCC25923 的冷冻样品。
- 第二天，从盘子中选择一个生长细菌菌落，并使用接种环将其从盘子上轻轻刮掉。然后，将其放入培养管中以接种10mL穆勒辛顿肉汤（MHB），并在培养箱振荡器中于37°C培养过夜。
- 在烧伤和感染当天，将培养物以4，000 ×g 离心5分钟。用生理盐水（0.9%NaCl溶液）洗涤沉淀。
- 将细菌沉淀重悬于盐水中，并稀释至0.1 OD 600nm（600nm 处的光密度）。通过取 200 μL 该细菌悬浮液并将其与 800 μL 盐水混合来稀释细菌接种物，以获得所需的 2 ×10 7 CFU/mL 细菌接种物。
- 在烧伤后15分钟将上一步制备的50μL 铜绿假单胞 菌或 金黄色葡萄球菌接种物（感染剂量1×106CFU ）注射到麻醉大鼠中，使用29G针皮下尽可能靠近烧伤创面。
- 感染烧伤伤口后，将大鼠放在加热垫上恢复。一旦动物恢复（~15-20分钟），将其放在干净的笼子里。
注意：烧伤后，每个笼子里养一只老鼠。使用水湿食物颗粒便于咀嚼，并将它们放在笼子地板上以便于触及。 - 用加了吗啡的水（0.4 mg/mL）填充笼子中的水瓶以控制疼痛。
注意：口服吗啡反映了人类烧伤患者的临床情况。这项研究利用口服吗啡使这些实验与人类烧伤患者在多次咨询兽医人员后相当。在整个实验过程中保持饮酒和体重日志。在所有过程中使用相同的饮水系统。其他镇痛药，如丁丙诺啡，可根据机构动物护理指南皮下/腹膜内给药。 - 填写监测清单，并在整个实验过程中密切监测动物的痛苦或疾病。
4.烧伤的评估
- 烧伤后立即从颜色和边缘方面评估皮肤烧伤。
- 用苏木精和伊红（H&E）染色烧伤的皮肤，以可视化烧伤伤口结构和上皮间隙15 （参见步骤5.6进行样品处理）。
5. 大鼠样品的后处理和细菌计数
- 在烧伤后24，48和72小时用过量麻醉对大鼠实施安乐死。
- 通过心脏穿刺 从 大鼠中提取血液样本，并将其收集在迷你收集管中。
- 分析血液样本中的全血细胞计数，以确定烧伤诱导对宿主免疫系统的影响。
- 在安乐死时收获皮肤、皮下组织、肌肉、肺和脾脏。
注意：保留一部分（~1厘米×1厘米;重量~200-300毫克）皮肤用于H&E染色，另一部分用于细菌计数。 - 将组织收集在 10 mL 收集管中，并将它们置于冰上的生理盐水中以进行细菌计数。
- 用生理盐水归一化组织重量，并使用组织均质器均质化样品（参见 材料表）。
- 在生理盐水中连续稀释组织匀浆。
- 板100μL未稀释的匀浆和西曲胺琼脂平板上每个组织样品的所有稀释液，用于从感染 铜绿假单胞菌的大鼠收集的样品。
注意：使用甘露醇琼脂平板对从感染 金黄色葡萄球菌的大鼠收集的样品进行电镀。 - 将板在37°C培养箱中孵育16-18小时。
- 第二天，计数平板上的细菌菌落，乘以稀释比以获得CFU / mL计数，并与组织的重量归一化以计算CFU / g组织。
- 使用数据分析软件绘制不同采样时间点不同器官中的细菌计数。
- 对烧伤的皮肤进行H&E染色，以可视化伤口结构和上皮间隙。
- 使用剪刀和齿镊子，从烧伤区域切下1cm x 1cm的皮肤贴片，并将其浸入固定剂（10%中性缓冲福尔马林，NBF）中，在室温下48小时。
注意：旋转容器以确保所有组织完全浸入固定剂中，固定剂的体积是组织体积的 30 倍。 - 在室温下用70%（v / v）乙醇使皮肤组织脱水72小时。
- 在石蜡块中处理脱水样品以切割切片并用H&E 15染色。
- 使用40倍物镜在载玻片扫描仪（参见 材料表）中对染色载玻片进行数字成像。
- 使用软件分析扫描的图像（有关分析图像的处理，请参见 补充文件1 ;请参阅 材料表）。
- 检查染色皮肤切片的所有区域，以评估表皮、真皮、皮下组织和骨骼肌的状况。
- 使用剪刀和齿镊子，从烧伤区域切下1cm x 1cm的皮肤贴片，并将其浸入固定剂（10%中性缓冲福尔马林，NBF）中，在室温下48小时。
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Representative Results
这里提出的方案是高度可重复的，并导致大鼠三度全层烧伤。烧伤诱导后烧伤创面呈蜡白色（图2B）。烧伤后72小时烧伤的颜色从白色变为棕色（图2B-E）。
组织学分析证实烧伤后24小时全层烧伤（深度>2.61毫米; 图 3B）。与完整的非烧伤皮肤相比，烧伤动物的皮肤样本在烧伤后24、48和72小时显示出所有层的损伤证据（图3）。此外，组织学分析显示表皮层完全破坏，皮下脂肪和骨骼肌累及真皮全层损伤（图3B）。
为了评估细菌清除率，在感染铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌后24，48和72小时收获各种组织。从所有烧伤大鼠的感染部位回收细菌（图4A，B）。此外，在感染后24小时从烧伤大鼠皮肤中回收的细菌数量少于铜绿假单胞菌的初始接种物，而在烧伤和感染后48和72小时获得的组织样品显示细菌负荷增加（图4A）。相比之下，与初始接种物相比，皮肤中金黄色葡萄球菌在所有时间点都观察到2对数10增加（图4B）。这表明金黄色葡萄球菌能够建立感染是因为其在组织中的活跃复制，而不仅仅是因为烧伤引起的免疫抑制。
还分析了皮肤的不同层（即皮下组织、肌肉和远端器官）以检查细菌传播。皮下组织和肌肉的细菌负荷高于肺和脾脏。综上所述，这些数据表明烧伤大鼠在伤口接种铜 绿假单胞菌 （图4A）或 金黄色葡萄球菌（图4B）后24小时或48小时发生全身感染。在基线和烧伤后72小时，使用血液学分析仪（见 材料表）也获得了全血细胞计数。白细胞总数随时间下降，表明免疫抑制。与基线相比，烧伤后中性粒细胞计数下降，但在感染后72小时增加（表1）。然而，在烧伤和感染后观察到红细胞和血小板计数增加，表明全身炎症。
图 1：用于造成燃烧感应的铜棒。 定制杆的重量为 420 克，直径 5.4 厘米，高度为 6.4 厘米。 请点击此处查看此图的大图。
图2：烧伤诱导前后大鼠背侧的宏观视图 。 （A）剃须后大鼠背侧，（B）烧伤后立即，（C）烧伤后24小时，（D）烧伤后48小时，（E）烧伤后72小时。 请点击此处查看此图的大图。
图3：每个烧伤严重程度水平的H&E染色横截面的代表性图像。 （A）假大鼠皮肤的组织学显示表皮，真皮和皮下组织层之间有明显的区别。（B）烧伤后24小时的皮肤组织学显示表皮减弱，真皮和皮下组织的整个厚度有凝血损伤，最大烧伤深度为>2.61毫米。 （C）在烧伤后48小时，最大烧伤深度为2.35毫米，（D）在烧伤后72小时，最大烧伤深度为2.20毫米。以40倍放大倍率扫描图像。比例尺 = 500 μm （A-D）。缩写：H&E =苏木精和伊红。请点击此处查看此图的大图。
图4：烧伤创面感染后不同器官细菌负荷的定量。 大鼠在烧伤后15分钟通过皮下注射 感染 6log CFU的细菌。在感染后24、48和72 h收集皮肤、皮下组织、肌肉、肺和脾脏，以确定全身性疾病的进展。每个时间点使用三只大鼠。（A） 铜绿假单胞 菌PA01，（B） 金黄色葡萄球菌 ATCC25923。缩写：CFU = 菌落形成单位。 请点击此处查看此图的大图。
| 细胞类型 | 基线（平均±标清） | 72 小时未感染（平均 ± SD） | 72 小时感染（平均 ± SD） |
| 白细胞 （109/L） | 16.9 ± 4.9 | 7.1 ± 2.0 | 6.50 ± 5.5 |
| 中性粒细胞（109/L）;(%) | 4.0 ± 1.1;（24.3 ± 2.8） | 1.4 ± 0.4;（20.2 ± 5.7） | 1.88 ± 1.0;（35.0 ± 12.4） |
| 淋巴细胞（109/L）;(%) | 11.6 ± 4.1;（68.5 ± 1.7） | 4.8 ± 1.7;（66.5 ± 7.6） | 3.54 ± 3.9;（46.4 ± 17.0） |
| 单核细胞（109/L）;(%) | 0.9 ± 0.3;（5.4 ± 1.5） | 0.8 ± 0.2;（11.5 ± 1.6） | 1.0 ± 0.6;（17.3 ± 5.5） |
| 红细胞 （1012/L） | 7.5 ± 0.3 | 7.1 ± 0.8 | 10.0 ± 1.1 |
| 血红蛋白（克/分升） | 14.3 ± 0.7 | 13.4 ± 1.0 | 18.6 ± 2.0 |
| 血小板 （109/L） | 723.3±353.1 | 942.7 ± 43.1 | 1359.0±228.5 |
| HCT （%） | 45.6 ± 3.0 | 39.9 ± 3.7 | 55.7 ± 8.2 |
表1：烧伤和感染前后的血液学参数。 缩写：HCT = 血细胞比容。
补充文件1：在Aperio ImageScope中分析H&E图像的步骤。 缩写：H&E =苏木精和伊红。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
已经提出了几种烧伤模型来研究烧伤的病理生理学8，12，16，17。在本研究中，我们采用大鼠模型开发了一种简单且可重复的方案，以诱导全层烧伤，然后是细菌感染，以模拟患者的感染烧伤创伤。选择大鼠作为动物模型来模拟人类条件是基于成本、易用性、可重复性和数据可靠性的平衡。本文中使用的大鼠模型与其他模型相比具有许多优点：它易于处理并且是最常用的烧伤模型，它允许跨文献进行比较。尽管大鼠在实验环境中被广泛使用，但大鼠和人类的外皮在组织学上并不相同18，19。大鼠的外皮由皮肤组成，皮肤是称为脂肪脂膜的脂肪层，在该层之下是与白色脂肪组织和平滑肌相关的松散结缔组织鞘，形成称为肉牛脂膜的层。后一层在大多数人类外皮中不存在。这具有重要意义，因为它的平滑肌细胞促进快速和充足的伤口收缩20。此外，必须注意的是，大鼠的伤口愈合机制与人类有很大不同8。因此，研究人员在解释本文中描述的协议的结果时应牢记这一点。尽管如此，大鼠模型在研究局部烧伤和烧伤后败血症方面的效用是毋庸置疑的，并且已经产生了大量临床可靠且可转移的数据21。此外，与其他小动物相比，大鼠具有更大的表面积，这允许诱导相对较大的烧伤伤口，使其成为临床相关烧伤研究的良好模型。
已经公布了不同的烧伤诱导方法，包括沸水16，加热黄铜棒22，加热铝模板17，恒温热板放置在不锈钢棒23上，以及烫伤超过45%的体表24。理想的实验方案将有能力实现大小和深度一致的烧伤伤口。在本研究中，使用420 g铜棒在97 °C的水中加热，通过直接传导传递热量以诱导燃烧。在烧伤诱导过程中，棒直接接触皮肤表面而不施加任何外部压力，因为从固体结构到皮肤表面的热能传导不取决于所使用的压力，而是取决于温度梯度25和固体结构与皮肤之间的距离17，25。决定金属选择的因素包括导热性和抗锈蚀能力。
与不锈钢、铝或黄铜相比，铜具有高导热性（398 W/mK;其中 W 是以瓦特为单位的热量，m 是以米为单位的面积，K 是以开尔文为单位的温度），分别为16 W/mK、225 W/mK 和 109 W/mK 9。高导热性金属棒比低导热性金属棒更快地将热能散发到皮肤组织，并在相同的暴露时间内诱导更深层次的灼伤。此外，从小鼠7，26，27的烧伤模型中异速缩放杆的大小和重量，并诱导约20%的TBSA烧伤。将直径为1.9cm的棒（四次施用后小鼠的总烧伤面积为11.3cm 2）缩放至直径5.4cm（四次施用后大鼠的总烧伤面积为91.6cm 2），以诱导大鼠相似的~20%-30%TBSA烧伤（220g大鼠的TBSA为356.0cm2）28， 考虑到大鼠的TBSA比小鼠大6倍（20g小鼠的TBSA为61.2cm2）29。结果清楚地表明，该方法诱导全层烧伤，组织学分析表明，在烧伤后不同时间点，正常和烧伤的皮肤组织之间具有极好的对比度（图3）。该模型还能够捕获免疫抑制，这在烧伤后的患者中观察到30，31（表1）。
细菌感染是影响烧伤患者愈合过程的重要威胁，通常是烧伤后发病和死亡的主要原因。为了模拟类似的条件，大鼠在铜 绿假单胞菌 或 金黄色葡萄球菌烧伤后被感染。最初，我们尝试局部应用细菌，但烧伤表面的蜡状外观抑制了细菌接种物的吸收。该模型还能够概括烧伤部位细菌感染后的全身性疾病进展，如从肺和脾脏恢复的细菌负荷（图4）。总之，我们已经展示了一种简单且可重复的方法来产生全层烧伤，该方法表现出在人类烧伤中观察到的许多特征。该方案可以帮助研究用于治疗感染烧伤创面的各种新型局部疗法。该模型也可以用作评估不同伤口敷料的经济高效的模型。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
作者感谢北卡罗来纳大学比较医学系提供和照顾动物。我们感谢病理学服务核心的Lauren Ralph和Mia Evangelista在组织病理学/数字病理学方面的专家技术援助，包括组织切片和成像。这项研究得到了国防部的研究资助（奖励号W81XWH-20-1-0500，GR和TV）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD, USA | 309597 | Used to inject the analgesic |
| 1.7 mL Microtube | Olympus, USA | 24-282 | Used to carry morphine |
| 10% NBF | VWR, USA | 16004-115 | Used to fix the skin piece for staining |
| 30 mL syringe | BD, USA | 302832 | Used to inject the lactate ringer solution |
| 70% ethyl alcohol | Fischer Scientific, USA | BP28184 | |
| Aperio AT2 Digital Pathology Slide Scanner with ImageScope software | Aperio, Technologies Inc., Vista, CA, USA | n/a | Scanning of H & E slides and analysis |
| Cetrimide agar plates | BD, USA | 285420 | Selective media plates for Pseudomonas aeruginosa growth |
| Copper rods | n/a | n/a | Used to induce the burn injury |
| Cotton tipped applicators | OMEGA Surgical supply, USA | 4225-IMC | Used to apply eye ointment |
| Electric shaver | Oster, USA | Golden A5 | Used to remove the dorsal side hairs |
| Eye lube | Dechra, UK | n/a | The eye wetting agent to provide long lasting comfort and avoid eye dryness |
| Fluff filled underpads | Medline, USA | MSC281225 | Used in the burn procedure |
| Forcep | F.S.T. | 11027-12 | Used to hold the skin piece |
| Gauze sponges | Oasis, USA | PK412 | Used to clean the applied nair cream from the dorsal side |
| Heat-resistant gloves | n/a | n/a | Used to hold the heated copper rods |
| Hematology Analyzer | IDEXX laboratories, USA | ProCyte Dx | |
| Induction chamber | Kent Scientific, USA | vetFlo-0730 | Used to anesthesize the animals |
| Insulin syringe | BD, USA | 329461 | |
| Isoflurane | Pivetal, USA | NDC46066-755-04 | Used to anesthesized rats to induce a loss of consciousness |
| Isoflurane vaporiser | n/a | n/a | |
| Lactated ringer's solution | icumedical, USA | NDC0990-7953-09 | Used to resuscitate the rats |
| L-shaped spreader | Fischer Scientific, USA | 14-665-230 | |
| Mannitol Agar | BD, USA | 211407 | Selective media plates for Staphylococcus aureus growth |
| Minicollect tubes (K2EDTA) | greiner bio-one, USA | 450480 | Used to collect the blood |
| Morphine | Mallinckrodt, UK | NDC0406-8003-30 | This analgesia was used to induce the inability to feel burn injury pain |
| Muller Hinton Broth | BD, USA | 275730 | |
| Muller Hinton II Agar | BD, USA | 211438 | |
| Nair hair removal lotion | Nair, USA | n/a | Used to remove the residual hairs on dorsal side |
| Needle 23 G | BD, USA | 305193 | Used to inject the lactate ringer solution |
| Normal saline | n/a | n/a | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific, USA | Genesys 30 | |
| Sprague-Dawley rats, male and female | Charles River Labs | n/a | 7-9 weeks old for burn induction |
| Surgical Scissor | F.S.T. | 14501-14 | Used to cut the desired skin piece |
| Tissue collection tubes | Globe Scientific | 220101236 | |
| Tissue Homogenizer | Kinematica, Inc, USA | POLYTRON PT2100 | Used to homogenize the tissue samples |
| Water bath | Fischer Scientific, USA | n/a | Used to induce the burn injury |
| Weighted heating pad | Comfytemp, USA | n/a | Used during the procedure to keep rat's body warm |
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