Summary
जलने की चोट और संक्रमण के नैदानिक परिदृश्य की नकल करने वाला एक मॉडल जलने के अनुसंधान को आगे बढ़ाने के लिए आवश्यक है। वर्तमान प्रोटोकॉल मनुष्यों में तुलनीय एक सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य चूहे के जलने के संक्रमण मॉडल को प्रदर्शित करता है। यह नए सामयिक एंटीबायोटिक उपचार विकसित करने के लिए जलने के बाद जलने और संक्रमण के अध्ययन की सुविधा प्रदान करता है।
Abstract
चूहे के मॉडल में बर्न प्रेरण पद्धतियों को असंगत रूप से वर्णित किया गया है। एक समान जलने का घाव मॉडल, जो नैदानिक परिदृश्य का प्रतिनिधित्व करता है, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य जलने अनुसंधान करने के लिए आवश्यक है। वर्तमान प्रोटोकॉल चूहों में ~ 20% कुल शरीर की सतह क्षेत्र (टीबीएसए) पूर्ण मोटाई जलने के लिए एक सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का वर्णन करता है। यहां, जलने की चोट को प्रेरित करने के लिए पानी के स्नान में 97 डिग्री सेल्सियस पर गर्म22.89 सेमी 2 (5.4 सेमी व्यास) तांबे की छड़ को चूहे की त्वचा की सतह पर लगाया गया था। एक उच्च तापीय चालकता के साथ एक तांबे की छड़ एक पूर्ण मोटाई जलने के लिए त्वचा के ऊतकों में गर्मी को गहराई से फैलाने में सक्षम थी। हिस्टोलॉजी विश्लेषण डर्मिस और चमड़े के नीचे के ऊतकों की पूर्ण मोटाई सीमा को कोगुलेटिव क्षति के साथ क्षीण एपिडर्मिस दिखाता है। इसके अतिरिक्त, यह मॉडल प्रतिरक्षा विकृति और जीवाणु संक्रमण जैसे जलने की चोट के बाद अस्पताल में भर्ती जलने वाले रोगियों में देखी गई नैदानिक स्थितियों का प्रतिनिधि है। मॉडल ग्राम-पॉजिटिव और ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया दोनों द्वारा प्रणालीगत जीवाणु संक्रमण को पुन: उत्पन्न कर सकता है। निष्कर्ष में, यह पेपर एक आसानी से सीखने वाला और मजबूत चूहा जलने वाला मॉडल प्रस्तुत करता है जो नैदानिक स्थितियों की नकल करता है, जिसमें प्रतिरक्षा विकृति और जीवाणु संक्रमण शामिल हैं, जो जलने के घाव और संक्रमण के लिए नई सामयिक एंटीबायोटिक दवाओं के विकास के लिए काफी उपयोगिता है।
Introduction
जलने की चोटें आघात के सबसे विनाशकारी रूपों में से हैं, विशेष बर्न सेंटर 1,2,3 में भी मृत्यु दर 12% तक पहुंच जाती है। हाल ही में प्रकाशित रिपोर्टों के अनुसार, संयुक्त राज्य अमेरिका में ~ 486,000 जले हुए रोगियों को सालाना चिकित्सा देखभाल की आवश्यकता होती है, जिसमें लगभग 3,500 मौतें 1,2,3,4,5,6 होती हैं। जलने की चोट रोगियों की प्रतिरक्षा प्रणाली के लिए एक बड़ी चुनौती लागू करती है और एक महत्वपूर्ण खुला घाव बनाती है, जो ठीक होने में धीमी होती है, जिससे उन्हें नोसोकोमियल, अवसरवादी बैक्टीरिया के साथ त्वचीय, फुफ्फुसीय और प्रणालीगत उपनिवेशीकरण के लिए अतिसंवेदनशील छोड़ दिया जाता है। बैक्टीरियल संक्रमण के साथ संयुक्त प्रतिरक्षा विकृति जलेहुए रोगियों में रुग्णता और मृत्यु दर में वृद्धि के साथ जुड़ी हुई है।
त्वचा की क्षति और जलने के आघात से जुड़े प्रतिरक्षा दमन के बाद जीवाणु संक्रमण के रोगजनन का अध्ययन करने के लिए एक पशु जलने और संक्रमण मॉडल आवश्यक है। इस तरह के मॉडल जले हुए रोगियों में जीवाणु संक्रमण के इलाज के लिए नए तरीकों के डिजाइन और मूल्यांकन को सक्षम करते हैं। चूहे और मनुष्य समान त्वचा शारीरिक और रोग संबंधी विशेषताओं को साझा करते हैं जिन्हें पहले प्रलेखित किया गयाहै। इसके अतिरिक्त, चूहे आकार में छोटे होते हैं, जिससे उन्हें संभालना आसान हो जाता है, अधिक किफायती होता है, और बड़े पशु मॉडल की तुलना में खरीदना और बनाए रखना आसान होता है।
ये विशेषताएं चूहों को जलने और संक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल जानवर बनातीहैं। दुर्भाग्य से, बर्न इंडक्शन की तकनीक असंगत है और अक्सर न्यूनतम रूप सेवर्णित 10,11,12,13,14 है। वर्तमान प्रोटोकॉल को एक चूहे के मॉडल में एक सुसंगत पूर्ण मोटाई जलने की चोट बनाने के लिए एक सरल, लागत प्रभावी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रक्रिया विकसित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है जो नैदानिक परिदृश्य का अनुकरण करता है और इसका उपयोग प्रतिरक्षा दमन और जीवाणु संक्रमण का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है।
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Protocol
सभी प्रक्रियाओं को उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था और इसके स्थापित दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया था। प्रयोगों के लिए 7-9 सप्ताह की आयु के नर और मादा स्प्राग डॉवले चूहों (250-300 ग्राम) का उपयोग किया गया था। सभी जानवरों को भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच के साथ 12 घंटे: 12 घंटे के प्रकाश-अंधेरे चक्र में रखा गया था। अध्ययन शुरू करने से पहले हमेशा एक एनाल्जेसिक योजना के बारे में अपने संस्थागत पशु चिकित्सक के साथ काम करें।
1. जलने की चोट के लिए चूहों को तैयार करना
- जलने से 24 घंटे पहले जानवरों को जलने की चोट के लिए तैयार करें।
- जब तक सांस धीमी न हो जाए, तब तक एक प्रेरण कक्ष में 100% ऑक्सीजन में 5% आइसोफ्लुरेन के साथ चूहे को एनेस्थेटाइज करें (प्रवाह दर: 2 एल / मिनट)।
- एक बार जब चूहे को गहराई से एनेस्थेटाइज्ड (सभी अंगों पर पैर की अंगुली के लिए अनुत्तरदायी) हो जाता है, तो चूहे को एक प्रवण स्थिति में हीटिंग पैड पर ले जाएं और नाक शंकु के माध्यम से रखरखाव के लिए ऑक्सीजन में आइसोफ्लुरेन को 1.5% तक कम करें।
- एनेस्थीसिया के बाद और प्रक्रिया के दौरान कॉर्नियल सुखाने से रोकने के लिए, कॉटन-टीप एप्लिकेटर का उपयोग करके दोनों आंखों के कॉर्निया पर आंख स्नेहक लागू करें।
- एक इलेक्ट्रिक क्लिपर का उपयोग करके चूहे के पृष्ठीय क्षेत्र को शेव करें ( सामग्री की तालिका देखें) और कंधे के ब्लेड से पूंछ के आधार तक एक बड़े आयत में जितना संभव हो उतना बाल हटा दें (चित्रा 2 ए)।
- ढीले बालों को पोंछने के लिए खारे रंग में भिगोए गए ऊतक के साथ मुंडा क्षेत्र को साफ करें। कॉटन-टिम्प्ड एप्लिकेटर का उपयोग करके शेव किए गए क्षेत्र पर हेयर रिमूवल लोशन लागू करें और इसे ~ 3 मिनट के लिए छोड़ दें।
नोट: 3 मिनट से अधिक समय के लिए संदर्भित हेयर रिमूवल लोशन का आवेदन त्वचा पर लाल चकत्ते को प्रेरित करेगा। - लोशन को हटाने और त्वचा की जलन को रोकने के लिए गीले धुंध स्पंज के साथ क्षेत्र को दो बार पोंछें।
- आइसोफ्लुरेन को बंद करें, नाक शंकु को हटा दें, और चूहे को रिकवरी पिंजरे में रखें।
नोट: रिकवरी पिंजरे में एक हीटिंग पैड रखें। - बरामद जानवर को अगले दिन की जलने की प्रक्रिया के लिए एक साफ आवास पिंजरे में स्थानांतरित करें (चूहे को संज्ञाहरण से ठीक होने में ~ 10-15 मिनट लग सकते हैं)।
2. चूहों में जलने की चोट को प्रेरित करना
- जलने के दिन, पानी के स्नान के तापमान को 97 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें और सभी चार तांबे की छड़ें (प्रत्येक 420 ग्राम; चित्र 1) जलने के प्रयोग से 1 घंटे पहले पानी के स्नान में छड़ों को समान रूप से गर्म करने दें।
नोट: छड़ को पानी में डुबोया जाना चाहिए। प्रयोग से पहले थर्मामीटर का उपयोग करके डिजिटल तापमान प्रदर्शन की सटीकता की जांच करें। - खंड 1 में उल्लिखित चूहे को एनेस्थेटाइज करें।
- एक बार जब चूहा सभी अंगों पर पैर की अंगुली के लिए अनुत्तरदायी हो जाता है, तो इसे रखरखाव के लिए ऑक्सीजन में 1.5% आइसोफ्लुरेन के साथ प्रवण स्थिति में हीटिंग पैड पर रखें (चित्रा 2 ए)।
- दर्द प्रबंधन के लिए इंट्रापरिटोनियल (यानी) मार्ग के माध्यम से मॉर्फिन (20 मिलीग्राम / किग्रा शरीर का वजन) इंजेक्टकरें।
- पानी के स्नान में पानी के तापमान की जांच करें। टाइमर सेट करें और गर्मी प्रतिरोधी दस्ताने पहनें।
- पानी के स्नान से एक गर्म तांबे की छड़ निकालें और इसे जलने के लिए प्रेरित करने के लिए चूहे के डोरसम क्षेत्र पर 7 सेकंड के लिए स्पर्श करें।
नोट: गर्मी के नुकसान को कम करने के लिए पानी के स्नान और जानवर के बीच न्यूनतम दूरी (10-15 सेमी) रखें, और जलने को प्रेरित करते समय छड़ पर दबाव न डालें (यानी, गुरुत्वाकर्षण द्वारा संपर्क बनाए रखा जाना चाहिए)। - लगभग 20% टीबीएसए पूर्ण-संपर्क बर्न का उत्पादन करने के लिए प्रति जलने वाली साइट पर एक रॉड का उपयोग करके चार बर्न लागू करें (चित्रा 2 बी)।
- जलने के बाद, स्तनपान कराने वाले रिंगर के घोल (0.1 एमएल / जी शरीर के वजन) के इंजेक्शन द्वारा जानवर को पुनर्जीवित करें।
नोट: चूहों को पुनर्जीवित करने के लिए शरीर के तापमान-समायोजित लैक्टेट रिंगर के समाधान का उपयोग करें। - आइसोफ्लुरेन को बंद करें, नाक शंकु को हटा दें, और ठीक होने के लिए चूहे को गर्मी मैट पर रखें।
3. बैक्टीरियल इनोकुलम और संक्रमण की तैयारी
- जलने के प्रयोग से 2 दिन पहले मुलर हिंटन एगर (एमएचए) प्लेटों पर स्यूडोमोनास एरुगिनोसा पीएओ 1 और स्टेफिलोकोकस ऑरेउ एसएटीसीसी 25923 के जमे हुए नमूने को स्ट्रीक करें।
- अगले दिन, प्लेट से उगाए गए बैक्टीरिया की एक कॉलोनी का चयन करें, और एक टीकाकरण लूप का उपयोग करके, इसे प्लेट से थोड़ा खुरचें। फिर, इसे एक इनक्यूबेटर शेकर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर मुलर हिंटन ब्रोथ (एमएचबी) और कल्चर के 10 एमएल को टीका लगाने के लिए कल्चर ट्यूब में रखें।
- जलने और संक्रमण के दिन, 5 मिनट के लिए 4,000 × ग्राम पर कल्चर को सेंट्रीफ्यूज करें। सामान्य खारा (0.9% NaCl समाधान) के साथ गोली धो लें।
- बैक्टीरियल पेलेट को खारा में पुन: निलंबित करें और 0.1 ओडी600 एनएम (600 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व) तक पतला करें। इस बैक्टीरियल सस्पेंशन के 200 μL लेकर बैक्टीरियल इनोकुलम को पतला करें और इसे 800 μL खारा के साथ मिलाकर 2 × 107 CFU / mL के वांछित बैक्टीरियल इनोकुलम प्राप्त करें।
- पिछले चरण (संक्रमण खुराक 1 × 106 सीएफयू) में तैयार पी. एरुगिनोसा या एस. ऑरेउएस इनोकुलम के 50 डिग्री लीटर को जलने के 15 मिनट बाद एनेस्थेटाइज्ड चूहे में इंजेक्ट करें, 29 ग्राम सुई का उपयोग करके जितना संभव हो सके जलने के घाव के करीब।
- जले हुए घाव को संक्रमित करने के बाद, चूहे को ठीक होने के लिए हीटिंग पैड पर रखें। एक बार जब जानवर ठीक हो जाता है (~ 15-20 मिनट), तो इसे एक साफ पिंजरे में रखें।
नोट: जलने की चोट के बाद, प्रति पिंजरे एक चूहा घर। आसान चबाने के लिए पानी गीले भोजन छर्रों का उपयोग करें और उन्हें आसान पहुंच के लिए पिंजरे के फर्श पर रखें। - दर्द प्रबंधन के लिए पिंजरे में पानी की बोतलों को मॉर्फिन-स्पाइक्ड पानी (0.4 मिलीग्राम / एमएल) से भरें।
नोट: मौखिक मॉर्फिन मानव जलने के रोगियों के साथ नैदानिक स्थिति को प्रतिबिंबित करता है। इस अध्ययन ने कई मौकों पर पशु चिकित्सा कर्मचारियों के साथ परामर्श करने के बाद इन प्रयोगों को मानव जलने के रोगियों के बराबर रखने के लिए मौखिक मॉर्फिन का उपयोग किया। पूरे प्रयोग के दौरान पीने और वजन लॉग बनाए रखा गया था। सभी प्रक्रियाओं के दौरान एक ही पीने की प्रणाली का उपयोग करें। अन्य एनाल्जेसिक, जैसे कि ब्यूप्रेनोर्फिन, संस्थागत पशु देखभाल दिशानिर्देशों के अनुसार चमड़े के नीचे / इंट्रापरिटोनियल रूप से प्रशासित किया जा सकता है। - निगरानी चेकलिस्ट भरें और प्रयोग की पूरी अवधि के लिए संकट या बीमारी के लिए जानवरों की बारीकी से निगरानी करें।
4. जलने की चोट का मूल्यांकन
- जलने की चोट के तुरंत बाद रंग और मार्जिन के संदर्भ में त्वचा की जलने की चोट का मूल्यांकन करें।
- जले हुए घाव संरचना और उपकला अंतराल15 की कल्पना करने के लिए हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) के साथ जली हुई त्वचा को दाग दें (नमूना प्रसंस्करण के लिए चरण 5.6 देखें)।
5. चूहे के नमूनों की पोस्टप्रोसेसिंग और जीवाणु गणना
- एनेस्थीसिया के ओवरडोज के साथ 24, 48 और 72 घंटे में चूहे को मार डाला।
- कार्डियक पंचर के माध्यम से चूहों से रक्त के नमूने वापस लें और उन्हें एक मिनी एकत्र ट्यूब में एकत्र करें।
- मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली पर जलने के प्रेरण के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए रक्त के नमूनों से पूर्ण रक्त गणना का विश्लेषण करें।
- इच्छामृत्यु के समय त्वचा, चमड़े के नीचे के ऊतक, मांसपेशियों, फेफड़े और प्लीहा की कटाई करें।
नोट: एच एंड ई धुंधला होने के लिए त्वचा का एक हिस्सा (~ 1 सेमी × 1 सेमी; वजन ~ 200-300 मिलीग्राम) और जीवाणु गणना के लिए दूसरा हिस्सा रखें। - ऊतकों को 10 एमएल संग्रह ट्यूब में इकट्ठा करें और उन्हें जीवाणु गणना के लिए बर्फ पर सामान्य खारा में रखें।
- ऊतक के वजन को सामान्य लवण के साथ सामान्य करें और ऊतक होमोजेनाइज़र का उपयोग करके नमूनों को समरूप करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- क्रमिक रूप से ऊतक होमोजेनेट्स को सामान्य खारा में पतला करें।
- एरुगिनोसा से संक्रमित चूहों से एकत्र किए गए नमूनों के लिए सेट्रीमाइड एगर प्लेटों पर प्रत्येक ऊतक के नमूने के सभी कमजोर पड़ने और बिना पतला होमोजेनेट की प्लेट 100 μL।
नोट: एस ऑरियस से संक्रमित चूहों से एकत्र किए गए नमूने चढ़ाना के लिए मैनिटोल एगर प्लेटों का उपयोग करें। - 16-18 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
- अगले दिन, प्लेटों पर जीवाणु कालोनियों की गणना करें, सीएफयू / एमएल गिनती प्राप्त करने के लिए कमजोर पड़ने के अनुपात से गुणा करें, और सीएफयू / जी ऊतक की गणना करने के लिए ऊतक के वजन के साथ सामान्य करें।
- विभिन्न नमूना समय-बिंदुओं पर विभिन्न अंगों में बैक्टीरिया की गिनती को प्लॉट करने के लिए डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
- घाव संरचना और उपकला अंतर की कल्पना करने के लिए जली हुई त्वचा का एच एंड ई धुंधलापन करें।
- कैंची और टूथेड फोर्सप्स का उपयोग करके, जले हुए क्षेत्र से 1 सेमी x 1 सेमी के त्वचा पैच को काटें और इसे कमरे के तापमान पर 48 घंटे के लिए एक फिक्सेटिव (10% तटस्थ बफर्ड फॉर्मेलिन, एनबीएफ) में डुबो दें।
नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कंटेनर को घुमाएं कि सभी ऊतक पूरी तरह से फिक्सेटिव में डूबे हुए हैं, जिसमें फिक्सेटिव की मात्रा 30 x ऊतक की मात्रा है। - कमरे के तापमान पर 72 घंटे के लिए 70% (वी / वी) इथेनॉल के साथ त्वचा के ऊतकों को निर्जलित करें।
- अनुभागों को काटने और एच एंड ई15 के साथ दाग लगाने के लिए पैराफिन ब्लॉकों में निर्जलित नमूनों को संसाधित करें।
- 40x उद्देश्य का उपयोग करके स्लाइड स्कैनर ( सामग्री की तालिका देखें) में दाग वाली स्लाइडों को डिजिटल रूप से चित्रित करें।
- सॉफ्टवेयर का उपयोग करके स्कैन की गई छवि का विश्लेषण करें (विश्लेषण के लिए छवि के प्रसंस्करण के लिए पूरक फ़ाइल 1 देखें; सामग्री की तालिका देखें)।
- एपिडर्मिस, डर्मिस, चमड़े के नीचे के ऊतक और कंकाल की मांसपेशियों की स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए दाग वाली त्वचा अनुभाग के सभी क्षेत्रों की जांच करें।
- कैंची और टूथेड फोर्सप्स का उपयोग करके, जले हुए क्षेत्र से 1 सेमी x 1 सेमी के त्वचा पैच को काटें और इसे कमरे के तापमान पर 48 घंटे के लिए एक फिक्सेटिव (10% तटस्थ बफर्ड फॉर्मेलिन, एनबीएफ) में डुबो दें।
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Representative Results
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और इसके परिणामस्वरूप चूहों में तीसरी डिग्री, पूर्ण मोटाई वाली जलने की चोट है। जलने का घाव जलने के बाद मोमी सफेद दिखाई देता है (चित्रा 2 बी)। जलने के बाद 72 घंटे के दौरान जलने की चोट का रंग सफेद से भूरे रंग में बदल गया (चित्रा 2 बी-ई)।
हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण ने 24 घंटे के बाद 24 घंटे के जलने पर एक पूर्ण मोटाई जलने (गहराई > 2.61 मिमी) की पुष्टि की; चित्र 3 बी)। बरकरार गैर-जली हुई त्वचा की तुलना में, जले हुए जानवरों से त्वचा के नमूनों ने जलने की चोट के बाद 24, 48 और 72 घंटे में सभी परतों में चोट के सबूत दिखाए (चित्रा 3)। इसके अतिरिक्त, हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण ने एपिडर्मल परत का पूर्ण विनाश और चमड़े के नीचे की वसा और कंकाल की मांसपेशियों की भागीदारी के साथ डर्मिस की पूर्ण मोटाई को नुकसान दिखाया (चित्रा 3 बी)।
जीवाणु निकासी का मूल्यांकन करने के लिए, पी एरुगिनोसा और एस ऑरियस के संक्रमण के बाद 24, 48 और 72 घंटे में विभिन्न ऊतकों की कटाई की गई थी। सभी जलने की चोट वाले चूहों के लिए संक्रमण स्थल से बैक्टीरिया बरामद किए गए थे (चित्रा 4 ए, बी)। इसके अलावा, जले हुए चूहों की त्वचा से बरामद बैक्टीरिया की संख्या संक्रमण के 24 घंटे बाद पी. एरुगिनोसा के लिए प्रारंभिक इनोकुलम से कम थी, जबकि 48 और 72 घंटे में प्राप्त ऊतक के नमूने जलने और संक्रमण के बाद बैक्टीरिया के बोझ में वृद्धि दिखाते हैं (चित्रा 4 ए)। इसके विपरीत, प्रारंभिक इनोकुलम (चित्रा 4 बी) की तुलना में त्वचा में एस ऑरियस के लिए सभी समय-बिंदुओं पर 2 लॉग10 की वृद्धि देखी गई थी। इससे पता चलता है कि एस ऑरियस ऊतकों में इसकी सक्रिय प्रतिकृति के कारण संक्रमण स्थापित करने में सक्षम था, न कि केवल जलने की चोट से प्रेरित इम्यूनोसप्रेशन के कारण।
जीवाणु प्रसार की जांच करने के लिए त्वचा की विभिन्न परतों (यानी, चमड़े के नीचे के ऊतक, मांसपेशियों और डिस्टल अंगों) का भी विश्लेषण किया गया था। चमड़े के नीचे के ऊतक और मांसपेशियों ने फेफड़े और प्लीहा की तुलना में अधिक जीवाणु भार दिखाया। एक साथ लिया गया, इन आंकड़ों से पता चलता है कि जलने वाले चूहों में क्रमशः पी. एरुगिनोसा (चित्रा 4 ए) या एस. ऑरियस के साथ घाव के टीकाकरण के 24 घंटे या 48 घंटे बाद एक प्रणालीगत संक्रमण विकसित होता है (चित्रा 4 बी)। बेसलाइन पर और जलने की चोट के बाद 72 घंटे में हेमेटोलॉजी विश्लेषक (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके पूर्ण रक्त गणना भी प्राप्त की गई थी। समय के साथ कुल सफेद रक्त कोशिका की गिनती कम हो गई, जो प्रतिरक्षा दमन का संकेत देती है। जलने के बाद न्यूट्रोफिल की संख्या में गिरावट आई लेकिन बेसलाइन की तुलना में 72 घंटे में संक्रमण के बाद वृद्धि हुई (तालिका 1)। हालांकि, जलने और संक्रमण के बाद लाल रक्त कोशिका और प्लेटलेट काउंट में वृद्धि देखी गई, जो प्रणालीगत सूजन का संकेत देती है।
चित्र 1: जलने के प्रेरण को प्रभावित करने के लिए तांबे की छड़ का उपयोग किया जाता है। कस्टम-निर्मित रॉड का वजन 5.4 सेमी व्यास और 6.4 सेमी ऊंचाई के साथ 420 ग्राम है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2: जलने से पहले और बाद में चूहे के पृष्ठीय पक्ष का मैक्रोस्कोपिक दृश्य। (A) शेविंग के तुरंत बाद चूहा डोरसम, (B) जलने के तुरंत बाद, (C) 24 घंटे जलने के बाद, (D) 48 घंटे जलने के बाद, और (E) 72 घंटे बाद जलने के बाद। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: जलने की गंभीरता के प्रत्येक स्तर के लिए एच एंड ई-सना हुआ क्रॉस-सेक्शन की प्रतिनिधि छवियां। (ए) शाम चूहे की त्वचा की हिस्टोलॉजी एपिडर्मिस, डर्मिस और चमड़े के नीचे के ऊतक परतों के बीच एक स्पष्ट अंतर दिखाती है। (B) स्किन हिस्टोलॉजी 24 घंटे के पोस्ट बर्न से पता चलता है कि डर्मिस की पूरी मोटाई और चमड़े के नीचे के ऊतक ों को >2.61 मिमी की अधिकतम जलने की गहराई के साथ कोगुलेटिव क्षति के साथ एपिडर्मिस को क्षीण किया गया है। (C) जलने के 48 घंटे बाद, अधिकतम जलने की गहराई 2.35 मिमी थी, और (डी) 72 घंटे के जलने के बाद, अधिकतम जलने की गहराई 2.20 मिमी थी। छवियों को 40x आवर्धन पर स्कैन किया गया था। स्केल सलाखों = 500 μm (A-D)। संक्षिप्त नाम: एच एंड ई = हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: जलने के घाव के संक्रमण के बाद विभिन्न अंगों में जीवाणु भार का परिमाणीकरण। जलने की चोट के 15 मिनट बाद चूहों को चमड़े के नीचे इंजेक्शन के माध्यम से बैक्टीरिया के 6 लॉग सीएफयू से संक्रमित किया गया था। प्रणालीगत रोग की प्रगति को निर्धारित करने के लिए संक्रमण के बाद त्वचा, चमड़े के नीचे के ऊतक, मांसपेशियों, फेफड़े और प्लीहा को 24, 48 और 72 घंटे में एकत्र किया गया था। प्रत्येक समय बिंदु पर तीन चूहों का उपयोग किया गया था। (ए) स्यूडोमोनास एरुगिनोसा पीए 01, (बी) स्टेफिलोकोकस ऑरियस एटीसीसी 25923। संक्षिप्त नाम: सीएफयू = कॉलोनी बनाने वाली इकाइयां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| सेल का प्रकार | बेसलाइन (एसडी ± औसत) | 72 एच अन-संक्रमित (एसडी ± औसत) | 72 एच-संक्रमित (एसडी ± औसत) |
| सफेद रक्त कोशिकाएं (109 / | 16.9 ± 4.9 | 7.1 ± 2.0 | 6.50 ± 5.5 |
| न्यूट्रोफिल (109 / एल); (%) | 4.0 ± 1.1; (24.3 ± 2.8) | 1.4 ± 0.4; (20.2 ± 5.7) | 1.88 ± 1.0; (35.0 ± 12.4) |
| लिम्फोसाइट्स (109 / एल); (%) | 11.6 ± 4.1; (68.5 ± 1.7) | 4.8 ± 1.7; (66.5 ± 7.6) | 3.54 ± 3.9; (46.4 ± 17.0) |
| मोनोसाइट्स (109 / एल); (%) | 0.9 ± 0.3; (5.4 ± 1.5) | 0.8 ± 0.2; (11.5 ± 1.6) | 1.0 ± 0.6; (17.3 ± 5.5) |
| लाल रक्त कोशिकाएं (1012 / | 7.5 ± 0.3 | 7.1 ± 0.8 | 10.0 ± 1.1 |
| हीमोग्लोबिन (g/dL) | 14.3 ± 0.7 | 13.4 ± 1.0 | 18.6 ± 2.0 |
| प्लेटलेट्स (109 / | 723.3 ± 353.1 | 942.7 ± 43.1 | 1359.0 ± 228.5 |
| HCT (%) | 45.6 ± 3.0 | 39.9 ± 3.7 | 55.7 ± 8.2 |
तालिका 1: जलने और संक्रमण से पहले और बाद में हेमेटोलॉजी पैरामीटर। संक्षिप्त नाम: एचसीटी = हेमटोक्रिट।
पूरक फ़ाइल 1: एपिरियो इमेजस्कोप में एच एंड ई छवियों का विश्लेषण करने के लिए कदम। संक्षिप्त नाम: एच एंड ई = हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
जलने की चोट 8,12,16,17 के पैथोफिज़ियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए कई बर्न मॉडल प्रस्तुत किए गए हैं। वर्तमान अध्ययन में, हमने रोगियों में संक्रमित जलने के आघात को अनुकरण करने के लिए जीवाणु संक्रमण के बाद पूर्ण मोटाई वाले जलने को प्रेरित करने के लिए एक सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए एक चूहे मॉडल को नियोजित किया। मानव स्थितियों की नकल करने के लिए पशु मॉडल के रूप में चूहे की पसंद लागत के संतुलन, उपयोग में आसानी, प्रजनन क्षमता और डेटा की विश्वसनीयता पर आधारित है। यहां उपयोग किए जाने वाले चूहे के मॉडल में दूसरों की तुलना में कई फायदे हैं: इसे संभालना आसान है और यह सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला बर्न मॉडल है, जो साहित्य में तुलना की अनुमति देता है। प्रायोगिक सेटिंग में चूहे का व्यापक रूप से उपयोग किए जाने के बावजूद, चूहे और मानव आंत हिस्टोलॉजिकल रूप से समान नहीं हैं 18,19. चूहे का झुकाव त्वचा से बना होता है, एक फैटी परत जिसे पैनिकुलस एडिपोसस के रूप में जाना जाता है, और इस परत के नीचे सफेद वसा ऊतक और चिकनी मांसपेशियों से जुड़े ढीले संयोजी ऊतक का एक आवरण होता है जो एक परत बनाता है जिसे पैनिकुलस कार्नोसस के रूप में जाना जाता है। उत्तरार्द्ध परत अधिकांश मानव संरचनाओं में अनुपस्थित है। यह महत्वपूर्ण है, क्योंकि इसकी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाएं तेजी से और पर्याप्त घाव संकुचन को बढ़ावा देतीहैं। इसके अतिरिक्त, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि चूहों के घाव भरने केतंत्र मनुष्यों से काफी अलग हैं। इसलिए, शोधकर्ताओं को इस पेपर में वर्णित प्रोटोकॉल के परिणामों की व्याख्या करते समय इसे ध्यान में रखना चाहिए। इसके बावजूद, स्थानीयकृत जलने की चोटों और पोस्टबर्न सेप्सिस का अध्ययन करने के लिए चूहे के मॉडल की उपयोगिता निर्विवाद है और इसने प्रचुर डेटा का उत्पादन किया है जो चिकित्सकीय रूप से विश्वसनीय औरहस्तांतरणीय हैं। इसके अतिरिक्त, चूहों में अन्य छोटे जानवरों की तुलना में अधिक सतह क्षेत्र होता है, जो अपेक्षाकृत बड़े जलने के घावों को शामिल करने की अनुमति देता है, जिससे यह चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक जलने के अध्ययन के लिए एक अच्छा मॉडल बन जाता है।
बर्न इंडक्शन के विभिन्न तरीकों को प्रकाशित किया गया है, जिसमें उबलते पानी16, गर्म पीतल बार22, गर्म एल्यूमीनियम टेम्पलेट17, स्टेनलेस स्टील रॉड23 पर रखी गई एक निरंतर तापमान गर्म प्लेट और शरीर की सतह24 के 45% से अधिक झुलसना शामिल है। एक आदर्श प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में जलने के घावों को प्राप्त करने की क्षमता होगी जो आकार और गहराई में सुसंगत हैं। वर्तमान अध्ययन में, 97 डिग्री सेल्सियस पर पानी में गर्म 420 ग्राम तांबे की छड़ों का उपयोग जलने को प्रेरित करने के लिए प्रत्यक्ष चालकता के माध्यम से गर्मी को स्थानांतरित करने के लिए किया गया था। जलने के प्रेरण के दौरान, छड़ों को किसी भी बाहरी दबाव को लागू किए बिना सीधे त्वचा की सतह पर छुआ गया था, क्योंकि एक ठोस संरचना से त्वचा की सतह तक थर्मल ऊर्जा चालकता नियोजित दबाव पर निर्भर नहीं करती है, बल्कि तापमान ढाल25 और ठोस संरचना और त्वचा के बीच की दूरी17,25 पर निर्भर करती है। धातु की पसंद को निर्धारित करने वाले कारकों में तापीय चालकता और जंग और जंग का विरोध करने की क्षमता शामिल थी।
तांबे में एक उच्च तापीय चालकता (398 W / mK; जहां W वाट में गर्मी है, m मीटर में क्षेत्र है, K केल्विन में तापमान है) स्टेनलेस स्टील, एल्यूमीनियम, या पीतल की तुलना में क्रमशः 16 W / mK, 225 W / mK, और 109 W / mK है। उच्च-तापीय चालकता धातु की छड़ें कम-तापीय चालकता छड़ों की तुलना में त्वचा के ऊतकों में गर्मी ऊर्जा को तेजी से नष्ट कर देंगी और जोखिम की समान अवधि के भीतर जलने के गहरे स्तर को प्रेरित करेंगी। इसके अतिरिक्त, रॉड का आकार और वजन चूहों 7,26,27 में बर्न मॉडल से ऑलोमेट्रिक रूप से स्केल किया गया था और लगभग 20% टीबीएसए जलने को प्रेरित करता है। एक 1.9 सेमी व्यास की रॉड (चार अनुप्रयोगों के बाद एक माउस में कुल जलने का क्षेत्रफल 11.3 सेमी2 है) को 5.4 सेमी व्यास (चार अनुप्रयोगों के बाद एक चूहे में कुल जलने का क्षेत्र 91.6 सेमी2 है) तक बढ़ाया गया था ताकि चूहे में समान ~ 20% -30% टीबीएसए बर्न को प्रेरित किया जा सके (220 ग्राम चूहे का टीबीएसए 356.0 सेमी2)28 है, यह देखते हुए कि चूहे का टीबीएसए माउस की तुलना में 6 गुना बड़ा है (20 ग्राम माउस का टीबीएसए 61.2 सेमी2)29 है। परिणाम स्पष्ट रूप से प्रदर्शित करते हैं कि इस विधि ने पूर्ण मोटाई जलने को प्रेरित किया, और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण ने जलने के बाद अलग-अलग समय बिंदुओं पर सामान्य और जली हुई त्वचा के ऊतकों के बीच उत्कृष्ट अंतर का संकेत दिया (चित्रा 3)। यह मॉडल प्रतिरक्षा दमन को पकड़ने में भी सक्षम था, जो जलने की चोट30,31 (तालिका 1) के बाद रोगियों में देखा जाता है।
बैक्टीरियल संक्रमण एक महत्वपूर्ण खतरा है जो जले हुए रोगियों की उपचार प्रक्रिया से समझौता करता है और अक्सर जलने की चोटों के बाद रुग्णता और मृत्यु दर का प्रमुख कारण होता है। इसी तरह की स्थितियों का अनुकरण करने के लिए, चूहे को पी. एरुगिनोसा या एस. ऑरियस के साथ जलने की चोट के बाद संक्रमित किया गया था। प्रारंभ में, हमने बैक्टीरिया के सामयिक अनुप्रयोग की कोशिश की, लेकिन जलने की सतह की मोमी उपस्थिति ने बैक्टीरिया इनोकुलम के अवशोषण को रोक दिया। यह मॉडल जलने की जगह के जीवाणु संक्रमण के बाद प्रणालीगत रोग की प्रगति को पुन: उत्पन्न करने में भी सक्षम था जैसा कि फेफड़ों और प्लीहा से बरामद जीवाणु बोझ के साथ देखा गया था (चित्रा 4)। अंत में, हमने पूर्ण मोटाई वाले जलने के लिए एक सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का प्रदर्शन किया है जो मानव जलने की चोटों में देखी गई कई विशेषताओं को प्रदर्शित करता है। यह प्रोटोकॉल संक्रमित जलने के घावों के उपचार के लिए विभिन्न प्रकार के उपन्यास सामयिक चिकित्सीय का अध्ययन करने में सहायता कर सकता है। इस मॉडल का उपयोग विभिन्न घाव ड्रेसिंग के मूल्यांकन के लिए लागत प्रभावी मॉडल के रूप में भी किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
लेखक जानवरों के प्रावधान और देखभाल के लिए उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय में तुलनात्मक चिकित्सा विभाग को धन्यवाद देते हैं। हम ऊतक सेक्शनिंग और इमेजिंग सहित हिस्टोपैथोलॉजी / डिजिटल पैथोलॉजी के साथ विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए पैथोलॉजी सर्विसेज कोर में लॉरेन राल्फ और मिया इवेंजेलिस्टा को धन्यवाद देते हैं। इस शोध को रक्षा विभाग (पुरस्कार संख्या W81XWH-20-1-0500, GR और TV) से एक शोध अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD, USA | 309597 | Used to inject the analgesic |
| 1.7 mL Microtube | Olympus, USA | 24-282 | Used to carry morphine |
| 10% NBF | VWR, USA | 16004-115 | Used to fix the skin piece for staining |
| 30 mL syringe | BD, USA | 302832 | Used to inject the lactate ringer solution |
| 70% ethyl alcohol | Fischer Scientific, USA | BP28184 | |
| Aperio AT2 Digital Pathology Slide Scanner with ImageScope software | Aperio, Technologies Inc., Vista, CA, USA | n/a | Scanning of H & E slides and analysis |
| Cetrimide agar plates | BD, USA | 285420 | Selective media plates for Pseudomonas aeruginosa growth |
| Copper rods | n/a | n/a | Used to induce the burn injury |
| Cotton tipped applicators | OMEGA Surgical supply, USA | 4225-IMC | Used to apply eye ointment |
| Electric shaver | Oster, USA | Golden A5 | Used to remove the dorsal side hairs |
| Eye lube | Dechra, UK | n/a | The eye wetting agent to provide long lasting comfort and avoid eye dryness |
| Fluff filled underpads | Medline, USA | MSC281225 | Used in the burn procedure |
| Forcep | F.S.T. | 11027-12 | Used to hold the skin piece |
| Gauze sponges | Oasis, USA | PK412 | Used to clean the applied nair cream from the dorsal side |
| Heat-resistant gloves | n/a | n/a | Used to hold the heated copper rods |
| Hematology Analyzer | IDEXX laboratories, USA | ProCyte Dx | |
| Induction chamber | Kent Scientific, USA | vetFlo-0730 | Used to anesthesize the animals |
| Insulin syringe | BD, USA | 329461 | |
| Isoflurane | Pivetal, USA | NDC46066-755-04 | Used to anesthesized rats to induce a loss of consciousness |
| Isoflurane vaporiser | n/a | n/a | |
| Lactated ringer's solution | icumedical, USA | NDC0990-7953-09 | Used to resuscitate the rats |
| L-shaped spreader | Fischer Scientific, USA | 14-665-230 | |
| Mannitol Agar | BD, USA | 211407 | Selective media plates for Staphylococcus aureus growth |
| Minicollect tubes (K2EDTA) | greiner bio-one, USA | 450480 | Used to collect the blood |
| Morphine | Mallinckrodt, UK | NDC0406-8003-30 | This analgesia was used to induce the inability to feel burn injury pain |
| Muller Hinton Broth | BD, USA | 275730 | |
| Muller Hinton II Agar | BD, USA | 211438 | |
| Nair hair removal lotion | Nair, USA | n/a | Used to remove the residual hairs on dorsal side |
| Needle 23 G | BD, USA | 305193 | Used to inject the lactate ringer solution |
| Normal saline | n/a | n/a | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific, USA | Genesys 30 | |
| Sprague-Dawley rats, male and female | Charles River Labs | n/a | 7-9 weeks old for burn induction |
| Surgical Scissor | F.S.T. | 14501-14 | Used to cut the desired skin piece |
| Tissue collection tubes | Globe Scientific | 220101236 | |
| Tissue Homogenizer | Kinematica, Inc, USA | POLYTRON PT2100 | Used to homogenize the tissue samples |
| Water bath | Fischer Scientific, USA | n/a | Used to induce the burn injury |
| Weighted heating pad | Comfytemp, USA | n/a | Used during the procedure to keep rat's body warm |
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