Het vermogen van bacteriofaag om DNA tussen bacteriële cellen te verplaatsen, maakt ze effectieve hulpmiddelen voor de genetische manipulatie van hun bacteriële gastheren. Hier wordt een methodologie gepresenteerd voor het induceren, herstellen en gebruiken van φBB-1, een bacteriofaag van Borrelia burgdorferi, om heterologe DNA te transduceren tussen verschillende stammen van de ziekte van Lyme spirocheet.
Het introduceren van vreemd DNA in de spirocheet Borrelia burgdorferi is bijna uitsluitend bereikt door transformatie met behulp van elektroporatie. Dit proces heeft aanzienlijk lagere efficiënties in de ziekte van Lyme spirocheet in vergelijking met andere, beter gekarakteriseerde Gram-negatieve bacteriën. De mate van succes van transformatie is sterk afhankelijk van het hebben van geconcentreerde hoeveelheden hoogwaardig DNA uit specifieke achtergronden en is onderhevig aan significante variabiliteit tussen stammen. Alternatieve middelen voor het introduceren van vreemd DNA (d.w.z. shuttlevectoren, fluorescerende verslaggevers en antibioticaresistentiemarkers) in B. burgdorferi kunnen een belangrijke aanvulling zijn op het armamentarium van nuttige hulpmiddelen voor de genetische manipulatie van de ziekte van Lyme spirocheet. Bacteriofaag is goed erkend als natuurlijke mechanismen voor de beweging van DNA tussen bacteriën in een proces dat transductie wordt genoemd. In deze studie is een methode ontwikkeld voor het gebruik van de alomtegenwoordige borrelfaag φBB-1 om DNA te transduceren tussen B. burgdorferi-cellen van zowel dezelfde als verschillende genetische achtergronden. Het getransduceerde DNA omvat zowel borreliaal DNA als heterologe DNA in de vorm van kleine shuttlevectoren. Deze demonstratie suggereert een potentieel gebruik van faag-gemedieerde transductie als aanvulling op elektroporatie voor de genetische manipulatie van de ziekte van Lyme spirocheet. Dit rapport beschrijft methoden voor de inductie en zuivering van faag φBB-1 van B. burgdorferi, het gebruik van deze faag in transductietests en de selectie en screening van potentiële transductanten.
De ontwikkeling van hulpmiddelen voor de genetische manipulatie van de spirochetale bacterie Borrelia burgdorferi heeft een onmetelijke waarde toegevoegd aan het begrip van de aard van de ziekte van Lyme 1,2,3,4. B. burgdorferi heeft een ongewoon complex genoom dat bestaat uit een klein lineair chromosoom en zowel lineaire als circulaire plasmiden 5,6. Spontaan plasmideverlies, intragene herschikking (beweging van genen van het ene plasmide naar het andere binnen hetzelfde organisme) en horizontale genoverdracht (HGT, de beweging van DNA tussen twee organismen) hebben geleid tot een duizelingwekkende hoeveelheid genetische heterogeniteit bij B. burgdorferi (zie bijvoorbeeld Schutzer et al.7). De resulterende genotypen (of “stammen”) zijn allemaal leden van dezelfde soort, maar hebben genetische verschillen die hun vermogen om over te dragen op en infecteren van verschillende zoogdiergastherenbeïnvloeden 8,9,10,11. In dit rapport zal de term “stam” worden gebruikt om te verwijzen naar B. burgdorferi met een bepaalde natuurlijk afgeleide genetische achtergrond; de term “kloon” zal worden gebruikt om te verwijzen naar een stam die genetisch is gemodificeerd voor een bepaald doel of als gevolg van experimentele manipulatie.
De moleculaire toolbox die beschikbaar is voor gebruik in B. burgdorferi omvat selecteerbare markers, genreporters, shuttlevectoren, transposonmutagenese, induceerbare promotors en counter-selectable markers (voor een overzicht, zie Drektrah en Samuels12). Het effectieve gebruik van deze methodologieën vereist de kunstmatige introductie van heterologe (vreemde) DNA in een B. burgdorferi-belangenstam. In B. burgdorferi wordt de introductie van heterologe DNA bijna uitsluitend bereikt via elektroporatie, een methode die een puls elektriciteit gebruikt om een bacterieel membraan tijdelijk doorlaatbaar te maken voor kleine stukjes DNA die in de media worden geïntroduceerd1. De meerderheid van de cellen (geschat op ≥99,5%) worden gedood door de pols, maar de resterende cellen hebben een hoge frequentie van het behoud van het heterologe DNA13. Hoewel beschouwd als een van de meest efficiënte methoden om DNA in bacteriën te introduceren, is de frequentie van elektroporatie in B. burgdorferi zeer laag (variërend van 1 transformator in 5 × 104 tot 5 × 106 cellen)13. De barrières voor het bereiken van hogere frequenties van transformatie lijken zowel technisch als biologisch te zijn. Technische barrières voor de succesvolle elektroporatie van B. burgdorferi omvatten zowel de hoeveelheid DNA (>10 μg) die nodig is als de vereiste dat de spirocheten zich in precies de juiste groeifase bevinden (mid-log, tussen 2 × 107 cellen·ml−1 en 7 × 107 cellen·ml−1) bij het bereiden van elektrocompetente cellen12,13. Deze technische barrières kunnen echter gemakkelijker te overwinnen zijn dan de biologische barrières.
Onderzoekers van de ziekte van Lyme erkennen dat B. burgdorferi-klonen kunnen worden onderverdeeld in twee brede categorieën met betrekking tot hun vermogen om genetisch te worden gemanipuleerd13,14. Hoge passage, lab-aangepaste isolaten worden vaak gemakkelijk getransformeerd, maar hebben meestal de plasmiden verloren die essentieel zijn voor infectiviteit, gedragen zich op een fysiologisch afwijkende manier en zijn niet in staat om een zoogdiergastheer te infecteren of te volharden in een tekenvector12,13. Hoewel deze klonen nuttig zijn geweest voor het ontleden van de moleculaire biologie van de spirocheet binnen het laboratorium, zijn ze van weinig waarde voor het bestuderen van de spirocheet binnen de biologische context van de enzoötische cyclus. Infectieuze isolaten met een lage doorgang daarentegen gedragen zich op een fysiologische manier die een infectieuze toestand weerspiegelt en kunnen de infectiecyclus voltooien, maar zijn meestal recalcitrant voor de introductie van heterologe DNA en zijn daarom moeilijk te manipuleren voor onderzoek12,13. De moeilijkheid bij het transformeren van isolaten met een lage doorgang houdt verband met ten minste twee verschillende factoren: (i) isolaten met een lage doorgang klonteren vaak strak samen, vooral onder de omstandigheden met hoge dichtheid die nodig zijn voor elektroporatie, waardoor veel cellen worden geblokkeerd voor de volledige toepassing van de elektrische lading of de toegang tot het DNA in de media13,15; en (ii) B. burgdorferi codeert ten minste twee verschillende plasmide-borne restriction-modification (R-M) systemen die verloren kunnen gaan in high-passage isolaten14,16. R-M-systemen zijn geëvolueerd om bacteriën in staat te stellen vreemd DNA te herkennen ente elimineren 17. Inderdaad, verschillende studies in B. burgdorferi hebben aangetoond dat transformatie-efficiënties toenemen wanneer de bron van het DNA B. burgdorferi is in plaats van Escherichia coli13,16. Helaas is het verkrijgen van de vereiste hoge concentratie DNA voor elektroporatie van B. burgdorferi een duur en tijdrovend vooruitzicht. Een andere mogelijke zorg bij het elektropoderen en selecteren van isolaten met een lage doorgang is dat het proces de voorkeur lijkt te geven aan transformatoren die het kritische virulentie-geassocieerde plasmide, lp25 14,18,19, hebben verloren; dus, de handeling van het genetisch manipuleren van low-passage B. burgdorferi isolaten via elektroporatie kan selecteren op klonen die niet geschikt zijn voor biologisch relevante analyse binnen de enzoötische cyclus20. Gezien deze problemen zou een systeem waarin heterologe DNA kan worden geëlektrotransformeerd in B. burgdorferi-klonen met hoge passage en vervolgens kan worden overgebracht in infectieuze isolaten met een lage passage via een andere methode dan elektroporatie, een welkome aanvulling kunnen zijn op de groeiende verzameling moleculaire hulpmiddelen die beschikbaar zijn voor gebruik in de spirocheet van de ziekte van Lyme.
Naast transformatie (de opname van naakt DNA) zijn er nog twee andere mechanismen waarmee bacteriën regelmatig heterologe DNA opnemen: conjugatie, de uitwisseling van DNA tussen bacteriën in direct fysiek contact met elkaar, en transductie, wat de uitwisseling van DNA is gemedieerd door een bacteriofaag21. Inderdaad, het vermogen van bacteriofaag om HGT te bemiddelen is gebruikt als een experimenteel hulpmiddel voor het ontleden van de moleculaire processen binnen een aantal bacteriële systemen 22,23,24. B. burgdorferi is van nature niet bekwaam voor de opname van naakt DNA, en er is weinig bewijs dat B. burgdorferi codeert voor het apparaat dat nodig is om succesvolle conjugatie te bevorderen. Eerdere rapporten hebben echter de identificatie en voorlopige karakterisering beschreven van φBB-1, een gematigde bacteriofaag van B. burgdorferi 25,26,27,28. φBB-1 pakketten een familie van 30 kb plasmiden gevonden in B. burgdorferi25; de leden van deze familie zijn aangewezen als cp32’s. Consistent met een rol voor φBB-1 bij deelname aan HGT onder B. burgdorferi-stammen, rapporteerden Stevenson et al. een identieke cp32 gevonden in twee stammen met anders ongelijksoortige cp32’s, wat een recente verdeling van deze cp32 tussen deze twee stammen suggereert, waarschijnlijk via transductie29. Er zijn ook aanwijzingen voor significante recombinatie via HGT bij de cp32’s in een verder relatief stabiel genoom 30,31,32,33. Ten slotte is het vermogen van φBB-1 om zowel cp32’s als heterologous shuttle vector DNA te transduceren tussen cellen van dezelfde stam en tussen cellen van twee verschillende stammen eerder aangetoond27,28. Gezien deze bevindingen is φBB-1 voorgesteld als een ander te ontwikkelen instrument voor de dissectie van de moleculaire biologie van B. burgdorferi.
Het doel van dit rapport is om een methode te beschrijven voor het induceren en zuiveren van faag φBB-1 van B. burgdorferi, evenals een protocol voor het uitvoeren van een transductietest tussen B. burgdorferi-klonen en het selecteren en screenen van potentiële transductanten.
Het gebruik van transductie zou een methode kunnen zijn om ten minste enkele van de biologische en technische barrières in verband met de elektrotransformatie van B. burgdorferi 1,4,13,37 te overwinnen. In veel systemen kan bacteriofaag gastheer (niet-profaag) DNA tussen bacteriële cellen verplaatsen door gegeneraliseerde of gespecialiseerde transductie</…
The authors have nothing to disclose.
De auteur wil Shawna Reed, D. Scott Samuels en Patrick Secor bedanken voor hun nuttige discussie en Vareeon (Pam) Chonweerawong voor hun technische assistentie. Dit werk werd ondersteund door het Department of Biomedical Sciences en facultaire onderzoeksbeurzen aan Christian H. Eggers van de School of Health Sciences aan de Quinnipiac University.
1 L filter units (PES, 0.22 µm pore size) | Millipore Sigma | S2GPU10RE | |
12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene) | USA Scientific | 1450-0810 | holds 4 mL with low void volume (for induction) |
15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) | USA Scientific | 5618-8271 | |
1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG) | Millipore Sigma | CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute | |
5.75" Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile) | Thermo Fisher Scientific | 13-678-8A | autoclave prior to use |
50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) | USA Scientific | 1500-1211 | |
Absolute ethanol | |||
Agarose LE | Dot Scientific inc. | AGLE-500 | |
Bacto Neopeptone | Gibco | DF0119-17-9 | |
Bacto TC Yeastolate | Gibco | 255772 | |
Bovine serum albumin (serum replacement grade) | Gemini Bio-Products | 700-104P | |
Chloroform (for molecular biology) | Thermo Fisher Scientific | BP1145-1 | CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood |
CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder) | US Biological | C5900-01 | cell culture grade |
Erythromycin | Research Products International Corp | E57000-25.0 | |
Gentamicin reagent solution | Gibco | 15750-060 | |
Glucose (Dextrose Anhydrous) | Thermo Fisher Scientific | BP350-500 | |
HEPES | Thermo Fisher Scientific | BP310-500 | |
Kanamycin sulfate | Thermo Fisher Scientific | 25389-94-0 | |
Millex-GS (0.22 µM pore size) | Millipore Sigma | SLGSM33SS | to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions |
Mitomycin C | Thermo Fisher Scientific | BP25312 | CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood |
N-acetyl-D-glucosamine | MP Biomedicals, LLC | 100068 | |
Oligonucleotides (primers for PCR) | IDT DNA | ||
OmniPrep (total genomic extraction kit) | G Biosciences | 786-136 | |
Petri Dish (100 mm × 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
Petroff-Hausser counting chamber | Hausser scientific | HS-3900 | |
Petroff-Hausser counting chamber cover glass | Hausser scientific | HS-5051 | |
Polyethylene glycol 8000 (PEG) | Thermo Fisher Scientific | BP233-1 | |
Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS) | Pel-Freez Biologicals | 31119-3 | heat inactivate as per manufacturer's instructions |
Semi-micro UV transparent cuvettes | USA Scientific | 9750-9150 | |
Sodium bicarbonate | Thermo Fisher Scientific | BP328-500 | |
Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
Sodium pyruvate | Millipore Sigma | P8674-25G | |
Spectronic Genesys 5 | Thermo Fisher Scientific | ||
Streptomycin sulfate solution | Millipore Sigma | S6501-50G | |
Trisodium citrate dihydrate | Millipore Sigma | S1804-500G | sodium citrate for BSK |