Bakteriofagens förmåga att flytta DNA mellan bakterieceller gör dem till effektiva verktyg för genetisk manipulation av deras bakterievärdar. Här presenteras en metod för att inducera, återhämta sig och använda φBB-1, en bakteriofag av Borrelia burgdorferi, för att transducera heterologt DNA mellan olika stammar av borrelia spiroket.
Införandet av främmande DNA i spiroketen Borrelia burgdorferi har nästan uteslutande åstadkommits genom transformation med hjälp av elektroporation. Denna process har särskilt lägre effektivitet i borrelia spirokete i förhållande till andra, bättre karakteriserade gramnegativa bakterier. Graden av framgång för transformation är mycket beroende av att ha koncentrerade mängder av högkvalitativt DNA från specifika bakgrunder och är föremål för betydande stam-till-stam-variation. Alternativa medel för att införa främmande DNA (dvs. skyttelvektorer, fluorescerande reportrar och markörer för antibiotikaresistens) i B. burgdorferi kan vara ett viktigt tillskott till beväpningen av användbara verktyg för genetisk manipulation av borrelia spiroket. Bakteriofag har varit välkända som naturliga mekanismer för rörelse av DNA bland bakterier i en process som kallas transduktion. I denna studie har en metod utvecklats för att använda den allestädes närvarande borreliala fagen φBB-1 för att transducera DNA mellan B. burgdorferi-celler med både samma och olika genetiska bakgrunder. Det transducerade DNA:t innefattar både borreliellt DNA och heterologt DNA i form av små skyttelvektorer. Denna demonstration tyder på en potentiell användning av fagmedierad transduktion som ett komplement till elektroporering för genetisk manipulation av borrelia spiroket. Denna rapport beskriver metoder för induktion och rening av φBB-1 från B. burgdorferi, användningen av denna i transduktionsanalyser och urval och screening av potentiella transduktanter.
Utvecklingen av verktyg för genmanipulation av spirochetalbakterien Borrelia burgdorferi har tillfört ett omätbart värde till förståelsen av borrelians natur 1,2,3,4. B. burgdorferi har ett ovanligt komplext genom som består av en liten linjär kromosom och både linjära och cirkulära plasmider 5,6. Spontan plasmidförlust, intragen omläggning (rörelse av gener från en plasmid till en annan inom samma organism) och horisontell genöverföring (HGT, DNA-rörelsen mellan två organismer) har gett upphov till en svindlande mängd genetisk heterogenitet bland B. burgdorferi (för ett exempel, se Schutzer et al.7). De resulterande genotyperna (eller “stammarna”) är alla medlemmar av samma art men har genetiska skillnader som påverkar deras förmåga att överföra till och infektera olika däggdjursvärdar 8,9,10,11. I denna rapport kommer termen “stam” att användas för att hänvisa till B. burgdorferi med en särskild naturligt härledd genetisk bakgrund; Termen “klon” kommer att användas för att hänvisa till en stam som har modifierats genetiskt för ett visst ändamål eller som ett resultat av experimentell manipulation.
Den molekylära verktygslådan som är tillgänglig för användning i B. burgdorferi inkluderar valbara markörer, genreportrar, skyttelvektorer, transposonmutagenes, inducerbara promotorer och motvalbara markörer (för en recension, se Drektrah och Samuels12). En effektiv användning av dessa metoder kräver ett artificiellt införande av heterologt (främmande) DNA i en B. burgdorferi-stam av intresse. I B. burgdorferi uppnås införandet av heterologt DNA nästan uteslutande via elektroporering, en metod som använder en puls av elektricitet för att göra ett bakteriemembran övergående permeabelt för små bitar av DNA som införs i mediet1. Majoriteten av cellerna (uppskattas till ≥99,5%) dödas av pulsen, men de återstående cellerna har en hög frekvens för att behålla det heterologa DNA13. Även om det anses vara bland de mest effektiva metoderna för att införa DNA i bakterier, är frekvensen av elektroporering i B. burgdorferi mycket låg (allt från 1 transformant i 5 × 104 till 5 × 106 celler)13. Hindren för att uppnå högre omvandlingsfrekvenser verkar vara både tekniska och biologiska. Tekniska hinder för framgångsrik elektroporering av B. burgdorferi inkluderar både mängden DNA (>10 μg) som är nödvändig och kravet på att spiroketerna ska vara i exakt rätt tillväxtfas (mitten av log, mellan 2 × 10 7 celler ·ml−1 och 7 × 107 celler·ml−1) vid framställning av elektrokompetenta celler 12,13. Dessa tekniska hinder kan dock vara lättare att övervinna än de biologiska hindren.
Borreliaforskare inser att B. burgdorferi-kloner kan delas in i två breda kategorier med avseende på deras förmåga att manipuleras genetiskt13,14. Högpassage, laboratorieanpassade isolat omvandlas ofta lätt men har vanligtvis förlorat de plasmider som är väsentliga för smittsamhet, beter sig på ett fysiologiskt avvikande sätt och kan inte infektera en däggdjursvärd eller kvarstå inom en fästingvektor12,13. Även om dessa kloner har varit användbara för att dissekera spiroketens molekylärbiologi inom laboratoriet, är de av litet värde för att studera spiroketen inom det biologiska sammanhanget för den enzootiska cykeln. Infektiösa isolat med låg passage, å andra sidan, beter sig på ett fysiologiskt sätt som återspeglar ett infektiöst tillstånd och kan slutföra den infektiösa cykeln men är vanligtvis motsträviga mot införandet av heterologt DNA och är därför svåra att manipulera för studie12,13. Svårigheten att omvandla lågpassageisolat är relaterad till minst två olika faktorer: (i) lågpassageisolat som ofta tätt klumpar ihop sig, särskilt under de förhållanden med hög densitet som krävs för elektroporering, vilket blockerar många celler från antingen fullständig applicering av den elektriska laddningen eller tillgång till DNA i mediet13,15; och (ii) B. burgdorferi kodar för minst två olika plasmidburna restriktionsmodifieringssystem (R-M) som kan gå förlorade i högpassageisolat14,16. R-M-system har utvecklats för att tillåta bakterier att känna igen och eliminera främmande DNA17. Faktum är att flera studier i B. burgdorferi har visat att omvandlingseffektiviteten ökar när källan till DNA är B. burgdorferi snarare än Escherichia coli13,16. Tyvärr är det en dyr och tidskrävande möjlighet att förvärva den nödvändiga höga koncentrationen av DNA för elektroporering från B. burgdorferi. Ett annat potentiellt problem vid elektroporering och val av lågpassageisolat är att processen verkar gynna transformanter som har förlorat den kritiska virulensassocierade plasmiden, lp2514,18,19; således kan själva handlingen att genetiskt manipulera lågpassage B. burgdorferi-isolat via elektroporering välja för kloner som inte är lämpliga för biologiskt relevant analys inom den enzootiska cykeln20. Med tanke på dessa problem kan ett system där heterologt DNA kan elektrotransformeras till B. burgdorferi-kloner med hög passage och sedan överföras till lågpassage-infektiösa isolat med en annan metod än elektroporering vara ett välkommet tillskott till den växande samlingen av molekylära verktyg som är tillgängliga för användning i borreliaspiroketen.
Förutom transformation (upptaget av naket DNA) finns det två andra mekanismer genom vilka bakterier regelbundet tar upp heterologt DNA: konjugering, vilket är utbyte av DNA mellan bakterier i direkt fysisk kontakt med varandra och transduktion, vilket är utbytet av DNA medierat av en bakteriofag21. Faktum är att bakteriofagens förmåga att förmedla HGT har använts som ett experimentellt verktyg för att dissekera de molekylära processerna inom ett antal bakteriesystem22,23,24. B. burgdorferi är inte naturligt kompetent för upptag av naket DNA, och det finns få bevis för att B. burgdorferi kodar för den apparat som är nödvändig för att främja framgångsrik konjugering. Tidigare rapporter har dock beskrivit identifieringen och den preliminära karakteriseringen av φBB-1, en tempererad bakteriofag av B. burgdorferi25,26,27,28. φBB-1 förpackar en familj av 30 kb plasmider som finns inom B. burgdorferi25; Medlemmarna i denna familj har betecknats CP32S. I överensstämmelse med en roll för φBB-1 i att delta i HGT bland B. burgdorferi-stammar, rapporterade Stevenson et al. en identisk cp32 som hittades i två stammar med annars olika cp32s, vilket tyder på en ny delning av denna cp32 mellan dessa två stammar, troligen via transduktion29. Det finns också tecken på signifikant rekombination via HGT bland cp32:orna i ett annars relativt stabilt genom30,31,32,33. Slutligen har förmågan hos φBB-1 att transducera både cp32s och heterologt skyttelvektor-DNA mellan celler av samma stam och mellan celler av två olika stammar visats tidigare27,28. Med tanke på dessa resultat har φBB-1 föreslagits som ett annat verktyg som ska utvecklas för dissektion av molekylärbiologin hos B. burgdorferi.
Målet med denna rapport är att beskriva en metod för att inducera och rena φBB-1 från B. burgdorferi, samt tillhandahålla ett protokoll för att utföra en transduktionsanalys mellan B. burgdorferi-kloner och välja och screena potentiella transduktanter.
Användningen av transduktion kan representera en metod för att övervinna åtminstone några av de biologiska och tekniska hinder som är förknippade med elektrotransformationen av B. burgdorferi 1,4,13,37. I många system kan bakteriofag flytta värd-DNA (icke-prophage) mellan bakterieceller genom antingen generaliserad eller specialiserad transduktion 22,23…
The authors have nothing to disclose.
Författaren vill tacka Shawna Reed, D. Scott Samuels och Patrick Secor för deras användbara diskussion och Vareeon (Pam) Chonweerawong för deras tekniska hjälp. Detta arbete stöddes av institutionen för biomedicinska vetenskaper och fakultetsforskningsbidrag till Christian H. Eggers från School of Health Sciences vid Quinnipiac University.
1 L filter units (PES, 0.22 µm pore size) | Millipore Sigma | S2GPU10RE | |
12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene) | USA Scientific | 1450-0810 | holds 4 mL with low void volume (for induction) |
15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) | USA Scientific | 5618-8271 | |
1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG) | Millipore Sigma | CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute | |
5.75" Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile) | Thermo Fisher Scientific | 13-678-8A | autoclave prior to use |
50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) | USA Scientific | 1500-1211 | |
Absolute ethanol | |||
Agarose LE | Dot Scientific inc. | AGLE-500 | |
Bacto Neopeptone | Gibco | DF0119-17-9 | |
Bacto TC Yeastolate | Gibco | 255772 | |
Bovine serum albumin (serum replacement grade) | Gemini Bio-Products | 700-104P | |
Chloroform (for molecular biology) | Thermo Fisher Scientific | BP1145-1 | CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood |
CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder) | US Biological | C5900-01 | cell culture grade |
Erythromycin | Research Products International Corp | E57000-25.0 | |
Gentamicin reagent solution | Gibco | 15750-060 | |
Glucose (Dextrose Anhydrous) | Thermo Fisher Scientific | BP350-500 | |
HEPES | Thermo Fisher Scientific | BP310-500 | |
Kanamycin sulfate | Thermo Fisher Scientific | 25389-94-0 | |
Millex-GS (0.22 µM pore size) | Millipore Sigma | SLGSM33SS | to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions |
Mitomycin C | Thermo Fisher Scientific | BP25312 | CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood |
N-acetyl-D-glucosamine | MP Biomedicals, LLC | 100068 | |
Oligonucleotides (primers for PCR) | IDT DNA | ||
OmniPrep (total genomic extraction kit) | G Biosciences | 786-136 | |
Petri Dish (100 mm × 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
Petroff-Hausser counting chamber | Hausser scientific | HS-3900 | |
Petroff-Hausser counting chamber cover glass | Hausser scientific | HS-5051 | |
Polyethylene glycol 8000 (PEG) | Thermo Fisher Scientific | BP233-1 | |
Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS) | Pel-Freez Biologicals | 31119-3 | heat inactivate as per manufacturer's instructions |
Semi-micro UV transparent cuvettes | USA Scientific | 9750-9150 | |
Sodium bicarbonate | Thermo Fisher Scientific | BP328-500 | |
Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
Sodium pyruvate | Millipore Sigma | P8674-25G | |
Spectronic Genesys 5 | Thermo Fisher Scientific | ||
Streptomycin sulfate solution | Millipore Sigma | S6501-50G | |
Trisodium citrate dihydrate | Millipore Sigma | S1804-500G | sodium citrate for BSK |