Summary
噬菌体在细菌细胞之间移动DNA的能力使其成为细菌宿主遗传操作的有效工具。这里介绍的是一种诱导、恢复和使用 φBB-1( 伯氏疏螺旋体噬菌体)在莱姆病螺旋体的不同菌株之间转导异源 DNA 的方法。
Abstract
将外源DNA引入伯氏螺旋体伯 氏疏螺旋 体几乎完全通过使用电穿孔的转化来完成。与其他特征更好的革兰氏阴性细菌相比,这一过程在莱姆病螺旋体中的效率显着降低。 转化的成功率高度依赖于来自特定背景的高质量DNA的浓缩量,并且受到显着的菌株间变异性的影响。将外源DNA(即穿梭载体、荧光报告基因和抗生素耐药性标记物)引入 伯氏螺旋体 的替代方法可能是莱姆病螺旋体遗传操作有用工具的重要补充。噬菌体已被公认为DNA在称为转导过程中在细菌之间移动的天然机制。在这项研究中,已经开发出一种使用无处不在的疏螺旋体噬菌体φBB-1在相同和不同遗传背景的 伯氏疏螺旋体 细胞之间转导DNA的方法。转导的DNA包括小穿梭载体形式的疏螺旋体DNA和异源DNA。这一证明表明,噬菌体介导的转导作为电穿孔的补充,用于莱姆病螺旋体的遗传操作。本报告描述了从 伯氏疏螺旋体中诱导和纯化噬菌体φBB-1的方法,该噬菌体在转导测定中的应用,以及潜在转导剂的选择和筛选。
Introduction
螺旋体细菌伯氏疏螺旋体遗传操作工具的开发为理解莱姆病的性质增加了不可估量的价值1,2,3,4。伯氏双歧杆菌具有异常复杂的基因组,由一条小的线性染色体以及线性和环状质粒5,6组成。自发质粒丢失、基因内重排(基因在同一生物体内从一个质粒移动到另一个质粒)和水平基因转移(HGT,两个生物体之间的DNA移动)在伯氏双歧杆菌中引起了令人眼花缭乱的遗传异质性(例如,参见Schutzer等人7)。由此产生的基因型(或“菌株”)都是同一物种的成员,但具有遗传差异,影响它们传播和感染不同哺乳动物宿主的能力8,9,10,11。在本报告中,术语“菌株”将用于指具有特定自然来源遗传背景的伯氏双歧杆菌;术语“克隆”将用于指为特定目的或作为实验操作结果而进行基因改造的菌株。
可用于伯氏芽孢杆菌的分子工具箱包括可选标记、基因报告基因、穿梭载体、转座子诱变、诱导启动子和反选择性标记(有关综述,请参阅Drektrah和Samuels12)。这些方法的有效使用需要人工将异源(外来)DNA引入感兴趣的伯氏疏螺旋体菌株中。在伯氏疏螺旋体中,异源DNA的引入几乎完全是通过电穿孔实现的,电穿孔是一种利用电脉冲使细菌膜瞬时渗透到引入培养基中的小块DNA的方法1。大多数细胞(估计为≥99.5%)被脉冲杀死,但其余细胞保留异源DNA的频率很高13。虽然被认为是将DNA引入细菌的最高效方法之一,但电穿孔到伯氏疏螺旋体的频率非常低(范围从5×104到5×106细胞中的1个转化体)13。实现更高频率转变的障碍似乎是技术和生物方面的。在制备电感受态细胞时,伯氏疏螺旋体成功电穿孔的技术障碍包括所需的 DNA 量 (>10 μg) 和螺旋体在制备电感受态细胞时完全处于正确的生长期(对数中期,在 2 × 10 7 个细胞·mL−1 和 7 × 107 个细胞·mL−1 之间)的要求12,13。然而,这些技术障碍可能比生物障碍更容易克服。
莱姆病研究人员认识到,伯氏疏螺旋体克隆可分为两大类,就其遗传操纵能力而言13,14。高传代、实验室适应的分离株通常很容易转化,但通常已经失去了感染性所必需的质粒,行为异常,并且无法感染哺乳动物宿主或持续存在于蜱载体12,13 中。虽然这些克隆对于在实验室内剖析螺旋体的分子生物学很有用,但它们对于在地方性动物病循环的生物学背景下研究螺旋体几乎没有价值。另一方面,低传代感染分离株以反映感染状态的生理方式表现,可以完成感染周期,但通常难以引入异源DNA,因此难以操作用于研究12,13。转化低传代分离株的困难至少与两个不同的因素有关:(i)低传代分离株通常紧密聚集在一起,特别是在电穿孔所需的高密度条件下,从而阻止许多细胞充分应用电荷或获取培养基中的DNA13,15;(ii)伯氏双歧杆菌编码至少两种不同的质粒携带的限制性限制性修饰(R-M)系统,这些系统可能在高传代分离株14,16中丢失。R-M系统已经进化到允许细菌识别和消除外来DNA17。事实上,对伯氏芽孢杆菌的几项研究表明,当DNA的来源是伯氏疏螺旋体而不是大肠杆菌时,转化效率会提高13,16。不幸的是,从伯氏疏螺旋体获得电穿孔所需的高浓度DNA是一个昂贵且耗时的前景。电泳和选择低传代分离物时的另一个潜在问题是,该过程似乎有利于失去关键毒力相关质粒lp2514,18,19的转化体;因此,通过电穿孔对低传代伯氏疏螺旋体分离株进行遗传操作的行为可能会选择不适合在地方性动物病循环20中进行生物学相关分析的克隆。鉴于这些问题,一个可以将异源DNA电转化为高传代伯氏疏螺旋体克隆,然后通过电穿孔以外的方法转移到低传代感染性分离株中的系统可能是可用于莱姆病螺旋体的越来越多的分子工具集合的受欢迎的补充。
除了转化(裸DNA的摄取)之外,细菌还定期吸收异源DNA的另外两种机制:偶联,这是细菌之间直接物理接触的DNA交换,以及转导,这是由噬菌体介导的DNA交换21。事实上,噬菌体介导HGT的能力已被用作解剖许多细菌系统内分子过程的实验工具22,23,24。B. burgdorferi不能天然地摄取裸DNA的能力,并且几乎没有证据表明B. burgdorferi编码促进成功偶联所需的装置。 然而,以前的报告已经描述了φBB-1的鉴定和初步表征,φBB-1是B. burgdorferi25,26,27,28的温带噬菌体。φBB-1 包装了在伯氏疏螺旋体25 中发现的 30 kb 质粒家族;该家族的成员被指定为CP32。与φBB-1在伯氏疏螺旋体中参与HGT的作用一致,Stevenson等人报告了在两种菌株中发现的相同的cp32,在其他方面不同的cp32s中,表明最近在这两种菌株之间共享该cp32,可能是通过转导29。还有证据表明,在其他相对稳定的基因组30,31,32,33中,cp32s通过HGT进行了显着重组。最后,φBB-1在同一菌株的细胞之间以及两种不同菌株的细胞之间转导cp32s和异源穿梭载体DNA的能力已在先前证明27,28。鉴于这些发现,φBB-1已被提议作为另一种用于解剖伯氏疏螺旋体分子生物学的工具。
本报告的目的是详细介绍一种从 伯氏疏螺旋体中诱导和纯化噬菌体φBB-1的方法,并提供一种在 伯氏疏螺旋体 克隆之间进行转导测定以及选择和筛选潜在转导剂的方案。
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Protocol
所有使用重组DNA和BSL-2生物体的实验都经过昆尼皮亚克大学机构生物安全委员会的审查和批准。
1. 伯氏芽孢杆菌 培养物的制备,用于生产φBB-1
- 准备补充有 6.6% 热灭活正常兔血清 (BSK) 的巴伯-斯托纳-凯利培养基15。对于 1 L 的 1x BSK,将表 1 中列出的组分混合在 900 mL 水中,使用 1 N 氢氧化钠将 pH 调节至 7.6,并在 4 °C 下缓慢混合 2-4 小时。混合完成后,如有必要,检查并重新调节pH值至7.6,并用水将体积增加到1L。通过0.22μM过滤器(见 材料表)对培养基进行灭菌,并使用新鲜的或在4°C下储存≤2个月。
- 在开始转导方案前三到五天,将 150 μL 适当的 伯氏疏螺旋体 克隆接种到 15 mL 的 1x BSK 中,放入密闭的无菌锥形离心管中(参见 材料表)。用适当浓度的抗生素或抗生素组合补充培养基,以选择和维持 伯氏疏螺旋体 克隆内的异源DNA(表2)。
注意:伯氏疏螺旋体是一种生物安全2级生物。在使用这种生物体时采取一切适当的预防措施。在经过认证和适当消毒的II类生物安全柜中对伯氏疏螺旋体的活培养物进行所有工作。根据CDC指南34正确处理与伯氏疏螺旋体接触的所有物质和生物体本身。 - 将培养物在33°C下孵育而不摇动,直到培养物达到≥5×107 螺旋体·mL−1的密度,大约需要3-5天。
2. 确定 伯氏双歧杆菌 培养物的密度(由塞缪尔斯改性)15
- 对于预期密度高于 5 × 106 个细胞·mL−1,使用光谱法确定细胞密度。
- 将 1 mL 培养物转移到 1.7 mL 微量离心管中,并在室温下以 8,000 x g 离心 5 分钟。
- 弃去上清液并将细胞沉淀重悬于1mL磷酸盐缓冲盐水(PBS;137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na 2 HPO 4和1.8mM KH2PO4)中。将整个细胞悬液转移到半微量紫外线透明比色皿中。
- 确定重悬样品在600nm(A600)波长处的光密度。将分光光度计(见 材料表)对PBS进行归零。
- 要计算原始培养物中螺旋体·mL−1 的浓度,请将A600 处的光密度乘以1.4×109。
- 对于预计在 5 × 104 细胞·mL−1 和 5 × 106 细胞·mL−1 之间的密度,使用彼得罗夫-豪瑟计数室(见 材料表)确定细胞密度,直接计数螺旋体的数量。该方法也可用于适当稀释后的更高密度。
注意:活螺旋体的可视化需要用暗场聚光镜修改显微镜。- 将 10 μL 样品涂在计数室中,并盖上适当的盖玻片。对于密度高于 1 × 107,将样品稀释在 PBS 中,以每场产生 50-100 个螺旋体。
- 使用暗场显微镜以200x-400x的放大倍率计数细胞。计算所有平面上 25 组 16 个小方块的整个字段。
- 将计数的数量乘以稀释因子(如果有的话)和 5 × 104 得到 原始培养物的细胞·mL−1 。
3. 伯氏疏 螺旋体噬菌体φBB-1的诱导
注意:通过高压灭菌对所有玻璃器皿和塑料器皿进行消毒;通过高压灭菌或通过0.22μM过滤器过滤对所有溶液进行灭菌。以下步骤基于15 mL的体积,但该方法可根据实验的个体需求扩展到更小或更大的体积。
- 对于将产生噬菌体的 伯氏疏螺旋 体培养物(供体),使用步骤 2 中任一方法计算的浓度来确定产生 4 mL 2 × 108 螺旋体·mL−1 所需的起始培养物体积。这将在恢复阶段(下面的步骤3.6)在15 mL中产生5×107 个螺旋体·mL−1 的最终浓度。
- 将步骤3.1中计算的培养物体积以6,000× g 离心10分钟。倒出上清液并将沉淀重悬于4 mL新鲜BSK中。 将样品转移到最小的无菌管中,以最小的顶部空间容纳样品。
- 根据4mL的培养体积,将适量的诱导剂加入至推荐浓度(表3),以诱导噬菌体的产生。盖紧管子并充分混合。
- 将样品在33°C孵育2-4小时。
- 孵育后,将样品转移到 15 mL 离心管中。将样品以6,000× g 离心10分钟。倒出上清液。
- 将细胞沉淀重悬于 15 mL 的 1x BSK 中。
注意:诱导噬菌体后,有两种不同的方法可以进行转导测定。这些方法如图 1 以及步骤 4 和步骤 6 所示。
4.供体暴露于诱导剂后共培养期间的转导(图1A)
注意:仅当噬菌体生产菌株(供体)对特定抗生素具有抗性并且要转导的菌株(受体)对另一种抗生素具有耐药性时,才能使用此协议。
- 制备伯 氏疏螺旋 体培养物,用作转导测定中的受体,如上述步骤1中供体菌株所述。根据步骤 2 中确定的密度,计算产生 1 × 107 螺旋体·mL−1 的 15 mL 所需的体积。
- 将步骤4.1中计算的培养物体积以6,000× g 离心10分钟。倒出上清液。
- 将沉淀重悬于步骤3.6(重悬噬菌体供体)中的1mL培养物中。将重新悬浮的接受者与捐赠者一起重新添加到文化中。不要补充抗生素。含有两种培养物的总体积为 15 mL。
- 在33°C孵育72-96小时。
- 如步骤7所述,在共培养后通过固相电镀进行转导剂的选择。
5. 聚乙二醇(PEG)沉淀以回收噬菌体用于转导测定
注意:该方案可用于噬菌体生产菌株(供体)对特定抗生素具有抗性并且要转导的菌株(受体)没有抗生素耐药性或对另一种抗生素具有耐药性的情况。
- 用 表2所示浓度的适当抗生素补充步骤3.6中的培养物。将样品在33°C孵育72-96小时。
- 准备PEG沉淀溶液。
- 准备 500 mL 的 5 M 氯化钠。使用前通过高压灭菌并冷却。在室温下储存。
- 通过将 200 g PEG8000 溶解在 400 mL 水中来制备 500 mL 的 40% PEG;搅拌时轻轻加热,直到溶液充分混合。用水使体积达到 500 mL。要完全溶解PEG8000并对溶液进行灭菌,请在使用前对溶液进行高压灭菌并冷却。在室温下储存。
- 准备 100 mL 悬浮培养基(SM;100 mM 氯化钠、10 mM MgSO4 和 50 mM Tris-HCl [pH 7.5])。通过高压灭菌灭菌。储存在4°C。
- 对于来自 供体B. burgdorferi 克隆的噬菌体的PEG沉淀(来自步骤3.6),孵育72-96小时后,将样品在4°C下以8,000× g 离心20分钟。
- 将上清液倒入干净的 50 mL 锥形管中;处理细胞沉淀。加入5M NaCl至终浓度为1 M.充分混合。在室温下轻轻摇摆1小时。
- 将样品在4°C下以8,000× g 离心10分钟。 将上清液倒入干净的 50 mL 锥形管中;颗粒可能很小或不存在。向上清液中加入40%PEG8000溶液至终浓度为10%。搅拌均匀,在冰上放置1小时以上至过夜。
注意:较长的时间似乎与噬菌体回收率显着增加无关。 - 将样品在4°C下以8,000× g 离心20分钟。 弃去上清液并尽可能多地去除多余的液体,而不会损失任何含有噬菌体颗粒的沉淀。
- 将沉淀重悬于最小体积的SM中,使用SM冲洗瓶子的侧面并收集任何潜在的噬菌体颗粒。推荐的比例为每 10 mL 原始上清液 400 μL SM,但根据沉淀的大小,完全重悬可能需要或多或少的 SM。
- 根据重悬液体积,用等体积的氯仿处理回收的噬菌体样品。充分混合样品,然后以8,000× g 离心10分钟。将水性(顶部)层移到干净的管中,避免任何厚界面层。
注意:φBB-1是一种无包膜噬菌体,对氯仿处理不敏感25。完成此步骤是为了进一步破坏任何膜结合结构(即细胞或泡)并杀死任何潜在的细胞污染物。氯仿是一种挥发性有机物,只能在通风良好的通风橱中使用;将含有氯仿的材料作为有机废物丢弃。 - 确定第一次氯仿处理后回收的体积,并再次用等于该体积10%的氯仿处理样品。充分混合并以8,000 x g 离心10分钟。去除水性(顶部)层,小心避免任何界面或有机层。将水层转移到干净的管中。
- 立即使用噬菌体(如步骤6中所述)或储存在4°C。
注意:不建议冷冻φBB-1噬菌体样品。虽然φBB-1在4°C下的稳定性尚未得到严格研究,但样品在回收后在4°C下储存长达1个月已成功用于转导测定。
6. φBB-1 PEG 沉淀后的转导测定(图 1B)
- 准备 伯氏疏螺旋 体培养物以用作转导测定中的受体,如上述步骤1中对供体菌株所述。根据步骤2中确定的密度,计算产生15 mL 1 × 107 螺蜥·mL−1所需的受者培养体积。
- 将步骤6.1中计算的培养物体积以6,000× g 离心10分钟。倒出上清液并将沉淀重悬于 14.5 mL 新鲜 BSK 中。
- 将 ≤500 μL PEG 沉淀的噬菌体样品(来自步骤 5)添加到受体克隆的培养物中。充分混合并在33°C孵育72-96小时。
注意:PEG沉淀期间回收的噬菌体量可以变化,具体取决于许多因素。然而,从 15 mL 诱导 伯氏疏螺旋体 菌株 CA-11.2A 培养物中,500 μL 通常含有 50-1,000 个活噬菌体28。噬菌体回收量≥500 μL对 伯氏疏螺旋体 的生长产生不利影响,可能是由于SM与BSK的比例增加。 - 如步骤7所述,在与PEG沉淀的噬菌体混合后,通过固相电镀进行转导剂的选择。
7. 转导剂的选择
注意:潜在转导剂的固相电镀是使用Samuels首次描述的协议的单层修改进行的。 伯氏疏螺旋体 菌落在琼脂内生长,因此为了通过固相电镀选择转导剂,必须在倒入平板时将样品添加到培养基中。在96孔板中使用稀释法选择转化体的替代方法也已在前面描述35。该技术也可能对转导剂的选择有效,但尚未为此目的进行尝试。
- 根据转导测定和对照中要接种的样品数量,确定选择转导剂所需的板数。
注意:通常,每个样品倒入两个板,一个相当于培养体积的约10%,另一个包括培养物的其余部分。此外,倒入作为阴性对照的平板,以单独测试用作供体和受体的噬菌体制剂和/或亲本克隆在选择期间使用的抗生素存在下不会生长。还建议为至少两个额外的板准备电镀材料。例如,如果要铺板的样品和对照数量为8个,则为10个板准备足够的电镀混合物。 - 如下所述制备电镀溶液。
注意:每个板将为 30 mL,包括 20 mL 用于电镀的 1.5x BSK 和 10 mL 2.1% 琼脂糖(2:1 比例)。这将产生终浓度为1x BSK和0.7%琼脂糖的板。例如,对于 10 个板,准备 300 mL 的总电镀混合物,包括 200 mL 1.5x BSK 和 100 mL 2.1% 琼脂糖。- 按照步骤1.1中对1x BSK的描述,使用 表1中列出的1.5x BSK的每种组分的量制备1 L的1.5x BSK。按照 1x BSK 的说明进行存储。
- 在水中制备2.1%琼脂糖并高压灭菌。使用新鲜的琼脂糖溶液或在室温下储存。如果在室温下储存,请在电镀前松散地盖上盖子微波炉,直到完全熔化。
- 根据整个电镀混合物确定达到适当浓度所需的抗生素体积(表2)。
注意:如果最终电镀液的总体积为 300 mL,请混合 200 mL 的 1.5x BSK 和足够的抗生素,以确保整个 300 mL 具有正确的最终抗生素浓度。如果转导测定中的供体和受体具有不同的抗生素抗性基因,则铺板混合物应包含两种抗生素。如果来自供体的PEG沉淀噬菌体(如步骤5中制备的)编码抗生素耐药性标记物并且受体没有抗生素耐药性标记物,则板混合物应仅包含一种抗生素。
- 根据要倒入的板数,将适量的 1.5x BSK 和抗生素转移到足够大的无菌瓶中,以容纳整个电镀混合物。在56°C的水浴中平衡≥15分钟。
- 在56°C水浴中平衡高压釜或微波中的熔融琼脂糖≥15分钟。
- 平衡后,用1.5x BSK(含抗生素)将测定量的2.1%琼脂糖加入瓶中,并将电镀溶液放回42°C的水浴中10-15分钟。
注意:较高的温度会损坏或杀死螺旋体36。如果使用与上述相同的水浴,请在启动平衡计时器之前将水浴冷却至42-45°C。不要让电镀液在42°C平衡超过20分钟,否则在倒入板时会开始凝固。 - 在平衡过程中,准备要电镀的 伯氏双歧杆菌 样品。将要接种的量转移到无菌的50 mL锥形离心管中(参见 材料表)。
- 如果电镀量小于 1.5 mL(最终 30 mL 板体积的 <5%),则将样品转移到新管中,并在电镀过程中将电镀混合物直接添加到样品中。
- 对于更大的体积,将所需体积的培养物转移到新管中,然后在室温下以6,000× g 离心10分钟。倒出除 100-500 μL 上清液以外的所有上清液,并在电镀前使用剩余的完全重悬沉淀。
- 对于共培养后的对照板,将供体或受体克隆的≥ 10 7 个细胞添加到无菌 50 mL 锥形离心管中。如果体积超过 1.5 mL,请按照步骤 7.6.2 离心并重悬沉淀。如果使用PEG沉淀的噬菌体进行转导测定,则除了受体克隆外,还将100-250μL噬菌体样品加入无菌的50 mL锥形管中进行电镀。
- 电镀液在42-45°C平衡10-15分钟后,将30mL电镀液转移到装有适当样品的管中;立即将电镀混合物和样品分配到标记的板中。对要铺板的每个样品重复使用新鲜移液管。
- 让板凝固15-20分钟,然后将它们置于补充有5%CO2的33°C培养箱中。倒入后至少48小时不要倒置板。
- 根据受体克隆的背景,在孵育10-21天后检查菌落是否出现在选择板上的琼脂糖内。使用无菌棉塞 5.75 硼硅酸盐移液管(参见 材料表)在两种抗生素存在下挑选至少 5-10 个在平板上生长的菌落,并将它们接种到 1.5 mL 的 1x BSK 中与适当的抗生素。
- 如步骤1.3所示,在33°C下培养接种的菌落3-5天,或使用暗场显微镜在200倍放大倍率下达到每场约20-40个螺旋体的密度。
注意:筛选后(参见步骤8),通过将等体积的培养物与60%甘油和40%1x BSK的混合物混合,通过0.22μm过滤器过滤灭菌,可以将螺旋体冷冻以在-80°C下长期储存。
8. 验证潜在的转导剂
注意:在两种抗生素存在的情况下筛选在平板上生长的克隆,以验证它们在预期(受体)背景中是否代表真正的转导剂。这些方法基于聚合酶链反应对特定区域的扩增和潜在测序。在 伯氏疏螺旋体 中进行PCR的详细方案和实践在别处描述(有关最近的示例,请参阅Seshu等人37)。根据所使用的菌株选择用于筛选转导剂的引物。关于如何筛选转导剂的一些建议如下所述。
- 准备 伯氏疏螺旋体 裂解物用于PCR筛选。
注意:以下协议用于从步骤7.9中生长的培养细胞中产生洗涤的 伯氏疏螺旋体裂解物 ,以便通过PCR立即分析DNA。该方法旨在最大限度地减少BSK中潜在抑制剂的干扰,但不建议用于生产用于测序或储存的高质量DNA。为此,请使用方案或试剂盒进行全基因组提取(见 材料表)。强烈建议同时制备来自亲本克隆(供体和受体菌株)的裂解物,以包含在每次分析中。- 将步骤7.10中选择和培养的每种潜在转导剂的500μL转移到干净的微量离心管中。
- 在室温下以8,000× g 离心培养物10分钟。
- 除去上清液并将每个沉淀重悬于500μLTE(10mM Tris Cl,pH 8.0;1mM EDTA,pH 8.0)中。在室温下以8,000× g 离心5分钟。
- 除去上清液并将每个沉淀重悬于 50 μL PCR 质量的水中。将样品煮沸10分钟。让它们短暂冷却,然后在室温下以8,000× g 离心10分钟。
- 对于每个PCR,立即从离心样品顶部使用2μL;避免干扰颗粒。
- 使用PCR筛选编码抗生素耐药性的特定基因的潜在转导剂。用于筛选转导测定中常用的抗生素耐药性标志物的引物参见 表4 。
注意:虽然在我们的经验中很少见,但可能发生用于选择 伯氏疏螺旋体 异源DNA的氨基糖苷类抗生素的自发突变。 - 也使用另一个菌株或克隆标记筛选潜在的转导剂,以确认背景是受体的背景。在这些分析中包括供体和受体亲本克隆。使用基于所用菌株的序列和用于确定菌株完整性的单个实验室方案筛选菌株特异性标记物。
- 如果试图转导成毒力克隆以在蜱载体或哺乳动物宿主中使用或与另一个克隆直接比较,请确定转导剂和亲本克隆的完整质粒含量。这样做是为了确保质粒含量与比较菌株的质粒含量相同,或者存在在地方动物病循环中繁殖所需的遗传元件,如其他地方所述18,19,37,38,39。
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Representative Results
使用噬菌体在更容易转化的 伯氏疏螺旋体 菌株或难以电转化的克隆之间移动DNA,代表了对莱姆病决定因素进行持续分子研究的另一种工具。本文描述的转导测定可以根据需要进行修改,以促进DNA在任何感兴趣的克隆之间的移动,使用一种或两种抗生素来选择潜在的转导剂。高传代菌株CA-11.2A克隆与高传代菌株B31克隆和菌株297的低传代毒力克隆之间的噬菌体DNA和异源 大肠杆菌/伯氏疏螺旋体 穿梭载体的转导先前已被证明28。下面给出的结果证明了噬菌体DNA在两个高传代无毒克隆之间的移动。供体克隆c1673是 伯氏疏螺旋 体菌株CA-11.2A克隆,在噬菌体DNA27,28上编码卡那霉素抗性基因。受体是 伯氏疏螺旋体 B31的克隆,命名为c1706,其在28号染色体上编码庆大霉素耐药标记。转导测定如图 1B所示进行;如协议步骤6所述,将从暴露于5%乙醇的c1673上清液中回收的PEG沉淀噬菌体与c1706混合。
将PEG沉淀从暴露于乙醇的c1673(编码对卡那霉素的抗性)的上清液中回收的约20%的噬菌体与c1706(编码对庆大霉素的耐药性)混合后,将混合物在两种抗生素存在下铺板;能够在卡那霉素和庆大霉素存在下生长的集落形成单位(CFU)表明转导事件(图2)27,28。CFU的数量报告为每个初始受体细胞的转导频率。在这个代表性的实验中,在噬菌体与1×107 受体细胞孵育后回收了大约275个转导剂,每个受体细胞的转导频率为2.75×10-5 CFU。
回收电位转导剂后,对其中10个克隆进行了编码卡那霉素和庆大霉素耐药性的基因的PCR扩增,图 3显示了两个代表性样品。卡那霉素抗性基因可以从供体(c1673)和潜在的转导剂扩增,但不能扩增受体(c1706)。类似地,庆大霉素耐药基因可以从受体(c1706)和潜在的转导剂中扩增,但不能从供体扩增。因此,回收的克隆特异性编码抗生素抗性基因并代表转导事件,而不是自发突变体。
为了证明卡那霉素耐药盒由φBB-1从供体转导到受体中,使用菌株特异性标记物测定转导剂的背景,如前所述28。如果转导剂是通过转导的共培养方法产生的,则这一点尤其重要。简而言之,先前发表的引物28 用于扩增各种疏螺旋体质粒的特定区域,生成可用于鉴定克隆背景的图谱(图4)。CA-11.2A 背景中的 c1673 克隆编码特定的扩增子 4、5 和 6,而具有高通道 B31 背景的 c1706 则不编码。同样,两个转导器缺少扩增子4、5和6;因此,这些克隆具有C1706背景,并从C1673获得了卡那霉素抗性基因。
元件 | 1x BSK (用于培养) (1 L) | 1.5x BSK (用于电镀) (1 L) |
牛血清白蛋白(馏分 V) | 35 克 | 52.5 克 |
10x CMRL-1066 (不含L-谷氨酰胺) | 8 克 | 12 克 |
新吡咯酮 | 4 克 | 6 克 |
叶氏 | 1.6 克 | 2.4 克 |
赫佩斯 | 4.8 克 | 7.2 克 |
葡萄糖 | 4 克 | 6 克 |
柠檬酸钠 | 0.56 克 | 0.84 克 |
丙酮酸钠 | 0.64 克 | 0.96 克 |
N-乙酰氨基葡萄糖 | 0.32 克 | 0.48 克 |
碳酸氢钠 | 1.76 克 | 2.64 克 |
热灭活正常兔血清 (INRS) | 66毫升 | 99毫升 |
表1:BSK用于培养和选择用于转导测定的伯氏疏螺旋体克隆。此处描述的用于培养伯氏疏螺旋体的 1x BSK 和用于固相选择伯氏疏螺旋体克隆的 1.5x BSK 的配方和制备基于 Samuel15。支持伯氏疏螺旋体生长的BSK(或MKP)37,40,41的不同制剂尚未使用转导测定进行测试。
抗生素 | 库存集中度 | Bb培养物的最终浓度 |
卡那霉素 | 100 mg.mL-1 (水中) | 200-400 μ g.mL-1 |
庆大霉素 | 50 mg.mL-1 (水中) | 50 μ g.mL-1 |
链霉素 | 50 mg.mL-1 (水中) | 50 μ g.mL-1 |
红霉素 | 2 mg.mL-1 (乙基乙烷) | 0.06微 g.mL-1 |
表2:用于选择和维持伯氏疏螺旋体异源DNA的潜在抗生素和浓度。该列表基于当前伯氏疏螺旋体42,43,44,45中常用的抗生素耐药性标志物。卡那霉素,庆大霉素和链霉素在水中制备,通过0.22μM过滤器灭菌,并储存在-20°C。 红霉素在95%乙醇中制备并储存在-20°C。 许多实验室报告了卡那霉素在200μg·mL−1浓度下的成功选择;当使用庆大霉素和卡那霉素进行转导测定选择时,使用400 μg·mL−1卡那霉素。aadA 基因赋予链霉素和壮观霉素44 的耐药性。用于选择含有E中aadA基因的构建体。大肠杆菌,使用100μg·mL−1大观霉素。请注意,氨基糖苷类药物(卡那霉素、庆大霉素和链霉素)与莱姆病的治疗没有临床相关性;然而,红霉素在某些情况下临床使用46。尽管据报道伯氏疏螺旋体对这种抗生素的天然耐药性已有47,但迄今为止,该耐药性标志物尚未用于此处报告的转导测定。
诱导剂 | 库存浓度(溶剂) | 样品中的最终浓度 |
乙醇 | 100%(无) | 5% |
丝裂霉素C | 2 mg.mL-1 (水) | 20 μ g.mL-1 |
1-甲基-3-亚硝基硝基胍 | 50 mg.mL-1 (二甲基硅) | 10 μ g.mL-1 |
表3:用于从伯氏疏螺旋体诱导φBB-1的潜在诱导剂和浓度。N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍 (MNNG)、丝裂霉素 C 和乙醇以及甲醇和异丙醇均已被证明可诱导 φBB-1 高于伯氏疏螺旋体菌株 CA.11-2A 的组成水平25,26,28。MNNG是一种可疑的致癌物和环境危害;慎用,溶于可燃溶剂,焚烧处置。丝裂霉素C是一种可疑的致癌物和潜在的环境危害;在化学通风橱下小心使用并妥善处理。虽然已发表的数据表明MNNG是诱导φBB-126的最有效药物,但使用这种化学物质的危害和获取它的困难使其使用变得复杂48,特别是对于学生。乙醇诱导始终优于甲醇或异丙醇28,并且最常用于转导测定。
基因名称或名称 | 抗生素耐药性 | 参考 | 引物名称 | 引物序列(5 ́至3 ́) | |||
来自Tn903的坎· | 卡那霉素 | 42 | 坎 382F | CGGTTGCATTCGATTCCTGT | |||
坎684R | GGCAAGATCCTGGTATCGGT | ||||||
aacC1 | 庆大霉素 | 43 | aacC1 166F | ACCTACTCCCAACATCAGCC | |||
aacC1 497R | TCTTCCCGTATGCCCAACTT | ||||||
aadA | 链霉素 | 44 | aadA 273F | TGTGCACGACGACATTC | |||
aadA 594R | TACTGCGCTGTACCAAATGC |
表4:用于抗生素耐药性标志物转导初步分析的引物。 此处指出的引物用于检测转导测定中常用的抗生素抗性基因。这些引物用于PCR,以下条件重复28个循环:在92°C下变性15秒,引物在56°C下退火15秒,并在72°C下靶DNA延伸30秒。
图1:用于监测噬菌体介导的DNA运动(转导)的转导测定。 转导测定可以使用(A)共培养方法或(B)通过PEG沉淀从培养上清液中回收的噬菌体进行。对于共培养方法(A),将诱导的 伯氏双歧杆菌 克隆(供体)编码由φBB-1转导的DNA上的抗生素抗性基因(绿色圆圈)与非诱导的 伯氏疏螺旋体 克隆(受体)一起培养,该克隆在染色体或其他稳定的遗传元件上编码第二个抗生素抗性基因(红色圆圈)。该方法需要使用两种不同的抗生素耐药性标记(在本例中,编码卡那霉素和庆大霉素耐药性的基因)。为了在转导测定(B)中使用纯化的噬菌体,通过PEG沉淀从诱导供体的上清液中回收的噬菌体颗粒与受体混合。虽然此处显示了使用两种不同的抗生素,但该方法可以仅使用编码在φBB-1噬菌体DNA上的一个抗生素耐药性标记物来执行,如前所述27。孵育后,在两种抗生素存在下通过固相电镀选择转导剂;如果方法 B 仅与在噬菌体DNA上编码的一个抗生素耐药性标记一起使用,则在固相接种过程中仅使用该抗生素进行选择。转导剂将包含抗生素耐药性标记物并具有受体的背景。该图经牛津大学出版社许可转载自Eggers et al.28 。在建模实验中,c1673和c1650代表两个不同的CA-11.2A克隆;c1673携带编码卡那霉素耐药性的φBB-1噬菌体,c1650在非噬菌体位置编码庆大霉素耐药标志物28。 请点击此处查看此图的大图。
图2:转导测定后通过固相板选择的菌落形成单位。 在c1673的噬菌体与c1706混合后,在两种抗生素存在下生长的菌落代表了潜在的转导剂。在包含单个供体和受体克隆或噬菌体制备样品(未显示)的对照板上不应生长菌落。原始样品中生产噬菌体的最小数量可以通过计算CFU的数量并乘以稀释因子来确定。在这种情况下,从供体的15mL培养物中沉淀的20%的噬菌体样品PEG产生了大约275个菌落。因此,通过PEG沉淀回收的生产性噬菌体的原始浓度为103 病毒粒子×≥1.3。 请点击此处查看此图的大图。
图3:两种潜在转导剂赋予卡那霉素耐药性和庆大霉素耐药性的基因的PCR扩增。 使用卡那霉素和庆大霉素抗性基因的引物进行PCR(表4)以筛选来自两个菌落(转导剂1和转导剂2)产生的裂解物。在c1673(供体)和c1706(受体)混合后,将这些菌落选择在含有卡那霉素和庆大霉素的平板上。在1x乙酸三酯-EDTA(TAE)缓冲液中以120 V电泳1%琼脂糖凝胶分离60分钟,并用0.5 μg·mL−1 溴化乙锭染色。这些数字表示以千碱基对为单位的大小标记。 请点击此处查看此图的大图。
图 4:确认转导器的背景。 从c1673,c1706和两个转导剂扩增特定遗传元件的区域,如前所述28,以确认转导剂的背景是受体克隆c1706的背景。选择的区域基于 伯氏疏螺旋体 B316内特定线性或圆形质粒(分别为lp或cp)上的基因序列。1 = BBA60 (lp54), 2 = BBB19 (cp26), 3 = BBE22 (lp25), 4 = BBG13 (lp28-2), 5 = BBI28 (lp28-4), 6 = BBK12 (lp36), 7 = BBS41 (cp32), 8 = fla 基因 (染色体)。在1x TAE缓冲液中以120 V电泳60 min的1%琼脂糖凝胶分离扩增子,并用0.5 μg·mL−1 溴化乙锭染色。这些数字表示以千碱基对为单位的大小标记。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
转导的使用可以代表一种克服至少一些与伯氏疏螺旋体1,4,13,37电转化相关的生物学和技术障碍的方法。在许多系统中,噬菌体可以通过广义或特化的转导在细菌细胞之间移动宿主(非噬菌体)DNA22,23,24,49,50。在专门的转导中,一些宿主基因总是与噬菌体DNA49,50一起包装在噬菌体衣壳中。例如,φBB-1总是包装cp32中源自细菌的部分,因为它们在质粒上与作为噬菌体基因组的cp32部分密不可分。在广义转导中,噬菌体的包装机制被认为附着在同源的非噬菌体序列上,并“意外”包装随机宿主DNA,而不是噬菌体DNA;然后这些DNA片段能够被引入另一个细胞49,50。关于噬菌体在伯氏芽孢杆菌中的广义转导知之甚少;然而,在表征更好的细菌系统中,从细胞释放的噬菌体中多达1%可以含有随机细菌基因而不是噬菌体DNA51。到目前为止,尚未观察到染色体标记在不同的伯氏疏螺旋体克隆之间转导,但先前证明cp32s和小异源穿梭载体都可以通过φBB-1包装和转导表明该噬菌体可以参与特化和广义转导28。因此,提出了在实验室中转导的用例,其中产生染色体突变的电转化仍然在感兴趣的背景下完成;然而,引入穿梭载体用于反式互补或使用报告构建体对电转化顽固的菌株进行表达研究可以通过在更易转化的高传代克隆和不太可转化的菌株之间进行转导来完成。如果未来的研究证明φBB-1也能够包装和移动染色体位点,那么这里描述的方法也可以证明在更容易转化的菌株和难以电转化的菌株之间移动修饰的染色体DNA。cp32样质粒在所有伯氏疏螺旋体菌株和绝大多数其他莱姆病螺旋体52,53中普遍存在;也有证据表明其他疏螺旋体属物种存在同源物,包括蛋黄疏螺旋体、宫本芽孢杆菌和引起回归热54,55,56 的物种。 其他疏螺旋体物种的同系物是否也是噬菌体尚不清楚,但如果是这样,那么转导也可能是这些物种分子解剖的工具,其中一些尚未成功进行基因操作。
这里提出了两种转导DNA的方法:在选择之前将供体和受体克隆共培养(图1A)或从供体中沉淀噬菌体并仅将该噬菌体与受体混合(图1B)。共培养后每个受体细胞的转导事件数高于使用PEG沉淀的噬菌体28,但共培养要求供体和受体携带不同的抗生素耐药性标志物,并且仔细筛选任何潜在转导剂的背景。由于φBB-1噬菌体在疏螺旋体52,53中无处不在,因此理论上有可能,当混合活跃生长的克隆时,抗生素耐药性标记或其他异源DNA可以从受体移动到供体(而不是像预期的那样从供体移动到受体)。在转导测定中使用PEG沉淀的噬菌体消除了这种可能性,因为供体不存在于噬菌体/受体混合物中。此外,如果噬菌体及其基因组内容物同时用于分析(即结构分析、定量、包装材料的鉴定等)和转导,则需要噬菌体的PEG沉淀。尽管有这些优点,但使用PEG沉淀的噬菌体确实有其潜在的缺点;除了不能产生与共培养物一样多的转导剂外,PEG沉淀可能非常耗时,可能导致噬菌体大量损失,并导致样品中含有可能干扰下游应用的污染物57,58。
到目前为止,已经从三种伯氏疏螺旋体菌株中证明了转导:CA-11.2A,一种高传代B31克隆和一种低传代297克隆28。在这三种中,伯氏疏螺旋体菌株CA-11.2A在诱导后产生的噬菌体量最高25,26,28;然而,即使在诱导后,从伯氏疏螺旋体中回收的噬菌体数量仍然比在表征更好的系统中回收的噬菌体低几个数量级,例如大肠杆菌体λ25,28,59。因此,在PEG沉淀后通过共培养或混合噬菌体使用转导时可能出现的一个问题是,即使暴露于诱导剂,从伯氏双歧杆菌释放的噬菌体数量也很少。此外,噬菌体生产中的批次间差异是显着的,即使实验之间的所有条件、培养基成分和方法似乎一致。因此,确定从给定克隆或在给定条件下至少产生最少数量的噬菌体非常重要。确定样品中噬菌体数量的传统测定法需要将少量含有噬菌体的样品与允许的细菌宿主混合,其中噬菌体是裂解的;样品中生产噬菌体颗粒的数量由该背景中发生的裂解事件的数量决定,导致在细菌的草坪上形成斑块60,61。噬菌体的数量报告为斑块形成单位(PFU)61。由于无法在茂密的草坪中生长伯氏疏螺旋体,并且目前对控制φBB-1溶原和裂解复制周期之间切换的机制缺乏了解,因此使用斑块测定法量化诱导后释放的生产性φBB-1的数量受到阻碍。事实上,虽然关于伯氏芽孢杆菌裂解培养物的轶事报道很多,但到目前为止,还没有已发表的研究将整个培养物裂解的观察与噬菌体的产生联系起来。根据经验,给定培养物中只有少数细胞似乎自发产生噬菌体,大概是通过裂解,并且这种产生只能随着暴露于已知的诱导剂25,28,62而适度增加。因此,斑块测定目前无法量化来自伯氏疏螺旋体的φBB-1。
为了量化诱导伯氏 芽孢杆菌后产生的生产噬菌体的数量,可以使用允许的 伯氏疏螺旋 体克隆进行本报告中所述的转导测定,该克隆与噬菌体包装的抗生素不同。该测定产生转导产生的菌落,每个菌落代表一个已确认的噬菌体。因此,样品中噬菌体的最小数量可以报告为CFU而不是PFU。这个数字可能(远远)低于实际产生的噬菌体总数,这是由于通过PEG沉淀(如果使用)回收噬菌体的固有效率低下,噬菌体附着和注射DNA以及 伯氏芽孢杆菌的固相镀。
确定伯氏 芽孢杆菌 培养物上清液中噬菌体DNA总量的一种潜在方法是定量PCR(qPCR),但来自 伯氏疏螺旋体 的cp32 DNA的qPCR方案在文献中没有得到很好的体现,并且qPCR还不是广泛用于此目的的方法。为了定性确定给定样品中至少存在中等水平的噬菌体DNA,可以在提取前的DNase处理后从 伯氏疏螺旋体 培养物的PEG沉淀上清液中提取总DNA;噬菌体DNA将受到完整的噬菌体衣壳25的保护。然后将回收的DNA在琼脂糖凝胶中分离并用DNA染色剂观察;该协议通常产生一个微弱的30 kb条带,代表包装在噬菌体头25内的线性DNA。基于染色的灵敏度和正确大小的噬菌体DNA条带相对于标记物的强度,可以确定回收的总噬菌体的近似数量为25,27。从上清液中回收的总噬菌体DNA水平与转导测定后回收的转导剂数量之间存在很强的正相关关系,这在先前已经证明28。
供体和受体菌株的选择对于成功使用转导作为分子工具至关重要。我们对cp32s作为φBB-1噬菌体的理解由于cp32s在莱姆病螺旋体52,53 中的普遍性以及单个 伯氏疏螺旋体 细胞可以包含这些质粒的多个同源物这一事实而变得复杂。细胞内的所有cp32似乎都包装在噬菌体生产菌株中的噬菌体头内,这些菌体生产菌株已经过检查27。然而,尚不清楚是否所有含有cp32s的 伯氏疏螺旋 体菌株都可以产生噬菌体,应在使用前测试菌株的这种能力。同样,关于允许特定菌株被φBB-1转导的受体一无所知,尽管噬菌体质粒在整个属中的普遍存在表明特定菌株很有可能被转导。从单个 伯氏疏螺旋 体细胞内存在多个cp32质粒中可以推断,似乎不存在任何由现存噬菌体的存在所赋予的噬菌体免疫63 ;菌株CA.11-2A,B31和297已用于转导测定,并且都可以产生并可以通过φBB-127,28转导。虽然以前的报告表明,使用PEG沉淀的噬菌体27只能转导到有限数量的菌株中,但这可能是由于该方法的技术困难,因为迄今为止测试的所有菌株都可以使用共培养方法28成功转导。
在设计使用转导测定的实验时,选择供体菌株的主要考虑因素应该是遗传背景,其通过电穿孔容易转化的能力以及产生噬菌体的能力。尽管尚未对每种菌株的高传代克隆进行详尽的调查,但即使在没有诱导的情况下,菌株CA-11.2A也能在可检测的水平上产生组成型噬菌体。同样,B31的高传代克隆,第一个完全测序的伯氏疏螺旋体菌株5和分子研究中常用的菌株,也组成型产生可检测量的φBB-1,并且通常具有高度可转化性1,4,25,27,37,64.如果研究需要其他菌株,建议首先通过电穿孔引入含有抗生素耐药性标记物的质粒来测试该菌株的高传代克隆的可转化性,然后通过对编码不同抗生素耐药性标志物的允许受体(如CA-11.2A或B31)进行转导测定来评估其转导能力。类似地,为了确保受体菌株或克隆允许转导,可以将产生噬菌体的菌株(例如携带编码对抗生素耐药性的噬菌体的噬菌体的CA-11.2A)与感兴趣的克隆混合以确保转导发生。
关于φBB-1的分子生物学及其在 伯氏双歧杆菌HGT中的作用,特别是当它通过地方性动物病周期时,还有很多事情需要了解。然而,φBB-1在实验室内实验转导噬菌体和异源DNA的能力为 伯氏疏螺旋体 的分子解剖及其在莱姆病发病机制中的作用提供了另一种工具的机会。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者希望感谢Shawna Reed,D. Scott Samuels和Patrick Secor的有益讨论以及Vareeon (Pam) Chonweerawong的技术援助。这项工作得到了生物医学科学系的支持,并为昆尼皮亚克大学健康科学学院的Christian H. Eggers提供了研究资助。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 L filter units (PES, 0.22 µm pore size) | Millipore Sigma | S2GPU10RE | |
12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene) | USA Scientific | 1450-0810 | holds 4 mL with low void volume (for induction) |
15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) | USA Scientific | 5618-8271 | |
1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG) | Millipore Sigma | CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute | |
5.75" Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile) | Thermo Fisher Scientific | 13-678-8A | autoclave prior to use |
50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) | USA Scientific | 1500-1211 | |
Absolute ethanol | |||
Agarose LE | Dot Scientific inc. | AGLE-500 | |
Bacto Neopeptone | Gibco | DF0119-17-9 | |
Bacto TC Yeastolate | Gibco | 255772 | |
Bovine serum albumin (serum replacement grade) | Gemini Bio-Products | 700-104P | |
Chloroform (for molecular biology) | Thermo Fisher Scientific | BP1145-1 | CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood |
CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder) | US Biological | C5900-01 | cell culture grade |
Erythromycin | Research Products International Corp | E57000-25.0 | |
Gentamicin reagent solution | Gibco | 15750-060 | |
Glucose (Dextrose Anhydrous) | Thermo Fisher Scientific | BP350-500 | |
HEPES | Thermo Fisher Scientific | BP310-500 | |
Kanamycin sulfate | Thermo Fisher Scientific | 25389-94-0 | |
Millex-GS (0.22 µM pore size) | Millipore Sigma | SLGSM33SS | to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions |
Mitomycin C | Thermo Fisher Scientific | BP25312 | CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood |
N-acetyl-D-glucosamine | MP Biomedicals, LLC | 100068 | |
Oligonucleotides (primers for PCR) | IDT DNA | ||
OmniPrep (total genomic extraction kit) | G Biosciences | 786-136 | |
Petri Dish (100 mm × 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
Petroff-Hausser counting chamber | Hausser scientific | HS-3900 | |
Petroff-Hausser counting chamber cover glass | Hausser scientific | HS-5051 | |
Polyethylene glycol 8000 (PEG) | Thermo Fisher Scientific | BP233-1 | |
Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS) | Pel-Freez Biologicals | 31119-3 | heat inactivate as per manufacturer's instructions |
Semi-micro UV transparent cuvettes | USA Scientific | 9750-9150 | |
Sodium bicarbonate | Thermo Fisher Scientific | BP328-500 | |
Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
Sodium pyruvate | Millipore Sigma | P8674-25G | |
Spectronic Genesys 5 | Thermo Fisher Scientific | ||
Streptomycin sulfate solution | Millipore Sigma | S6501-50G | |
Trisodium citrate dihydrate | Millipore Sigma | S1804-500G | sodium citrate for BSK |
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