Summary
En model, der efterligner det kliniske scenarie med brandskade og infektion, er nødvendig for at fremme brandsårsforskning. Denne protokol demonstrerer en enkel og reproducerbar infektionsmodel for rotteforbrænding, der kan sammenlignes med den hos mennesker. Dette letter undersøgelsen af forbrænding og infektioner efter forbrænding for at udvikle nye topiske antibiotikabehandlinger.
Abstract
Brændeinduktionsmetoder er inkonsekvent beskrevet i rottemodeller. En ensartet brandsårsmodel, som repræsenterer det kliniske scenarie, er nødvendig for at udføre reproducerbar brandsårsforskning. Denne protokol beskriver en enkel og reproducerbar metode til at skabe ~ 20% total body surface area (TBSA) forbrændinger i fuld tykkelse hos rotter. Her blev en 22,89 cm2 (5,4 cm diameter) kobberstang opvarmet til 97 °C i et vandbad påført rottens hudoverflade for at fremkalde brandskaden. En kobberstang med høj varmeledningsevne var i stand til at sprede varmen dybere i hudvævet for at skabe en forbrænding i fuld tykkelse. Histologianalyse viser svækket epidermis med koagulativ skade på dermis og det subkutane vævs fulde tykkelse. Derudover er denne model repræsentativ for de kliniske situationer, der observeres hos indlagte brandsårspatienter efter forbrændingsskader, såsom immundysregulering og bakterielle infektioner. Modellen kan rekapitulere den systemiske bakterielle infektion med både grampositive og gramnegative bakterier. Afslutningsvis præsenterer dette papir en let at lære og robust rotteforbrændingsmodel, der efterligner de kliniske situationer, herunder immundysregulering og bakterielle infektioner, hvilket er af betydelig nytte for udviklingen af nye topiske antibiotika til brandsår og infektioner.
Introduction
Forbrændingsskader er blandt de mest ødelæggende former for traumer, hvor dødeligheden når 12% selv i specialiserede forbrændingscentre 1,2,3. Ifølge nyligt offentliggjorte rapporter kræver ~ 486,000 brandsårspatienter lægehjælp årligt i USA, med næsten 3,500 dødsfald 1,2,3,4,5,6. Forbrændingsskader udgør en stor udfordring for patienternes immunsystem og skaber et betydeligt åbent sår, som er langsomt at helbrede, hvilket efterlader dem modtagelige for kutan, lunge- og systemisk kolonisering med nosokomiale, opportunistiske bakterier. Immundysregulering kombineret med bakterieinfektionen er forbundet med øget sygelighed og dødelighed hos brandsårspatienter7.
En dyreforbrændings- og infektionsmodel er afgørende for at studere patogenesen af bakterielle infektioner efter hudskader og immunundertrykkelse forbundet med forbrændingstraumer. Sådanne modeller muliggør design og evaluering af nye metoder til behandling af bakterielle infektioner hos brandsårspatienter. Rotter og mennesker har lignende hudfysiologiske og patologiske egenskaber, som tidligere er dokumenteret8. Derudover er rotter mindre i størrelse, hvilket gør dem lettere at håndtere, mere overkommelige og lettere at anskaffe og vedligeholde end større dyremodeller.
Disse egenskaber gør rotter til et ideelt modeldyr til at studere forbrændinger og infektioner9. Desværre er teknikken til forbrændingsinduktion inkonsekvent og ofte minimalt beskrevet 10,11,12,13,14. Denne protokol er designet til at udvikle en enkel, omkostningseffektiv og reproducerbar procedure til at skabe en konsistent forbrændingsskade i fuld tykkelse i en rottemodel, der simulerer det kliniske scenarie og kan bruges til at evaluere immunsuppression og bakteriel infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of North Carolina og blev udført i overensstemmelse med dets etablerede retningslinjer. Han- og hunrotter (250-300 g) i alderen 7-9 uger blev brugt til forsøgene. Alle dyr blev opstaldet i en 12 timer:12 timers lys-mørk cyklus med fri adgang til mad og vand ad libitum. Samarbejd altid med din institutionsdyrlæge om en smertestillende plan inden studiestart.
1. Forberedelse af rotter til brandskaden
- Forbered dyrene på brandskade 24 timer før forbrændingen.
- Bedøv rotten med 5% isofluran i 100% oxygen i et induktionskammer i 5 min (strømningshastighed: 2 L/min), indtil vejrtrækningen er aftaget.
- Når rotten er dybt bedøvet (reagerer ikke på tåklemme på alle lemmer), flyttes rotten over til en varmepude i en udsat position og reducerer isofluran til 1,5% i ilt til vedligeholdelse gennem en næsekegle.
- For at forhindre hornhindetørring efter anæstesi og under proceduren påføres øjensmøremiddel på hornhinderne i begge øjne ved hjælp af en applikator med bomuldsspids.
- Barber rottens rygområde ved hjælp af en elektrisk klipper (se materialetabellen) og fjern så meget hår som muligt i et stort rektangel fra skulderbladene ned til bunden af halen (figur 2A).
- Rens det barberede område med et væv gennemblødt i saltvand for at tørre de løse hår ud. Påfør hårfjerningslotion på det barberede område ved hjælp af en applikator med bomuldsspids og lad den sidde i ~3 minutter.
BEMÆRK: Anvendelse af den refererede hårfjerningslotion i mere end 3 minutter vil fremkalde røde udslæt på huden. - Tør området af med en våd gasbind svamp to gange for at fjerne lotionen og forhindre hudirritation.
- Sluk for isofluranen, fjern næsekeglen, og placer rotten i genopretningsburet.
BEMÆRK: Sæt en varmepude i genvindingsburet. - Overfør det genvundne dyr til et rent husbur til næste dags forbrændingsprocedure (det kan tage ~ 10-15 minutter for rotten at komme sig efter bedøvelsen).
2. Inducering af brandskade hos rotter
- På dagen for forbrændingen indstilles vandbadstemperaturen til 97 °C, og alle fire kobberstænger anbringes (420 g hver; Figur 1) i vandbadet 1 time før forbrændingsforsøget for at lade stængerne varme op ensartet.
BEMÆRK: Stængerne skal nedsænkes i vandet. Kontroller nøjagtigheden af det digitale temperaturdisplay ved hjælp af et termometer før eksperimentet. - Bedøv rotten som nævnt i punkt 1.
- Når rotten ikke reagerer på tåklemme på alle lemmer, skal du placere den på en varmepude i en udsat position med 1,5% isofluran i ilt til vedligeholdelse (figur 2A).
- Injicer morfin (20 mg/kg legemsvægt) via intraperitoneal (i.p.) vej til smertebehandling6.
- Kontroller temperaturen på vandet i vandbadet. Indstil timeren, og tag de varmebestandige handsker på.
- Tag en opvarmet kobberstang ud af vandbadet og rør den på rottens dorsumområde i 7 s for at fremkalde forbrændingen.
BEMÆRK: Hold en minimumsafstand (10-15 cm) mellem vandbadet og dyret for at minimere varmetab, og læg ikke pres på stængerne, mens du inducerer forbrændingen (dvs. kontakt skal opretholdes af tyngdekraften). - Der påføres fire forbrændinger med en stang pr. brændsted, den ene umiddelbart efter den anden for at frembringe en forbrænding med fuld kontakt på ca. 20 % TBSA (figur 2B).
- Efter forbrændingen genoplives dyret ved injektion af lakteret Ringers opløsning (0,1 ml/g legemsvægt).
BEMÆRK: Brug en kropstemperaturjusteret lakteret ringereopløsning til at genoplive rotterne. - Sluk for isofluranen, fjern næsekeglen, og læg rotten på varmemåtten for genopretning.
3. Fremstilling af bakteriel inokulum og infektion
- Streak den frosne prøve af Pseudomonas aeruginosa PAO1 og Staphylococcus aureus ATCC25923 på Muller Hinton Agar (MHA) plader, 2 dage før forbrændingseksperimentet.
- Den næste dag skal du vælge en enkelt koloni af dyrkede bakterier fra pladen, og ved hjælp af en podningssløjfe skal du skrabe den lidt af pladen. Derefter anbringes den i dyrkningsrøret for at pode 10 ml Muller Hinton Broth (MHB) og dyrkes natten over ved 37 °C i en inkubatorryster.
- På dagen for forbrænding og infektion centrifugeres kulturen ved 4.000 × g i 5 min. Vask pelleten med normal saltvand (0,9% NaCl-opløsning).
- Resuspender bakteriepelleten i saltvand og fortynd op til 0,1 OD 600nm (optisk densitet ved600 nm). Fortynd bakterieinokulumet ved at tage 200 μL af denne bakterielle suspension og blande den med 800 μL saltvand for at få det ønskede bakterieinokulum på 2 × 107 CFU / ml.
- 50 μL P. aeruginosa eller S. aureus inokulum fremstillet i det foregående trin (infektionsdosis 1 × 106 CFU) injiceres i den bedøvede rotte 15 minutter efter forbrændingen med en 29 G kanyle subkutant så tæt på brandsåret som muligt.
- Efter infektion af brændesåret skal du placere rotten på varmepuden til genopretning. Når dyret kommer sig (~ 15-20 min), skal du huse det i et rent bur.
BEMÆRK: Efter brandskaden skal du huse en rotte pr. Bur. Brug vandvåde madpiller til let tygning, og læg dem på burgulvet for nem rækkevidde. - Fyld vandflaskerne i buret med morfin-spiked vand (0,4 mg / ml) til smertebehandling.
BEMÆRK: Oral morfin afspejler den kliniske situation hos patienter med forbrænding af mennesker. Denne undersøgelse brugte oral morfin til at holde disse eksperimenter sammenlignelige med humane forbrændingspatienter efter konsultation med veterinærpersonalet ved flere lejligheder. Drikke- og vægtlogfiler blev opretholdt under hele eksperimentet. Brug det samme drikkesystem under alle procedurerne. Andre analgetika, såsom Buprenorphin, kan administreres subkutant / intraperitonealt i henhold til institutionelle retningslinjer for dyrepleje. - Udfyld overvågningstjeklisten, og overvåg dyrene nøje for angst eller sygdom i hele forsøgets varighed.
4. Vurdering af brandskaden
- Evaluer hudforbrændingsskaden morfologisk med hensyn til farve og margen umiddelbart efter forbrændingsskaden.
- Plet den brændte hud med hæmatoxylin og eosin (H&E) for at visualisere brandsårsstrukturen og epitelgabet15 (se trin 5.6 for prøvebehandling).
5. Efterbehandling af rotteprøver og bakterietælling
- Aflive rotten ved 24, 48 og 72 timer efter forbrænding med en overdosis anæstesi.
- Udtag blodprøver fra rotterne via hjertepunktur og saml dem i et miniopsamlingsrør.
- Analyser komplette blodtællinger fra blodprøverne for at bestemme effekten af forbrændingsinduktion på værtsimmunsystemet.
- Høst hud, subkutant væv, muskler, lunge og milt på tidspunktet for eutanasi.
BEMÆRK: Opbevar en del (~ 1 cm × 1 cm; vejer ~ 200-300 mg) af huden til H&E-farvning og en anden del til bakterietælling. - Saml vævene i et 10 ml opsamlingsrør og læg dem i normalt saltvand på is til bakteriel tælling.
- Normaliser vævsvægten med normalt saltvand og homogeniser prøverne ved hjælp af en vævshomogenisator (se materialetabellen).
- Serielt fortyndes vævshomogenaterne i normalt saltvand.
- Plade 100 μl ufortyndet homogenat og alle fortyndinger af hver vævsprøve på agarplader af cetrimid for prøver indsamlet fra rotter inficeret med P. aeruginosa.
BEMÆRK: Brug mannitol agarplader til plettering af prøver indsamlet fra rotter inficeret med S. aureus. - Pladerne inkuberes ved 37 °C i en inkubator i 16-18 timer.
- Den næste dag tælles bakteriekolonierne på pladerne, ganges med fortyndingsforholdet for at få CFU / ml-tællingen og normaliseres med vævets vægt for at beregne CFU / g-vævet.
- Anvend dataanalysesoftware til at plotte bakterietællingerne i forskellige organer på de forskellige prøveudtagningstidspunkter.
- Udfør H&E-farvning af brændt hud for at visualisere sårstrukturen og epitelgabet.
- Brug saks og tandtang til at klippe et hudplaster på 1 cm x 1 cm fra forbrændingsområdet og nedsænke det i et fikseringsmiddel (10% neutralt bufret formalin, NBF) i 48 timer ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Hvirvl beholderen rundt for at sikre, at alt væv er helt nedsænket i fikseringsmidlet, med fikseringsmidlets volumen 30x vævsvolumenet. - Dehydrer hudvævet med 70% (v / v) ethanol i 72 timer ved stuetemperatur.
- Behandl de dehydrerede prøver i paraffinblokke for at skære sektionerne og pletter med H&E15.
- Afbild de farvede dias digitalt i en diasscanner (se materialetabellen) ved hjælp af en 40x-målsætning.
- Analysér det scannede billede ved hjælp af software (se Supplerende fil 1 for behandling af billedet til analyse; se materialefortegnelsen).
- Undersøg alle felter i den farvede hudsektion for at evaluere tilstanden af epidermis, dermis, subkutant væv og skeletmuskulatur.
- Brug saks og tandtang til at klippe et hudplaster på 1 cm x 1 cm fra forbrændingsområdet og nedsænke det i et fikseringsmiddel (10% neutralt bufret formalin, NBF) i 48 timer ved stuetemperatur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen, der præsenteres her, er meget reproducerbar og resulterede i en tredjegrads brændeskade i fuld tykkelse hos rotter. Brandsåret fremstår voksagtigt hvidt efter induktion af forbrænding (figur 2B). Farven på brandskaden ændrede sig fra hvid til brun i løbet af 72 timer efter forbrænding (figur 2B-E).
Histologisk analyse bekræftede en forbrænding i fuld tykkelse (dybde >2,61 mm ved 24 timer efter forbrænding; Figur 3B). Sammenlignet med intakt ikke-brændt hud viste hudprøver fra brandsårsdyr tegn på skade på tværs af alle lag 24, 48 og 72 timer efter forbrænding (figur 3). Derudover viste histologisk analyse fuldstændig ødelæggelse af det epidermale lag og beskadigelse af dermis fulde tykkelse med involvering af subkutant fedt og skeletmuskulatur (figur 3B).
For at evaluere bakteriel clearance blev forskellige væv høstet ved 24, 48 og 72 timer efter infektion med P. aeruginosa og S. aureus. Bakterier blev genfundet fra infektionsstedet for alle brandsårsskaderotter (figur 4A,B). Desuden var antallet af bakterier, der blev genfundet fra huden hos brandsårsrotter, mindre end det oprindelige podemateriale for P. aeruginosa 24 timer efter infektion, mens vævsprøver opnået 48 og 72 timer efter forbrænding og infektion viste en stigning i bakteriebyrden (figur 4A). I modsætning hertil blev der observeret en stigning på 2 log10 på alle tidspunkter for S. aureus i huden sammenlignet med det oprindelige podemateriale (figur 4B). Dette tyder på, at S. aureus var i stand til at etablere infektion på grund af dets aktive replikation i vævene og ikke udelukkende på grund af immunsuppression induceret af forbrændingsskaden.
Forskellige lag af huden (dvs. subkutant væv, muskler og distale organer) blev også analyseret for at undersøge bakteriel spredning. Det subkutane væv og muskler viste en højere bakteriel belastning end lungen og milten. Samlet set viser disse data, at brandsårsrotter udvikler en systemisk infektion 24 timer eller 48 timer efter sårpodning med henholdsvis P. aeruginosa (figur 4A) eller S. aureus (figur 4B). Komplette blodtællinger blev også opnået ved hjælp af en hæmatologisk analysator (se materialetabellen) ved baseline og 72 timer efter forbrændingsskade. Det samlede antal hvide blodlegemer faldt over tid, hvilket indikerer immunsuppression. Neutrofiltallet faldt efter forbrænding, men steg efter infektion ved 72 timer sammenlignet med baseline (tabel 1). Imidlertid blev der observeret stigninger i antallet af røde blodlegemer og blodplader efter forbrænding og infektion, hvilket indikerer systemisk inflammation.
Figur 1: Kobberstang anvendt til at påføre forbrændingsinduktion. Vægten af den specialfremstillede stang er 420 g med en diameter på 5,4 cm og 6,4 cm højde. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Makroskopisk billede af rottens dorsale side før og efter forbrændingsinduktion . A) rotteryg efter barbering, B) umiddelbart efter brandskade, C) 24 timer efter forbrænding, D) 48 timer efter forbrænding og E) 72 timer efter forbrænding. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative billeder af H&E-farvede tværsnit for hvert niveau af forbrændingssværhedsgrad. (A) Histologien af falsk rottehud viser en klar skelnen mellem epidermis, dermis og subkutane vævslag. (B) Hudhistologi 24 timer efter forbrænding viser svækket epidermis med koagulativ skade på dermis og det subkutane vævs fulde tykkelse med en maksimal forbrændingsdybde på >2,61 mm. (C) Ved 48 timers efterforbrænding var den maksimale forbrændingsdybde 2,35 mm, og (D) ved 72 timer efter forbrænding var den maksimale forbrændingsdybde 2,20 mm. Billeder blev scannet med 40x forstørrelse. Skalastænger = 500 μm (A-D). Forkortelse: H&E = hæmatoxylin og eosin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Kvantificering af bakteriebelastning i forskellige organer efter infektion af brandsår. Rotter blev inficeret med 6 log CFU af bakterierne via subkutane injektioner 15 minutter efter brandskaden. Hud, subkutant væv, muskler, lunger og milt blev indsamlet 24, 48 og 72 timer efter infektion for at bestemme progressionen af systemisk sygdom. Tre rotter blev brugt på hvert tidspunkt. a) Pseudomonas aeruginosa PA01, B) Staphylococcus aureus ATCC25923. Forkortelse: CFU = kolonidannende enheder. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Celletype | Baseline (gennemsnitlig ± SD) | 72 timer Ikke-inficeret (gennemsnitlig ± SD) | 72 h-inficerede (gennemsnitlig ± SD) |
| Hvide blodlegemer (109/l) | 16.9 ± 4.9 | 7.1 ± 2.0 | 6.50 ± 5.5 |
| Neutrofil (109/l); (%) | 4.0 ± 1.1; (24,3 ± 2,8) | 1,4 ± 0,4; (20,2 ± 5,7) | 1,88 ± 1,0; (35,0 ± 12,4) |
| lymfocytter (109/l); (%) | 11.6 ± 4.1; (68,5 ± 1,7) | 4.8 ± 1.7; (66,5 ± 7,6) | 3,54 ± 3,9; (46,4 ± 17,0) |
| Monocytter (109/l); (%) | 0,9 ± 0,3; (5.4 ± 1.5) | 0,8 ± 0,2; (11,5 ± 1,6) | 1,0 ± 0,6; (17.3 ± 5.5) |
| Røde blodlegemer (1012/l) | 7,5 ± 0,3 | 7.1 ± 0.8 | 10.0 ± 1.1 |
| Hæmoglobin (g / dl) | 14,3 ± 0,7 | 13.4 ± 1.0 | 18.6 ± 2.0 |
| Blodplader (109/l) | 723,3 ± 353,1 | 942,7 ± 43,1 | 1359,0 ± 228,5 |
| HCT (%) | 45,6 ± 3,0 | 39,9 ± 3,7 | 55,7 ± 8,2 |
Tabel 1: Hæmatologiske parametre før og efter forbrænding og infektion. Forkortelse: HCT = hæmatokrit.
Supplerende fil 1: Trin til analyse af H&E-billeder i Aperio ImageScope. Forkortelse: H&E = hæmatoxylin og eosin. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere forbrændingsmodeller er blevet præsenteret for at studere patofysiologien af brandskade 8,12,16,17. I denne undersøgelse anvendte vi en rottemodel til at udvikle en enkel og reproducerbar protokol til at inducere en forbrænding i fuld tykkelse efterfulgt af bakteriel infektion for at simulere et inficeret forbrændingstraume hos patienter. Valget af rotten som dyremodel til at efterligne menneskelige forhold er baseret på en balance mellem omkostninger, brugervenlighed, reproducerbarhed og pålidelighed af dataene. Den rottemodel, der anvendes her, har mange fordele i forhold til andre: den er nem at håndtere og er den mest anvendte brændemodel, som giver mulighed for sammenligninger på tværs af litteraturen. På trods af at rotten er meget udbredt i forsøgsmiljøet, er rotte- og menneskelige integreringer ikke histologisk identiske18,19. Rottens integument består af huden, et fedtlag kendt som panniculus adiposus, og under dette lag er en kappe af løst bindevæv forbundet med hvidt fedtvæv og glat muskel, der danner et lag kendt som panniculus carnosus. Sidstnævnte lag er fraværende i det meste af det menneskelige integument. Dette er vigtigt, da dets glatte muskelceller fremmer hurtig og rigelig sårsammentrækning20. Derudover skal det bemærkes, at sårhelingsmekanismerne hos rotter er væsentligt forskellige fra hos mennesker8. Derfor bør forskere huske dette, når de fortolker resultaterne af protokollen beskrevet i dette papir. Ikke desto mindre er rottemodellens anvendelighed til at studere lokaliserede brandskader og sepsis efter forbrænding ubestridelig og har produceret rigelige data, der er klinisk pålidelige og overførbare21. Derudover har rotter mere overfladeareal sammenlignet med andre små dyr, hvilket tillader induktion af relativt større brandsår, hvilket gør det til en god model for klinisk relevante forbrændingsundersøgelser.
Forskellige metoder til forbrændingsinduktion er blevet offentliggjort, herunder kogende vand16, opvarmet messingstang 22, opvarmet aluminiumsskabelon17, en varmeplade med konstant temperatur placeret over stænger i rustfrit stål23 og skoldning over 45% af kropsoverfladen24. En ideel eksperimentel protokol ville have kapacitet til at opnå brandsår, der er konsistente i størrelse og dybde. I denne undersøgelse blev 420 g kobberstænger opvarmet i vand ved 97 °C brugt til at overføre varmen gennem direkte ledning for at fremkalde forbrændingen. Under forbrændingsinduktion blev stænger direkte berørt til hudoverfladen uden at anvende noget eksternt tryk, da den termiske energikonduktans fra en fast struktur til en hudoverflade ikke afhænger af det anvendte tryk, men snarere af temperaturgradienten 25 og afstanden mellem den faste struktur og huden17,25. De faktorer, der bestemte valget af metal, omfattede varmeledningsevne og evnen til at modstå rust og korrosion.
Kobber har en høj varmeledningsevne (398 W / mK; hvor W er varme i watt, m er areal i meter, K er temperatur i kelvin) sammenlignet med rustfrit stål, aluminium eller messing med henholdsvis 16 W / mK, 225 W / mK og 109 W / mK9. Metalstænger med høj varmeledningsevne ville sprede varmeenergi hurtigere til hudvævene end stænger med lav varmeledningsevne og fremkalde et dybere niveau af forbrænding inden for samme eksponeringsvarighed. Derudover blev stangens størrelse og vægt allometrisk skaleret fra forbrændingsmodellen i mus 7,26,27 og inducerer en ca. 20% TBSA-forbrænding. En stang med en diameter på 1,9 cm (det samlede forbrændingsareal er 11,3 cm 2 i en mus efter fire applikationer) blev skaleret til 5,4 cm diameter (det samlede forbrændingsareal er 91,6 cm 2 i en rotte efter fire applikationer) for at fremkalde en lignende ~ 20% -30% TBSA-forbrænding hos rotter (TBSA for en 220 g rotte er 356,0 cm2)28, i betragtning af at TBSA hos rotter er 6x større end hos mus (TBSA hos en 20 g mus er 61,2 cm2)29. Resultaterne viser tydeligt, at denne metode inducerede forbrænding i fuld tykkelse, og histologisk analyse indikerede fremragende kontrast mellem normalt og brændt hudvæv på forskellige tidspunkter efter forbrænding (figur 3). Denne model var også i stand til at fange immunsuppression, som observeres hos patienter efter forbrændingsskade30,31 (tabel 1).
Bakterielle infektioner er en vigtig trussel, der kompromitterer helingsprocessen hos brandsårspatienter og ofte er den hyppigste årsag til sygelighed og dødelighed efter brandskader. For at simulere lignende forhold blev rotten inficeret efter en brandskade med enten P. aeruginosa eller S. aureus. I første omgang forsøgte vi topisk anvendelse af bakterierne, men det voksagtige udseende af forbrændingsoverfladen hæmmede absorptionen af bakterieinokulumet. Denne model var også i stand til at rekapitulere systemisk sygdomsprogression efter bakteriel infektion på forbrændingsstedet set med bakteriel byrde genvundet fra lungen og milten (figur 4). Afslutningsvis har vi demonstreret en enkel og reproducerbar metode til at skabe forbrændinger i fuld tykkelse, der udviser mange af de funktioner, der observeres ved menneskelige forbrændingsskader. Denne protokol kan hjælpe med at studere en bred vifte af nye topiske behandlinger til behandling af inficerede brandsår. Denne model kan også bruges som en omkostningseffektiv model til evaluering af forskellige sårforbindinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takker Division of Comparative Medicine ved University of North Carolina for levering og pleje af dyr. Vi takker Lauren Ralph og Mia Evangelista i Pathology Services Core for ekspert teknisk assistance med histopatologi / digital patologi, herunder vævssektionering og billeddannelse. Denne forskning blev støttet af en forskningsbevilling fra forsvarsministeriet (prisnummer W81XWH-20-1-0500, GR og TV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD, USA | 309597 | Used to inject the analgesic |
| 1.7 mL Microtube | Olympus, USA | 24-282 | Used to carry morphine |
| 10% NBF | VWR, USA | 16004-115 | Used to fix the skin piece for staining |
| 30 mL syringe | BD, USA | 302832 | Used to inject the lactate ringer solution |
| 70% ethyl alcohol | Fischer Scientific, USA | BP28184 | |
| Aperio AT2 Digital Pathology Slide Scanner with ImageScope software | Aperio, Technologies Inc., Vista, CA, USA | n/a | Scanning of H & E slides and analysis |
| Cetrimide agar plates | BD, USA | 285420 | Selective media plates for Pseudomonas aeruginosa growth |
| Copper rods | n/a | n/a | Used to induce the burn injury |
| Cotton tipped applicators | OMEGA Surgical supply, USA | 4225-IMC | Used to apply eye ointment |
| Electric shaver | Oster, USA | Golden A5 | Used to remove the dorsal side hairs |
| Eye lube | Dechra, UK | n/a | The eye wetting agent to provide long lasting comfort and avoid eye dryness |
| Fluff filled underpads | Medline, USA | MSC281225 | Used in the burn procedure |
| Forcep | F.S.T. | 11027-12 | Used to hold the skin piece |
| Gauze sponges | Oasis, USA | PK412 | Used to clean the applied nair cream from the dorsal side |
| Heat-resistant gloves | n/a | n/a | Used to hold the heated copper rods |
| Hematology Analyzer | IDEXX laboratories, USA | ProCyte Dx | |
| Induction chamber | Kent Scientific, USA | vetFlo-0730 | Used to anesthesize the animals |
| Insulin syringe | BD, USA | 329461 | |
| Isoflurane | Pivetal, USA | NDC46066-755-04 | Used to anesthesized rats to induce a loss of consciousness |
| Isoflurane vaporiser | n/a | n/a | |
| Lactated ringer's solution | icumedical, USA | NDC0990-7953-09 | Used to resuscitate the rats |
| L-shaped spreader | Fischer Scientific, USA | 14-665-230 | |
| Mannitol Agar | BD, USA | 211407 | Selective media plates for Staphylococcus aureus growth |
| Minicollect tubes (K2EDTA) | greiner bio-one, USA | 450480 | Used to collect the blood |
| Morphine | Mallinckrodt, UK | NDC0406-8003-30 | This analgesia was used to induce the inability to feel burn injury pain |
| Muller Hinton Broth | BD, USA | 275730 | |
| Muller Hinton II Agar | BD, USA | 211438 | |
| Nair hair removal lotion | Nair, USA | n/a | Used to remove the residual hairs on dorsal side |
| Needle 23 G | BD, USA | 305193 | Used to inject the lactate ringer solution |
| Normal saline | n/a | n/a | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific, USA | Genesys 30 | |
| Sprague-Dawley rats, male and female | Charles River Labs | n/a | 7-9 weeks old for burn induction |
| Surgical Scissor | F.S.T. | 14501-14 | Used to cut the desired skin piece |
| Tissue collection tubes | Globe Scientific | 220101236 | |
| Tissue Homogenizer | Kinematica, Inc, USA | POLYTRON PT2100 | Used to homogenize the tissue samples |
| Water bath | Fischer Scientific, USA | n/a | Used to induce the burn injury |
| Weighted heating pad | Comfytemp, USA | n/a | Used during the procedure to keep rat's body warm |
References
- Peck, M., Molnar, J., Swart, D. A global plan for burn prevention and care. Bulletin of the World Health Organization. 87, 802-803 (2009).
- American Burn Association. Burn incidence and treatment in the United States: 2011 fact sheet. Chicago: American Burn Association. , (2011).
- Miller, S. F., et al. National burn repository 2007 report: a synopsis of the 2007 call for data. Journal of Burn Care & Research. 29 (6), 862-870 (2008).
- Kruger, E., Kowal, S., Bilir, S. P., Han, E., Foster, K. Relationship between patient characteristics and number of procedures as well as length of stay for patients surviving severe burn injuries: analysis of the American Burn Association National Burn Repository. Journal of Burn Care & Research. 41 (5), 1037-1044 (2020).
- American Burn Association. Burn incidence and treatment in the United States: 2016. Burn Incidence Fact Sheet. Chicago: American Burn Association. , (2016).
- Willis, M. L., et al. Plasma extracellular vesicles released after severe burn injury modulate macrophage phenotype and function. Journal of Leukocyte Biology. 111 (1), 33-49 (2022).
- Kartchner, L. B., et al. One-hit wonder: late after burn injury, granulocytes can clear one bacterial infection but cannot control a subsequent infection. Burns. 45 (3), 627-640 (2019).
- Abdullahi, A., Amini-Nik, S., Jeschke, M.
- Cai, E. Z., et al. Creation of consistent burn wounds: a rat model. Archives of Plastic Surgery. 41 (4), 317 (2014).
- Pessolato, A. G. T., dos Santos Martins, D., Ambrósio, C. E., Mançanares, C. A. F., de Carvalho, A. F. Propolis and amnion reepithelialise second-degree burns in rats. Burns. 37 (7), 1192-1201 (2011).
- Gurung, S., Škalko-Basnet, N. Wound healing properties of Carica papaya latex: in vivo evaluation in mice burn model. Journal of Ethnopharmacology. 121 (2), 338-341 (2009).
- Eloy, R., Cornillac, A. Wound healing of burns in rats treated with a new amino acid copolymer membrane. Burns. 18 (5), 405-411 (1992).
- Upadhyay, N., et al. Safety and healing efficacy of Sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) seed oil on burn wounds in rats. Food and Chemical Toxicology. 47 (6), 1146-1153 (2009).
- El-Kased, R. F., Amer, R. I., Attia, D., Elmazar, M. M. Honey-based hydrogel: In vitro and comparative In vivo evaluation for burn wound healing. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Fan, G. -Y., et al. Severe burn injury in a swine model for clinical dressing assessment. Journal of Visualized Experiments. (141), e57942 (2018).
- Davenport, L., Dobson, G., Letson, H. A new model for standardising and treating thermal injury in the rat. MethodsX. 6, 2021-2027 (2019).
- Kaufman, T., Lusthaus, S., Sagher, U., Wexler, M. Deep partial skin thickness burns: a reproducible animal model to study burn wound healing. Burns. 16 (1), 13-16 (1990).
- Casal, D., et al. Blood supply to the integument of the abdomen of the rat: a surgical perspective. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 5 (9), (2017).
- Casal, D., et al. A model of free tissue transfer: the rat epigastric free flap. Journal of Visualized Experiments. (119), e55281 (2017).
- Naldaiz-Gastesi, N., Bahri, O. A., Lopez de Munain, A., McCullagh, K. J., Izeta, A. The panniculus carnosus muscle: an evolutionary enigma at the intersection of distinct research fields. Journal of Anatomy. 233 (3), 275-288 (2018).
- Weber, B., et al. Modeling trauma in rats: similarities to humans and potential pitfalls to consider. Journal of Translational Medicine. 17 (1), 1-19 (2019).
- Nguyen, J. Q. M., et al. Spatial frequency domain imaging of burn wounds in a preclinical model of graded burn severity. Journal of Biomedical Optics. 18 (6), 066010 (2013).
- Sobral, C., Gragnani, A., Morgan, J., Ferreira, L. Inhibition of proliferation of Pseudomonas aeruginosa by KGF in an experimental burn model using human cultured keratinocytes. Burns. 33 (5), 613-620 (2007).
- Olivera, F., Bevilacqua, L., Anaruma, C., Boldrini Sde, C., Liberti, E. Morphological changes in distant muscle fibers following thermal injury i n Wistar rats. Acta Cirurgica Brasileira. 25, 525-528 (2010).
- Davies, J. W. Physiological Responses to Burning Injury. , Academic Press. (1982).
- Neely, C. J., et al. Flagellin treatment prevents increased susceptibility to systemic bacterial infection after injury by inhibiting anti-inflammatory IL-10+ IL-12-neutrophil polarization. PloS One. 9 (1), e85623 (2014).
- Dunn, J. L., et al. Direct detection of blood nitric oxide reveals a burn-dependent decrease of nitric oxide in response to Pseudomonas aeruginosa infection. Burns. 42 (7), 1522-1527 (2016).
- Gouma, E., et al. A simple procedure for estimation of total body surface area and determination of a new value of Meeh's constant in rats. Laboratory Animals. 46 (1), 40-45 (2012).
- Dawson, N.
- Moins-Teisserenc, H., et al. Severe altered immune status after burn injury is associated with bacterial infection and septic shock. Frontiers in Immunology. 12, 529 (2021).
- Robins, E. V.
