Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

التلاعب الجيني بوساطة العاثيات لمرض لايم Spirochete Borrelia burgdorferi

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64408
Automatic Translation
1
1Department of Biomedical Sciences, Quinnipiac University

Summary

إن قدرة البكتيريا على نقل الحمض النووي بين الخلايا البكتيرية تجعلها أدوات فعالة للتلاعب الجيني بمضيفيها البكتيريين. تظهر هنا منهجية لتحريض واستعادة واستخدام φBB-1 ، وهي بكتيريا من Borrelia burgdorferi ، لتحويل الحمض النووي غير المتجانس بين سلالات مختلفة من مرض لايم spirochete.

Abstract

تم إنجاز إدخال الحمض النووي الأجنبي في اللولبية Borrelia burgdorferi بشكل حصري تقريبا عن طريق التحويل باستخدام التثقيب الكهربائي. هذه العملية لها كفاءة أقل بشكل ملحوظ في مرض لايم spirochete مقارنة بالبكتيريا الأخرى سالبة الجرام ذات الخصائص الأفضل. يعتمد معدل نجاح التحول بشكل كبير على وجود كميات مركزة من الحمض النووي عالي الجودة من خلفيات محددة ويخضع لتباين كبير من سلالة إلى سلالة. يمكن أن تكون الوسائل البديلة لإدخال الحمض النووي الأجنبي (أي ناقلات المكوك ، ومراسلي الفلورسنت ، وعلامات مقاومة المضادات الحيوية) في B. burgdorferi إضافة مهمة إلى تسليح الأدوات المفيدة للتلاعب الجيني لمرض لايم spirochete. تم التعرف على البكتيريا جيدا كآليات طبيعية لحركة الحمض النووي بين البكتيريا في عملية تسمى النقل. في هذه الدراسة ، تم تطوير طريقة لاستخدام العاثية البورلية في كل مكان φBB-1 لتحويل الحمض النووي بين خلايا B. burgdorferi من نفس الخلفيات الجينية والمختلفة. يتضمن الحمض النووي المحول كلا من الحمض النووي المحول والحمض النووي غير المتجانس في شكل نواقل مكوكية صغيرة. يشير هذا العرض التوضيحي إلى استخدام محتمل للنقل بوساطة العاثيات كمكمل للتثقيب الكهربائي للتلاعب الجيني لمرض لايم spirochete. يصف هذا التقرير طرق تحريض وتنقية العاثية φBB-1 من B. burgdorferi ، واستخدام هذه العاثية في مقايسات النقل ، واختيار وفحص المحولات المحتملة.

Introduction

أضاف تطوير أدوات للتلاعب الجيني للبكتيريا اللولبية Borrelia burgdorferi قيمة لا حصر لها لفهم طبيعة مرض لايم1،2،3،4. يحتوي B. burgdorferi على جينوم معقد بشكل غير عادي يتكون من كروموسوم خطي صغير وبلازميدات خطية ودائرية 5,6. أدى فقدان البلازميد التلقائي ، وإعادة الترتيب داخل الجينات (حركة الجينات من بلازميد إلى آخر داخل نفس الكائن الحي) ، ونقل الجينات الأفقي (HGT ، حركة الحمض النووي بين كائنين) إلى ظهور كمية مذهلة من عدم التجانس الجيني بين B. burgdorferi (على سبيل المثال ، انظر Schutzer et al.7). الأنماط الجينية الناتجة (أو "السلالات") كلها أعضاء في نفس النوع ولكن لها اختلافات وراثية تؤثر على قدرتها على الانتقال إلى وإصابة مضيفات الثدييات المختلفة8،9،10،11. وفي هذا التقرير، سيستخدم مصطلح "سلالة" للإشارة إلى B. burgdorferi ذات الخلفية الجينية المشتقة طبيعيا؛ سيتم استخدام مصطلح "استنساخ" للإشارة إلى سلالة تم تعديلها وراثيا لغرض معين أو نتيجة للتلاعب التجريبي.

يتضمن صندوق الأدوات الجزيئية المتاح للاستخدام في B. burgdorferi علامات قابلة للاختيار ، ومراسلين جينيين ، ونواقل مكوكية ، وطفرات transposon ، ومروجين محرضان ، وعلامات قابلة للاختيار المضاد (للمراجعة ، انظر Drektrah and Samuels12). يتطلب الاستخدام الفعال لهذه المنهجيات الإدخال الاصطناعي للحمض النووي غير المتجانس (الأجنبي) في سلالة B. burgdorferi ذات الأهمية. في B. burgdorferi ، يتم إدخال الحمض النووي غير المتجانس بشكل حصري تقريبا عن طريق التثقيب الكهربائي ، وهي طريقة تستخدم نبضة من الكهرباء لجعل الغشاء البكتيري قابلا للنفاذ بشكل عابر لقطع صغيرة من الحمض النووي يتم إدخالها في الوسائط1. يتم قتل غالبية الخلايا (المقدرة ب ≥99.5٪) بواسطة النبض ، لكن الخلايا المتبقية لديها تردد عال للاحتفاظ بالحمض النووي غير المتجانس13. على الرغم من أنها تعتبر من بين أكثر الطرق كفاءة لإدخال الحمض النووي في البكتيريا ، إلا أن تواتر التثقيب الكهربائي في B. burgdorferi منخفض جدا (يتراوح من محول واحد في 5 × 104 إلى 5 × 106 خلايا)13. يبدو أن الحواجز التي تحول دون تحقيق ترددات أعلى للتحويل هي حواجز تقنية وبيولوجية على حد سواء. تشمل العوائق التقنية أمام التثقيب الكهربائي الناجح ل B. burgdorferi كلا من كمية الحمض النووي (>10 ميكروغرام) الضرورية ومتطلبات اللولبيات لتكون في مرحلة النمو الصحيحة تماما (منتصف السجل ، بين 2 × 10 7 خلايا · مل − 1 و 7 × 107 خلايا · مل − 1) عند تحضير الخلايا الكهربائيةالمختصة 12,13. ومع ذلك ، قد يكون التغلب على هذه الحواجز التقنية أسهل من التغلب على الحواجز البيولوجية.

يدرك باحثو مرض لايم أنه يمكن تقسيم استنساخ B. burgdorferi إلى فئتين عريضتين فيما يتعلق بقدرتها على التلاعب بها وراثيا13,14. غالبا ما تتحول العزلات عالية المرور والمتكيفة في المختبر بسهولة ولكنها عادة ما تفقد البلازميدات الضرورية للعدوى ، وتتصرف بطريقة شاذة من الناحية الفسيولوجية ، ولا يمكنها إصابة مضيف الثدييات أو الاستمرار داخل ناقل القراد12,13. في حين أن هذه الحيوانات المستنسخة كانت مفيدة لتشريح البيولوجيا الجزيئية لل spirochete داخل المختبر ، إلا أنها ذات قيمة قليلة لدراسة spirochete في السياق البيولوجي للدورة enzootic. من ناحية أخرى ، تتصرف العزلات المعدية ذات المرور المنخفض بطريقة فسيولوجية تعكس حالة معدية ويمكن أن تكمل الدورة المعدية ولكنها عادة ما تكون متمردة على إدخال الحمض النووي غير المتجانس ، وبالتالي يصعب التلاعب بها للدراسة12,13. ترتبط صعوبة تحويل عزلات الممر المنخفض بعاملين مختلفين على الأقل: (أ) غالبا ما تتجمع العزلات ذات الممر المنخفض بإحكام معا ، لا سيما في ظل الظروف عالية الكثافة المطلوبة للتثقيب الكهربائي ، وبالتالي تمنع العديد من الخلايا من التطبيق الكامل للشحنة الكهربائية أو الوصول إلى الحمض النووي في الوسائط13,15 ؛ و (ii) يشفر B. burgdorferi نظامين مختلفين على الأقل لتعديل التقييد (R-M) اللذين قد يضعان في عزلات الممر العالي14,16. تطورت أنظمة R-M للسماح للبكتيريا بالتعرف على الحمض النوويالأجنبي 17 والقضاء عليه. في الواقع ، أظهرت العديد من الدراسات في B. burgdorferi أن كفاءات التحول تزداد عندما يكون مصدر الحمض النووي هو B. burgdorferi بدلا من Escherichia coli13,16. لسوء الحظ ، فإن الحصول على التركيز العالي المطلوب من الحمض النووي للتثقيب الكهربائي من B. burgdorferi هو احتمال مكلف ويستغرق وقتا طويلا. مصدر قلق محتمل آخر عند التوصيل الكهربائي واختيار العزلات ذات المرور المنخفض هو أن العملية يبدو أنها تفضل المحولات التي فقدت البلازميد المرتبط بالفوعة الحرجة ، lp2514،18،19 ؛ وبالتالي ، فإن فعل التلاعب الجيني بعزلات B. burgdorferi ذات الممر المنخفض عن طريق التثقيب الكهربائي قد يختار الحيوانات المستنسخة غير المناسبة للتحليل ذي الصلة بيولوجيا ضمن الدورة الحيوانية20. بالنظر إلى هذه المشكلات ، فإن النظام الذي يمكن فيه تحويل الحمض النووي غير المتجانس كهربائيا إلى استنساخ B. burgdorferi عالي المرور ثم نقله إلى عزلات معدية منخفضة المرور بطريقة أخرى غير التثقيب الكهربائي يمكن أن يكون إضافة مرحب بها إلى المجموعة المتزايدة من الأدوات الجزيئية المتاحة للاستخدام في مرض لايم spirochete.

بالإضافة إلى التحول (امتصاص الحمض النووي العاري) ، هناك آليتان أخريان تأخذ من خلالهما البكتيريا بانتظام الحمض النووي غير المتجانس: الاقتران ، وهو تبادل الحمض النووي بين البكتيريا في اتصال جسدي مباشر مع بعضها البعض ، والنقل ، وهو تبادل الحمض النووي بوساطة البكتيريا21. في الواقع ، تم استخدام قدرة البكتيريا على التوسط HGT كأداة تجريبية لتشريح العمليات الجزيئية داخل عدد من الأنظمة البكتيرية22،23،24. B. burgdorferi ليست مؤهلة بشكل طبيعي لامتصاص الحمض النووي العاري ، وهناك القليل من الأدلة على أن B. burgdorferi يشفر الجهاز اللازم لتعزيز الاقتران الناجح. ومع ذلك ، فقد وصفت التقارير السابقة التحديد والتوصيف الأولي ل φBB-1 ، وهي بكتيريا معتدلة من B. burgdorferi25،26،27،28. φBB-1 حزم عائلة من 30 كيلو بايت البلازميدات الموجودة داخل B. burgdorferi25 ؛ تم تعيين أفراد هذه العائلة CP32S. تمشيا مع دور φBB-1 في المشاركة في HGT بين سلالات B. burgdorferi ، أبلغ Stevenson et al. عن وجود cp32 متطابق في سلالتين مع cp32s متباينة ، مما يشير إلى مشاركة حديثة لهذا cp32 بين هاتين السلالتين ، على الأرجح عن طريق النقل29. هناك أيضا دليل على إعادة تركيب كبيرة عبر HGT بين cp32s في جينوم مستقر نسبيا30،31،32،33. أخيرا ، تم إثبات قدرة φBB-1 على تحويل كل من cp32s والحمض النووي المتجه للمكوك غير المتجانس بين خلايا نفس السلالة وبين خلايا سلالتين مختلفتين سابقا27,28. بالنظر إلى هذه النتائج ، تم اقتراح φBB-1 كأداة أخرى يتم تطويرها لتشريح البيولوجيا الجزيئية ل B. burgdorferi.

الهدف من هذا التقرير هو تفصيل طريقة لتحفيز وتنقية العاثية φBB-1 من B. burgdorferi ، بالإضافة إلى توفير بروتوكول لإجراء اختبار نقل بين استنساخ B. burgdorferi واختيار وفحص المحولات المحتملة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت مراجعة جميع التجارب التي تستخدم الحمض النووي المؤتلف والكائنات الحية BSL-2 والموافقة عليها من قبل لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية بجامعة كوينيبياك.

1. إعداد ثقافة B. burgdorferi لإنتاج φBB-1

  1. تحضير وسط Barbour-Stoenner-Kelly المكمل بمصل أرنب طبيعي معطل بالحرارة بنسبة 6.6٪ (BSK)15. بالنسبة إلى 1 لتر من 1x BSK ، اجمع المكونات المدرجة في الجدول 1 في 900 مل من الماء ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.6 باستخدام 1 N هيدروكسيد الصوديوم ، واخلطه ببطء عند 4 درجات مئوية لمدة 2-4 ساعات. بعد اكتمال الخلط ، افحص وأعد ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.6 إذا لزم الأمر ، وقم بزيادة الحجم إلى 1 لتر بالماء. تعقيم الوسط عن طريق المرور عبر مرشح 0.22 ميكرومتر (انظر جدول المواد) واستخدامه طازجا أو تخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة ≤2 أشهر.
  2. قبل ثلاثة إلى خمسة أيام من بدء بروتوكول النقل ، قم بتلقيح 150 ميكرولتر من استنساخ (نسخ) B. burgdorferi المناسب إلى 15 مل من 1x BSK في أنابيب طرد مركزي مخروطية معقمة بإحكام (انظر جدول المواد). استكمل الوسط بالتركيز المناسب للمضادات الحيوية أو مجموعة من المضادات الحيوية لاختيار وصيانة الحمض النووي غير المتجانس داخل استنساخ (استنساخات) B. burgdorferi (الجدول 2).
    ملاحظة: B. burgdorferi هو كائن حي من المستوى 2 للسلامة الأحيائية. اتخاذ جميع الاحتياطات المناسبة أثناء العمل مع هذا الكائن الحي. أداء جميع الأعمال مع الثقافات الحية ل B. burgdorferi في خزانة سلامة بيولوجية معتمدة ومطهرة بشكل صحيح من الفئة الثانية. تخلص بشكل صحيح من جميع المواد التي تتصل ب B. burgdorferi والكائنات الحية نفسها بناء على إرشادات CDC34.
  3. احتضان الثقافات عند 33 درجة مئوية دون الاهتزاز حتى تصل الثقافات إلى كثافة ≥5 × 107 spirochetes·mL−1 ، والتي تستغرق حوالي 3-5 أيام.

2. تحديد كثافة ثقافة (ثقافات) B. burgdorferi (معدلة من Samuels)15

  1. بالنسبة للكثافات المتوقع أن تكون أعلى من 5 × 106 خلايا · مل − 1 ، حدد كثافة الخلية باستخدام التحليل الطيفي.
    1. انقل 1 مل من الثقافة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 مل وأجهزة طرد مركزي بسرعة 8000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ؛ 137 mM NaCl ، 2.7 mM KCl ، 10 mM Na 2 HPO 4 ، و 1.8mM KH2PO4). انقل معلق الخلية بالكامل إلى كوفيت شفاف شبه دقيق للأشعة فوق البنفسجية.
    3. أوجد الكثافة البصرية للعينة المعاد تعليقها عند طول موجي مقداره 600 نانومتر (A600). صفر مقياس الطيف الضوئي (انظر جدول المواد) مقابل PBS.
    4. لحساب تركيز اللولبيات · مل − 1 في الثقافة الأصلية ، اضرب الكثافة البصرية عند A600 في 1.4 × 109.
  2. بالنسبة للكثافات المتوقع أن تكون بين 5 × 104 خلايا · مل − 1 و 5 × 106 خلايا · مل − 1 ، حدد كثافة الخلية باستخدام غرفة عد Petroff-Hausser (انظر جدول المواد) لحساب عدد اللولبيات مباشرة. يمكن استخدام هذه الطريقة أيضا للكثافات العالية بعد التخفيف المناسب.
    ملاحظة: يتطلب تصور اللولبيات الحية مجهرا معدلا بمكثف المجال المظلم.
    1. ضع 10 ميكرولتر من العينة على غرفة العد وقم بتغطيتها بغطاء زجاجي مناسب. بالنسبة للكثافات الأعلى من 1 × 107 ، قم بتخفيف العينة في PBS لإنتاج 50-100 spirochetes لكل حقل.
    2. عد الخلايا باستخدام مجهر الحقل المظلم بتكبير 200x-400x. عد الحقل بأكمله المكون من 25 مجموعة من 16 مربعا صغيرا في جميع المستويات.
    3. اضرب العدد المحسوب بعامل التخفيف (إن وجد) و 5 × 104 للحصول على خلايا · مل − 1 من الثقافة الأصلية.

3. تحريض B. بورغدورفيري فاج φBB-1

ملاحظة: تعقيم جميع الأواني الزجاجية والبلاستيكية عن طريق التعقيم ؛ تعقيم جميع الحلول عن طريق التعقيم أو الترشيح من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. يتم تقديم الخطوات أدناه بناء على أحجام 15 مل ، ولكن الطريقة قابلة للتطوير إلى أحجام أصغر أو أكبر اعتمادا على الاحتياجات الفردية للتجربة.

  1. بالنسبة لمزرعة B. burgdorferi التي سيتم إنتاج العاثية منها (المتبرع) ، استخدم التركيز المحسوب بأي من الطريقتين في الخطوة 2 لتحديد حجم ثقافة البداية اللازمة لإنتاج 4 مل من 2 × 108 spirochetes · mL − 1. سينتج عن ذلك تركيز نهائي قدره 5 × 107 spirochetes·mL−1 في 15 مل خلال مرحلة الاسترداد (الخطوة 3.6 أدناه).
  2. أجهزة الطرد المركزي حجم الثقافة المحسوبة في الخطوة 3.1 عند 6000 × جم لمدة 10 دقائق. صب المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 4 مل من BSK الطازج. انقل العينة إلى أصغر أنبوب معقم متاح لحمل العينة بأقل مساحة للرأس.
  3. أضف الكمية المناسبة من العامل المحرض إلى التركيز الموصى به (الجدول 3) بناء على حجم مزرعة يبلغ 4 مل للحث على إنتاج العاثيات. قم بتغطية الأنبوب بإحكام واخلطه جيدا.
  4. احتضان العينة عند 33 درجة مئوية لمدة 2-4 ساعات.
  5. بعد الحضانة ، انقل العينة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي للعينة عند 6000 × جم لمدة 10 دقائق. صب الطاف.
  6. أعد تعليق حبيبات الخلية في 15 مل من 1x BSK.
    ملاحظة: بعد تحريض العاثية ، هناك طريقتان مختلفتان للمضي قدما في فحص النقل. يتم عرض هذه الطرق في الشكل 1 وفي الخطوة 4 والخطوة 6.

4. النقل أثناء الاستزراع المشترك بعد تعرض المتبرع للعامل المحرض (الشكل 1 أ)

ملاحظة: لا يمكن استخدام هذا البروتوكول إلا عندما تكون السلالة المنتجة للعاثيات (المتبرع) مقاومة لمضاد حيوي معين والسلالة المراد تحويلها (المتلقي) لديها مقاومة لمضاد حيوي آخر.

  1. قم بإعداد مزرعة B. burgdorferi لاستخدامها كمتلقي في فحوصات النقل ، كما هو موضح لسلالة المتبرع في الخطوة 1 أعلاه. بناء على الكثافة المحددة كما في الخطوة 2 ، احسب الحجم اللازم لإنتاج 15 مل من 1 × 107 spirochetes·mL−1.
  2. أجهزة الطرد المركزي حجم الثقافة المحسوبة في الخطوة 4.1 عند 6000 × جم لمدة 10 دقائق. صب الطاف.
  3. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من المزرعة من الخطوة 3.6 (المتبرع بالعاثيات المعاد تعليقه). أضف المستلم المعاد تعليقه مرة أخرى إلى الثقافة مع المتبرع. لا تكمل مع المضادات الحيوية. الحجم الكلي الذي يحتوي على كلتا الثقافتين هو 15 مل.
  4. احتضان عند 33 درجة مئوية لمدة 72-96 ساعة.
  5. قم بإجراء اختيار أجهزة نقل الهواء عن طريق الطلاء في الطور الصلب بعد الاستزراع المشترك كما هو موضح في الخطوة 7.

5. ترسيب البولي إيثيلين جلايكول (PEG) لاستعادة العاثية لاستخدامها في مقايسة النقل

ملاحظة: يمكن استخدام هذا البروتوكول في الحالات التي يكون فيها للسلالة المنتجة للعاثيات (المانح) مقاومة لمضاد حيوي معين والسلالة المراد تحويلها (المتلقي) إما ليس لديها مقاومة للمضادات الحيوية أو مقاومة لمضاد حيوي آخر.

  1. استكمل الثقافة من الخطوة 3.6 بالمضاد الحيوي المناسب بالتركيز الموضح في الجدول 2. احتضان العينة عند 33 درجة مئوية لمدة 72-96 ساعة.
  2. إعداد حلول لهطول الأمطار PEG.
    1. تحضير 500 مل من 5 م كلوريد الصوديوم. تعقيم عن طريق التعقيم والسماح لتبرد قبل الاستخدام. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
    2. تحضير 500 مل من 40٪ PEG عن طريق إذابة 200 غرام من PEG8000 في 400 مل من الماء ؛ يسخن برفق مع التحريك حتى يمتزج المحلول جيدا. ارفع الحجم إلى 500 مل بالماء. لإذابة PEG8000 تماما وتعقيم المحلول ، قم بتعقيم المحلول وتبريده قبل الاستخدام. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
    3. قم بإعداد 100 مل من وسط التعليق (SM ؛ 100 mM NaCl ، 10 mM MgSO4 ، و 50 mM Tris-HCl [pH 7.5]). تعقيم عن طريق التعقيم. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  3. بالنسبة لترسيب PEG للعاثية من استنساخ B. burgdorferi المانح (من الخطوة 3.6) ، بعد 72-96 ساعة من الحضانة ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 8000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  4. صب المادة الطافية في أنبوب مخروطي نظيف سعة 50 مل ؛ تخلص من بيليه الخلية. أضف 5 م كلوريد الصوديوم إلى تركيز نهائي قدره 1 م. تخلط جيدا. صخرة بلطف في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  5. أجهزة الطرد المركزي للعينات عند 8000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. صب المادة الطافية في أنبوب مخروطي نظيف سعة 50 مل ؛ قد تكون الحبيبات صغيرة أو غائبة. أضف محلول PEG8000 بنسبة 40٪ إلى المادة الطافية إلى تركيز نهائي بنسبة 10٪. تخلط جيدا وتوضع على الثلج لأكثر من 1 ساعة حتى بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: لا يبدو أن الأوقات الأطول ترتبط بزيادة كبيرة في استعادة العاثيات.
  6. أجهزة الطرد المركزي للعينات عند 8000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من السوائل الزائدة دون فقد أي حبيبات تحتوي على جزيئات العاثية.
  7. أعد تعليق الحبيبات في الحد الأدنى من حجم SM ، باستخدام SM لغسل جانب الزجاجة وجمع أي جزيئات عاثية محتملة. النسبة الموصى بها هي 400 ميكرولتر من SM لكل 10 مل من المادة الطافية الأصلية ، ولكن اعتمادا على حجم الحبيبات ، قد تكون هناك حاجة إلى SM أكثر أو أقل للتعليق الكامل.
  8. عالج عينة العاثية المستردة بحجم متساو من الكلوروفورم بناء على حجم التعليق. امزج العينة جيدا ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 8000 × جم لمدة 10 دقائق. قم بإزالة الطبقة المائية (العلوية) إلى أنبوب نظيف ، وتجنب أي من طبقة الواجهة السميكة.
    ملاحظة: φBB-1 عبارة عن عاثية غير مغلفة وليست عرضة للعلاج بالكلوروفورم25. تتم هذه الخطوة لزيادة تعطيل أي هياكل مرتبطة بالغشاء (أي الخلايا أو الفقاعات) وقتل أي ملوثات خلوية محتملة. الكلوروفورم هو مادة عضوية متطايرة ويجب استخدامه فقط في غطاء دخان جيد التهوية ؛ تخلص من المواد التي تحتوي على الكلوروفورم كنفايات عضوية.
  9. حدد الحجم المستعاد بعد معالجة الكلوروفورم الأولى وعالج العينة مرة أخرى بكمية من الكلوروفورم تساوي 10٪ من هذا الحجم. تخلط جيدا وأجهزة الطرد المركزي في 8000 × غرام لمدة 10 دقائق. قم بإزالة الطبقة المائية (العلوية) ، مع الحرص على تجنب أي من الواجهة أو الطبقة العضوية. نقل الطبقة المائية إلى أنبوب نظيف.
  10. استخدم العاثية على الفور (كما هو موضح في الخطوة 6) أو خزنها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: لا ينصح بتجميد عينات العاثية φBB-1. على الرغم من أن استقرار φBB-1 عند 4 درجات مئوية لم يتم فحصه بدقة ، فقد تم استخدام العينات المخزنة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد بعد الاسترداد بنجاح في فحوصات النقل.

6. مقايسة النقل بعد هطول الأمطار PEG من φBB-1 (الشكل 1B)

  1. قم بإعداد مزارع B. burgdorferi لاستخدامها كمتلقي في فحوصات النقل ، كما هو موضح لسلالة المتبرع في الخطوة 1 أعلاه. بناء على الكثافة المحددة كما في الخطوة 2 ، احسب حجم ثقافة المتلقي اللازمة لإنتاج 15 مل من 1 × 107 spirochetes · mL − 1.
  2. أجهزة الطرد المركزي حجم الثقافة المحسوبة في الخطوة 6.1 عند 6000 × جم لمدة 10 دقائق. صب المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 14.5 مل من BSK الطازج.
  3. أضف ≤500 ميكرولتر من عينة العاثية المترسبة ب PEG (من الخطوة 5) إلى ثقافة استنساخ المتلقي. تخلط جيدا وتحتضن عند 33 درجة مئوية لمدة 72-96 ساعة.
    ملاحظة: يمكن أن تكون كمية العاثيات المستعادة أثناء هطول الأمطار PEG متغيرة ، اعتمادا على عدد من العوامل. ومع ذلك ، من 15 مل من سلالة B. burgdorferi المستحثة CA-11.2A ، يحتوي 500 ميكرولتر عادة على 50-1000 عاثيةقابلة للحياة 28. تؤثر أحجام استعادة العاثيات ≥500 ميكرولتر سلبا على نمو B. burgdorferi ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى زيادة نسبة SM إلى BSK.
  4. قم بإجراء اختيار أجهزة نقل الهواء عن طريق الطلاء بالمرحلة الصلبة بعد الخلط مع العاثية المترسبة ب PEG كما هو موضح في الخطوة 7.

7. اختيار المحولات

ملاحظة: يتم إجراء طلاء الطور الصلب للمحولات المحتملة باستخدام تعديل أحادي الطبقة للبروتوكول الذي وصفه صموئيل15 لأول مرة. تنمو مستعمرات B. burgdorferi داخل أجار ، لذلك لاختيار المحولات عن طريق الطلاء في المرحلة الصلبة ، يجب إضافة العينات إلى الوسائط أثناء سكب الألواح. كما تم وصف طريقة بديلة لاختيار المحولات باستخدام طريقة التخفيف في 96 لوحة بئر سابقا35. قد تكون هذه التقنية فعالة أيضا في اختيار أجهزة التحويل ولكن لم يتم تجربتها بعد لهذا الغرض.

  1. حدد عدد الألواح اللازمة لاختيار أجهزة نقل الهواء بناء على عدد العينات من مقايسات النقل وأدوات التحكم المراد طلاؤها.
    ملاحظة: عادة ، يتم سكب طبقين لكل عينة ، أحدهما يعادل حوالي 10٪ من حجم المستنبت والآخر يتضمن بقية الثقافة. بالإضافة إلى ذلك ، قم بصب الألواح التي تعمل كعناصر تحكم سلبية لاختبار أن إعداد العاثية و / أو استنساخ الوالدين المستخدم كمتبرع ومتلقي لا ينمو في وجود المضاد الحيوي (المضادات الحيوية) المستخدم أثناء الاختيار. يوصى أيضا بإعداد مواد الطلاء لطبقين إضافيين على الأقل. على سبيل المثال ، إذا كان عدد العينات وأدوات التحكم المراد طلاؤها ثمانية ، فقم بإعداد مزيج طلاء كاف ل 10 لوحات.
  2. قم بإعداد حلول للطلاء كما هو موضح أدناه.
    ملاحظة: ستكون كل لوحة 30 مل ، تتكون من 20 مل من 1.5x BSK للطلاء و 10 مل من 2.1٪ أغاروز (نسبة 2: 1). سينتج عن ذلك صفيحة بتركيزات نهائية تبلغ 1x BSK و 0.7٪ أغاروز. على سبيل المثال ، بالنسبة ل 10 ألواح ، قم بإعداد مزيج طلاء إجمالي يبلغ 300 مل ، يتكون من 200 مل من 1.5x BSK و 100 مل من 2.1٪ أغاروز.
    1. قم بإعداد 1 لتر من 1.5x BSK كما هو موضح ل 1x BSK في الخطوة 1.1 باستخدام كميات كل مكون مدرج ل 1.5x BSK في الجدول 1. يخزن كما هو موضح ل 1x BSK.
    2. تحضير 2.1 ٪ agarose في الماء والأوتوكلف. استخدم محلول الأغاروز طازجا أو خزنه في درجة حرارة الغرفة. إذا تم تخزينها في درجة حرارة الغرفة ، في الميكروويف مع الغطاء بشكل غير محكم حتى يذوب تماما قبل الطلاء.
    3. تحديد حجم المضادات الحيوية اللازمة لتحقيق التركيز المناسب (الجدول 2) بناء على مزيج الطلاء بأكمله.
      ملاحظة: إذا كان الحجم الإجمالي لمحلول الطلاء النهائي 300 مل ، فقم بخلط 200 مل من 1.5x BSK ومضاد حيوي كاف للتأكد من أن 300 مل بالكامل تحتوي على تركيز المضادات الحيوية النهائي الصحيح. إذا كان لدى كل من المتبرع والمتلقي في مقايسة النقل جينات مختلفة مقاومة للمضادات الحيوية ، فيجب أن يحتوي مزيج الطلاء على كلا المضادات الحيوية. إذا كانت العاثية المترسبة ب PEG من المتبرع (كما هو موضح في الخطوة 5) تشفر علامة مقاومة للمضادات الحيوية ولم يكن لدى المتلقي أي علامة ، فيجب أن يحتوي مزيج الطلاء على مضاد حيوي واحد فقط.
  3. بناء على عدد الأطباق المراد سكبها ، انقل الكمية المناسبة من 1.5x BSK والمضادات الحيوية إلى زجاجة معقمة كبيرة بما يكفي لاستيعاب مزيج الطلاء بالكامل. التوازن في حمام مائي عند 56 درجة مئوية لمدة ≥15 دقيقة.
  4. قم بموازنة الأغاروز المنصهر من الأوتوكلاف أو الميكروويف في حمام مائي بدرجة حرارة 56 درجة مئوية لمدة ≥15 دقيقة.
  5. بعد التوازن ، أضف الكمية المحددة من 2.1٪ أغاروز إلى الزجاجة مع 1.5x BSK (مع مضاد حيوي) ووضع محلول الطلاء مرة أخرى في حمام مائي عند 42 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة.
    ملاحظة: يمكن أن تؤدي درجات الحرارة المرتفعة إلى إتلاف أو قتل اللولبيات36. في حالة استخدام نفس الحمام المائي المذكور أعلاه ، قم بتبريد الحمام المائي إلى 42-45 درجة مئوية قبل بدء المؤقت للتوازن. لا تدع محلول الطلاء يتوازن عند 42 درجة مئوية لأكثر من 20 دقيقة وإلا سيبدأ في التصلب أثناء صب الألواح.
  6. أثناء التوازن ، قم بإعداد عينات B. burgdorferi المراد طلاؤها. انقل الكمية المراد طلاؤها إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم سعة 50 مل (انظر جدول المواد).
    1. في حالة الطلاء بكمية أقل من 1.5 مل (<5٪ من حجم اللوحة النهائي 30 مل) ، انقل العينة إلى الأنبوب الجديد وأضف مزيج الطلاء مباشرة إلى العينة أثناء الطلاء.
    2. بالنسبة للأحجام الأكبر ، انقل الحجم المطلوب من الثقافة إلى الأنبوب الجديد ثم قم بجهاز طرد مركزي بسرعة 6000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. صب كل ما عدا 100-500 ميكرولتر من المادة الطافية واستخدم الباقي لإعادة تعليق الحبيبات تماما قبل الطلاء.
    3. بالنسبة للوحات التحكم بعد الزراعة المشتركة ، أضف ≥107 خلايا من استنساخ المتبرع أو المتلقي إلى أنابيب طرد مركزي مخروطية معقمة سعة 50 مل. إذا كان الحجم أكثر من 1.5 مل ، قم بالطرد المركزي وإعادة تعليق الحبيبات كما في الخطوة 7.6.2. إذا تم إجراء اختبار نقل باستخدام العاثية المترسبة ب PEG ، بالإضافة إلى استنساخ المتلقي ، أضف 100-250 ميكرولتر من عينة العاثية إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل للطلاء.
  7. بعد توازن محلول الطلاء عند 42-45 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة ، انقل 30 مل من محلول الطلاء إلى أنبوب مع العينة المناسبة ؛ قم على الفور بتوزيع مزيج الطلاء والعينة في لوحة ملصقة. كرر باستخدام ماصة جديدة لكل عينة ليتم طلاؤها.
  8. اترك الألواح تتجمد لمدة 15-20 دقيقة ثم ضعها في حاضنة 33 درجة مئوية مكملة ب 5٪ CO2. لا تقلب الألواح لمدة 48 ساعة على الأقل بعد سكبها.
  9. اعتمادا على خلفية استنساخ المستلم ، تحقق من ظهور المستعمرات داخل الأغاروز على لوحات الاختيار بعد 10-21 يوما من الحضانة. اختر ما لا يقل عن 5-10 مستعمرات تنمو على الطبق في وجود كلا المضادات الحيوية باستخدام 5.75 معقم موصول بالقطن في ماصة البورسليكات (انظر جدول المواد) وقم بتلقيحها إلى 1.5 مل من 1x BSK مع المضادات الحيوية المناسبة.
  10. قم بزراعة المستعمرات الملقحة عند 33 درجة مئوية كما في الخطوة 1.3 لمدة 3-5 أيام أو حتى تصل إلى كثافة تقارب 20-40 لولبية لكل حقل عند تكبير 200x باستخدام مجهر المجال المظلم.
    ملاحظة: بمجرد غربلة (انظر الخطوة 8) ، يمكن تجميد اللولبيات للتخزين طويل الأجل عند -80 درجة مئوية عن طريق خلط حجم متساو من الثقافة مع خليط من 60٪ جلسرين و 40٪ 1x BSK معقم عن طريق الترشيح من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر.

8. التحقق من المحولات المحتملة

ملاحظة: فحص الحيوانات المستنسخة التي تنمو على لوحات في وجود اثنين من المضادات الحيوية للتحقق من أنها تمثل ناقلات حقيقية في الخلفية المتوقعة (المتلقي). تعتمد هذه الطرق على تضخيم مناطق محددة ، وربما تسلسلها ، بواسطة تفاعل البلمرة المتسلسل. تم وصف البروتوكولات والممارسات التفصيلية لأداء تفاعل البوليميراز المتسلسل في B. burgdorferi في مكان آخر (للحصول على مثال حديث ، انظر Seshu et al.37). حدد البادئات المستخدمة لفحص المحولات بناء على السلالات المستخدمة. فيما يلي بعض الاقتراحات حول كيفية التعامل مع فحص أجهزة التحويل.

  1. تحضير محللات B. burgdorferi لفحص PCR.
    ملاحظة: يستخدم البروتوكول التالي لإنتاج محللات B. burgdorferi المغسولة من الخلايا المستزرعة المزروعة كما في الخطوة 7.9 للتحليل الفوري للحمض النووي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل. تم تصميم هذه الطريقة لتقليل تداخل المثبطات المحتملة في BSK ولكن لا ينصح بها لإنتاج حمض نووي عالي الجودة للتسلسل أو التخزين. لهذا الغرض ، استخدم بروتوكولا أو مجموعة لاستخراج الجينوم الكلي (انظر جدول المواد). يوصى بشدة بإعداد المحللات من الحيوانات المستنسخة الأم (سلالات المتبرع والمتلقي) في نفس الوقت لتضمينها في كل تحليل.
    1. نقل 500 ميكرولتر من كل ناقل محتمل تم اختياره واستزراعه كما في الخطوة 7.10 إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف.
    2. قم بالطرد المركزي للثقافات لمدة 10 دقائق عند 8000 × جم في درجة حرارة الغرفة.
    3. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق كل حبيبات في 500 ميكرولتر من TE (10 mM Tris Cl ، درجة الحموضة 8.0 ؛ 1 mM EDTA ، درجة الحموضة 8.0). جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 8000 × جم في درجة حرارة الغرفة.
    4. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق كل حبيبات في 50 ميكرولتر من الماء بجودة تفاعل البوليميراز المتسلسل. اغلي العينات لمدة 10 دقائق. دعها تبرد لفترة وجيزة ، ثم أجهزة الطرد المركزي بسرعة 8000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    5. لكل PCR ، استخدم على الفور 2 ميكرولتر من أعلى عينة الطرد المركزي ؛ تجنب إزعاج الحبيبات.
  2. فحص المحولات المحتملة للجينات المحددة التي تشفر مقاومة المضادات الحيوية باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل. انظر الجدول 4 للاطلاع على البادئات لفحص علامات مقاومة المضادات الحيوية التي يشيع استخدامها في مقايسات النقل.
    ملاحظة: على الرغم من ندرتها في تجربتنا ، يمكن أن تحدث طفرة عفوية في المضادات الحيوية أمينوغليكوزيد المستخدمة لاختيار الحمض النووي غير المتجانس في B. burgdorferi.
  3. قم بفحص المحولات المحتملة أيضا باستخدام سلالة أخرى أو علامة استنساخ للتأكد من أن الخلفية هي خلفية المستلم. قم بتضمين كل من المستنسخ من المتبرع والمتلقي في هذه التحليلات. فحص العلامات الخاصة بالسلالة باستخدام تسلسلات بناء على السلالات المستخدمة والبروتوكولات المختبرية الفردية لتحديد سلامة السلالة.
  4. في حالة محاولة التحويل إلى استنساخ خبيث للاستخدام داخل ناقل القراد أو مضيف الثدييات أو للمقارنة المباشرة مع استنساخ آخر ، حدد محتوى البلازميد الكامل للمحولات واستنساخ الأصل. يتم ذلك لضمان نفس محتوى البلازميد مثل محتوى السلالة المقارنة أو وجود العناصر الوراثية اللازمة للتكاثر داخل الدورة الحيوانية ، كما هو موضح في مكان آخر 18،19،37،38،39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يمثل استخدام البكتيريا لنقل الحمض النووي بين سلالات B. burgdorferi القابلة للتحويل بسهولة أكبر أو الحيوانات المستنسخة المتمردة على التحول الكهربائي أداة أخرى للتحقيق الجزيئي المستمر لمحددات مرض لايم. يمكن تعديل مقايسة النقل الموصوفة هنا حسب الحاجة لتسهيل حركة الحمض النووي بين أي مستنسخات ذات أهمية باستخدام واحد أو اثنين من المضادات الحيوية لاختيار أجهزة نقل القناة المحتملة. تم إثبات نقل كل من الحمض النووي للتنبؤ ونواقل مكوك E. coli / B. burgdorferi غير المتجانسة بين سلالة CA-11.2A عالية المرور وكل من استنساخ سلالة B31 عالية المرور واستنساخ خبيث منخفض المرور من السلالة 297 سابقا28. توضح النتائج المعروضة أدناه حركة الحمض النووي للنبوءة بين نسختين عاليتي المرور وطائرتين. استنساخ المتبرع ، c1673 ، هو استنساخ من سلالة B. burgdorferi CA-11.2A الذي يشفر جين مقاومة الكانامايسين على الحمض النوويللعاثية 27,28. المتلقي هو نسخة من سلالة B. burgdorferi B31 ، المعينة c1706 ، والتي تشفر علامة مقاومة الجنتاميسين على الكروموسوم28. تم إجراء اختبار النقل كما هو موضح في الشكل 1 ب ؛ تم خلط العاثية المترسبة ب PEG المستعادة من المواد الطافية ل c1673 المعرضة للإيثانول بنسبة 5٪ مع c1706 كما هو موضح في الخطوة 6 من البروتوكول.

بعد خلط ما يقرب من 20 ٪ من العاثية المستعادة عن طريق هطول الأمطار PEG من المواد الطافية من c1673 المعرضة للإيثانول (ترميز المقاومة إلى kanamycin) مع c1706 (ترميز المقاومة للجنتاميسين) ، تم طلاء الخليط في وجود كل من المضادات الحيوية. تشير وحدات تشكيل المستعمرات (CFUs) القادرة على النمو في وجود كل من الكانامايسين والجنتاميسين إلى أحداث النقل (الشكل 2)27,28. يتم الإبلاغ عن عدد وحدات CFU كتردد نقل لكل خلية مستلمة أولية. في هذه التجربة التمثيلية ، تم استرداد ما يقرب من 275 من أجهزة نقل الهواء بعد حضانة العاثية مع 1 × 107 خلايا مستلمة ، مما أدى إلى تردد نقل 2.75 × 10−5 CFUs لكل خلية متلقية.

بعد استعادة المحولات المحتملة ، تم إجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل للجينات المشفرة كاناميسين ومقاومة الجنتاميسين على 10 من الحيوانات المستنسخة ، مع عينتين تمثيليتين موضحتين في الشكل 3. يمكن تضخيم جين مقاومة الكانامايسين من المتبرع (c1673) والتحويلات المحتملة ولكن ليس المتلقين (c1706). وبالمثل ، يمكن تضخيم الجين المقاوم للجنتاميسين من المتلقي (c1706) والتحويلات المحتملة ولكن ليس من المتبرع. وبالتالي ، فإن الحيوانات المستنسخة المستعادة تشفر على وجه التحديد كلا من الجينات المقاومة للمضادات الحيوية وتمثل أحداث النقل ، وليس الطفرات التلقائية.

لإثبات أن الكاسيت المقاوم للكاناميسين قد تم تحويله بواسطة φBB-1 من المتبرع إلى المتلقي ، تم تحديد خلفية أجهزة التحويل باستخدام علامات خاصة بالسلالة ، كما هو موضح سابقا28. هذا مهم بشكل خاص إذا تم إنشاء المحولات بواسطة طريقة الاستزراع المشترك للنقل. باختصار ، تم استخدام البادئاتالمنشورة سابقا 28 لتضخيم مناطق معينة من البلازميدات البورلية المختلفة ، مما أدى إلى إنشاء ملف تعريف يمكن استخدامه لتحديد خلفية الاستنساخ (الشكل 4). يقوم استنساخ c1673 في خلفية CA-11.2A بتشفير مضخمات محددة 4 و 5 و 6 ، في حين أن c1706 ، الذي يحتوي على خلفية B31 عالية المرور ، لا يفعل ذلك. وبالمثل ، فإن اثنين من المحتاجين يفتقدان الأمبليكون 4 و 5 و 6 ؛ وبالتالي ، فإن هذه الحيوانات المستنسخة لها خلفية C1706 واكتسبت جين مقاومة الكانامايسين من C1673.

مكون 1x BSK (للزراعة) (1 لتر) 1.5x BSK (للطلاء) (1 لتر)
ألبومين مصل الأبقار (الجزء الخامس) ٣٥ غرام ٥٢,٥ غرام
10x CMRL-1066 (بدون L- الجلوتامين) ٨ غرام ١٢ غرام
نيوبتون 4 غرام 6 غرام
الخميرة 1.6 غ 2.4 غ
هيبس 4.8 غ 7.2 غ
الجلوكوز 4 غرام 6 غرام
سترات الصوديوم 0.56 غ 0.84 غ
بيروفات الصوديوم 0.64 غ 0.96 غ
إن-أسيتيل-الجلوكوزامين 0.32 غ 0.48 غ
بيكربونات الصوديوم 1.76 غ 2.64 غ
مصل الأرانب العادي المعطل بالحرارة (INRS) 66 مل 99 مل

الجدول 1: BSK لزراعة واختيار استنساخ B. burgdorferi لمقايسات النقل. تعتمد صياغة وإعداد 1x BSK لزراعة B. burgdorferi و 1.5x BSK لاختيار المرحلة الصلبة لاستنساخ B. burgdorferi الموصوف هنا على Samuels15. لم يتم بعد اختبار تركيبات مختلفة من BSK (أو MKP) 37،40،41 التي تدعم نمو B. burgdorferi باستخدام مقايسة النقل.

مضاد حيوي تركيز المخزون التركيز النهائي في استزراع Bb
كاناميسين 100 mg.mL-1 (في الماء) 200-400 μ g.mL-1
الجنتاميسين 50 mg.mL-1 (في الماء) 50 μ g.mL-1
الستربتومايسين 50 mg.mL-1 (في الماء) 50 ميكرو g.mL-1
الاريثروميسين 2 mg.mL-1 (في EtOH) 0.06 ميكرو g.mL-1

الجدول 2: المضادات الحيوية والتركيزات المحتملة لاستخدامها في اختيار وصيانة الحمض النووي غير المتجانس في B. burgdorferi. تستند هذه القائمة إلى العلامات الحالية المقاومة للمضادات الحيوية المستخدمة بشكل شائع في Borrelia burgdorferi42،43،44،45. يتم تحضير الكانامايسين والجنتاميسين والستربتومايسين في الماء ، وتعقيمها بالترشيح من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر ، وتخزينها في -20 درجة مئوية. يتم تحضير الاريثروميسين في 95٪ من الإيثانول وتخزينه في -20 درجة مئوية. أبلغت العديد من المختبرات عن الاستخدام الناجح للكاناميسين للاختيار بتركيز 200 ميكروغرام − مل − 1 ؛ عند استخدام كل من الجنتاميسين والكاناميسين للاختيار في فحوصات النقل ، يتم استخدام 400 ميكروغرام · مل − 1 كاناميسين. يمنح جين aadA مقاومة لكل من الستربتومايسين والسبكتينومايسين44. لاختيار التركيبات التي تحتوي على جين aadA في E. يتم استخدام الإشريكية القولونية ، 100 ميكروغرام · مل − 1 سبيكتينومايسين. لاحظ أن الأمينوغليكوزيدات (كاناميسين ، جنتاميسين ، وستربتومايسين) ليست ذات صلة سريريا في علاج مرض لايم. ومع ذلك ، يتم استخدام الاريثروميسين سريريا في حالات معينة46. على الرغم من أنه تم الإبلاغ عن مقاومة طبيعية لهذا المضاد الحيوي في B. burgdorferi 47 ، إلا أن علامة المقاومة هذه لم تستخدم حتى الآن في فحوصات النقل المذكورة هنا.

عامل تحريض تركيز المخزون (مذيب) التركيز النهائي في العينة
ايثانول 100٪ (لا يوجد) 5%
ميتوميسين سي 2 mg.mL-1 (ماء) 20 μ g.mL-1
1-ميثيل-3-نيتروسو-نيتروجوانيدين (MNNG) 50 mg.mL-1 (DMSO) 10 μ g.mL-1

الجدول 3: العوامل والتركيزات المحفزة المحتملة المستخدمة لتحريض φBB-1 من B. burgdorferi. N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) ، ميتوميسين C ، والإيثانول ، وكذلك الميثانول والأيزوبروبانول ، ثبت جميعا أنها تحفز φBB-1 فوق المستويات التأسيسية في سلالة B. burgdorferi CA.11-2A25،26،28. MNNG هو مادة مسرطنة وخطر بيئي مشتبه به. استخدم بحذر ، تذوب في مذيب قابل للاحتراق ، وتحرق للتخلص منها. ميتوميسين C هو مادة مسرطنة مشتبه بها وخطر بيئي محتمل. استخدمه بحذر تحت غطاء دخان كيميائي وتخلص منه بشكل صحيح. بينما تشير البيانات المنشورة إلى أن MNNG هو العامل الأكثر فعالية لتحفيز φBB-126 ، فإن مخاطر العمل مع هذه المادة الكيميائية والصعوبات في الحصول عليها تجعل استخدامها معقدا48 ، خاصة مع الطلاب. الحث مع الإيثانول أفضل باستمرار من الميثانول أو الأيزوبروبانول28 وقد استخدم بشكل شائع في مقايسة النقل.

اسم الجين أو التعيين مقاومة المضادات الحيوية مرجع اسم التمهيدي تسلسل التمهيدي (5 ́ إلى 3 ́)
كانR من Tn903 كاناميسين 42 كان آر 382 إف CGGTTGCATTCGATTCCTGT
كان آر 684R GGCAAGATCCTGGTATCGGT
aacC1 الجنتاميسين 43 aacC1 166F ACCTACTCCCAACATCAGCC
aacC1 497R TCTTCCCGTATGCCCAACTT
آد أ الستربتومايسين 44 aadA 273F TGTGCACGACGACATCATTC
aadA 594R TACTGCGCTGTACCAAATGC

الجدول 4: البادئات المستخدمة في التحليل الأولي لنقل علامات مقاومة المضادات الحيوية. البادئات المشار إليها هنا هي للكشف عن الجينات المقاومة للمضادات الحيوية التي يشيع استخدامها في فحوصات النقل. تستخدم هذه البادئات في تفاعل البوليميراز المتسلسل مع تكرار الحالات التالية لمدة 28 دورة: تمسخ عند 92 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، تلدين التمهيدي عند 56 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، وتمديد الحمض النووي المستهدف عند 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.

Figure 1
الشكل 1: مقايسة التنبيغ لمراقبة الحركة بوساطة العاثيات (نقل) الحمض النووي. يمكن إجراء مقايسة النقل باستخدام إما (A) طريقة الاستزراع المشترك أو (B) العاثية المستعادة من طاف الاستزراع بواسطة ترسيب PEG. بالنسبة لطريقة الاستزراع المشترك (A) ، يتم استنساخ B. burgdorferi المستحث (المتبرع) الذي يشفر جينا مقاوما للمضادات الحيوية على الحمض النووي ليتم تحويله بواسطة φBB-1 (الدائرة الخضراء) مع استنساخ B. burgdorferi غير المستحث (المتلقي) ، والذي يشفر جينا ثانيا مقاوما للمضادات الحيوية على الكروموسوم أو عنصر وراثي مستقر آخر (الدائرة الحمراء). تتطلب هذه الطريقة استخدام علامتين مختلفتين لمقاومة المضادات الحيوية (في هذا المثال ، الجينات التي تشفر مقاومة الكانامايسين والجنتاميسين). لاستخدام العاثية المنقاة في مقايسة النقل (B) ، يتم خلط جزيئات العاثية المستعادة بواسطة ترسيب PEG للطافت من المتبرع المستحث مع المتلقي. بينما يظهر هنا باستخدام اثنين من المضادات الحيوية المختلفة ، يمكن إجراء هذه الطريقة باستخدام علامة مقاومة واحدة فقط للمضادات الحيوية مشفرة على الحمض النووي φBB-1 prophage ، كما هو موضح سابقا27. بعد الحضانة ، يتم اختيار المحولات عن طريق الطلاء في المرحلة الصلبة في وجود كل من المضادات الحيوية. إذا تم استخدام الطريقة B مع علامة مقاومة واحدة فقط للمضادات الحيوية مشفرة على الحمض النووي للعاثية ، الاختيار باستخدام هذا المضاد الحيوي فقط أثناء الطلاء بالمرحلة الصلبة. ستحتوي أجهزة التحويل على كل من علامات مقاومة المضادات الحيوية ولها خلفية المتلقي. أعيد طبع هذا الرقم من Eggers et al.28 بإذن من مطبعة جامعة أكسفورد. في التجربة النموذجية ، يمثل c1673 و c1650 نسختين مختلفتين من CA-11.2A. يحمل c1673 مقاومة الكانامايسين التي تشفر φBB-1 ، ويشفر c1650 علامة مقاومة الجنتاميسين في موقع غير عاثية28. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: وحدات تشكيل المستعمرات المختارة عن طريق الطلاء في الطور الصلب بعد مقايسة النقل. تمثل المستعمرات التي تنمو في وجود كل من المضادات الحيوية بعد خلط العاثية من c1673 مع c1706 ناقلات محتملة. يجب ألا تنمو أي مستعمرات على لوحات تحكم تحتوي على استنساخ المتبرع والمتلقي الفردي أو عينة من إعداد العاثيات (غير معروضة). يمكن تحديد الحد الأدنى لعدد العاثيات المنتجة في العينة الأصلية عن طريق حساب عدد وحدات CFU وضربها في عامل التخفيف. في هذه الحالة ، أنتجت 20٪ من عينة العاثية المترسبة من مزرعة 15 مل من المتبرع ما يقرب من 275 مستعمرة. وبالتالي ، كان التركيز الأصلي للعاثية المنتجة المستعادة من هطول الأمطار PEG هو ≥1.3 × 103 virions. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل للجينات التي تمنح مقاومة الكانامايسين ومقاومة الجنتاميسين من اثنين من أجهزة نقل القنوات المحتملة. تم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات للجينات المقاومة للكاناميسين والجنتاميسين (الجدول 4) لفحص المحللات المتولدة من مستعمرتين (الناقل 1 وناقل الأنبوب 2). تم اختيار هذه المستعمرات على طبق يحتوي على كل من كاناميسين وجنتاميسين بعد خلط c1673 (مانح) و c1706 (مستلم). تم حل الأمبليكون على هلام أغاروز 1٪ كهربائيا لمدة 60 دقيقة عند 120 فولت في 1x Tris-acetate-EDTA (TAE) عازلة وملطخة ببروميد إيثيديوم 0.5 ميكروغرام − 1 . تشير الأرقام إلى علامات الحجم في أزواج كيلوبيس. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: تأكيد خلفية أجهزة تحويل الأقراص. تم تضخيم مناطق عناصر وراثية محددة من c1673 ، c1706 ، واثنين من أجهزة التحويل ، كما هو موضح سابقا28 ، للتأكد من أن خلفية المحولات كانت خلفية استنساخ المتلقي ، c1706. استندت المناطق المختارة إلى تسلسل الجينات على بلازميدات خطية أو دائرية محددة (lp أو cp ، على التوالي) داخل سلالة نوع B. burgdorferi ، B316. 1 = BBA60 (lp54) ، 2 = BBB19 (cp26) ، 3 = BBE22 (lp25) ، 4 = BBG13 (lp28-2) ، 5 = BBI28 (lp28-4) ، 6 = BBK12 (lp36) ، 7 = BBS41 (cp32) ، و 8 = جين fla (كروموسوم). تم حل الأمبليكون على هلام أغاروز 1٪ كهربائيا لمدة 60 دقيقة عند 120 فولت في 1x TAE عازلة وملطخة ب 0.5 ميكروغرام − مل − 1 بروميد الإيثيديوم. تشير الأرقام إلى علامات الحجم في أزواج كيلوبيس. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يمكن أن يمثل استخدام النقل طريقة واحدة للتغلب على الأقل على بعض الحواجز البيولوجية والتقنية المرتبطة بالتحويل الكهربائي ل B. burgdorferi1،4،13،37. في العديد من الأنظمة ، يمكن للبكتيريا نقل الحمض النووي المضيف (غير التكهني) بين الخلايا البكتيرية إما عن طريق النقل المعمم أو المتخصص22،23،24،49،50. في النقل المتخصص ، يتم دائما حزم عدد قليل من الجينات المضيفة داخل قفيصة العاثية جنبا إلى جنب مع الحمض النوويللبروفاج 49,50. على سبيل المثال ، يقوم φBB-1 دائما بحزم تلك الأجزاء من cp32 التي هي بكتيرية في الأصل ، لأنها مرتبطة ارتباطا وثيقا على البلازميد بأجزاء cp32 التي هي جينوم العاثية. في النقل المعمم ، يعتقد أن آلية تغليف البكتيريا تلتصق بتسلسلات متماثلة غير عاثية و "عن طريق الخطأ" حزمة الحمض النووي المضيف العشوائي بدلا من الحمض النووي للعاثية. ثم يمكن إدخال هذه القطع من الحمض النووي في خلية أخرى49,50. لا يعرف سوى القليل عن النقل المعمم بواسطة العاثية في B. burgdorferi. ومع ذلك ، في الأنظمة البكتيرية ذات الخصائص الأفضل ، يمكن أن يحتوي ما يصل إلى 1٪ من البكتيريا المنبعثة من الخلية على جينات بكتيرية عشوائية بدلا من الحمض النووي للعاثية51. حتى الآن ، لم يلاحظ أي علامات كروموسومية يتم تحويلها بين استنساخ B. burgdorferi المختلفة ، ولكن العرض السابق على أن كلا من cp32s ونواقل المكوك الصغيرة غير المتجانسة يمكن تعبئتها وتحويلها بواسطة φBB-1 يشير إلى أن هذه العاثية يمكن أن تشارك في كل من النقل المتخصص والمعمم28. لذلك ، يتم اقتراح حالة استخدام للتحويل في المختبر ، حيث لا يزال يتم إجراء التحويل الكهربائي الذي يولد طفرة كروموسومية في خلفية الاهتمام ؛ ومع ذلك ، فإن إدخال ناقلات المكوك للتكامل في Trans أو لدراسات التعبير باستخدام تركيبات المراسل في سلالات متمردة للتحويل الكهربائي يمكن أن يتم عن طريق النقل بين استنساخ ممر عالي أكثر قابلية للتحويل وسلالات أقل قابلية للتحويل. إذا أظهرت الدراسات المستقبلية قدرة φBB-1 على حزم ونقل مواقع الكروموسومات ، فإن الطرق الموضحة هنا يمكن أن تكون مفيدة أيضا في نقل الحمض النووي الكروموسومي المعدل بين السلالات القابلة للتحويل بسهولة أكبر والسلالات التي يصعب تحويلها كهربائيا. تنتشر البلازميدات الشبيهة ب cp32 بين جميع سلالات B. burgdorferi والغالبية العظمى من أمراض لايم الأخرى spirochetes52,53. هناك أيضا أدلة على وجود متجانسات في أنواع Borrelia الأخرى ، بما في ذلك B. mayonii و B. miyamotoi وتلك التي تسبب الحمى الانتكاسية54،55،56. لم يعرف بعد ما إذا كانت المتماثلات في أنواع Borrelia الأخرى هي أيضا نبوءة ، ولكن إذا كان الأمر كذلك ، فيمكن أن يكون النقل أيضا أداة للتشريح الجزيئي لهذه الأنواع ، والتي لم يتم التلاعب ببعضها وراثيا بنجاح.

تم تقديم طريقتين لتحويل الحمض النووي هنا: الاستزراع المشترك بين المستنسخين من المتبرع والمتلقي معا قبل الاختيار (الشكل 1 أ) أو العاثية المترسبة PEG من المتبرع وخلط تلك العاثية فقط مع المتلقي (الشكل 1 ب). عدد أحداث النقل لكل خلية متلقية أعلى بعد الزراعة المشتركة مما هو عليه باستخدام العاثية28 المترسبة ب PEG ، لكن الثقافة المشتركة تتطلب أن يحمل كل من المتبرع والمتلقي علامات مقاومة مختلفة للمضادات الحيوية وأن يتم فحص خلفية أي مناقلات محتملة بعناية. نظرا لأن نبوءة φBB-1 موجودة في كل مكان بين Borrelia52,53 ، فهناك فرصة نظرية أنه عند خلط الحيوانات المستنسخة التي تنمو بنشاط ، يمكن أن تنتقل علامة مقاومة المضادات الحيوية أو غيرها من الحمض النووي غير المتجانس من المتلقي إلى المتبرع (بدلا من المتبرع إلى المتلقي ، على النحو المنشود). إن استخدام العاثية المترسبة ب PEG في مقايسة النقل يلغي هذا الاحتمال ، لأن المتبرع غير موجود في مزيج العاثية / المتلقي. بالإضافة إلى ذلك ، يلزم ترسيب PEG للعاثية إذا كان سيتم استخدام العاثية ومحتوياتها الجينومية للتحليل (أي التحليل الهيكلي ، والقياس الكمي ، وتحديد المواد المعبأة ، وما إلى ذلك) والنقل. على الرغم من هذه المزايا ، فإن استخدام العاثية المترسبة ب PEG له عيوبه المحتملة. بالإضافة إلى عدم إنتاج العديد من أجهزة نقل الهواء كما هو الحال مع الاستزراع المشترك ، يمكن أن يستغرق هطول الأمطار PEG وقتا طويلا ، وقد يؤدي إلى فقدان كبير للعاثيات ، وينتج عنه عينات تحتوي على ملوثات يمكن أن تتداخل مع تطبيقات المصب57,58.

تم إثبات النقل من ثلاث سلالات B. burgdorferi حتى الآن: CA-11.2A ، استنساخ B31 عالي الممر ، واستنساخ 297 منخفض الممر28. من بين هؤلاء الثلاثة ، تنتج سلالة B. burgdorferi CA-11.2A أكبر كمية من العاثية بعد الحث25،26،28. ومع ذلك ، حتى بعد الحث ، لا يزال عدد العاثيات المستردة من B. burgdorferi أقل من العاثية المستعادة في أنظمة ذات خصائص أفضل ، مثل تلك الموجودة في coliphage λ25،28،59. وبالتالي ، فإن إحدى المشكلات التي قد تنشأ في استخدام النقل إما عن طريق الاستزراع المشترك أو خلط العاثيات بعد هطول الأمطار PEG هي العدد الصغير من البكتيريا التي يتم إطلاقها من B. burgdorferi ، حتى عند تعرضها للعوامل المحرضة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الاختلاف من دفعة إلى أخرى في إنتاج العاثيات مهم ، حتى عندما تبدو جميع الظروف ومكونات الوسائط والأساليب متسقة بين التجارب. لهذا السبب ، من المهم تحديد أن الحد الأدنى على الأقل من العاثيات يتم إنتاجه من استنساخ معين أو في ظل ظروف معينة. تتطلب المقايسات التقليدية لتحديد عدد العاثيات في العينة خلط كمية صغيرة من العينة التي تحتوي على العاثية مع مضيف بكتيري متساهل تكون فيه البكتيريا حلالية. يتم تحديد عدد جزيئات العاثية المنتجة في العينة من خلال عدد الأحداث الليتية التي تحدث في تلك الخلفية ، مما يؤدي إلى تكوين لويحات على حديقة من البكتيريا60,61. تم الإبلاغ عن عدد العاثيات كوحدات تشكيل البلاك (PFUs)61. إن تحديد عدد φBB-1 المنتج الذي تم إطلاقه بعد الحث باستخدام مقايسة البلاك يعوقه عدم القدرة على زراعة Borrelia burgdorferi في حديقة كثيفة ونقص حالي في فهم الآليات التي تتحكم في التبديل بين دورات النسخ المتماثل الليزوجيني و lytic ل φBB-1. في الواقع ، في حين أن التقارير القصصية عن الثقافات المحللة ل B. burgdorferi عديدة ، لم تكن هناك ، حتى الآن ، دراسات منشورة تربط ملاحظة تحلل ثقافة بأكملها بإنتاج العاثية. من التجربة ، يبدو أن عددا صغيرا فقط من الخلايا في ثقافة معينة ينتج العاثية تلقائيا ، على الأرجح عن طريق التحلل ، ولا يمكن زيادة هذا الإنتاج إلا بشكل متواضع مع التعرض للعوامل المحفزة المعروفة25،28،62. وبالتالي ، فإن فحص البلاك غير ممكن حاليا لتحديد φBB-1 من B. burgdorferi.

لتحديد عدد العاثيات المنتجة المنتجة بعد تحريض B. burgdorferi ، يمكن إجراء اختبار النقل كما هو موضح في هذا التقرير باستخدام استنساخ B. burgdorferi المتساهل مع مضاد حيوي مختلف عن ذلك الذي تعبئته البكتيريا. ينتج عن هذا الفحص مستعمرات ناتجة عن النقل ، حيث تمثل كل مستعمرة عاثية مؤكدة. وبالتالي ، يمكن الإبلاغ عن الحد الأدنى لعدد العاثيات في العينة على أنه CFU بدلا من PFU. من المحتمل أن يكون هذا الرقم (بعيدا) أقل من العدد الإجمالي الفعلي للعاثيات المنتجة بسبب أوجه القصور المتأصلة في استعادة العاثية عن طريق ترسيب PEG (إذا تم استخدامها) ، وربط وحقن الحمض النووي بواسطة العاثية ، وطلاء المرحلة الصلبة ل B. burgdorferi.

إحدى الطرق المحتملة لتحديد الكمية الإجمالية للحمض النووي للنبوءات داخل طاف ثقافات B. burgdorferi هي تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) ، لكن بروتوكولات qPCR للحمض النووي cp32 من B. burgdorferi ليست ممثلة بشكل جيد في الأدبيات ، و qPCR ليست بعد منهجية مستخدمة على نطاق واسع لهذا الغرض. لتحديد نوعيا أن هناك على الأقل مستوى معتدل من الحمض النووي للعاثية في عينة معينة ، يمكن استخراج الحمض النووي الكلي من المواد الطافية المترسبة ب PEG لمزارع B. burgdorferi بعد معالجة DNase قبل الاستخراج ؛ سيتم حماية الحمض النووي للعاثية بواسطة قفيصة عاثيةسليمة 25. ثم يتم حل الحمض النووي المستعاد في هلام الأغاروز وتصوره مع صبغة الحمض النووي. ينتج عن هذا البروتوكول عادة نطاق باهت بحجم 30 كيلوبايت يمثل الحمض النووي الخطي المعبأ داخل رأس العاثية25. بناء على حساسية البقعة وشدة نطاق الحمض النووي للعاثية ذات الحجم الصحيح بالنسبة للعلامة ، يمكن تحديد العدد التقريبي لإجمالي العاثية المستردة25,27. تم إثبات وجود ارتباط إيجابي قوي لمستويات الحمض النووي العاثي الكلي المستعاد من المادة الطافية مع عدد أجهزة نقل الهواء المستعادة بعد مقايسة النقل سابقا28.

يعد اختيار سلالات المتبرع والمتلقي أمرا بالغ الأهمية لنجاح استخدام النقل كأداة جزيئية. إن فهمنا ل cp32s باعتباره نبوءة ل φBB-1 معقد بسبب انتشار cp32s في اللولبيات لمرض لايم52,53 وحقيقة أن خلية B. burgdorferi الفردية يمكن أن تحتوي على متجانسات متعددة لهذه البلازميدات. يبدو أن جميع cp32s داخل الخلية يتم تعبئتها داخل رؤوس العاثيات في السلالات المنتجة للعاثيات التي تم فحصها27. ومع ذلك ، ليس من الواضح ما إذا كانت جميع سلالات B. burgdorferi التي تحتوي على cp32s يمكن أن تنتج البكتيريا ، ويجب اختبار السلالات لهذه القدرة قبل الاستخدام. وبالمثل ، لا يعرف شيء عن المستقبلات التي تسمح بتحويل سلالة معينة بواسطة φBB-1 ، على الرغم من أن انتشار بلازميد البروفاج في جميع أنحاء الجنس يشير إلى احتمال كبير لإمكانية تحويل سلالة معينة. كما يمكن استنتاجه من وجود بلازميدات cp32 متعددة داخل خلية B. burgdorferi الفردية ، لا يبدو أن هناك أي مناعة عاثية63 يمنحها وجود نبوءة موجودة. تم استخدام السلالات CA.11-2A و B31 و 297 في فحوصات النقل وكلاهما ينتج ويمكن تحويله بواسطة φBB-127,28. في حين أشارت التقارير السابقة إلى أن النقل كان ممكنا إلى عدد محدود فقط من السلالات باستخدام العاثية27 المترسبة ب PEG ، فقد يكون ذلك بسبب صعوبات تقنية في تلك الطريقة ، حيث أن جميع السلالات التي تم اختبارها حتى الآن كانت قابلة للتحويل بنجاح باستخدام طريقة الاستزراع المشترك28.

عند تصميم تجربة لاستخدام مقايسة النقل ، يجب أن تكون الاعتبارات الرئيسية لاختيار سلالة المتبرع هي الخلفية الجينية ، وقدرتها على التحول بسهولة عن طريق التثقيب الكهربائي ، وقدرتها على إنتاج العاثية. على الرغم من أنه لم يتم إجراء مسح شامل لاستنساخ الممر العالي لكل سلالة ، إلا أن السلالة CA-11.2A تنتج العاثية بشكل أساسي عند مستويات يمكن اكتشافها حتى في حالة عدم وجود تحريض. وبالمثل ، فإن الحيوانات المستنسخة عالية المرور من B31 ، وهي أول سلالة B. burgdorferi يتم تسلسلها بالكامل5 وسلالة شائعة الاستخدام في الدراسات الجزيئية ، تنتج أيضا بشكل أساسي كميات يمكن اكتشافها من φBB-1 وهي بشكل عام قابلة للتحويل بدرجة عالية1،4،25،27،37،64 . إذا كانت التحقيقات تتطلب سلالات أخرى ، فمن المستحسن أن يتم أولا اختبار الحيوانات المستنسخة عالية المرور من تلك السلالة من أجل قابليتها للتحويل عن طريق إدخال بلازميد يحتوي على علامة مقاومة للمضادات الحيوية عن طريق التثقيب الكهربائي ثم تقييم قدرتها على التحويل عن طريق إجراء اختبار نقل مع متلقي متساهل ، مثل CA-11.2A أو B31 ، ترميز علامة مقاومة مختلفة للمضادات الحيوية. وبالمثل ، للتأكد من أن سلالة المتلقي أو الاستنساخ متساهلة للتحويل ، يمكن خلط سلالة منتجة للعاثيات ، مثل CA-11.2A تحمل مقاومة ترميز prophage لمضاد حيوي ، مع استنساخ الاهتمام لضمان حدوث النقل.

لا يزال هناك الكثير مما يجب فهمه حول البيولوجيا الجزيئية ل φBB-1 ودورها في HGT داخل B. burgdorferi ، خاصة أثناء عبورها الدورة الحيوانية. ومع ذلك ، فإن قدرة φBB-1 على تحويل كل من الحمض النووي العاثي وغير المتجانس تجريبيا داخل المختبر ، تقدم فرصة لإضافة أداة أخرى للتشريح الجزيئي ل B. burgdorferi ودورها في التسبب في مرض لايم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلف ما يكشف عنه.

Acknowledgments

يود المؤلف أن يشكر شونا ريد ود. سكوت صامويلز وباتريك سيكور على مناقشتهم المفيدة وفاريون (بام) تشونوييراونغ على مساعدتهم التقنية. تم دعم هذا العمل من قبل قسم العلوم الطبية الحيوية ومنح أبحاث أعضاء هيئة التدريس إلى كريستيان إتش إيجرز من كلية العلوم الصحية بجامعة كوينيبياك.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L filter units (PES, 0.22 µm pore size) Millipore Sigma S2GPU10RE
12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene) USA Scientific 1450-0810 holds 4 mL with low void volume (for induction)
15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) USA Scientific 5618-8271
1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG) Millipore Sigma CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute
5.75" Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile) Thermo Fisher Scientific 13-678-8A autoclave prior to use
50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) USA Scientific 1500-1211
Absolute ethanol
Agarose LE Dot Scientific inc. AGLE-500
Bacto Neopeptone Gibco DF0119-17-9
Bacto TC Yeastolate Gibco 255772
Bovine serum albumin (serum replacement grade) Gemini Bio-Products 700-104P
Chloroform (for molecular biology) Thermo Fisher Scientific BP1145-1 CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood
CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder) US Biological C5900-01 cell culture grade
Erythromycin Research Products International Corp E57000-25.0
Gentamicin reagent solution Gibco 15750-060
Glucose (Dextrose Anhydrous) Thermo Fisher Scientific BP350-500
HEPES Thermo Fisher Scientific BP310-500
Kanamycin sulfate Thermo Fisher Scientific 25389-94-0
Millex-GS (0.22 µM pore size) Millipore Sigma SLGSM33SS to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions
Mitomycin C Thermo Fisher Scientific BP25312 CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood
N-acetyl-D-glucosamine MP Biomedicals, LLC 100068
Oligonucleotides (primers for PCR) IDT DNA
OmniPrep (total genomic extraction kit) G Biosciences 786-136
Petri Dish (100 mm × 15 mm) Thermo Fisher Scientific FB0875712
Petroff-Hausser counting chamber Hausser scientific HS-3900
Petroff-Hausser counting chamber cover glass Hausser scientific HS-5051
Polyethylene glycol 8000 (PEG) Thermo Fisher Scientific BP233-1
Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS) Pel-Freez Biologicals 31119-3 heat inactivate as per manufacturer's instructions
Semi-micro UV transparent cuvettes USA Scientific 9750-9150
Sodium bicarbonate Thermo Fisher Scientific BP328-500
Sodium chloride Thermo Fisher Scientific BP358-1
Sodium pyruvate Millipore Sigma P8674-25G
Spectronic Genesys 5 Thermo Fisher Scientific
Streptomycin sulfate solution Millipore Sigma S6501-50G
Trisodium citrate dihydrate Millipore Sigma S1804-500G sodium citrate for BSK

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. Genetic transformation and complementation. Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).
  2. Winslow, C., Coburn, J. Recent discoveries and advancements in research on the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. F1000Research. 8, F1000 Faculty Rev-763 (2019).
  3. Coburn, J., et al. Lyme disease pathogenesis. Current Issues in Molecular Biology. 42, 473-518 (2021).
  4. Rosa, P. A., Jewett, M. W. Genetic manipulation of Borrelia. Current Issues in Molecular Biology. 42, 307-332 (2021).
  5. Fraser, C. M., et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature. 390 (6660), 580-586 (1997).
  6. Casjens, S., et al. A bacterial genome in flux: The twelve linear and nine circular extrachromosomal DNAs in an infectious isolate of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Molecular Microbiology. 35 (3), 490-516 (2000).
  7. Schutzer, S. E., et al. Whole-genome sequences of thirteen isolates of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 193 (4), 1018-1020 (2011).
  8. Ohnishi, J., Piesman, J., de Silva, A. M. Antigenic and genetic heterogeneity of Borrelia burgdorferi populations transmitted by ticks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (2), 670-675 (2001).
  9. Dykhuizen, D. E., et al. The propensity of different Borrelia burgdorferi sensu stricto genotypes to cause disseminated infections in humans. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 78 (5), 806-810 (2008).
  10. Hanincova, K., et al. Multilocus sequence typing of Borrelia burgdorferi suggests existence of lineages with differential pathogenic properties in humans. PLoS One. 8 (9), 73066 (2013).
  11. Kern, A., et al. Heterogeneity of Borrelia burgdorferi sensu stricto population and its involvement in Borrelia pathogenicity: Study on murine model with specific emphasis on the skin interface. PLoS One. 10 (7), 0133195 (2015).
  12. Drecktrah, D., Samuels, D. S. Genetic manipulation of Borrelia spp. Current Topics in Microbiology and Immunology. 415, 113-140 (2017).
  13. Tilly, K., Elias, A. F., Bono, J. L., Stewart, P., Rosa, P. DNA exchange and insertional inactivation in spirochetes. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 2 (4), 433-442 (2000).
  14. Lawrenz, M. B., Kawabata, H., Purser, J. E., Norris, S. J. Decreased electroporation efficiency in Borrelia burgdorferi containing linear plasmids lp25 and lp56: Impact on transformation of infectious B. burgdorferi. Infection and Immunity. 70 (9), 4798-4804 (2002).
  15. Samuels, D. S. Electrotransformation of the spirochete Borrelia burgdorferi. Methods in Molecular Biology. 47, 253-259 (1995).
  16. Rego, R. O., Bestor, A., Rosa, P. A. Defining the plasmid-borne restriction-modification systems of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 193 (5), 1161-1171 (2011).
  17. Makarova, K. S., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. Comparative genomics of defense systems in archaea and bacteria. Nucleic Acids Research. 41 (8), 4360-4377 (2013).
  18. Grimm, D., Elias, A. F., Tilly, K., Rosa, P. A. Plasmid stability during in vitro propagation of Borrelia burgdorferi assessed at a clonal level. Infection and Immunity. 71 (6), 3138-3145 (2003).
  19. Grimm, D., et al. Experimental assessment of the roles of linear plasmids lp25 and lp28-1 of Borrelia burgdorferi throughout the infectious cycle. Infection and Immunity. 72 (10), 5938-5946 (2004).
  20. Heery, D. M., Powell, R., Gannon, F., Dunican, L. K. Curing of a plasmid from E. coli using high-voltage electroporation. Nucleic Acids Research. 17 (23), 10131 (1989).
  21. Ochman, H., Lawrence, J. G., Groisman, E. A. Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation. Nature. 405 (6784), 299-304 (2000).
  22. Morsczeck, C. Strategies for mycobacterial genetics. International Journal of Medical Microbiology. 293 (4), 251-259 (2003).
  23. Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L. E. coli genome manipulation by P1 transduction. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 1 1-8 (2007).
  24. Keller, C. M., Kendra, C. G., Bruna, R. E., Craft, D., Pontes, M. H. Genetic modification of Sodalis species by DNA transduction. mSphere. 6 (1), e01331 (2021).
  25. Eggers, C. H., Samuels, D. S. Molecular evidence for a new bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 181 (23), 7308-7313 (1999).
  26. Eggers, C. H., et al. Bacteriophages of spirochetes. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 2 (4), 365-373 (2000).
  27. Eggers, C. H., et al. Transduction by φBB-1, a bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 183 (16), 4771-4778 (2001).
  28. Eggers, C. H., et al. Phage-mediated horizontal gene transfer of both prophage and heterologous DNA by φBB-1, a bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Pathogens and Disease. 74 (9), (2016).
  29. Stevenson, B., Miller, J. C. Intra- and interbacterial genetic exchange of Lyme disease spirochete erp genes generates sequence identity amidst diversity. Journal of Molecular Evolution. 57 (3), 309-324 (2003).
  30. Dykhuizen, D. E., Baranton, G. The implications of a low rate of horizontal transfer in Borrelia. Trends in Microbiology. 9 (7), 344-350 (2001).
  31. Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Reviews in Genetics. 46, 515-536 (2012).
  32. Brisson, D., Zhou, W., Jutras, B. L., Casjens, S., Stevenson, B. Distribution of cp32 prophages among Lyme disease-causing spirochetes and natural diversity of their lipoprotein-encoding erp loci. Applied and Environmental Microbiology. 79 (13), 4115-4128 (2013).
  33. Schwartz, I., Margos, G., Casjens, S. R., Qiu, W. G., Eggers, C. H. Multipartite genome of Lyme disease Borrelia: Structure, variation and prophages. Current Issues in Molecular Biology. 42, 409-454 (2021).
  34. Centers for Disease Control and Prevention. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories,. 6th edition. , Centers for National Institutes of Health. Bethesda, Maryland. (2020).
  35. Yang, X. F., Pal, U., Alani, S. M., Fikrig, E., Norgard, M. V. Essential role for OspA/B in the life cycle of the Lyme disease spirochete. Journal of Experimental Medicine. 199 (5), 641-648 (2004).
  36. Lee, S. K., Yousef, A. E., Marth, E. H. Thermal inactivation of Borrelia burgdorferi, the cause of Lyme disease. Journal of Food Protection. 53 (4), 296-299 (1990).
  37. Seshu, J., Moy, B. E., Ingle, T. M. Transformation of Borrelia burgdorferi. Current Protocols. 1 (3), 61 (2021).
  38. Purser, J. E., Norris, S. J. Correlation between plasmid content and infectivity in Borrelia burgdorferi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13865-13870 (2000).
  39. Labandeira-Rey, M., Seshu, J., Skare, J. T. The absence of linear plasmid 25 or 28-1 of Borrelia burgdorferi dramatically alters the kinetics of experimental infection via distinct mechanisms. Infection and Immunity. 71 (8), 4608-4613 (2003).
  40. Ruzic-Sabljic, E., et al. Comparison of MKP and BSK-H media for the cultivation and isolation of Borrelia burgdorferi sensu lato. PLoS One. 12 (2), 0171622 (2017).
  41. Wang, G., et al. Variations in Barbour-Stoenner-Kelly culture medium modulate infectivity and pathogenicity of Borrelia burgdorferi clinical isolates. Infection and Immunity. 72 (11), 6702-6706 (2004).
  42. Bono, J. L., et al. Efficient targeted mutagenesis in Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 182 (9), 2445-2452 (2000).
  43. Elias, A. F., et al. New antibiotic resistance cassettes suitable for genetic studies in Borrelia burgdorferi. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 6 (1), 29-40 (2003).
  44. Frank, K. L., Bundle, S. F., Kresge, M. E., Eggers, C. H., Samuels, D. S. aadA confers streptomycin resistance in Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 185 (22), 6723-6727 (2003).
  45. Sartakova, M. L., et al. Novel antibiotic-resistance markers in pGK12-derived vectors for Borrelia burgdorferi. Gene. 303 (1-2), 131-137 (2003).
  46. Wormser, G. P., et al. The clinical assessment, treatment, and prevention of Lyme disease, human granulocytic anaplasmosis, and babesiosis: Clinical practice guidelines by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 43 (9), 1089-1134 (2006).
  47. Terekhova, D., Sartakova, M. L., Wormser, G. P., Schwartz, I., Cabello, F. C. Erythromycin resistance in Borrelia burgdorferi. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (11), 3637-3640 (2002).
  48. Sorbye, H., Kvinnsland, S., Svanes, K. Penetration of N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine to proliferative cells in gastric mucosa of rats is different in pylorus and fundus and depends on exposure time and solvent. Carcinogenesis. 14 (5), 887-892 (1993).
  49. Muniesa, M., Imamovic, L., Jofre, J. Bacteriophages and genetic mobilization in sewage and faecally polluted environments. Microbial Biotechnology. 4 (6), 725-734 (2011).
  50. Penades, J. R., Chen, J., Quiles-Puchalt, N., Carpena, N., Novick, R. P. Bacteriophage-mediated spread of bacterial virulence genes. Current Opinion in Microbiology. 23, 171-178 (2015).
  51. Thierauf, A., Perez, G., Maloy, A. S. Generalized transduction. Methods in Molecular Biology. 501, 267-286 (2009).
  52. Casjens, S. R., et al. Plasmid diversity and phylogenetic consistency in the Lyme disease agent Borrelia burgdorferi. BMC Genomics. 18 (1), 165 (2017).
  53. Ojaimi, C., et al. Borrelia burgdorferi gene expression profiling with membrane-based arrays. Methods in Enzymology. 358, 165-177 (2002).
  54. Stevenson, B., et al. The relapsing fever spirochete Borrelia hermsii contains multiple, antigen-encoding circular plasmids that are homologous to the cp32 plasmids of Lyme disease spirochetes. Infection and Immunity. 68 (7), 3900-3908 (2000).
  55. Kingry, L. C., et al. Whole genome sequence and comparative genomics of the novel Lyme borreliosis causing pathogen, Borrelia mayonii. PLoS One. 11 (12), 0168994 (2016).
  56. Kuleshov, K. V., et al. Whole genome sequencing of Borrelia miyamotoi isolate Izh-4: Reference for a complex bacterial genome. BMC Genomics. 21 (1), 16 (2020).
  57. Dong, D., Sutaria, S., Hwangbo, J. Y., Chen, P. A simple and rapid method to isolate purer M13 phage by isoelectric precipitation. Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (18), 8023-8029 (2013).
  58. Kleiner, M., Hooper, L. V., Duerkop, B. A. Evaluation of methods to purify virus-like particles for metagenomic sequencing of intestinal viromes. BMC Genomics. 16, 7 (2015).
  59. Patterson, T. A., Dean, M. Preparation of high titer lambda phage lysates. Nucleic Acids Research. 15 (15), 6298 (1987).
  60. Ackermann, H. W., et al. Guidelines for bacteriophage characterization. Advances in Virus Research. 23, 1-24 (1978).
  61. Anderson, B., et al. Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays. Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).
  62. Eggers, C. H., Casjens, S., Samuels, D. S. Bacteriophages of Borrelia burgdorferi and Other Spirochetes. The Spirochetes: Molecular and Cellular Biology. Saier, M. H., Garcia-Lara, J. , Horizon Scientific Press. Wymondham, UK. Chapter 4 35-44 (2001).
  63. Birge, E. A. Bacterial and Bacteriophage Genetics,. 5th edition. , Springer. New York, NY. (2010).
  64. Eggers, C. H., et al. Identification of loci critical for replication and compatibility of a Borrelia burgdorferi cp32 plasmid and use of a cp32-based shuttle vector for the expression of fluorescent reporters in the Lyme disease spirochaete. Molecular Microbiology. 43 (2), 281-295 (2002).

Tags

علم المناعة والعدوى ، العدد 187 ، Borrelia burgdorferi ، البكتيريا ، نقل الجينات الأفقي ، النقل
التلاعب الجيني بوساطة العاثيات لمرض لايم Spirochete <em>Borrelia burgdorferi</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eggers, C. H. Phage-Mediated Genetic … More

Eggers, C. H. Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (187), e64408, doi:10.3791/64408 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter