Summary

בדיקת הפחתה מסיסה המבוססת על טטרזוליום להערכת השפעת נוגדנים על ביופילמים של קנדידה טרופיקליס

Published: September 16, 2022
doi:

Summary

פרוטוקול מבוסס צלחת מיקרוטיטר 96-well המשתמש ב-2,3-ביס(2-מתוקסי-4-ניטרו-5-סולפופניל)-5-קרבוקסילייד-2H-tetrazolium (XTT) מתואר כאן, כדי לחקור את השפעת הנוגדנים על ביופילמים שנוצרו על ידי C. tropicalis. ניתן להשתמש בפרוטוקול in vitro זה כדי לבדוק את ההשפעה של תרכובות אנטי-פטרייתיות חדשות פוטנציאליות על הפעילות המטבולית של תאי מין קנדידה בביופילמים.

Abstract

מיני קנדידה הם הגורם הרביעי בשכיחותו לזיהומים נוסוקומיאליים מערכתיים. קנדידה מערכתית או פולשנית כרוכה לעתים קרובות בהיווצרות ביופילם במכשירים מושתלים או בצנתרים, הקשורה לעלייה באלימות ובתמותה. ביופילמים המיוצרים על ידי זני קנדידה שונים מפגינים עמידות משופרת נגד תרופות אנטי פטרייתיות שונות. לכן, יש צורך לפתח אימונותרפיות יעילות או טיפולים משלימים נגד ביופילמים של קנדידה. בעוד שתפקיד החסינות התאית מבוסס היטב בהגנה נגד קנדידה, תפקידה של חסינות הומורלית נחקר פחות.

הועלתה השערה כי עיכוב היווצרות ביופילם והבשלתו הוא אחד התפקידים העיקריים של נוגדנים מגנים, ונוגדנים של צינוריות חיידקים קנדידה אלביקנס (CAGTA) הוכחו כמדכאים צמיחה במבחנה והיווצרות ביופילם של C. albicans מוקדם יותר. מאמר זה מתווה פרוטוקול מפורט להערכת תפקידם של נוגדנים על ביופילמים שנוצרו על ידי C. tropicalis. המתודולוגיה של פרוטוקול זה כוללת היווצרות ביופילם C. tropicalis בלוחות מיקרוטיטרים בעלי 96 בארות, אשר לאחר מכן דוגרו בנוכחות או בהיעדר נוגדנים ספציפיים לאנטיגן, ולאחר מכן 2,3-ביס(2-מתוקסי-4-ניטרו-5-סולפופניל)-5-קרבוקסניליד-2H-tetrazolium (XTT) למדידת הפעילות המטבולית של תאים פטרייתיים בביופילם.

הספציפיות אושרה על ידי שימוש בבקרות מתאימות בסרום, כולל סרום מדולדל בנוגדנים ספציפיים ל-Sap2. התוצאות מראות כי נוגדנים הנמצאים בסרום של בעלי חיים מחוסנים יכולים לעכב את הבשלת הביופילם של קנדידה במבחנה. לסיכום, מאמר זה מספק תובנות חשובות לגבי הפוטנציאל של נוגדנים בפיתוח אימונותרפיות חדשניות וטיפולים סינרגטיים או משלימים נגד ביופילמים במהלך קנדידה פולשנית. ניתן להשתמש בפרוטוקול in vitro זה כדי לבדוק את ההשפעה של תרכובות אנטי-פטרייתיות חדשות פוטנציאליות על הפעילות המטבולית של תאי מין קנדידה בביופילמים.

Introduction

קנדידה מערכתית היא הגורם העיקרי הרביעי לזיהומים נוסוקומיאליים, הקשורים לשיעורי תחלואה ותמותה גבוהים ברחבי העולם. ברחבי העולם, קנדידה מערכתית משפיעה על כ 700,000 אנשים1. מיני קנדידה, כלומר C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata, ו- C. auris, הם הגורם השכיח ביותר לזיהומים פולשניים בקנדידה 2. מיני קנדידה הם פתוגנים אופורטוניסטיים המייצרים ביופילמים3. ביופילמים קשורים בעיקר לאלימות של קנדידה, וקנדידה יכולה לעמוד בתנאי עקה חמצוניים ואוסמוטיים על ידי גרימת היווצרות ביופילם4. ביופילמים מווסתים עוד יותר את הביטוי של גורמי אלימות ורכיבי דופן התא ויוצרים מטריצת הגנה אקסופולימרית, המסייעת לקנדידה להסתגל לנישות מארחות שונות4. ביופילמים תורמים להיצמדות השמרים ברקמות המארחות ובמכשירים רפואיים5. ככזה, יצירת ביופילם קשורה ליתרון לשמרים, שכן תאי שמרים בתוך הביופילמים יכולים לחמוק מהתגובה החיסונית של המארח6. היווצרות ביופילם גם מגנה על השמרים הפתוגניים מפני פעולה של תרופות אנטי פטרייתיות5. ירידה ברגישות של ביופילמים של C. albicans לאמפוטריצין B הודגמה על ידי Pierce et al.7,8. יתר על כן, ביופילמים מדגימים עמידות של תרופה אנטי-פטרייתית לפלוקונזול, מה שפוגע בניהול יעיל של קנדידה סיסטמית 9,10.

למיקרובים יש נטייה פנימית להיצמד למשטחים ביוטיים וא-ביוטיים שונים, מה שמביא להיווצרות ביופילם. קנדידה אלביקנס, שהיא פטרייה דימורפית, קיימת בצורות שמרים והיפאלים, והיווצרות הביופילם שלה אופיינה במערכות שונות במבחנה ובמודל in vivo 11. השלבים של היווצרות ביופילם כוללים הידבקות של תאי קנדידה למצע, נימה, שגשוג והבשלת ביופילם11. בתחילה, צורת השמרים של C. albicans נצמדת למצעים, כולל מכשירים רפואיים ורקמות אנושיות, ולאחר מכן נימה והתפשטות של C. albicans לצורות hyphal ו pseudohyphal, ולבסוף התבגרות של ביופילמים מוטבע מטריצה חוץ-תאית11. היווצרות ביופילם תורמת במידה רבה למנגנוני הפתוגנזה של C. albicans 12. מיני קנדידה יוצרים ביופילמים עמידים לתרופות, מה שהופך את חיסולם למאתגר13. תת-קבוצה קטנה של אוכלוסיית ייצור הביופילם C. albicans תוארה כבעלת עמידות גבוהה לתרופות האנטי-פטרייתיות אמפוטריצין B וכלורהקסידין14. יש לציין כי תאי שמרים בביופילמים מפגינים עמידות גבוהה לטיפול רב-תכליתי בהשוואה לתאי שמרים בשלב הפלנקטוני ובשלב ההתרבות14. הוצע כי תאי שמרים הקיימים בביופילמים עמידים מאוד לתרופות אנטי פטרייתיות, מה שתורם להישרדות C. albicans בביופילמים14. תאים קיימים אלה דווחו כגרסאות פנוטיפיות של C. albicans ולא מוטנטים14. יתר על כן, תאים של ביופילמים של קנדידה המכונים “תאים מתמידים” סובלניים למינונים גבוהים של טיפול באמפוטריצין-B ותורמים להישרדות הקנדידה, ובכך מהווים נטל גדול של זיהומי קנדידה סיסטמיים חוזרים ונשנים אצל אנשים בסיכון גבוה15.

העלייה בעמידות לתרופות אנטי-פטרייתיות בזני קנדידה מחייבת מחקר עבור חומרים אנטי-פטרייתיים ואימונותרפיות חדשים. כפי שניתן לראות מהמחקרים שהוזכרו לעיל, ביופילמים של קנדידה מראים ירידה ברגישות לתרופות אנטי פטרייתיות. לכן, יש צורך באימונותרפיות משופרות כדי לשלוט בהיווצרות הביופילם של קנדידה. מחקרים קודמים הראו כי CAGTA יכול לספק הגנה יעילה מפני זיהומים סיסטמיים של קנדידה על ידי עיכוב היווצרות ביופילם של C. albicans במבחנה16. מחקר אחר דיווח כי חיסון של עכברים עם חלבון C. albicans rAls3-N משרה רמות נוגדנים גבוהות שמפריעות להיווצרות ביופילם של C. albicans במבחנה17. נוגדנים נגד Als3-N הפעילו גם השפעה מעכבת על פיזור C. albicans מביופילמים17. חיסון NDV-3A המבוסס על C. albicans נמצא כעת בניסוי קליני ונגד NDV-3A sera נמצאו גם כמפחיתים את היווצרות הביופילם C. auris 18. מחקר שנערך לאחרונה זיהה עיכוב של היווצרות ביופילם על ידי נוגדנים Sap2 כמנגנון הגנה במודל מורין של קנדידה מערכתית19.

מאמר זה מתווה פרוטוקול מבחנה מפורט להערכת ההשפעה של נוגדנים ספציפיים לאנטיגן הנמצאים בסרום פוליקלונלי המתקבל מקבוצות שונות של עכברים מחוסנים ב-Sap2 על ביופילמים מוכנים מראש של קנדידה טרופיקליס . כדי להשיג זאת, שיטה המבוססת על בדיקת הפחתת XTT עברה אופטימיזציה ופותחה במעבדה, שיכולה למדוד את כדאיות הביופילם באופן מהיר, רגיש ובעל תפוקה גבוהה, בנוכחות או בהיעדר נוגדנים.

מבחן XTT משמש למדידת הפעילות המטבולית של התאים כאינדיקטור לכדאיות התאים, התפשטות התאים וציטוטוקסיות20. בדיקה קולורימטרית זו מבוססת על הפחתה של מלח טטרזוליום צהוב, נתרן 3′-[1-(פנילאמינוקרוניל)-3,4-טטרזוליום]-ביס (4-מתוקסי-6-ניטרו) בנזן חומצה סולפונית הידרט (XTT) לצבע פורמאזן כתום על ידי תאים פעילים מטבולית. מכיוון שרק תאים בני קיימא יכולים להפחית XTT, כמות הפורמאזן המופחתת של XTT פרופורציונלית לעוצמת הצבע ולכדאיות התא. הצבע הפורמזני שנוצר מסיס במים ומכמת אותו ישירות באמצעות קורא צלחות. בשל אופיו המסיס במים, מבחן XTT מאפשר לחקור ביופילמים שלמים, כמו גם בדיקה של רגישות לתרופות ביופילם, ללא הפרעה למבנה הביופילם21. בנוסף, שיטה זו מיושמת בהערכות כדאיות פטרייתיות של קנדידה בשל קלות השימוש, המהירות, הדיוק, התפוקה הגבוהה והרמה הגבוהה של יכולת השחזור 7,22.

בנוסף לבדיקת הפחתת XTT, זוהו גם טכניקות חלופיות רבות למדידת כמות הביופילם. חלקם כוללים שימוש בבדיקת הפחתת MTT, צביעת סגול גבישי, כימות DNA, PCR כמותי, כימות חלבונים, מדידת משקל תא יבש וספירת מושבות בת קיימא. נהלים אלה משתנים מאוד מבחינת דרישות הזמן והעלות שלהם. Taff et al. ביצעו ניתוח השוואתי של שבעה מבחני כמות שונים של קנדידה ביופילם ומצאו כי בדיקת XTT סיפקה את השיטה הניתנת לשחזור, מדויקת ויעילה ביותר להערכה כמותית של ביופילמים של C. albicans 23. טכניקות צביעה כגון סגול קריסטל יש מגבלות מסוימות; בדיקת סגול הגביש קובעת בעקיפין את כמות הביופילם על ידי מדידת הצפיפות האופטית של מטריצת הביופילם והתאים המוכתמים בסגול. אף על פי שהבדיקה הסגולה הגבישית מספקת מדידה טובה של מסת הביופילם, היא אינה נותנת מדד לכדאיות הביופילם מכיוון שהיא מכתימה הן את התאים המיקרוביאליים והן את המטריצה החוץ-תאית24. Dhale et al. דיווחו עוד כי בדיקת הפחתת XTT הייתה השיטה הרגישה, הניתנת לשחזור, המדויקת, היעילה והספציפית ביותר לזיהוי ייצור ביופילם בהשוואה למבחן סגול גבישי25. דוחות ספרות הראו כי בדיקת XTT מתואמת היטב עם פרמטר CFU/mL בשיטת ספירת CFU. עם זאת, בהשוואה למבחן XTT, שיטת CFU היא עתירת עבודה ואיטית26. יתר על כן, ייתכן שהחלק של תאים חיים מנותקים אינו מייצג את אוכלוסיית הביופילם הראשונית27. למרות שבדיקת הפחתת XTT נראית כאפשרות הטובה ביותר הזמינה לכימות הכדאיות, ישנן כמה מגבלות של טכניקה זו. בעוד ששיטת XTT שימושית להשוואות הכוללות זן פטרייתי אחד, השימוש בה עשוי להיות מוגבל כאשר משווים זנים ומינים פטרייתיים שונים. השוואות בין-גזעיות עשויות להיות קשות בהיעדר סטנדרטיזציה מפורטת מכיוון שזנים שונים מעכלים מצעים בעלי יכולות שונות21.

Protocol

עכברי BALB/c שוכנו במתקן החיות הקטן ב- IIT Roorkee. כל בעלי החיים הוחזקו במחזור אור:חושך של 12 שעות:12 שעות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס וסופקו להם דיאטת גלולות ומים עד ליביטום. כל ההליכים למען בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לאתיקה של בעלי חיים (IAEC) של IIT Roorkee. 1. הכנת C. tropica…

Representative Results

הביופילמים של קנדידה טרופיקליס גודלו בלוחות מיקרוטיטרים של 96 בארות והצטלמו לפי 40 באמצעות מיקרוסקופ הפוך (איור 1A). הביופילם הוכתם עוד יותר באמצעות סיגלית גבישית ונצפה פי 40 באמצעות מיקרוסקופ הפוך (איור 1B). מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת מראה תמונה מייצגת …

Discussion

זיהומים פטרייתיים הנגרמים על ידי זני קנדידה קשורים לשיעורי תחלואה ותמותה גבוהים ברחבי העולם. האיום הגובר של זיהום פטרייתי פולשני מחייב ניהול מוקדם של מחלות מסכנות חיים כאלה. רוב זיהומי הקנדידה כרוכים בהיווצרות ביופילמים, אשר דבקים במגוון מכשירים רפואיים ואחראים להתמדה ולהישנו…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענק Ramalingaswami DBT-843-BIO (המחלקה לביוטכנולוגיה, ממשלת הודו) ופרס מחקר קריירה מוקדמת SER-1058-BIO (מועצת המחקר למדע והנדסה, ממשלת הודו) ל- S.R. המחברים מכירים במענק ICMR-JRF ל-P.C ובמענק DBT-JRF ל-P.S. המחברים מודים לד”ר רביקאנט רנג’אן על ההצעות על כתב היד ועל הסיוע הטכני של מר פראדיפ סינג תאקור במהלך SEM.

Materials

15 mL conical centrifuge tubes BD Falcon 546021
1x PBS Prepared in lab NaCl : 4 g
KCl : 0.1 g
Na2HPO4:  0.72 g
KH2PO4 : 0.12 g
Water 500 mL. Adjust pH to 7.4
50 mL conical centrifuge tubes BD Falcon 546041
96-well microtiter plates Nunc 442404
Incubator Generic
Menadione Sigma M5625
Microtiter Plate Reader Generic
Multichannel pipette and tips Generic
Petri dishes Tarson 460090
Ringers Lactate Prepared in lab sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0 
RPMI 1640 MOPS Himedia AT180
Sabouraud dextrose Agar SRL 24613
Sabouraud dextrose Broth SRL 24835
XTT  Invitrogen X6493

References

  1. Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R. O., Denning, D. W. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).
  2. Pappas, P., Lionakis, M., Arendrup, M., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. Invasive candidiasis. Nature Reviews Disease Primers. 4, 18026 (2018).
  3. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  4. Pemmaraju, S. C., Padmapriya, K., Pruthi, P. A., Prasad, R., Pruthi, V. Impact of oxidative and osmotic stresses on Candida albicans biofilm formation. Biofouling. 32 (8), 897-909 (2016).
  5. Cavalheiro, M., Teixeira, M. C. Candida biofilms: threats, challenges, and promising strategies. Frontiers in Medicine. 5, 28 (2018).
  6. Roilides, E., Simitsopoulou, M., Katragkou, A., Walsh, T. J. How biofilms evade host defenses. Microbiology Spectrum. 3 (3), 3 (2015).
  7. Pierce, C. G., et al. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nature Protocols. 3 (9), 1494-1500 (2008).
  8. Pierce, C. G., Uppuluri, P., Tummala, S., Lopez-Ribot, J. L. A 96 well microtiter plate-based method for monitoring formation and antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Journal of Visualized Experiments. (44), e2287 (2010).
  9. Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 49 (6), 973-980 (2002).
  10. Quindós, G. Epidemiology of candidaemia and invasive candidiasis. A changing face. Revista Iberoamericana de Micología. 31 (1), 42-48 (2014).
  11. Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofilms and the host: models and new concepts for eradication. International Journal of Microbiology. 2012, 845352 (2012).
  12. Wall, G., Montelongo-Jauregui, D., Vidal Bonifacio, B., Lopez-Ribot, J., Uppuluri, P. Candida albicans biofilm growth and dispersal: contributions to pathogenesis. Current Opinion in Microbiology. 52, 1-6 (2019).
  13. Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, M. J. S. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62, 10-24 (2013).
  14. LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).
  15. Galdiero, E., et al. Eradication of Candida albicans persister cell biofilm by the membranotropic peptide gH625. Scientific Reports. 10 (1), 5780 (2020).
  16. Carrano, G., et al. Anti-Candida albicans germ tube antibodies reduce in vitro growth and biofilm formation of C. albicans. Revista Iberoamericana de Micología. 36 (1), 9-16 (2019).
  17. Alqarihi, A., Singh, S., Edwards, J. E., Ibrahim, A. S., Uppuluri, P. NDV-3A vaccination prevents C. albicans colonization of jugular vein catheters in mice. Scientific Reports. 9 (1), 6194 (2019).
  18. Singh, S., et al. The NDV-3A vaccine protects mice from multidrug resistant Candida auris infection. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007460 (2019).
  19. Shukla, M., Rohatgi, S. Vaccination with secreted aspartyl proteinase 2 protein from Candida parapsilosis can enhance survival of mice during C. tropicalis-mediated systemic candidiasis. Infection and Immunity. 88 (10), 00312-00320 (2020).
  20. Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT. Journal of Immunological Methods. 142 (2), 257-265 (1991).
  21. Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism. Journal of Clinical Microbiology. 41 (1), 506-508 (2003).
  22. Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. Journal of Clinical Microbiology. 49 (4), 1426-1433 (2011).
  23. Taff, H. T., Nett, J. E., Andes, D. R. Comparative analysis of Candida biofilm quantitation assays. Medical Mycology. 50 (2), 214-218 (2012).
  24. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
  25. Dhale, R. P., Ghorpade, M. V., Dharmadhikari, C. A. Comparison of various methods used to detect biofilm production of Candida species. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 8 (11), 18-20 (2014).
  26. Moffa, E. B., et al. Interaction between XTT assay and candida albicans or streptococcus mutans viability. Journal of International Oral Health. 8 (1), 12 (2016).
  27. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
  28. Harriott, M. M., Noverr, M. C. Ability of Candida albicans mutants to induce Staphylococcus aureus vancomycin resistance during polymicrobial biofilm formation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (9), 3746-3755 (2010).
  29. Pierce, C. G., et al. A novel small molecule inhibitor of Candida albicans biofilm formation, filamentation and virulence with low potential for the development of resistance. NPJ Biofilms and Microbiomes. 1, 15012 (2015).
  30. Dekkerová, J., Lopez-Ribot, J. L., Bujdáková, H. Activity of anti-CR3-RP polyclonal antibody against biofilms formed by Candida auris, a multidrug-resistant emerging fungal pathogen. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 101-108 (2019).
  31. Muzny, C. A., Schwebke, J. R. Biofilms: an underappreciated mechanism of treatment failure and recurrence in vaginal infections. Clinical Infectious Diseases. 61 (4), 601-606 (2015).
  32. Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 14-19 (2004).
  33. Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiology. 8 (10), 1325-1337 (2013).
  34. Singh, R., Kumari, A., Kaur, K., Sethi, P., Chakrabarti, A. Relevance of antifungal penetration in biofilm-associated resistance of Candida albicans and non-albicans Candida species. Journal of Medical Microbiology. 67 (7), 922-926 (2018).
  35. Gulati, M., Ennis, C. L., Rodriguez, D. L., Nobile, C. J. Visualization of biofilm formation in Candida albicans using an automated microfluidic device. Journal of Visualized Experiments. (130), e56743 (2017).
  36. Krom, B. P., Willems, H. M. In vitro models for Candida biofilm development. Candida Species. , 95-105 (2016).
  37. Gu, W., Xu, D., Guo, D., Zhang, L., Sun, S. In vivo models for Candida albicans biofilms study, research & reviews. Journal of Microbiology and Biotechnology. 5 (1), 26-31 (2016).
  38. Shukla, M., Chandley, P., Rohatgi, S. The role of B-cells and antibodies against Candida vaccine antigens in invasive candidiasis. Vaccines. 9 (10), 1159 (2021).
  39. Bujdáková, H., et al. Antibody response to the 45 kDa Candida albicans antigen in an animal model and potential role of the antigen in adherence. Journal of Medical Microbiology. 57 (12), 1466-1472 (2008).
  40. Bujdáková, H., Paulovicová, E., Paulovicová, L., Simová, Z. Participation of the Candida albicans surface antigen in adhesion, the first phase of biofilm development. FEMS Immunology & Medical Microbiology. 59 (3), 485-492 (2010).
  41. Chupácová, J., Borghi, E., Morace, G., Los, A., Bujdáková, H. Anti-biofilm activity of antibody directed against surface antigen complement receptor 3-related protein-comparison of Candida albicans and Candida dubliniensis. Pathogens and Disease. 76 (1), 127 (2018).
  42. Gulati, M., et al. In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), 60 (2018).
  43. Ramage, G. Comparing apples and oranges: considerations for quantifying candidal biofilms with XTT [2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide] and the need for standardized testing. Journal of Medical Microbiology. 65 (4), 259-260 (2016).
  44. Kovács, R., et al. Synergistic effect of nikkomycin Z with caspofungin and micafungin against Candida albicans and Candida parapsilosis biofilms. Letters in Applied Microbiology. 69 (4), 271-278 (2019).
  45. Fernández-Calderón, M. C., et al. Antifungal and anti-biofilm activity of a new Spanish extract of propolis against Candida glabrata. BMC Complementary Medicine and Therapies. 21 (1), 1-10 (2021).
  46. Li, Z., et al. Synergistic effect of pseudolaric acid B with fluconazole against resistant isolates and biofilm of Candida tropicalis. Infection and Drug Resistance. 13, 2733-2743 (2020).
  47. Chatzimoschou, A., Giampani, A., Meis, J. F., Roilides, E. Activities of nine antifungal agents against Candida auris biofilms. Mycoses. 64 (4), 381-384 (2021).
  48. Haney, E. F., Trimble, M. J., Cheng, J. T., Vallé, Q., Hancock, R. Critical assessment of methods to quantify biofilm growth and evaluate antibiofilm activity of host defence peptides. Biomolecules. 8 (2), 29 (2018).
  49. Puri, S., et al. Secreted aspartic protease cleavage of Candida albicans Msb2 activates Cek1 MAPK signaling affecting biofilm formation and oropharyngeal candidiasis. PLoS One. 7, 46020 (2012).
  50. Staib, P., et al. Tetracycline-inducible expression of individual secreted aspartic proteases in Candida albicans allows isoenzyme-specific inhibitor screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (1), 146-156 (2008).

Play Video

Cite This Article
Chandley, P., Subba, P., Rohatgi, S. A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms. J. Vis. Exp. (187), e64425, doi:10.3791/64425 (2022).

View Video