Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

مقايسة اختزال قابلة للذوبان تعتمد على التترازوليوم لتقييم تأثير الأجسام المضادة على الأغشية الحيوية المبيضات الاستوائية

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64425
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Roorkee
* These authors contributed equally

Summary

تم وصف بروتوكول قائم على صفيحة عيار دقيق مكون من 96 بئرا باستخدام مقايسة اختزال 2،3-مكرر (2-ميثوكسي-4-نيترو-5-سلفوفينيل) -5-كربوكسانيليد-2H-تيترازوليوم (XTT) هنا ، لدراسة تأثيرات الأجسام المضادة على الأغشية الحيوية التي شكلتها C. tropicalis. يمكن استخدام هذا البروتوكول في المختبر للتحقق من تأثير المركبات المضادة للفطريات الجديدة المحتملة على النشاط الأيضي لخلايا أنواع المبيضات في الأغشية الحيوية.

Abstract

أنواع المبيضات هي السبب الرابع الأكثر شيوعا لعدوى المستشفيات الجهازية. غالبا ما ينطوي داء المبيضات الجهازي أو الغازي على تكوين الأغشية الحيوية على الأجهزة المزروعة أو القسطرة ، والتي ترتبط بزيادة الفوعة والوفيات. تظهر الأغشية الحيوية التي تنتجها أنواع المبيضات المختلفة مقاومة معززة ضد الأدوية المضادة للفطريات المختلفة. لذلك ، هناك حاجة لتطوير علاجات مناعية فعالة أو علاجات مساعدة ضد الأغشية الحيوية المبيضات. في حين أن دور المناعة الخلوية راسخ في الحماية من المبيضات ، فقد تمت دراسة دور المناعة الخلطية بشكل أقل.

وقد افترض أن تثبيط تكوين الأغشية الحيوية ونضجها هو أحد الوظائف الرئيسية للأجسام المضادة الواقية ، وقد ثبت أن الأجسام المضادة للأنبوب الجرثومي المبيضات البيض (CAGTA) تثبط النمو في المختبر وتشكيل الأغشية الحيوية ل C. albicans في وقت سابق. تحدد هذه الورقة بروتوكولا مفصلا لتقييم دور الأجسام المضادة على الأغشية الحيوية التي شكلتها C. tropicalis. تتضمن منهجية هذا البروتوكول تكوين الأغشية الحيوية C. tropicalis في 96 صفيحة ميكرومتر بئر ، والتي تم تحضينها بعد ذلك في وجود أو عدم وجود أجسام مضادة خاصة بالمستضد ، تليها مقايسة 2،3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl) -5-carboxanilide-2H-tetrazolium (XTT) لقياس النشاط الأيضي للخلايا الفطرية في الغشاء الحيوي.

تم تأكيد الخصوصية باستخدام ضوابط المصل المناسبة ، بما في ذلك مصل Sap2 المستنفد للأجسام المضادة. تظهر النتائج أن الأجسام المضادة الموجودة في مصل الحيوانات المحصنة يمكن أن تمنع نضوج المبيضات الحيوية في المختبر. باختصار ، تقدم هذه الورقة رؤى مهمة فيما يتعلق بإمكانات الأجسام المضادة في تطوير علاجات مناعية جديدة وعلاجات تآزرية أو مساعدة ضد الأغشية الحيوية أثناء داء المبيضات الغازي. يمكن استخدام هذا البروتوكول في المختبر للتحقق من تأثير المركبات المضادة للفطريات الجديدة المحتملة على النشاط الأيضي لخلايا أنواع المبيضات في الأغشية الحيوية.

Introduction

داء المبيضات الجهازي هو السبب الرئيسي الرابع لعدوى المستشفيات ، والتي ترتبط بارتفاع معدلات المراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم. على الصعيد العالمي ، يؤثر داء المبيضات الجهازي على ما يقرب من 700000 فرد1. أنواع المبيضات ، وهي C. albicans ، C. tropicalis ، C. parapsilosis ، C. glabrata ، و C. auris، هي السبب الأكثر شيوعا لعدوى المبيضات الغازية2. أنواع المبيضات هي مسببات الأمراض الانتهازية التي تنتج الأغشية الحيوية3. ترتبط الأغشية الحيوية في الغالب بضراوة المبيضات ، ويمكن أن تتحمل المبيضات ظروف الإجهاد التأكسدي والتناضحي عن طريق إحداث تكوين الأغشية الحيوية4. تعمل الأغشية الحيوية على تعديل التعبير عن عوامل الفوعة ومكونات جدار الخلية وتشكل مصفوفة واقية من البوليمرات الخارجية ، مما يساعد المبيضات على التكيف مع منافذ المضيف المختلفة4. تساهم الأغشية الحيوية في التصاق الخميرة بأنسجة المضيف والأدوات الطبية5. على هذا النحو ، يرتبط تكوين الأغشية الحيوية بميزة للخمائر ، حيث يمكن لخلايا الخميرة داخل الأغشية الحيوية أن تتهرب من الاستجابة المناعية للمضيف6. يحمي تكوين الأغشية الحيوية أيضا الخمائر المسببة للأمراض من عمل الأدوية المضادة للفطريات5. تم إثبات انخفاض حساسية الأغشية الحيوية ل C. albicans للأمفوتريسين B بواسطة Pierce et al.7,8. علاوة على ذلك ، تظهر الأغشية الحيوية مقاومة الأدوية المضادة للفطريات للفلوكونازول ، مما يضعف الإدارة الفعالة لداء المبيضات الجهازي 9,10.

لدى الميكروبات ميل جوهري للالتصاق بمختلف الأسطح الحيوية وغير الحيوية ، مما يؤدي إلى تكوين الأغشية الحيوية. المبيضات البيض ، وهي فطر ثنائي الشكل ، موجودة في أشكال الخميرة و hyphal ، وقد تم تمييز تكوين الأغشية الحيوية في مختلف أنظمة النماذج في المختبر وفي الجسم الحي 11. تشمل خطوات تكوين الأغشية الحيوية الرقيقة التصاق خلايا المبيضات بالركيزة ، والخيوط ، والانتشار ، ونضج الأغشية الحيوية11. في البداية ، يلتصق شكل الخميرة من C. albicans بالركائز ، بما في ذلك الأجهزة الطبية والأنسجة البشرية ، يليها خيوط وتكاثر C. albicans في أشكال hyphal و pseudohyphal ، وأخيرا نضوج الأغشية الحيوية المضمنة في المصفوفة خارج الخلية11. يساهم تكوين الأغشية الحيوية إلى حد كبير في آليات التسبب في C. albicans 12. تشكل أنواع المبيضات أغشية حيوية مقاومة للعقاقير ، مما يجعل القضاء عليها أمرا صعبا13. وصفت مجموعة فرعية صغيرة من السكان المنتجين للغشاء الحيوي C. albicans بأنها شديدة المقاومة للعقاقير المضادة للفطريات الأمفوتريسين B والكلورهيكسيدين14. وتجدر الإشارة إلى أن خلايا الخميرة في الأغشية الحيوية تظهر مقاومة عالية للعلاج متعدد الأدوية مقارنة بخلايا الخميرة في مرحلة العوالق ومرحلة الانتشار14. وقد اقترح أن خلايا الخميرة الموجودة في الأغشية الحيوية شديدة التحمل للأدوية المضادة للفطريات ، مما يساهم في بقاء C. albicans في الأغشية الحيوية14. تم الإبلاغ عن أن هذه الخلايا الموجودة هي متغيرات النمط الظاهري ل C. albicans وليست طفرات14. علاوة على ذلك ، فإن خلايا الأغشية الحيوية المبيضات المعروفة باسم "الخلايا الثابتة" تتحمل جرعات عالية من علاج الأمفوتريسين-B وتساهم في بقاء المبيضات ، مما يشكل عبئا كبيرا من عدوى المبيضات الجهازية المتكررة في الأفراد المعرضين لمخاطر عالية15.

تتطلب الزيادة في مقاومة الأدوية المضادة للفطريات في سلالات المبيضات البحث عن عوامل جديدة مضادة للفطريات وعلاجات مناعية. كما يتضح من الدراسات المذكورة أعلاه ، تظهر الأغشية الحيوية المبيضات انخفاض التعرض للأدوية المضادة للفطريات. لذلك ، هناك حاجة لتحسين العلاجات المناعية للتحكم في تكوين المبيضات بيوفيلم. أظهرت دراسات سابقة أن CAGTA يمكن أن يوفر حماية فعالة ضد عدوى المبيضات الجهازية عن طريق تثبيط تكوين الأغشية الحيوية C. albicans في المختبر16. أفادت دراسة أخرى أن تحصين الفئران ببروتين C. albicans rAls3-N يحفز عيارات الأجسام المضادة العالية التي تتداخل مع تكوين الأغشية الحيوية C. albicans في المختبر17. كما مارست الأجسام المضادة ل Als3-N تأثيرا مثبطا على تشتت C. albicans من الأغشية الحيوية17. يخضع لقاح NDV-3A القائم على C. albicans حاليا للتجربة السريرية ، كما تم العثور على الأمصال المضادة ل NDV-3A لتقليل تكوين الأغشية الحيوية C. أوريس 18. حددت دراسة حديثة تثبيط تكوين الأغشية الحيوية بواسطة الأجسام المضادة Sap2 كآلية حماية في نموذج الفئران لداء المبيضات الجهازي19.

تحدد هذه الورقة بروتوكولا مفصلا في المختبر لتقييم تأثير الأجسام المضادة الخاصة بالمستضد الموجودة في المصل متعدد النسيلة الذي تم الحصول عليه من مجموعات مختلفة من الفئران الملقحة Sap2 على الأغشية الحيوية المبيضات الاستوائية المشكلة مسبقا. لتحقيق ذلك ، تم تحسين وتطوير طريقة تعتمد على مقايسة تقليل XTT في المختبر ، والتي يمكنها قياس قابلية بقاء الأغشية الحيوية بطريقة سريعة وحساسة وعالية الإنتاجية ، في وجود أو عدم وجود أجسام مضادة.

يستخدم اختبار XTT لقياس النشاط الأيضي الخلوي كمؤشر على بقاء الخلية ، والانتشار الخلوي ، والسمية الخلوية20. يعتمد هذا الفحص اللوني على اختزال ملح التترازوليوم الأصفر ، الصوديوم 3'- [1- (فينيلامينوكربونيل) -3،4-تيترازوليوم] -مكرر (4-ميثوكسي-6-نيترو) هيدرات حمض السلفونيك البنزين (XTT) إلى صبغة فورمازان برتقالية بواسطة الخلايا النشطة الأيضية. نظرا لأن الخلايا القابلة للحياة فقط هي التي يمكن أن تقلل من XTT ، فإن كمية فورمازان XTT المخفضة تتناسب مع شدة اللون وصلاحية الخلية. صبغة الفورمازان المتكونة قابلة للذوبان في الماء ويتم قياسها مباشرة باستخدام قارئ الألواح. نظرا لطبيعتها القابلة للذوبان في الماء ، يسمح اختبار XTT بدراسة الأغشية الحيوية السليمة ، وكذلك فحص حساسية أدوية الأغشية الحيوية ، دون تعطيل بنية الأغشية الحيوية21. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تنفيذ هذه الطريقة في تقييمات صلاحية الفطريات المبيضات نظرا لسهولة استخدامها وسرعتها ودقتها وإنتاجيتها العالية ودرجة عالية من التكاثر 7,22.

بالإضافة إلى مقايسة اختزال XTT ، تم أيضا تحديد العديد من التقنيات البديلة لقياس كمية الأغشية الحيوية. يتضمن بعضها استخدام مقايسة تقليل MTT ، وتلطيخ البنفسجي البلوري ، وتقدير كمية الحمض النووي ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي ، وقياس البروتين ، وقياس وزن الخلية الجافة ، وعد المستعمرات القابلة للحياة. تختلف هذه الإجراءات اختلافا كبيرا من حيث متطلبات الوقت والتكلفة. أجرى Taff et al. تحليلا مقارنا لسبعة مقايسات كمية مختلفة من المبيضات الحيوية ووجدوا أن مقايسة XTT قدمت الطريقة الأكثر قابلية للتكرار والدقة والكفاءة للتقدير الكمي للأغشية الحيوية C. albicans 23. تقنيات تلطيخ مثل الكريستال البنفسجي لها قيود معينة. يحدد اختبار الكريستال البنفسجي بشكل غير مباشر كمية الأغشية الحيوية عن طريق قياس الكثافة البصرية لمصفوفة وخلايا الأغشية الحيوية الملطخة باللون البنفسجي البلوري. على الرغم من أن مقايسة البنفسج البلوري توفر مقياسا جيدا لكتلة الأغشية الحيوية ، إلا أنها لا تعطي مقياسا لصلاحية الأغشية الحيوية لأنها تلطخ كل من الخلايا الميكروبية والمصفوفة خارج الخلية24. أفاد Dhale et al. كذلك أن مقايسة اختزال XTT كانت الطريقة الأكثر حساسية وقابلية للتكرار والدقة والكفاءة والمحددة للكشف عن إنتاج الأغشية الحيوية مقارنة بمقايسة البنفسجي البلوري25. أظهرت تقارير الأدبيات أن مقايسة XTT ترتبط بشكل جيد مع معلمة CFU / mL في طريقة عد CFU. ومع ذلك ، بالمقارنة مع اختبار XTT ، فإن طريقة CFU كثيفة العمالة وبطيئة26. علاوة على ذلك، قد لا يكون جزء الخلايا الحية المنفصلة ممثلا لمجتمع الأغشية الحيوية الأولي27. على الرغم من أن مقايسة تخفيض XTT تبدو أفضل خيار متاح لتحديد الجدوى ، إلا أن هناك بعض القيود على هذه التقنية. في حين أن طريقة XTT مفيدة للمقارنات التي تنطوي على سلالة فطرية واحدة ، فقد يكون استخدامها محدودا عند مقارنة سلالات وأنواع فطرية مختلفة. قد تكون المقارنات بين سلالات صعبة في غياب توحيد مفصل لأن السلالات المختلفة تستقلب ركائز ذات قدرات مختلفة21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم إيواء الفئران BALB / c في مرفق الحيوانات الصغيرة في IIT Roorkee. تم الحفاظ على جميع الحيوانات في دورة 12 ساعة: 12 ساعة خفيفة: مظلمة عند 25 درجة مئوية وتم تزويدها بنظام غذائي بيليه وماء حسب الرغبة. تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان المؤسسية (IAEC) التابعة ل IIT Roorkee.

1. إعداد C. الاستوائية

ملاحظة: ينتمي فطر المبيضات الاستوائية إلى مسببات الأمراض من مجموعة المخاطر 2 ويصنف على أنه كائن حي دقيق BSL2. استخدم دائما خزانات السلامة البيولوجية المعتمدة من الفئة الثانية عند العمل مع أنواع المبيضات . ممارسة تقنيات التعقيم والعقم أثناء العمل مع C. tropicalis واتباع إجراءات السلامة البيولوجية الموصى بها للتخلص السليم من هذا العامل الممرض.

  1. خط C. tropicalis (سلالة ATCC 750) على صفيحة أجار سكر العنب Sabouraud (SAB).
  2. قم بإعداد مزرعة نمت بين عشية وضحاها من C. tropicalis عن طريق تلقيح مستعمرة واحدة من صفيحة أجار SAB في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل يحتوي على 10 مل من وسط مرق SAB. بدلا من ذلك ، استخدم مخزون الجلسرين المجمد من C. tropicalis وقم بتلقيح 100 ميكرولتر من مخزون الجلسرين في دورق مخروطي معقم سعة 250 مل يحتوي على 50 مل من وسط مرق SAB.
  3. احتضان استزراع C. tropicalis في شاكر مداري عند 180 دورة في الدقيقة عند 30 درجة مئوية لمدة 24-48 ساعة.
  4. جهاز طرد مركزي للمزرعة الفطرية (الخلايا في المرحلة اللوغاريتمية) عند 2150 × جم لمدة 15 دقيقة عند 21 درجة مئوية.
  5. تخلص من المادة الطافية وأضف 50 مل من 1x PBS المعقم إلى الحبيبات. اغسل وأعد تعليق الحبيبات في 1x PBS معقمة مع دوامة لطيفة.
  6. جهاز طرد مركزي مرة أخرى عند 2150 × جم لمدة 15 دقيقة عند 21 درجة مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات الفطرية في 10 مل من 1x PBS المعقم.
  7. احسب تركيز الخلايا عن طريق العد باستخدام مقياس الدم.
  8. تحضير مخزون فطري بكثافة نهائية تبلغ 1.0 × 106 خلايا / مل في وسط حمض مورفولين بروبان سلفونيك RPMI 1640 (MOPS). استخدم معلق الخلية من الخطوة 1.6 على الفور.
    ملاحظة: لإعداد لوحة واحدة من 96 بئرا ، فإن إجمالي حجم المخزون الفطري المطلوب هو 10 مل (100 ميكرولتر / بئر). مقياس حسب الحاجة.

2. تكوين الأغشية الحيوية الاستوائية

  1. تحضير الأغشية الحيوية المبيضات في صفيحة معايرة دقيقة من البوليسترين مسطحة القاع 96 بئرا كما هو موضح سابقا (الشكل 1) 28,29.
  2. أضف 100 ميكرولتر من مستنبت C. tropicalis (من 106 خلايا/مل، محضرة على النحو الوارد أعلاه) إلى صفيحة معايرة دقيقة ذات 96 بئرا باستخدام ماصة متعددة القنوات (الشكل 2A). احتفظ بالعمودين الأخيرين (11 و 12) ك "لا فطر بالإضافة إلى مصل" و "لا فطر ولا مصل" عناصر تحكم سلبية عن طريق عدم إضافة خلايا فطرية. املأ العمودين 11 و 12 ب 100 ميكرولتر من متوسط RPMI 1640 MOPS وحده.
  3. قم بتغطية لوحة المعايرة الدقيقة بغطاء وورق الألمنيوم. احتضان اللوحة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في ظل ظروف ثابتة.
  4. في اليوم التالي ، قم بشفط الوسيط بعناية باستخدام ماصة متعددة القنوات (دون لمس أو تعطيل الأغشية الحيوية). اضغط على اللوحة برفق في وضع مقلوب على صفائح النشاف لإزالة أي وسيط متبقي.
  5. اغسل اللوحة ب 200 ميكرولتر من 1x PBS (لكل بئر) باستخدام ماصة متعددة القنوات. أضف PBS برفق شديد على طول الجدران الجانبية للبئر لتجنب تعطيل الأغشية الحيوية. استنشاق PBS بعناية باستخدام ماصة متعددة القنوات. كرر غسل PBS 2x (ما مجموعه ثلاث غسلات).
  6. لإزالة PBS الزائد ، قم بتجفيف اللوحة بالهواء (بدون غطاء) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، داخل خزانة السلامة البيولوجية.

3. علاج الأغشية الحيوية بالأجسام المضادة

ملاحظة: يمكن الآن معالجة الأغشية الحيوية لتقييم تثبيط نضوج الأغشية الحيوية بواسطة الأجسام المضادة. تم استخدام مصل الفئران كمصدر للأجسام المضادة متعددة النسيلة. مجموعات مختلفة من Sap2-munized (Sap2-albicans و Sap2-tropicalis و Sap2-parapsilosis) جنبا إلى جنب مع الفئران المحصنة ضد الشام نزفت خلف المداري وتم عزل المصل كما هو موضح سابقا19. تم تأكيد وجود الأجسام المضادة ل Sap2 باستخدام ELISA الخاص ب Sap2 كما هو موضح سابقا19.

  1. قم بإجراء التعطيل الحراري للمصل (مصدر الأجسام المضادة متعددة النسيلة) عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام لاستبعاد دور المكمل في النشاط المثبط. قم بتعطيل السيروم بالحرارة قبل تخفيف المصل.
    ملاحظة: استخدم المصل من الفئران المحصنة ضد الشام والفئران قبل المناعة والمصل المستنفد للأجسام المضادة الخاصة ب Sap2 كعناصر تحكم إضافية19. تم تحضير مصل مستنفد للأجسام المضادة وفقا لدراسة سابقة19. من بين التخفيفات التسلسلية (1:25 ، 1:50 ، 1:100 ، 1:200 ، 1:400 ، 1:800 ، 1:1,600 ، 1:3,200 ، 1:6,400 ، و 1:12,800) للمصل الذي تم اختباره في هذا البروتوكول ، لوحظ تثبيط نضج الأغشية الحيوية في 1:25 و 1:50 و 1:100. ومن ثم ، تم اختيار 1:50 لتحقيق توازن بين التثبيط واستهلاك المصل.
  2. تحضير التخفيفات التسلسلية لعينات المصل المعطلة بالحرارة في وسط RPMI 1640 MOPS المعقم (1:50). استخدم مخفف مصل شائع (1:50) لجميع عينات المصل ليتم اختبارها لتثبيط نضج الأغشية الحيوية30.
  3. أضف 100 ميكرولتر من تخفيف المصل المحدد إلى كل بئر من لوحة المعايرة الدقيقة المكونة من 96 بئرا. لكل عينة ، أضف تخفيفات المصل في نسختين ، وفقا للتخطيط المرفق (الشكل 2 ب).
    1. في العمود 10 ، لا تضيف تخفيف المصل ؛ أضف فقط RPMI 1640 MOPS المتوسطة للتحكم الإيجابي للفطريات فقط .
      ملاحظة: العمود 10 ، الصفان G1-G8 و H1-H8 كانا يحتويان في البداية على خلايا فطرية في RPMI-MOPS. ومع ذلك ، بينما تمت إضافة RPMI-MOPS إلى العمود 10 حتى بعد 24 ساعة ، كانت الصفوف G1-G8 بمثابة عنصر تحكم في PBS والصفوف H1-H8 كعنصر تحكم بدون مصل بعد 24 ساعة.
    2. في العمود 11 ، أضف تخفيفا بنسبة 1:50 من المصل إلى جميع الآبار ليكون بمثابة عدم وجود فطر بالإضافة إلى التحكم السلبي في المصل.
    3. في العمود 12 ، لا تضيف تخفيف المصل إلى أي بئر ؛ حافظ على هذا لأنه لا يوجد فطر لا يوجد تحكم سلبي في المصل.
  4. غطي اللوحة بغطاء وورق الألمنيوم. احتضان اللوحة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.

4. تقدير النشاط الأيضي الأغشية الحيوية

  1. في اليوم التالي ، قم بشفط المصل بعناية باستخدام ماصة متعددة القنوات (دون لمس أو تعطيل الأغشية الحيوية). اضغط على اللوحة برفق في وضع مقلوب على صفائح النشاف لإزالة أي مصل متبقي.
  2. اغسل اللوحة ب 200 ميكرولتر من 1x PBS (لكل بئر) باستخدام ماصة متعددة القنوات ، مع إضافة PBS على طول الجدران الجانبية للبئر لتجنب تعطيل الأغشية الحيوية. قم بشفط PBS بعناية باستخدام ماصة متعددة القنوات وكرر غسل PBS 2x (ما مجموعه ثلاث غسلات). جفف اللوحة في الهواء (بدون غطاء) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، داخل خزانة السلامة البيولوجية لتجفيف أي PBS زائد.
  3. تحضير XTT / ميناديون:
    1. تحضير XTT في Ringers Lactate المعقمة كمحلول 0.5 جم / لتر. قم بإذابة 25 مجم من XTT في 50 مل من Ringers Lactate المعقم بالمرشح. حصة 10 مل في أنابيب منفصلة مغطاة بورق الألمنيوم وتخزينها في -80 درجة مئوية.
    2. تحضير menadione كمخزون 10 mM. قم بإذابة 8.6 مجم من الميناديون في 5 مل من الأسيتون وتوزيع 50 ميكرولتر في 100 أنبوب دقيق منفصل. قم بتخزين القسمة في -80 درجة مئوية.
    3. قم بإعداد محلول XTT / menadione قبل الاستخدام مباشرة عن طريق أخذ 10 مل من XTT وإضافة 1 ميكرولتر من menadione للحصول على محلول عمل 1 ميكرومتر.
  4. أضف 100 ميكرولتر من محلول XTT / menadione لكل بئر من لوحة المعايرة الدقيقة المكونة من 96 بئرا. غطي اللوحة بغطاء وورق الألمنيوم. احتضان اللوحة لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية في الظلام.
  5. انقل 80 ميكرولتر من المادة الطافية الملونة من كل بئر إلى صفيحة جديدة من 96 بئرا. اقرأ اللوحة عند 490 نانومتر.
  6. احسب متوسط قيم الامتصاص للآبار في العمود 10 (التحكم الإيجابي للفطريات فقط) ، والذي سيكون بمثابة قيمة مرجعية لحساب النسبة المئوية لتثبيط الأغشية الحيوية بواسطة كل عينة مصل باستخدام المعادلة (1).
    ٪ تثبيط الأغشية الحيوية = 100 - Equation 1× 100 (1)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نمت الأغشية الحيوية Candida tropicalis في 96 لوحة معايرة دقيقة وتم تصويرها بمعدل 40x باستخدام مجهر مقلوب (الشكل 1 أ). تم تلطيخ الغشاء الحيوي باستخدام البنفسجي البلوري ولوحظ عند 40x باستخدام مجهر مقلوب (الشكل 1B). يظهر المجهر الإلكتروني الماسح صورة تمثيلية لغشاء حيوي C. tropicalis (الشكل 1C). لإجراء مقايسة تثبيط الأغشية الحيوية، أضيفت 105 خلايا من المبيضات إلى آبار صفيحة المعايرة الدقيقة المكونة من 96 بئرا في الوقت 0، وفقا للتخطيط (الشكل 2 أ). بعد 24 ساعة ، تم غسل اللوحة ، وأضيفت عينات المصل إلى الأغشية الحيوية المشكلة مسبقا. تم اختيار تخفيف مصل شائع بنسبة 1:50 لمقارنة عينات المصل المختلفة التي تم الحصول عليها من مجموعات مختلفة من الفئران المحصنة ب Sap2 والمحصنة ضد الشام وفقا لدراسة تجريبية وتقرير منشور سابقا30.

تمت إضافة عينات مصل مختلفة إلى لوحة المعايرة الدقيقة المكونة من 96 بئرا حسب التخطيط (الشكل 2 ب) وتم تقييمها من نسختين. تم تحليل الأمصال التي تم الحصول عليها في اليوم 30 بعد التحصين من ثلاثة فئران لكل مجموعة (Sap2-albicans محصنة ، Sap2-tropicalis محصنة ، Sap2-parapsilosis محصنة ، مجموعة محصنة وهمية ، فئران ما قبل المناعة ، وعينة تحكم مستنفدة Sap2) عند تخفيف 1:50. تمت قراءة اللوحة بطول موجي 490 نانومتر باستخدام قارئ ELISA للحصول على قراءات XTT اللونية (قيم OD490 ) للأغشية الحيوية C. tropicalis التي تشكلت في وجود أو عدم وجود مصل (الجدول 1). تم حساب الفراغ السالب باستخدام متوسط العمودين 11 و 12 (0.04). تم حساب الشاهد الإيجابي عن طريق حساب متوسط الآبار التي تحتوي على الفطريات فقط (العمود 10 ؛ 0.8165). قبل الحسابات ، تم طرح متوسط قيمة الامتصاص لآبار التحكم في العمودين 11 و 12 (0.04) من قياسات الامتصاص للآبار التجريبية. وهكذا ، تم تعيين القيمة المرجعية للتحكم الإيجابي للغشاء الحيوي (العمود 10) على 0.7765 (= 0.8165 - 0.04).

ثم تم قسمة القيم (المتوسط ناقص الفراغ) التي تم الحصول عليها للآبار التجريبية على هذا التحكم الإيجابي (0.7765) وتم الحصول على النسبة المئوية بالضرب في 100. تم حساب النسبة المئوية لتثبيط الأغشية الحيوية عن طريق طرح القيمة التي تم الحصول عليها من 100. يوضح الرسم البياني بالأعمدة جميع القيم المرسومة (الشكل 3). تم استخدام ANOVA العادي أحادي الاتجاه متبوعا باختبار Dunnett اللاحق للمقارنات المتعددة لحساب قيم p لتقييم الاختلافات الإحصائية بين مجموعات المصل المختلفة. تم اعتبار قيمة p البالغة <0.05 ذات دلالة إحصائية. يمكن أن يمنع مصل الفئران المحصنة Sap2-parapsilosis نضوج الأغشية الحيوية C. tropicalis مسبقة التشكيل بنسبة 65٪ ، مقارنة بالمصل من Sap2-albicans (45٪) و Sap2-tropicalis (55٪) الفئران المحصنة. بشكل عام ، كان تثبيط الغشاء الحيوي بواسطة مصل Sap2 المناعي أعلى بكثير من مصل المناعة الوهمية (16٪) ومصل ما قبل المناعة (13٪) على التوالي. عند استنفاد الأجسام المضادة الخاصة ب Sap2 من المصل كما هو موضح في مكان آخر19 ، تم تقليل قدرة تثبيط الأغشية الحيوية إلى 10٪. كان تثبيط الأغشية الحيوية قريبا من الإهمال عند استخدام PBS (5٪) والتحكم في عدم وجود مصل (5٪).

Figure 1
الشكل 1: تصوير الغشاء الحيوي ل Candida tropicalis . (أ) تصور الغشاء الحيوي ل Candida tropicalis المتكون في قاع صفيحة معايرة دقيقة ذات 96 بئرا بعد إزالة وسط RPMI ، باستخدام مجهر مقلوب. تم التقاط الصورة باستخدام الفحص المجهري برايتفيلد (لم يتم استخدام أي بقعة). (ب) تصور الأغشية الحيوية C. tropicalis المتكونة في قاع صفيحة معايرة دقيقة ذات 96 بئرا بعد تلطيخ البنفسجي البلوري. (ج) تصور الأغشية الحيوية C. tropicalis المتكونة على شرائح زجاجية باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر (أ ، ب) ، 10 ميكرومتر (ج). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: تخطيط شكل لوحة 96 بئر. إضافة (أ) الخلايا الفطرية إلى الآبار و (ب) تخفيفات المصل من مجموعات الفئران المختلفة (Sap2-albicans المحصنة ، Sap2-tropicalis المحصنة ، Sap2-parapsilosis المحصنة ، و sham-immune ؛ n = 3) تم تقييمها في نسختين عند تخفيف 1:50. تضمنت عناصر التحكم الإضافية مصل Sap2 المستنفد ، ومصل المناعة ، و PBS ، والتحكم في عدم وجود مصل. العمود 10 لم يكن لديه مصل مضاف (الخلايا الفطرية موجودة ، السيطرة الإيجابية). العمود 11 لم يكن لديه خلايا فطرية مضافة (المصل موجود). العمود 12 لم يكن لديه خلايا فطرية مضافة (المصل غائب). الاختصارات: PBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات ؛ Sap2 = يفرز بروتيناز أسبارتيل 2. تشير المصطلحات m1 و m2 و m3 إلى فئران مختلفة في كل مجموعة (n = 3). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: رسم بياني يوضح فعالية الأجسام المضادة متعددة النسيلة الخاصة ب Sap2 ضد الأغشية الحيوية لبكتيريا C. tropicalis مسبقة التشكيل. يظهر مصدر المصل المناعي على المحور السيني ، بينما تظهر النسبة المئوية لتثبيط نضج الأغشية الحيوية C. tropicalis على المحور الصادي. تمثل الأشرطة متوسط ± SEM (n = 3). تم استخدام ANOVA العادي أحادي الاتجاه متبوعا باختبار Dunnett اللاحق للمقارنات المتعددة لحساب قيم p . تمثل الأشرطة والرموز الاختلافات بين مجموعات الفئران المحصنة ب Sap2 مع الفئران المحصنة ضد الشام. ، ص < 0.0001. الاختصارات: PBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات ؛ Sap2 = يفرز بروتيناز أسبارتيل 2. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

<> 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.475 0.4141 0.0441 0.4637 0.485 0.0484 0.5179 0.4068 0.0442 0.8826 0.0452 0.0404
B 0.3848 0.3773 0.0428 0.369 0.3781 0.0465 0.4105 0.3773 0.0447 0.8428 0.0426 0.041
C 0.2754 0.2728 0.0427 0.305 0.3083 0.0415 0.3531 0.3213 0.0432 0.9661 0.0444 0.0453
D 0.6965 0.7185 0.043 0.6681 0.6711 0.0403 0.6346 0.728 0.0433 0.8643 0.0384 0.0358
E 0.7031 0.7117 0.0481 0.7806 0.688 0.0521 0.7095 0.6998 0.0525 0.7883 0.0491 0.0416
F 0.7588 0.7441 0.0456 0.7173 0.7233 0.0437 0.7733 0.6808 0.0462 0.7256 0.0468 0.0354
G 0.7681 0.7708 0.0435 0.7949 0.7496 0.0445 0.7695 0.7898 0.0451 0.7335 0.0429 0.0371
H 0.7652 0.7855 0.0469 0.7818 0.7766 0.0428 0.7592 0.7765 0.0445 0.7295 0.044 0.0341

الجدول 1: قراءات الامتصاص عند 490 نانومتر للوحة المعايرة الدقيقة 96 بئرا. تم استخدام قارئ لوحة قياسي (Tecan) للحصول على قراءات الامتصاص وتم مطابقة القراءات مع التخطيط الموصوف في الشكل 2. تم إجراء الحسابات اللاحقة باستخدام هذه البيانات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ترتبط الالتهابات الفطرية التي تسببها أنواع المبيضات بارتفاع معدلات المراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم. يتطلب التهديد المتزايد للعدوى الفطرية الغازية الإدارة المبكرة لمثل هذه الأمراض التي تهدد الحياة. تتضمن معظم عدوى المبيضات تكوين الأغشية الحيوية ، التي تلتصق بمجموعة متنوعة من الأجهزة الطبية وهي مسؤولة عن استمرار وتكرار الالتهابات الفطرية في المستشفيات31. تتكون الأغشية الحيوية من خلايا الخميرة أو الخلايا الفطرية ، وتظهر مقاومة كبيرة لغالبية الأدوية المضادة للفطريات التقليدية32. تعزى المقاومة المضادة للفطريات بواسطة الأغشية الحيوية المبيضات إلى عدة آليات ، بما في ذلك انخفاض تغلغل مضادات الفطريات ، ووجود مصفوفة خارج الخلية ، والإفراط في التعبير عن مضخات تدفق الدواء ، وتغيير تكوين ستيرول غشاء الخلية ، والنمو البطيء وعدم التجانس المكاني ، وتفعيل مسارات الإشارات المختلفة ، ووجود خلايا ثابتة تتحمل الأدوية33,34. يعد تثبيط التصاق المبيضات وتكوين الأغشية الحيوية من أهم الاستراتيجيات للوقاية من عدوى المبيضات.

تم استخدام مقايسات مختلفة في المختبر ، مثل مقايسات صلاحية الخلية ، ومقايسات لوحة المعايرة الدقيقة ، ومقايسات قياس الوزن الجاف ، لدراسة تكوين الأغشية الحيوية المبيضات ، والتي تستند إلى تقييم النقطة الزمنية المحددة للأغشية الحيوية23. تم تطوير فحوصات أكثر تقدما مثل المقايسات القائمة على جهاز الموائع الدقيقة ، والتي يمكن استخدامها لتقييم تكوين الأغشية الحيوية في الوقت الفعلي35. حتى الآن ، تمت دراسة تكوين الأغشية الحيوية باستخدام المقايسات في المختبر ، ولكن هناك حاجة لفهم العملية الديناميكية لتكوين الأغشية الحيوية في ظل ظروف الجسم الحي أيضا36,37. وفي الوقت الحالي، تنطبق معظم دراسات تثبيط الأغشية الحيوية على المطثية البيض، ولا يتوفر سوى عدد قليل من الدراسات للقضاء على الأغشية الحيوية المبيضات غير البيضاء. تغير طيف عدوى المبيضات تدريجيا على مدى العقود القليلة الماضية وتشكل أنواع المبيضات الناشئة غير البيض عبئا كبيرا من المراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم. لذلك ، هناك حاجة ملحة لتطوير استراتيجيات جديدة للتحكم في تكوين الأغشية الحيوية وتطوير مقايسات تثبيط الأغشية الحيوية التي تركز على أنواع المبيضات غير البيضاء. العلاج المناعي ، وخاصة الأجسام المضادة ، لديه إمكانات كبيرة لمنع تكوين الأغشية الحيوية ويمكن استخدامه لعلاج عدوى المبيضات الجهازية38. أظهرت العديد من التقارير دور الأجسام المضادة في تثبيط الأغشية الحيوية في المراحل المبكرة من تكوين الأغشية الحيوية. أفيد أن الأجسام المضادة متعددة النسيلة المتولدة استجابة لتكملة البروتين المرتبط بالمستقبلات 3 (CR3-RP ، التي لها دور محتمل في الالتصاق الفطري) التحصين في الأرانب قللت من الالتصاق وتكوين الأغشية الحيوية ل C. albicans على الخلايا الظهارية الشدقية39. علاوة على ذلك ، تم تحضين سلالات المبيضات بما في ذلك عزلات القسطرة بجسم مضاد متعدد النسيلة مضاد CR3-RP وجسم مضاد وحيد النسيلة ، OKM1 ، مما قلل من الالتصاق وتكوين الأغشية الحيوية. تم تقييم صلاحية الخلية ل C. albicans باستخدام مقايسة XTT خلال مرحلة الالتزام ومرحلة تكوين الأغشية الحيوية40. قامت دراسات قليلة بتقييم دور الأجسام المضادة ضد تكوين الأغشية الحيوية لأنواع المبيضات غير البيضاء. قام Chupacova et al. بتقييم فعالية الأجسام المضادة متعددة النسيلة المضادة ل CR3-RP ضد C. albicans جنبا إلى جنب مع C. dubliniensis باستخدام مقايسة XTT. تمنع الأجسام المضادة متعددة النسيلة المضادة ل CR3-RP الالتصاق وتكوين الأغشية الحيوية لكل من C. albicans و C. dubliniensis41.

في هذه الدراسة ، تم وصف بروتوكول بسيط وسريع وسهل الاستخدام لتقييم تأثير الأجسام المضادة على نضج الأغشية الحيوية وتطورها. يقيس اختبار XTT القائم على 96 بئرا النشاط الأيضي للخلايا القابلة للحياة في الأغشية الحيوية وقد تم تكييفه من الدراسات السابقة 7,8. يستخدم اختبار XTT الموصوف هنا على نطاق واسع لتقدير نمو الأغشية الحيوية القابلة للحياة. لقد أصبح اختبار صلاحية الخلية شائع الاستخدام لأنه سريع ومريح ويمكن استخدامه بتنسيق عالي الإنتاجية مثل لوحة 96 بئر. علاوة على ذلك ، يمكن استخدامه لتحديد كل من أشكال الخميرة و hyphal من الأغشية الحيوية المبيضات. يمكن استخدامه أيضا لقياس الأغشية الحيوية المبيضات على مجموعة متنوعة من الركائز مثل الأجهزة الطبية (مثل القسطرة) والعدسات اللاصقة.

تتضمن بعض الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول دوامة معلقة الخلية بقوة قبل السحب في جميع الخطوات ، لتجنب التراكم الفطري7. من المرجح أن تتطور الأغشية الحيوية الضعيفة عندما تكون كثافة الخلايا إما عالية جدا أو منخفضة جدا. لذلك ، يجب على المستخدمين اتباع كثافة الخلايا الفطرية المثالية في اللقاح الأولي7. خطوات الغسيل حرجة للغاية ويجب تجنب الغسيل المفرط للخلايا لمنع تعطيل الغشاء الحيوي22. لا ينبغي إزعاج الطبقة السفلية من الغشاء الحيوي أثناء عملية الغسيل. يجب إجراء الفحص دائما في ظروف مظلمة ، ومن الضروري تضمين نسخ متماثلة متعددة22. يجب إعداد حل جديد من XTT في كل مرة قبل الاستخدام مباشرة. نظرا لأن الفارق الزمني بين تفاعلين قد يحرف النتائج ، يجب على المستخدمين العمل بسرعة لضمان الحد الأدنى من فارق الوقت عند إضافة حل XTT إلى البئر الأول والأخير من لوحة96 بئرا 42. يوصى باستخدام رقائق معدنية أو بارافيلم لمنع التبخر. يمكن تنفيذ العديد من خطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها إذا لزم الأمر. في حالة غياب نمو الأغشية الحيوية الرقيقة أو عدم رضاها، ينبغي استخدام التخفيف المناسب للقاح البذر والحسابات الحسابية. من أجل تكوين غشاء حيوي أفضل ، يمكن تغيير ظروف الاستزراع الفرعي ، ويمكن تجربة نمو الأغشية الحيوية باستخدام مواد سطحية مختلفة. لتحسين حساسية مقايسة XTT بشكل كبير ، يمكن للمرء تقليل الوقت اللازم لتشكيل الأغشية الحيوية ، أو زيادة تركيز العامل المضاد للفطريات ، أو تقصير فترة حضانة الفحص7. لتجنب تعطيل الغشاء الحيوي ، يجب تجنب غسل الخلايا المفرط22. يمكن للمرء إما تجنب الآبار الخارجية لمنع عوامل الفحص من التعرض للضوء أو إضافة سائل إلى الآبار الخارجية لمنع العوامل من التبخر من الآبار الداخلية. يجب إعطاء غسلات لطيفة إذا تعطل الغشاء الحيوي الرقيق أثناء الغسيل22. بينما يختبر هذا البروتوكول تأثير المصل على الأغشية الحيوية مسبقة التشكيل لمدة 24 ساعة لتقييم تثبيط نضج الأغشية الحيوية ، يمكن للمستخدمين أيضا تعديل هذا البروتوكول لإضافة مصل في الوقت 0 لتقييم تثبيط تكوين الأغشية الحيوية ، وفقا لتقرير سابق30.

بالمقارنة مع الطرق البديلة الأخرى لقياس نمو الأغشية الحيوية ، فإن طريقة XTT هي الطريقة الأكثر حساسية وقابلية للتكرار والدقة والفعالية من حيث التكلفة والمحددة. على الرغم من أن اختبار XTT هو تقنية سريعة وسهلة الاستخدام بشكل شائع لتقييم الأغشية الحيوية ، إلا أن لها قيودا معينة. في حين أنه مفيد لتحديد جرعة أو تأثيرات العوامل المختلفة في الغشاء الحيوي من نوع واحد ، إلا أنه يجب استخدامه بحذر لمقارنة عزلات متعددة في وقت واحد بسبب التباين الأيضي بين العزلات21. بالنسبة لمقارنات الأغشية الحيوية بين السلالات، ينبغي إجراء توحيد تقني مفصل21. علاوة على ذلك ، في حين أن منتج XTT formazan يذوب بسهولة في المحلول ، فقد تحتفظ بعض السلالات ببعض الكمية داخل الخلية21. نظرا لوجود نقص في الوضوح يتضمن متغيرات ، مثل اختيار الوسائط ، ووقت تطوير الأغشية الحيوية ، وخصائص المصل ، فمن المستحسن إجراء فحوصات حيوية تأكيدية بالإضافة إلى مقايسة XTT ، على سبيل المثال ، قياس سمك الغشاء الحيوي / الكتلة الحيوية (باستخدام البنفسجي البلوري) أو صلاحية الخلية (باستخدام طريقة CFU)43. تجدر الإشارة إلى أن نتائج مقايسة XTT هذه مرتبطة جيدا بمقايسة البنفسج البلوري وطريقة CFU (البيانات غير معروضة). على الرغم من القيود المذكورة أعلاه ، يمكن استقراء هذه الطريقة لتقييم مجموعات مختلفة من عينات المصل (مصدر الأجسام المضادة متعددة النسيلة) ، أو الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ، أو العلاجات المناعية المساعدة. على الرغم من أن بروتوكول الاختزال XTT المقدم هنا يظهر فقط تأثير الأجسام المضادة على الأغشية الحيوية C. tropicalis ، فقد استخدمه الباحثون لدراسة تأثير الأجسام المضادة على الأغشية الحيوية C. auris أيضا18. بالإضافة إلى ذلك ، فإن هذا البروتوكول مستمد من الدراسات السابقة التي أجريت مع أنواع المبيضات الأخرى مثل C. albicans و C. parapsilosis و C. glabrata و C. dubliniensis و C. tropicalis و C. auris، والتي يمكن أن تستحق تمديد هذا البروتوكول إلى جنس المبيضات16،41،44،45،46،47.

يمكن أن يؤدي التحسين والتوحيد القياسي والتحسين المنتظم في فحوصات القياس الكمي للغشاء الحيوي إلى تعزيز الدقة والإنتاجية وقابلية التكاثر. تم استخدام مقايسة الحد XTT التي يستند إليها هذا البروتوكول على نطاق واسع لتقييم النشاط الأيضي وصلاحية الأغشية الحيوية. نظرا لأن المبيضات البيوفيلم غالبا ما تكون مقاومة للأدوية المضادة للفطريات ، فإن استكشاف أدوية جديدة وتركيبات جديدة يعد ضرورة ملحة33. لمكافحة مشكلة العدوى المرتبطة بالأغشية الحيوية، يجب استكشاف المزيد من مركبات الأغشية الحيوية باستخدام مقايسات فحص الأغشية الحيوية48. يمكن استخدام هذا البروتوكول في المختبر للتحقق من تأثير المركبات المضادة للفطريات الجديدة المحتملة على النشاط الأيضي لخلايا أنواع المبيضات في الأغشية الحيوية. قد تساعد الأبحاث المستقبلية القائمة على توحيد وتحسين مقايسة الحد من XTT التي تتضمن العلاجات المناعية القائمة على الأجسام المضادة في تطوير علاجات محسنة لإدارة الأمراض ومكافحتها بشكل فعال.

تم الإبلاغ عن تثبيط الأغشية الحيوية بواسطة الأجسام المضادة الخاصة ب Sap2 كآلية حماية بوساطة الأجسام المضادة في الحماية بوساطة لقاح Sap2 أثناء داء المبيضات الجهازي للفئران الناجم عن C. tropicalis19. أظهرت دراسة سابقة أيضا أن CAGTA يحتمل أن تتعرف على مستضدات Sap تقلل من نمو وتكوين الأغشية الحيوية ل C. albicans في المختبر16. في دراسة أخرى ، أظهرت الطفرات المحذوفة من Sap2 عيبا في نمو الأغشية الحيوية في وجود الببستاتين A49. بالإضافة إلى ذلك ، أثناء تكوين الأغشية الحيوية ، لعب مستضد Sap2 دورا في المعالجة المحللة للبروتين للموسين Msb2 بوساطة مسار إشارات بروتين كيناز المنشط بالميتوجينCek1 50. لذلك ، يمكن التكهن بأن معالجة Msb2 يتم تثبيطها عن طريق تحييد Sap2 بوساطة الأجسام المضادة ، مما يؤثر على سلامة الأغشية الحيوية. باختصار ، توفر هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لتقييم دور الأجسام المضادة في المصل في نضوج وتطور الأغشية الحيوية C. tropicalis ، والتي يمكن تطبيقها لتحديد النشاط الأيضي للغشاء الحيوي في بيئات مختلفة ، باستخدام سلالات فطرية مختلفة أو مصادر الأجسام المضادة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من خلال منحة Ramalingaswami DBT-843-BIO (قسم التكنولوجيا الحيوية ، حكومة الهند) وجائزة البحث الوظيفي المبكر SER-1058-BIO (مجلس أبحاث العلوم والهندسة ، حكومة الهند) إلى SR. يقر المؤلفون بمنحة ICMR-JRF إلى P.C ومنحة DBT-JRF إلى P.S. يشكر المؤلفون الدكتور رافيكانت رانجان على اقتراحاته بشأن المخطوطة والمساعدة الفنية التي قدمها السيد براديب سينغ ثاكور خلال SEM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical centrifuge tubes BD Falcon 546021
1x PBS - Prepared in lab NaCl : 4 g
KCl : 0.1 g
Na2HPO4:  0.72 g
KH2PO4 : 0.12 g
Water 500 mL. Adjust pH to 7.4
50 mL conical centrifuge tubes BD Falcon 546041
96-well microtiter plates Nunc 442404
Incubator Generic
Menadione Sigma M5625
Microtiter Plate Reader Generic
Multichannel pipette and tips Generic
Petri dishes Tarson 460090
Ringers Lactate - Prepared in lab sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0 
RPMI 1640 MOPS Himedia AT180
Sabouraud dextrose Agar SRL 24613
Sabouraud dextrose Broth SRL 24835
XTT  Invitrogen X6493

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R. O., Denning, D. W. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).
  2. Pappas, P., Lionakis, M., Arendrup, M., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. Invasive candidiasis. Nature Reviews Disease Primers. 4, 18026 (2018).
  3. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  4. Pemmaraju, S. C., Padmapriya, K., Pruthi, P. A., Prasad, R., Pruthi, V. Impact of oxidative and osmotic stresses on Candida albicans biofilm formation. Biofouling. 32 (8), 897-909 (2016).
  5. Cavalheiro, M., Teixeira, M. C. Candida biofilms: threats, challenges, and promising strategies. Frontiers in Medicine. 5, 28 (2018).
  6. Roilides, E., Simitsopoulou, M., Katragkou, A., Walsh, T. J. How biofilms evade host defenses. Microbiology Spectrum. 3 (3), 3 (2015).
  7. Pierce, C. G., et al. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nature Protocols. 3 (9), 1494-1500 (2008).
  8. Pierce, C. G., Uppuluri, P., Tummala, S., Lopez-Ribot, J. L. A 96 well microtiter plate-based method for monitoring formation and antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Journal of Visualized Experiments. (44), e2287 (2010).
  9. Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 49 (6), 973-980 (2002).
  10. Quindós, G. Epidemiology of candidaemia and invasive candidiasis. A changing face. Revista Iberoamericana de Micología. 31 (1), 42-48 (2014).
  11. Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofilms and the host: models and new concepts for eradication. International Journal of Microbiology. 2012, 845352 (2012).
  12. Wall, G., Montelongo-Jauregui, D., Vidal Bonifacio, B., Lopez-Ribot, J., Uppuluri, P. Candida albicans biofilm growth and dispersal: contributions to pathogenesis. Current Opinion in Microbiology. 52, 1-6 (2019).
  13. Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, M. J. S. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62, 10-24 (2013).
  14. LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).
  15. Galdiero, E., et al. Eradication of Candida albicans persister cell biofilm by the membranotropic peptide gH625. Scientific Reports. 10 (1), 5780 (2020).
  16. Carrano, G., et al. Anti-Candida albicans germ tube antibodies reduce in vitro growth and biofilm formation of C. albicans. Revista Iberoamericana de Micología. 36 (1), 9-16 (2019).
  17. Alqarihi, A., Singh, S., Edwards, J. E., Ibrahim, A. S., Uppuluri, P. NDV-3A vaccination prevents C. albicans colonization of jugular vein catheters in mice. Scientific Reports. 9 (1), 6194 (2019).
  18. Singh, S., et al. The NDV-3A vaccine protects mice from multidrug resistant Candida auris infection. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007460 (2019).
  19. Shukla, M., Rohatgi, S. Vaccination with secreted aspartyl proteinase 2 protein from Candida parapsilosis can enhance survival of mice during C. tropicalis-mediated systemic candidiasis. Infection and Immunity. 88 (10), 00312-00320 (2020).
  20. Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT. Journal of Immunological Methods. 142 (2), 257-265 (1991).
  21. Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism. Journal of Clinical Microbiology. 41 (1), 506-508 (2003).
  22. Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. Journal of Clinical Microbiology. 49 (4), 1426-1433 (2011).
  23. Taff, H. T., Nett, J. E., Andes, D. R. Comparative analysis of Candida biofilm quantitation assays. Medical Mycology. 50 (2), 214-218 (2012).
  24. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
  25. Dhale, R. P., Ghorpade, M. V., Dharmadhikari, C. A. Comparison of various methods used to detect biofilm production of Candida species. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 8 (11), 18-20 (2014).
  26. Moffa, E. B., et al. Interaction between XTT assay and candida albicans or streptococcus mutans viability. Journal of International Oral Health. 8 (1), 12 (2016).
  27. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
  28. Harriott, M. M., Noverr, M. C. Ability of Candida albicans mutants to induce Staphylococcus aureus vancomycin resistance during polymicrobial biofilm formation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (9), 3746-3755 (2010).
  29. Pierce, C. G., et al. A novel small molecule inhibitor of Candida albicans biofilm formation, filamentation and virulence with low potential for the development of resistance. NPJ Biofilms and Microbiomes. 1, 15012 (2015).
  30. Dekkerová, J., Lopez-Ribot, J. L., Bujdáková, H. Activity of anti-CR3-RP polyclonal antibody against biofilms formed by Candida auris, a multidrug-resistant emerging fungal pathogen. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 101-108 (2019).
  31. Muzny, C. A., Schwebke, J. R. Biofilms: an underappreciated mechanism of treatment failure and recurrence in vaginal infections. Clinical Infectious Diseases. 61 (4), 601-606 (2015).
  32. Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 14-19 (2004).
  33. Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiology. 8 (10), 1325-1337 (2013).
  34. Singh, R., Kumari, A., Kaur, K., Sethi, P., Chakrabarti, A. Relevance of antifungal penetration in biofilm-associated resistance of Candida albicans and non-albicans Candida species. Journal of Medical Microbiology. 67 (7), 922-926 (2018).
  35. Gulati, M., Ennis, C. L., Rodriguez, D. L., Nobile, C. J. Visualization of biofilm formation in Candida albicans using an automated microfluidic device. Journal of Visualized Experiments. (130), e56743 (2017).
  36. Krom, B. P., Willems, H. M. In vitro models for Candida biofilm development. Candida Species. , Humana Press. New York, NY. 95-105 (2016).
  37. Gu, W., Xu, D., Guo, D., Zhang, L., Sun, S. In vivo models for Candida albicans biofilms study, research & reviews. Journal of Microbiology and Biotechnology. 5 (1), 26-31 (2016).
  38. Shukla, M., Chandley, P., Rohatgi, S. The role of B-cells and antibodies against Candida vaccine antigens in invasive candidiasis. Vaccines. 9 (10), 1159 (2021).
  39. Bujdáková, H., et al. Antibody response to the 45 kDa Candida albicans antigen in an animal model and potential role of the antigen in adherence. Journal of Medical Microbiology. 57 (12), 1466-1472 (2008).
  40. Bujdáková, H., Paulovicová, E., Paulovicová, L., Simová, Z. Participation of the Candida albicans surface antigen in adhesion, the first phase of biofilm development. FEMS Immunology & Medical Microbiology. 59 (3), 485-492 (2010).
  41. Chupácová, J., Borghi, E., Morace, G., Los, A., Bujdáková, H. Anti-biofilm activity of antibody directed against surface antigen complement receptor 3-related protein-comparison of Candida albicans and Candida dubliniensis. Pathogens and Disease. 76 (1), 127 (2018).
  42. Gulati, M., et al. In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), 60 (2018).
  43. Ramage, G. Comparing apples and oranges: considerations for quantifying candidal biofilms with XTT [2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide] and the need for standardized testing. Journal of Medical Microbiology. 65 (4), 259-260 (2016).
  44. Kovács, R., et al. Synergistic effect of nikkomycin Z with caspofungin and micafungin against Candida albicans and Candida parapsilosis biofilms. Letters in Applied Microbiology. 69 (4), 271-278 (2019).
  45. Fernández-Calderón, M. C., et al. Antifungal and anti-biofilm activity of a new Spanish extract of propolis against Candida glabrata. BMC Complementary Medicine and Therapies. 21 (1), 1-10 (2021).
  46. Li, Z., et al. Synergistic effect of pseudolaric acid B with fluconazole against resistant isolates and biofilm of Candida tropicalis. Infection and Drug Resistance. 13, 2733-2743 (2020).
  47. Chatzimoschou, A., Giampani, A., Meis, J. F., Roilides, E. Activities of nine antifungal agents against Candida auris biofilms. Mycoses. 64 (4), 381-384 (2021).
  48. Haney, E. F., Trimble, M. J., Cheng, J. T., Vallé, Q., Hancock, R. Critical assessment of methods to quantify biofilm growth and evaluate antibiofilm activity of host defence peptides. Biomolecules. 8 (2), 29 (2018).
  49. Puri, S., et al. Secreted aspartic protease cleavage of Candida albicans Msb2 activates Cek1 MAPK signaling affecting biofilm formation and oropharyngeal candidiasis. PLoS One. 7, 46020 (2012).
  50. Staib, P., et al. Tetracycline-inducible expression of individual secreted aspartic proteases in Candida albicans allows isoenzyme-specific inhibitor screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (1), 146-156 (2008).

Tags

علم المناعة والعدوى ، العدد 187 ،
مقايسة اختزال قابلة للذوبان تعتمد على التترازوليوم لتقييم تأثير الأجسام المضادة على الأغشية الحيوية <em>المبيضات الاستوائية</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chandley, P., Subba, P., Rohatgi, S. … More

Chandley, P., Subba, P., Rohatgi, S. A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms. J. Vis. Exp. (187), e64425, doi:10.3791/64425 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter