Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

בדיקת הפחתה מסיסה המבוססת על טטרזוליום להערכת השפעת נוגדנים על ביופילמים של קנדידה טרופיקליס

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64425
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Roorkee
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול מבוסס צלחת מיקרוטיטר 96-well המשתמש ב-2,3-ביס(2-מתוקסי-4-ניטרו-5-סולפופניל)-5-קרבוקסילייד-2H-tetrazolium (XTT) מתואר כאן, כדי לחקור את השפעת הנוגדנים על ביופילמים שנוצרו על ידי C. tropicalis. ניתן להשתמש בפרוטוקול in vitro זה כדי לבדוק את ההשפעה של תרכובות אנטי-פטרייתיות חדשות פוטנציאליות על הפעילות המטבולית של תאי מין קנדידה בביופילמים.

Abstract

מיני קנדידה הם הגורם הרביעי בשכיחותו לזיהומים נוסוקומיאליים מערכתיים. קנדידה מערכתית או פולשנית כרוכה לעתים קרובות בהיווצרות ביופילם במכשירים מושתלים או בצנתרים, הקשורה לעלייה באלימות ובתמותה. ביופילמים המיוצרים על ידי זני קנדידה שונים מפגינים עמידות משופרת נגד תרופות אנטי פטרייתיות שונות. לכן, יש צורך לפתח אימונותרפיות יעילות או טיפולים משלימים נגד ביופילמים של קנדידה. בעוד שתפקיד החסינות התאית מבוסס היטב בהגנה נגד קנדידה, תפקידה של חסינות הומורלית נחקר פחות.

הועלתה השערה כי עיכוב היווצרות ביופילם והבשלתו הוא אחד התפקידים העיקריים של נוגדנים מגנים, ונוגדנים של צינוריות חיידקים קנדידה אלביקנס (CAGTA) הוכחו כמדכאים צמיחה במבחנה והיווצרות ביופילם של C. albicans מוקדם יותר. מאמר זה מתווה פרוטוקול מפורט להערכת תפקידם של נוגדנים על ביופילמים שנוצרו על ידי C. tropicalis. המתודולוגיה של פרוטוקול זה כוללת היווצרות ביופילם C. tropicalis בלוחות מיקרוטיטרים בעלי 96 בארות, אשר לאחר מכן דוגרו בנוכחות או בהיעדר נוגדנים ספציפיים לאנטיגן, ולאחר מכן 2,3-ביס(2-מתוקסי-4-ניטרו-5-סולפופניל)-5-קרבוקסניליד-2H-tetrazolium (XTT) למדידת הפעילות המטבולית של תאים פטרייתיים בביופילם.

הספציפיות אושרה על ידי שימוש בבקרות מתאימות בסרום, כולל סרום מדולדל בנוגדנים ספציפיים ל-Sap2. התוצאות מראות כי נוגדנים הנמצאים בסרום של בעלי חיים מחוסנים יכולים לעכב את הבשלת הביופילם של קנדידה במבחנה. לסיכום, מאמר זה מספק תובנות חשובות לגבי הפוטנציאל של נוגדנים בפיתוח אימונותרפיות חדשניות וטיפולים סינרגטיים או משלימים נגד ביופילמים במהלך קנדידה פולשנית. ניתן להשתמש בפרוטוקול in vitro זה כדי לבדוק את ההשפעה של תרכובות אנטי-פטרייתיות חדשות פוטנציאליות על הפעילות המטבולית של תאי מין קנדידה בביופילמים.

Introduction

קנדידה מערכתית היא הגורם העיקרי הרביעי לזיהומים נוסוקומיאליים, הקשורים לשיעורי תחלואה ותמותה גבוהים ברחבי העולם. ברחבי העולם, קנדידה מערכתית משפיעה על כ 700,000 אנשים1. מיני קנדידה, כלומר C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata, ו- C. auris, הם הגורם השכיח ביותר לזיהומים פולשניים בקנדידה 2. מיני קנדידה הם פתוגנים אופורטוניסטיים המייצרים ביופילמים3. ביופילמים קשורים בעיקר לאלימות של קנדידה, וקנדידה יכולה לעמוד בתנאי עקה חמצוניים ואוסמוטיים על ידי גרימת היווצרות ביופילם4. ביופילמים מווסתים עוד יותר את הביטוי של גורמי אלימות ורכיבי דופן התא ויוצרים מטריצת הגנה אקסופולימרית, המסייעת לקנדידה להסתגל לנישות מארחות שונות4. ביופילמים תורמים להיצמדות השמרים ברקמות המארחות ובמכשירים רפואיים5. ככזה, יצירת ביופילם קשורה ליתרון לשמרים, שכן תאי שמרים בתוך הביופילמים יכולים לחמוק מהתגובה החיסונית של המארח6. היווצרות ביופילם גם מגנה על השמרים הפתוגניים מפני פעולה של תרופות אנטי פטרייתיות5. ירידה ברגישות של ביופילמים של C. albicans לאמפוטריצין B הודגמה על ידי Pierce et al.7,8. יתר על כן, ביופילמים מדגימים עמידות של תרופה אנטי-פטרייתית לפלוקונזול, מה שפוגע בניהול יעיל של קנדידה סיסטמית 9,10.

למיקרובים יש נטייה פנימית להיצמד למשטחים ביוטיים וא-ביוטיים שונים, מה שמביא להיווצרות ביופילם. קנדידה אלביקנס, שהיא פטרייה דימורפית, קיימת בצורות שמרים והיפאלים, והיווצרות הביופילם שלה אופיינה במערכות שונות במבחנה ובמודל in vivo 11. השלבים של היווצרות ביופילם כוללים הידבקות של תאי קנדידה למצע, נימה, שגשוג והבשלת ביופילם11. בתחילה, צורת השמרים של C. albicans נצמדת למצעים, כולל מכשירים רפואיים ורקמות אנושיות, ולאחר מכן נימה והתפשטות של C. albicans לצורות hyphal ו pseudohyphal, ולבסוף התבגרות של ביופילמים מוטבע מטריצה חוץ-תאית11. היווצרות ביופילם תורמת במידה רבה למנגנוני הפתוגנזה של C. albicans 12. מיני קנדידה יוצרים ביופילמים עמידים לתרופות, מה שהופך את חיסולם למאתגר13. תת-קבוצה קטנה של אוכלוסיית ייצור הביופילם C. albicans תוארה כבעלת עמידות גבוהה לתרופות האנטי-פטרייתיות אמפוטריצין B וכלורהקסידין14. יש לציין כי תאי שמרים בביופילמים מפגינים עמידות גבוהה לטיפול רב-תכליתי בהשוואה לתאי שמרים בשלב הפלנקטוני ובשלב ההתרבות14. הוצע כי תאי שמרים הקיימים בביופילמים עמידים מאוד לתרופות אנטי פטרייתיות, מה שתורם להישרדות C. albicans בביופילמים14. תאים קיימים אלה דווחו כגרסאות פנוטיפיות של C. albicans ולא מוטנטים14. יתר על כן, תאים של ביופילמים של קנדידה המכונים "תאים מתמידים" סובלניים למינונים גבוהים של טיפול באמפוטריצין-B ותורמים להישרדות הקנדידה, ובכך מהווים נטל גדול של זיהומי קנדידה סיסטמיים חוזרים ונשנים אצל אנשים בסיכון גבוה15.

העלייה בעמידות לתרופות אנטי-פטרייתיות בזני קנדידה מחייבת מחקר עבור חומרים אנטי-פטרייתיים ואימונותרפיות חדשים. כפי שניתן לראות מהמחקרים שהוזכרו לעיל, ביופילמים של קנדידה מראים ירידה ברגישות לתרופות אנטי פטרייתיות. לכן, יש צורך באימונותרפיות משופרות כדי לשלוט בהיווצרות הביופילם של קנדידה. מחקרים קודמים הראו כי CAGTA יכול לספק הגנה יעילה מפני זיהומים סיסטמיים של קנדידה על ידי עיכוב היווצרות ביופילם של C. albicans במבחנה16. מחקר אחר דיווח כי חיסון של עכברים עם חלבון C. albicans rAls3-N משרה רמות נוגדנים גבוהות שמפריעות להיווצרות ביופילם של C. albicans במבחנה17. נוגדנים נגד Als3-N הפעילו גם השפעה מעכבת על פיזור C. albicans מביופילמים17. חיסון NDV-3A המבוסס על C. albicans נמצא כעת בניסוי קליני ונגד NDV-3A sera נמצאו גם כמפחיתים את היווצרות הביופילם C. auris 18. מחקר שנערך לאחרונה זיהה עיכוב של היווצרות ביופילם על ידי נוגדנים Sap2 כמנגנון הגנה במודל מורין של קנדידה מערכתית19.

מאמר זה מתווה פרוטוקול מבחנה מפורט להערכת ההשפעה של נוגדנים ספציפיים לאנטיגן הנמצאים בסרום פוליקלונלי המתקבל מקבוצות שונות של עכברים מחוסנים ב-Sap2 על ביופילמים מוכנים מראש של קנדידה טרופיקליס . כדי להשיג זאת, שיטה המבוססת על בדיקת הפחתת XTT עברה אופטימיזציה ופותחה במעבדה, שיכולה למדוד את כדאיות הביופילם באופן מהיר, רגיש ובעל תפוקה גבוהה, בנוכחות או בהיעדר נוגדנים.

מבחן XTT משמש למדידת הפעילות המטבולית של התאים כאינדיקטור לכדאיות התאים, התפשטות התאים וציטוטוקסיות20. בדיקה קולורימטרית זו מבוססת על הפחתה של מלח טטרזוליום צהוב, נתרן 3'-[1-(פנילאמינוקרוניל)-3,4-טטרזוליום]-ביס (4-מתוקסי-6-ניטרו) בנזן חומצה סולפונית הידרט (XTT) לצבע פורמאזן כתום על ידי תאים פעילים מטבולית. מכיוון שרק תאים בני קיימא יכולים להפחית XTT, כמות הפורמאזן המופחתת של XTT פרופורציונלית לעוצמת הצבע ולכדאיות התא. הצבע הפורמזני שנוצר מסיס במים ומכמת אותו ישירות באמצעות קורא צלחות. בשל אופיו המסיס במים, מבחן XTT מאפשר לחקור ביופילמים שלמים, כמו גם בדיקה של רגישות לתרופות ביופילם, ללא הפרעה למבנה הביופילם21. בנוסף, שיטה זו מיושמת בהערכות כדאיות פטרייתיות של קנדידה בשל קלות השימוש, המהירות, הדיוק, התפוקה הגבוהה והרמה הגבוהה של יכולת השחזור 7,22.

בנוסף לבדיקת הפחתת XTT, זוהו גם טכניקות חלופיות רבות למדידת כמות הביופילם. חלקם כוללים שימוש בבדיקת הפחתת MTT, צביעת סגול גבישי, כימות DNA, PCR כמותי, כימות חלבונים, מדידת משקל תא יבש וספירת מושבות בת קיימא. נהלים אלה משתנים מאוד מבחינת דרישות הזמן והעלות שלהם. Taff et al. ביצעו ניתוח השוואתי של שבעה מבחני כמות שונים של קנדידה ביופילם ומצאו כי בדיקת XTT סיפקה את השיטה הניתנת לשחזור, מדויקת ויעילה ביותר להערכה כמותית של ביופילמים של C. albicans 23. טכניקות צביעה כגון סגול קריסטל יש מגבלות מסוימות; בדיקת סגול הגביש קובעת בעקיפין את כמות הביופילם על ידי מדידת הצפיפות האופטית של מטריצת הביופילם והתאים המוכתמים בסגול. אף על פי שהבדיקה הסגולה הגבישית מספקת מדידה טובה של מסת הביופילם, היא אינה נותנת מדד לכדאיות הביופילם מכיוון שהיא מכתימה הן את התאים המיקרוביאליים והן את המטריצה החוץ-תאית24. Dhale et al. דיווחו עוד כי בדיקת הפחתת XTT הייתה השיטה הרגישה, הניתנת לשחזור, המדויקת, היעילה והספציפית ביותר לזיהוי ייצור ביופילם בהשוואה למבחן סגול גבישי25. דוחות ספרות הראו כי בדיקת XTT מתואמת היטב עם פרמטר CFU/mL בשיטת ספירת CFU. עם זאת, בהשוואה למבחן XTT, שיטת CFU היא עתירת עבודה ואיטית26. יתר על כן, ייתכן שהחלק של תאים חיים מנותקים אינו מייצג את אוכלוסיית הביופילם הראשונית27. למרות שבדיקת הפחתת XTT נראית כאפשרות הטובה ביותר הזמינה לכימות הכדאיות, ישנן כמה מגבלות של טכניקה זו. בעוד ששיטת XTT שימושית להשוואות הכוללות זן פטרייתי אחד, השימוש בה עשוי להיות מוגבל כאשר משווים זנים ומינים פטרייתיים שונים. השוואות בין-גזעיות עשויות להיות קשות בהיעדר סטנדרטיזציה מפורטת מכיוון שזנים שונים מעכלים מצעים בעלי יכולות שונות21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

עכברי BALB/c שוכנו במתקן החיות הקטן ב- IIT Roorkee. כל בעלי החיים הוחזקו במחזור אור:חושך של 12 שעות:12 שעות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס וסופקו להם דיאטת גלולות ומים עד ליביטום. כל ההליכים למען בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לאתיקה של בעלי חיים (IAEC) של IIT Roorkee.

1. הכנת C. tropicalis

הערה: הפטרייה קנדידה טרופיקליס שייכת לפתוגנים מקבוצת הסיכון 2 ומסווגת כמיקרואורגניזם BSL2. השתמש תמיד בארונות בטיחות ביולוגיים מוסמכים מדרגה II בעת עבודה עם מיני קנדידה . תרגול טכניקות אספטיות סטריליות במהלך העבודה עם C. tropicalis ופעל לפי נהלי biosafety המומלצים לסילוק נאות של פתוגן זה.

  1. פסים C. tropicalis (זן ATCC 750) על צלחת אגר דקסטרוז של סבוראוד (SAB).
  2. הכינו תרבית שגדלה בן לילה של C. tropicalis על ידי חיסון מושבה אחת מצלחת האגר SAB לצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל של מדיום מרק SAV. לחלופין, יש להשתמש במלאי גליצרול קפוא של C. tropicalis ולחסן 100 μL של ציר הגליצרול לתוך בקבוק חרוטי סטרילי של 250 מ"ל המכיל 50 מ"ל של מדיום מרק SAV.
  3. דגירה C. tropicalis תרבית בשייקר מסלולי ב 180 סל"ד ב 30 מעלות צלזיוס במשך 24-48 שעות.
  4. צנטריפוגה של תרבית פטרייתית (תאים בפאזה לוגריתמית) ב 2,150 × גרם במשך 15 דקות ב 21 מעלות צלזיוס.
  5. השליכו את הסופרנטנט והוסיפו 50 מ"ל של PBS סטרילי 1x לכדור. יש לשטוף ולמרוח את הכדור ב-PBS סטרילי 1x עם מערבולת עדינה.
  6. צנטריפוגה שוב ב 2,150 × גרם במשך 15 דקות ב 21 מעלות צלזיוס. השליכו את ה-supernatant והחזירו את הכדור הפטרייתי ב-10 מ"ל של PBS סטרילי 1x.
  7. חשב את ריכוז התאים על ידי ספירה באמצעות haemocytometer.
  8. הכן מלאי פטרייתי בצפיפות סופית של 1.0 × 106 תאים למ"ל במדיום RPMI 1640 מורפולינפרופנסולפוני חומצה (MOPS). השתמש בהשעיית התא משלב 1.6 באופן מיידי.
    הערה: כדי להגדיר צלחת אחת של 96 בארות, נפח המלאי הכולל של הפטריות הדרוש הוא 10 מ"ל (100 μL/well). ניתן לשנות את קנה המידה לפי הצורך.

2. C. היווצרות ביופילם טרופיקליס

  1. הכינו ביופילמים של קנדידה בצלחת מיקרוטיטר פוליסטירן בעלת תחתית שטוחה בעלת 96 בארות, כפי שתואר קודם לכן (איור 1)28,29.
  2. הוסף 100 μL של תרבית C. tropicalis (מתוך 10 מלאי של6 תאים/מ"ל, שהוכן כנ"ל) לצלחת מיקרוטיטר של 96 בארות באמצעות פיפטה רב-ערוצית (איור 2A). שמור על שתי העמודות האחרונות (11 ו-12) כ'אין פטרייה פלוס סרום' ו'אין פטריה ואין סרום' שולטות שליליות על-ידי אי-הוספת תאים פטרייתיים. מלא את העמודות 11 ו-12 ב-100 μL של RPMI 1640 MOPS בינוני בלבד.
  3. מכסים את צלחת המיקרוטיטר במכסה ובנייר אלומיניום. לדגום את הצלחת במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים נייחים.
  4. למחרת, שאפו את המדיום בזהירות באמצעות פיפטה רב ערוצית (מבלי לגעת או לשבש את הביופילמים). הקש על הצלחת בעדינות במיקום הפוך על יריעות הכתמה כדי להסיר שאריות של מדיום.
  5. לשטוף את הצלחת עם 200 μL של 1x PBS (לכל באר) באמצעות פיפטה רב ערוצית. הוסיפו PBS בעדינות רבה לאורך הדפנות הצדדיות של הבאר כדי למנוע הפרעה לביופילמים. שאפו את ה- PBS בזהירות באמצעות פיפטה רב-ערוצית. חזור על שטיפת PBS 2x (סה"כ שלוש כביסות).
  6. כדי להסיר עודפי PBS, ייבשו את הצלחת באוויר (ללא המכסה) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, בתוך ארון בטיחות ביולוגי.

3. טיפול בביופילם עם נוגדנים

הערה: כעת ניתן לעבד ביופילמים להערכת עיכוב הבשלת הביופילם על ידי נוגדנים. סרום מורין שימש כמקור לנוגדנים פוליקלונליים. קבוצות שונות של Sap2-מחוסנים (Sap2-albicans, Sap2-tropicalis, ו-Sap2-parapsilosis) יחד עם עכברים מחוסנים בדימום רטרו-אורביטלי וסרום בודד כפי שתואר קודםלכן 19. נוכחותם של נוגדנים נגד Sap2 אושרה באמצעות ELISA ספציפי ל-Sap2 כפי שתואר קודםלכן 19.

  1. יש לבצע השבתת חום של הסרום (מקור לנוגדנים פוליקלונליים) בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני השימוש כדי לשלול את תפקיד המשלים בפעילות המעכבת. יש להשבית את הסרום בחום לפני ביצוע דילול בסרום.
    הערה: יש להשתמש בסרום מעכברים מחוסני בושה, עכברים טרום-חיסוניים וסרום מדולדל בנוגדנים ספציפיים ל-Sap2 כאמצעי בקרה נוספים19. סרום מדולדל בנוגדנים הוכן לפי מחקר קודם19. בין הדילולים הסדרתיים (1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1,600, 1:3,200, 1:6,400 ו-1:12,800) שנבדקו בסרום בפרוטוקול זה, נצפתה עיכוב של הבשלת ביופילם ב-1:25, 1:50 ו-1:100; לפיכך, 1:50 נבחר כדי למצוא איזון בין עיכוב לצריכת סרום.
  2. הכן דילולים סדרתיים של דגימות סרום מומת חום במדיום RPMI 1640 MOPS סטרילי (1:50). השתמש בדילול סרום נפוץ (1:50) עבור כל דגימות הסרום כדי להיבדק לעיכוב הבשלת ביופילם30.
  3. הוסף 100 μL של דילול הסרום שנבחר לכל באר של צלחת microtiter 96 באר. עבור כל דגימה, הוסיפו דילולים בסרום בשכפול, בהתאם לפריסה המצורפת (איור 2B).
    1. בעמודה 10, אין להוסיף דילול סרום; הוסף רק מדיום RPMI 1640 MOPS לשליטה חיובית בפטריות בלבד .
      הערה: עמודה 10, בשורות G1-G8 ו-H1-H8 היו בתחילה תאים פטרייתיים ב-RPMI-MOPS. עם זאת, בעוד RPMI-MOPS נוסף לעמודה 10 גם לאחר 24 שעות, שורות G1-G8 שימשו כבקרת PBS ושורות H1-H8 כבקרה ללא סרום לאחר 24 שעות.
    2. בעמודה 11, הוסיפו דילול של סרום ביחס של 1:50 לכל הבארות כדי לשמש כבקרה שלילית ללא פטריות פלוס בסרום.
    3. בעמודה 12, אין להוסיף דילול סרום לכל באר; שמור את זה כמו לא פטרייה ללא שליטה שלילית בסרום.
  4. מכסים את הצלחת במכסה ובנייר אלומיניום. לדגור את הצלחת במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.

4. הערכת פעילות מטבולית של ביופילם

  1. למחרת, שאפו את הסרום בזהירות באמצעות פיפטה רב ערוצית (מבלי לגעת או לשבש את הביופילמים). טפחו על הצלחת בעדינות במיקום הפוך על יריעות הכתמים כדי להסיר שאריות של סרום.
  2. שטפו את הצלחת עם 200 μL של 1x PBS (לכל באר) באמצעות פיפטה רב ערוצית, והוסיפו את ה- PBS לאורך הקירות הצדדיים של הבאר כדי למנוע הפרעה לביופילמים. שאפו את ה-PBS בזהירות באמצעות פיפטה רב-ערוצית וחזרו על שטיפת PBS 2x (סה"כ שלוש כביסות). ייבשו את הצלחת באוויר (ללא המכסה) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, בתוך ארון בטיחות ביולוגי לייבוש כל עודף PBS.
  3. הכנת XTT/מנדיון:
    1. הכן XTT בצלצולים סטריליים לקטט כתמיסה של 0.5 גרם לליטר. יש להמיס 25 מ"ג של XTT ב-50 מ"ל של רינגרים לקטט מעוקרים במסנן. Aliquot 10 מ"ל בצינורות נפרדים מכוסים רדיד אלומיניום ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
    2. הכינו את מנדיון כציר של 10 מ"מ. יש להמיס 8.6 מ"ג מנדיון ב-5 מ"ל אצטון ולהפיץ 50 מיקרו-ליטר ב-100 מיקרו-צינוריות נפרדות. אחסנו את האליקוטים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
    3. הכן תמיסת XTT/menadione ממש לפני השימוש על ידי נטילת 10 מ"ל של XTT והוספת 1 μL של מנדיון כדי לקבל פתרון עבודה של 1 μM.
  4. הוסף 100 μL של תמיסת XTT/menadione לכל באר של צלחת microtiter 96 באר. מכסים את הצלחת במכסה ובנייר אלומיניום. לדגור את הצלחת במשך 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס בחושך.
  5. מעבירים 80 מיקרון של הסופרנטנט הצבעוני מכל באר לצלחת טרייה של 96 בארות. קרא את הצלחת ב 490 ננומטר.
  6. חשב את הממוצע של ערכי הספיגה של הבארות בעמודה 10 (בקרה חיובית של פטריות בלבד), אשר ישמש כערך ייחוס לחישוב אחוז עיכוב הביופילם על ידי כל דגימת סרום באמצעות משוואה (1).
    % עיכוב ביופילם = 100 - Equation 1× 100 (1)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הביופילמים של קנדידה טרופיקליס גודלו בלוחות מיקרוטיטרים של 96 בארות והצטלמו לפי 40 באמצעות מיקרוסקופ הפוך (איור 1A). הביופילם הוכתם עוד יותר באמצעות סיגלית גבישית ונצפה פי 40 באמצעות מיקרוסקופ הפוך (איור 1B). מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת מראה תמונה מייצגת של ביופילם C. tropicalis (איור 1C). לצורך ביצוע בדיקת עיכוב הביופילם, 105 תאים של קנדידה נוספו לבארות של צלחת המיקרוטיטר בעלת 96 הבארות בזמן 0, לפי הפריסה (איור 2A). לאחר 24 שעות, הצלחת נשטפה, ודגימות סרום נוספו לביופילמים המוכנים. דילול סרום נפוץ של 1:50 נבחר כדי להשוות דגימות סרום שונות שהתקבלו מקבוצות שונות של עכברים מחוסנים ב-Sap2 ומחוסני בושה, לפי מחקר פיילוט ודו"ח30 שפורסם בעבר.

דגימות סרום שונות נוספו ללוחית המיקרוטיטר בעלת 96 הבארות לפי הפריסה (איור 2B) והוערכו בשכפול. סרה שהתקבלה ביום ה-30 לאחר החיסון משלושה עכברים בכל קבוצה (חיסון Sap2-אלביקנס, חיסון Sap2-טרופיקליס, חיסון Sap2-parapsilosis, קבוצת חיסון בושה, עכברים טרום-חיסוניים ודגימת בקרה מדולדלת Sap2) נותחו בדילול של 1:50. הלוח נקרא באורך גל של 490 ננומטר באמצעות קורא ELISA לקבלת קריאות XTT-colorimetric (ערכי OD490 ) עבור ביופילמים של C. tropicalis שנוצרו בנוכחות או היעדר סרום (טבלה 1). ריק שלילי חושב באמצעות הממוצע של עמודות 11 ו 12 (0.04). שליטה חיובית חושבה על ידי חישוב ממוצע של בארות פטרייה בלבד (עמודה 10; 0.8165). לפני החישובים, ערך הספיגה הממוצע של בארות הבקרה בעמודות 11 ו-12 (0.04) הופחת ממדידות הספיגה של בארות הניסוי. לפיכך, ערך הייחוס של הבקרה החיובית של הביופילם (עמודה 10) נקבע על 0.7765 (= 0.8165 − 0.04).

הערכים (ממוצע מינוס ריק) שהתקבלו עבור בארות הניסוי חולקו אז על ידי שליטה חיובית זו (0.7765) והאחוז התקבל על ידי הכפלה ב -100. אחוז עיכוב הביופילם חושב על ידי הפחתה נוספת של הערך המתקבל מ-100. גרף עמודות מציג את כל הערכים המסומנים (איור 3). ANOVA חד-כיווני רגיל ואחריו מבחן פוסט-הוק של דנט להשוואות מרובות שימשו לחישוב ערכי p להערכת הבדלים סטטיסטיים בין קבוצות סרום שונות. ערך p של <0.05 נחשב מובהק סטטיסטית. סרום מעכברים מחוסנים Sap2-parapsilosis יכול למנוע את ההבשלה של ביופילמים מוכנים מראש של C. tropicalis ב-65%, בהשוואה לסרום מעכברים מחוסנים של Sap2-albicans (45%) ו-Sap2-tropicalis (55%). באופן כללי, עיכוב הביופילם על ידי סרום חיסוני Sap2 היה גבוה משמעותית מזה של סרום חיסוני (16%) וסרום קדם-חיסוני (13%), בהתאמה. כאשר דלדל נוגדנים ספציפיים ל-Sap2 מסרום כפי שתואר במקום אחר 19, יכולת העיכוב של הביופילם הופחתהל-10%. עיכוב הביופילם היה קרוב לזניחה בשימוש ב-PBS (5%) ובבקרה ללא סרום (5%).

Figure 1
איור 1: הדמיה של קנדידה טרופיקליס ביופילם. (A) הדמיה של ביופילם קנדידה טרופיקליס שנוצר בתחתית לוח מיקרוטיטר בעל 96 בארות לאחר הסרת מדיום RPMI, באמצעות מיקרוסקופ הפוך. התמונה צולמה באמצעות מיקרוסקופיה של ברייטפילד (לא נעשה שימוש בכתם). (B) הדמיה של ביופילם C. tropicalis שנוצר בתחתית לוח מיקרוטיטר בעל 96 בארות לאחר צביעת קריסטל סגול. (C) הדמיה של ביופילם C. tropicalis שנוצר על שקופיות זכוכית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר (A,B), 10 מיקרומטר (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: פריסה של תבנית לוח 96 בארות. תוספת של (A) תאים פטרייתיים לבארות ו-(B) דילולים בסרום מקבוצות עכברים שונות (Sap2-albicans מחוסן, Sap2-tropicalis מחוסן, Sap2-parapsilosis מחוסן, וחיסון בושה; n = 3) הוערך בכפילות בדילול של 1:50. אמצעי בקרה נוספים כללו סרום מדולדל Sap2, סרום טרום-אימוני, PBS ובקרה ללא סרום. בעמודה 10 לא נוספו סרום (קיימים תאים פטרייתיים, שליטה חיובית). בעמודה 11 לא נוספו תאים פטרייתיים (בסרום קיים). בעמודה 12 לא נוספו תאים פטרייתיים (בסרום נעדר). קיצורים: PBS = מלח עם מאגר פוספטים; Sap2 = חלבון אספרטיל מופרש 2. המונחים m1, m2 ו-m3 מתייחסים לעכברים שונים בכל קבוצה (n = 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: גרף שמראה את היעילות של נוגדנים פוליקלונליים ספציפיים ל-Sap2 נגד ביופילמים של C. tropicalis. מקור הסרום החיסוני מוצג על ציר ה-x, בעוד שאחוז העיכוב של הבשלת ביופילם C. tropicalis מוצג על ציר ה-y. עמודות מייצגות ממוצע ± SEM (n = 3). ANOVA חד-כיווני רגיל ואחריו מבחן הפוסט הוק של דנט להשוואות מרובות שימשו לחישוב ערכי p. ברים וסמלים מייצגים את ההבדלים בין קבוצות עכברים מחוסנים ב-Sap2 לבין עכברים מחוסנים על-ידי Sham. עמ' < 0.0001., קיצורים: PBS = מלח עם מאגר פוספטים; Sap2 = חלבון אספרטיל מופרש 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

<> 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.475 0.4141 0.0441 0.4637 0.485 0.0484 0.5179 0.4068 0.0442 0.8826 0.0452 0.0404
B 0.3848 0.3773 0.0428 0.369 0.3781 0.0465 0.4105 0.3773 0.0447 0.8428 0.0426 0.041
C 0.2754 0.2728 0.0427 0.305 0.3083 0.0415 0.3531 0.3213 0.0432 0.9661 0.0444 0.0453
D 0.6965 0.7185 0.043 0.6681 0.6711 0.0403 0.6346 0.728 0.0433 0.8643 0.0384 0.0358
E 0.7031 0.7117 0.0481 0.7806 0.688 0.0521 0.7095 0.6998 0.0525 0.7883 0.0491 0.0416
F 0.7588 0.7441 0.0456 0.7173 0.7233 0.0437 0.7733 0.6808 0.0462 0.7256 0.0468 0.0354
G 0.7681 0.7708 0.0435 0.7949 0.7496 0.0445 0.7695 0.7898 0.0451 0.7335 0.0429 0.0371
H 0.7652 0.7855 0.0469 0.7818 0.7766 0.0428 0.7592 0.7765 0.0445 0.7295 0.044 0.0341

טבלה 1: קריאות ספיגה ב-490 ננומטר עבור צלחת מיקרוטיטר בעלת 96 בארות. נעשה שימוש בקורא לוחות סטנדרטי (Tecan) כדי לקבל את קריאות הספיגה והקריאות הותאמו לפריסה המתוארת באיור 2. חישובים מאוחרים יותר בוצעו באמצעות נתונים אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

זיהומים פטרייתיים הנגרמים על ידי זני קנדידה קשורים לשיעורי תחלואה ותמותה גבוהים ברחבי העולם. האיום הגובר של זיהום פטרייתי פולשני מחייב ניהול מוקדם של מחלות מסכנות חיים כאלה. רוב זיהומי הקנדידה כרוכים בהיווצרות ביופילמים, אשר דבקים במגוון מכשירים רפואיים ואחראים להתמדה ולהישנות של זיהומים פטרייתיים בבתי חולים31. ביופילמים מורכבים משמרים או מתאי היפל, והם מפגינים עמידות ניכרת לרוב התרופות האנטי-פטרייתיות הקונבנציונליות32. עמידות אנטי-פטרייתית על ידי ביופילמים של קנדידה יוחסה למספר מנגנונים, כולל ירידה בחדירה אנטי-פטרייתית, נוכחות של מטריצה חוץ-תאית, ביטוי יתר של משאבות שטף תרופות, שינוי בהרכב הסטרול של קרום התא, צמיחה איטית והטרוגניות מרחבית, הפעלה של מסלולי איתות שונים, ונוכחות של תאים מתמידים עמידים לתרופות33,34. עיכוב הידבקות קנדידה והיווצרות ביופילם הן האסטרטגיות החשובות ביותר למניעת זיהום בקנדידה.

מבחני מבחנה שונים, כגון מבחני כדאיות תאים, מבחני צלחת מיקרוטיטר ומבחני מדידת משקל יבש, שימשו לחקר היווצרות ביופילם קנדידה, המבוססים על הערכת נקודת הזמן הספציפית של ביופילמים23. פותחו מבחנים מתקדמים יותר כגון מבחנים מבוססי התקנים מיקרופלואידיים, בהם ניתן להשתמש כדי להעריך היווצרות ביופילם בזמן אמת35. עד כה, היווצרות ביופילם נחקרה באמצעות מבחני in vitro, אך יש צורך להבין את התהליך הדינמי של היווצרות ביופילם בתנאי in vivo כמו גם36,37. כיום, רוב מחקרי עיכוב הביופילם חלים על C. albicans ומעט מחקרים זמינים למיגור ביופילמים קנדידה שאינם אלביקנים. הספקטרום של זיהומי קנדידה השתנה בהדרגה בעשורים האחרונים ומיני קנדידה שאינם אלביקנים מתעוררים מהווים נטל גבוה של תחלואה ותמותה ברחבי העולם. לכן, יש צורך מתפתח בפיתוח אסטרטגיות חדשניות לשליטה בהיווצרות ביופילם ופיתוח מבחני עיכוב ביופילם המתמקדים במיני קנדידה שאינם אלביקנים. לאימונותרפיה, במיוחד נוגדנים, יש פוטנציאל גדול לעכב היווצרות ביופילם וניתן להשתמש בה לטיפול בזיהום קנדידה סיסטמי38. מספר דיווחים הדגימו את תפקידם של נוגדנים בעיכוב ביופילם בשלבים מוקדמים יותר של היווצרות ביופילם. דווח כי נוגדנים פוליקלונליים שנוצרו בתגובה לחלבון משלים הקשור לקולטן 3 (CR3-RP, בעל תפקיד פוטנציאלי בהיצמדות פטרייתית) חיסון בארנבות הפחיתו את הדבקות ואת היווצרות הביופילם של C. albicans על תאי אפיתל buccal39. יתר על כן, זני קנדידה, כולל צנתרים מבודדים, הודגמו מראש עם נוגדן פוליקלונלי נגד CR3-RP ונוגדן חד-שבטי, OKM1, שהפחיתו את ההיצמדות ואת היווצרות הביופילם. כדאיות התאים של C. albicans הוערכה באמצעות מבחן XTT בשלב ההיצמדות ובשלב היווצרות הביופילם40. מחקרים מעטים העריכו את תפקידם של נוגדנים נגד היווצרות ביופילם של מיני קנדידה שאינם אלביקנים. Chupacova et al. העריכו את היעילות של נוגדנים פוליקלונליים נגד CR3-RP נגד C. albicans יחד עם C. dubliniensis באמצעות מבחן XTT. נוגדנים פוליקלונליים נגד CR3-RP עיכבו הדבקות והיווצרות ביופילם הן של C. albicans והן של C. dubliniensis41.

במחקר זה מתואר פרוטוקול פשוט, מהיר וידידותי למשתמש להערכת השפעת נוגדנים על התבגרות והתפתחות ביופילם. מבחן הפחתת XTT זה, המבוסס על 96 מיקרוטיטרים, מודד את הפעילות המטבולית של תאים בני קיימא בביופילמים, והותאם ממחקרים קודמים 7,8. בדיקת XTT המתוארת כאן נמצאת בשימוש נרחב להערכת צמיחת ביופילם בת קיימא. זה הפך להיות מבחן כדאיות התא נפוץ כי זה מהיר, נוח, וניתן להשתמש בו בפורמט תפוקה גבוהה כגון צלחת 96 באר. יתר על כן, ניתן להשתמש בו כדי לכמת הן שמרים והן צורות hyphal של ביופילמים קנדידה. ניתן להשתמש בו גם למדידת ביופילמים של קנדידה על מגוון מצעים כגון מכשירים רפואיים (למשל, קטטרים) ועדשות מגע.

חלק מהשלבים הקריטיים של פרוטוקול זה כוללים מערבולת נמרצת של מתלי התאים לפני צנרת בכל השלבים, כדי למנוע צבירה פטרייתית7. ביופילמים גרועים צפויים להתפתח כאשר צפיפות התאים גבוהה מדי או נמוכה מדי. לכן, על המשתמשים לעקוב אחר צפיפות התאים הפטרייתית האידיאלית באינוקולוםהראשוני 7. שלבי הכביסה הם קריטיים מאוד ויש להימנע משטיפת תאים מוגזמת כדי למנוע הפרעה לביופילם22. אין להפריע לשכבה התחתונה של הביופילם במהלך תהליך הכביסה. הבדיקה צריכה להתבצע תמיד בתנאים חשוכים, ויש צורך לכלול שכפולים מרובים22. פתרון טרי של XTT צריך להיות מוכן בכל פעם ממש לפני השימוש. מכיוון שהפרש הזמן בין שתי תגובות עלול להטות את התוצאות, המשתמשים צריכים לעבוד מהר כדי להבטיח הפרשי זמן מינימליים בעת הוספת פתרון XTT לבאר הראשונה והאחרונה של לוח42 בעל 96 הבארות. השימוש בנייר כסף או בפרפילם מומלץ למניעת אידוי. ניתן לבצע מספר שלבים לפתרון בעיות במידת הצורך. במקרה שצמיחת הביופילם נעדרת או לא מספקת, יש להשתמש בדילול וחישובים מתאימים של זריעה. ליצירת ביופילם טובה יותר, ניתן לשנות את תנאי התת-תרבות, ולנסות את גדילת הביופילם באמצעות חומרי פני שטח שונים. כדי לשפר באופן משמעותי את הרגישות של בדיקת XTT, ניתן לקצר את הזמן הדרוש ליצירת ביופילם, להעלות את ריכוז החומר האנטי פטרייתי, או לקצר את תקופת הדגירה של הבדיקה7. כדי למנוע הפרעה לביופילם, יש להימנע משטיפת תאים מוגזמת22. אפשר להימנע מהבארות החיצוניות כדי למנוע מחומרי הבדיקה להיחשף לאור או להוסיף נוזל לבארות החיצוניות כדי למנוע מהסוכנים להתאדות מהבארות הפנימיות. יש לתת שטיפות עדינות אם הביופילם משתבש במהלך הכביסה22. בעוד שפרוטוקול זה בודק את השפעת הסרום על ביופילמים מוכנים מראש 24 שעות להערכת עיכוב הבשלת ביופילם, משתמשים יכולים גם לשנות פרוטוקול זה כדי להוסיף סרום בזמן 0 להערכת עיכוב היווצרות ביופילם, לפי דוח מוקדםיותר 30.

בהשוואה לשיטות חלופיות אחרות לכימות גידול ביופילם, שיטת XTT היא השיטה הרגישה ביותר, ניתנת לשחזור, מדויקת, חסכונית וספציפית. למרות שבדיקת XTT היא טכניקה מהירה וקלה לשימוש נפוץ להערכת ביופילמים, יש לה מגבלות מסוימות. בעוד שהוא שימושי לקביעת המינון או ההשפעות של סוכנים שונים בביופילם ממין יחיד, יש להשתמש בו בזהירות כדי להשוות מספר מבודדים בו זמנית בשל השתנות מטבולית בין מבודדים21. עבור השוואות ביופילם interstrain, סטנדרטיזציה מפורטת של טכניקה צריכה להתבצע21. יתר על כן, בעוד שתוצר הפורמזן XTT מתמוסס בקלות בתמיסה, זנים מסוימים עשויים לשמור על כמות מסוימת בתוך תא21. מכיוון שקיים חוסר בהירות המערב משתנים, כגון בחירת המדיה, זמן התפתחות הביופילם ופרטים ספציפיים של הסרום, מומלץ לבצע בדיקות ביולוגיות מאשרות בנוסף למבחן XTT, לדוגמה, מדידת עובי ביופילם / ביומסה (באמצעות סגול גבישי) או כדאיות התא (בשיטת CFU)43. יש לציין כי התוצאות של בדיקת XTT זו תאמו היטב את הבדיקה הסגולה הגבישית ואת שיטת CFU (הנתונים לא מוצגים). על אף המגבלות שהוזכרו לעיל, ניתן לבצע אקסטרפולציה בשיטה זו כדי להעריך קבוצות שונות של דגימות סרום (מקור לנוגדנים פוליקלונליים), נוגדנים חד שבטיים או אימונותרפיות משלימות. למרות שפרוטוקול הפחתת XTT המוצג כאן מראה רק את השפעת הנוגדנים על ביופילמים של C. tropicalis, הוא שימש חוקרים כדי לחקור את השפעת הנוגדנים על ביופילמים של C. auris גם18. בנוסף, פרוטוקול זה נובע ממחקרים קודמים שבוצעו עם מיני קנדידה אחרים כגון C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. dubliniensis, C. tropicalis, ו- C. auris, אשר יכולים לזכות בהרחבה של פרוטוקול זה לסוג קנדידה 16,41,44,45,46,47.

אופטימיזציה, סטנדרטיזציה ושיפור קבוע במבחני כימות ביופילם יכולים לשפר את הדיוק, התפוקה ויכולת השחזור. מבחן הפחתת XTT שעליו מבוסס פרוטוקול זה היה בשימוש נרחב להערכת הפעילות המטבולית והכדאיות של ביופילמים. מכיוון שביופילם קנדידה עמיד לעתים קרובות לתרופות אנטי פטרייתיות, חקר תרופות חדשות ושילובים חדשים הוא הכרח דחוף33. כדי להילחם בבעיית הזיהומים הקשורים לביופילם, יש לחקור תרכובות אנטיביופילם נוספות באמצעות מבחני סינון ביופילם48. ניתן להשתמש בפרוטוקול in vitro זה כדי לבדוק את ההשפעה של תרכובות אנטי-פטרייתיות חדשות פוטנציאליות על הפעילות המטבולית של תאי מין קנדידה בביופילמים. מחקר עתידי המבוסס על סטנדרטיזציה ושיפור של בדיקת הפחתת XTT הכוללת אימונותרפיות מבוססות נוגדנים עשוי לסייע בפיתוח טיפולים משופרים לניהול ובקרה יעילים של המחלה.

עיכוב ביופילם על ידי נוגדנים ספציפיים ל-Sap2 דווח כמנגנון הגנה בתיווך נוגדנים בהגנה בתיווך חיסון Sap2 במהלך קנדידה מערכתית מורין הנגרמת על ידי C. tropicalis19. מחקר מוקדם יותר הראה גם כי CAGTA שעשוי לזהות אנטיגנים של Sap מפחית את הצמיחה ואת היווצרות הביופילם של C. albicans במבחנה16. במחקר אחר, מוטציות שנמחקו על-ידי Sap2 הראו פגם בצמיחת ביופילם בנוכחות פפסטטין A49. בנוסף, במהלך היווצרות הביופילם, האנטיגן Sap2 מילא תפקיד בעיבוד פרוטאוליטי של המוצין Msb2 בתיווך מסלול איתות חלבון קינאז המופעל על-ידי מיטוגן Cek150. לכן, ניתן לשער כי עיבוד Msb2 מעוכב על ידי נטרול Sap2 בתיווך נוגדנים, אשר משפיע על שלמות הביופילם. לסיכום, מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט להערכת תפקידם של נוגדנים בסרום בהתבגרות ופיתוח ביופילם C. tropicalis , אשר ניתן ליישם לקביעת פעילות מטבולית של ביופילם במסגרות שונות, תוך שימוש בזני פטריות שונים או במקורות נוגדנים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענק Ramalingaswami DBT-843-BIO (המחלקה לביוטכנולוגיה, ממשלת הודו) ופרס מחקר קריירה מוקדמת SER-1058-BIO (מועצת המחקר למדע והנדסה, ממשלת הודו) ל- S.R. המחברים מכירים במענק ICMR-JRF ל-P.C ובמענק DBT-JRF ל-P.S. המחברים מודים לד"ר רביקאנט רנג'אן על ההצעות על כתב היד ועל הסיוע הטכני של מר פראדיפ סינג תאקור במהלך SEM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical centrifuge tubes BD Falcon 546021
1x PBS - Prepared in lab NaCl : 4 g
KCl : 0.1 g
Na2HPO4:  0.72 g
KH2PO4 : 0.12 g
Water 500 mL. Adjust pH to 7.4
50 mL conical centrifuge tubes BD Falcon 546041
96-well microtiter plates Nunc 442404
Incubator Generic
Menadione Sigma M5625
Microtiter Plate Reader Generic
Multichannel pipette and tips Generic
Petri dishes Tarson 460090
Ringers Lactate - Prepared in lab sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0 
RPMI 1640 MOPS Himedia AT180
Sabouraud dextrose Agar SRL 24613
Sabouraud dextrose Broth SRL 24835
XTT  Invitrogen X6493

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R. O., Denning, D. W. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).
  2. Pappas, P., Lionakis, M., Arendrup, M., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. Invasive candidiasis. Nature Reviews Disease Primers. 4, 18026 (2018).
  3. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  4. Pemmaraju, S. C., Padmapriya, K., Pruthi, P. A., Prasad, R., Pruthi, V. Impact of oxidative and osmotic stresses on Candida albicans biofilm formation. Biofouling. 32 (8), 897-909 (2016).
  5. Cavalheiro, M., Teixeira, M. C. Candida biofilms: threats, challenges, and promising strategies. Frontiers in Medicine. 5, 28 (2018).
  6. Roilides, E., Simitsopoulou, M., Katragkou, A., Walsh, T. J. How biofilms evade host defenses. Microbiology Spectrum. 3 (3), 3 (2015).
  7. Pierce, C. G., et al. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nature Protocols. 3 (9), 1494-1500 (2008).
  8. Pierce, C. G., Uppuluri, P., Tummala, S., Lopez-Ribot, J. L. A 96 well microtiter plate-based method for monitoring formation and antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Journal of Visualized Experiments. (44), e2287 (2010).
  9. Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 49 (6), 973-980 (2002).
  10. Quindós, G. Epidemiology of candidaemia and invasive candidiasis. A changing face. Revista Iberoamericana de Micología. 31 (1), 42-48 (2014).
  11. Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofilms and the host: models and new concepts for eradication. International Journal of Microbiology. 2012, 845352 (2012).
  12. Wall, G., Montelongo-Jauregui, D., Vidal Bonifacio, B., Lopez-Ribot, J., Uppuluri, P. Candida albicans biofilm growth and dispersal: contributions to pathogenesis. Current Opinion in Microbiology. 52, 1-6 (2019).
  13. Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, M. J. S. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62, 10-24 (2013).
  14. LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).
  15. Galdiero, E., et al. Eradication of Candida albicans persister cell biofilm by the membranotropic peptide gH625. Scientific Reports. 10 (1), 5780 (2020).
  16. Carrano, G., et al. Anti-Candida albicans germ tube antibodies reduce in vitro growth and biofilm formation of C. albicans. Revista Iberoamericana de Micología. 36 (1), 9-16 (2019).
  17. Alqarihi, A., Singh, S., Edwards, J. E., Ibrahim, A. S., Uppuluri, P. NDV-3A vaccination prevents C. albicans colonization of jugular vein catheters in mice. Scientific Reports. 9 (1), 6194 (2019).
  18. Singh, S., et al. The NDV-3A vaccine protects mice from multidrug resistant Candida auris infection. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007460 (2019).
  19. Shukla, M., Rohatgi, S. Vaccination with secreted aspartyl proteinase 2 protein from Candida parapsilosis can enhance survival of mice during C. tropicalis-mediated systemic candidiasis. Infection and Immunity. 88 (10), 00312-00320 (2020).
  20. Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT. Journal of Immunological Methods. 142 (2), 257-265 (1991).
  21. Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism. Journal of Clinical Microbiology. 41 (1), 506-508 (2003).
  22. Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. Journal of Clinical Microbiology. 49 (4), 1426-1433 (2011).
  23. Taff, H. T., Nett, J. E., Andes, D. R. Comparative analysis of Candida biofilm quantitation assays. Medical Mycology. 50 (2), 214-218 (2012).
  24. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
  25. Dhale, R. P., Ghorpade, M. V., Dharmadhikari, C. A. Comparison of various methods used to detect biofilm production of Candida species. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 8 (11), 18-20 (2014).
  26. Moffa, E. B., et al. Interaction between XTT assay and candida albicans or streptococcus mutans viability. Journal of International Oral Health. 8 (1), 12 (2016).
  27. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
  28. Harriott, M. M., Noverr, M. C. Ability of Candida albicans mutants to induce Staphylococcus aureus vancomycin resistance during polymicrobial biofilm formation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (9), 3746-3755 (2010).
  29. Pierce, C. G., et al. A novel small molecule inhibitor of Candida albicans biofilm formation, filamentation and virulence with low potential for the development of resistance. NPJ Biofilms and Microbiomes. 1, 15012 (2015).
  30. Dekkerová, J., Lopez-Ribot, J. L., Bujdáková, H. Activity of anti-CR3-RP polyclonal antibody against biofilms formed by Candida auris, a multidrug-resistant emerging fungal pathogen. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 101-108 (2019).
  31. Muzny, C. A., Schwebke, J. R. Biofilms: an underappreciated mechanism of treatment failure and recurrence in vaginal infections. Clinical Infectious Diseases. 61 (4), 601-606 (2015).
  32. Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 14-19 (2004).
  33. Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiology. 8 (10), 1325-1337 (2013).
  34. Singh, R., Kumari, A., Kaur, K., Sethi, P., Chakrabarti, A. Relevance of antifungal penetration in biofilm-associated resistance of Candida albicans and non-albicans Candida species. Journal of Medical Microbiology. 67 (7), 922-926 (2018).
  35. Gulati, M., Ennis, C. L., Rodriguez, D. L., Nobile, C. J. Visualization of biofilm formation in Candida albicans using an automated microfluidic device. Journal of Visualized Experiments. (130), e56743 (2017).
  36. Krom, B. P., Willems, H. M. In vitro models for Candida biofilm development. Candida Species. , Humana Press. New York, NY. 95-105 (2016).
  37. Gu, W., Xu, D., Guo, D., Zhang, L., Sun, S. In vivo models for Candida albicans biofilms study, research & reviews. Journal of Microbiology and Biotechnology. 5 (1), 26-31 (2016).
  38. Shukla, M., Chandley, P., Rohatgi, S. The role of B-cells and antibodies against Candida vaccine antigens in invasive candidiasis. Vaccines. 9 (10), 1159 (2021).
  39. Bujdáková, H., et al. Antibody response to the 45 kDa Candida albicans antigen in an animal model and potential role of the antigen in adherence. Journal of Medical Microbiology. 57 (12), 1466-1472 (2008).
  40. Bujdáková, H., Paulovicová, E., Paulovicová, L., Simová, Z. Participation of the Candida albicans surface antigen in adhesion, the first phase of biofilm development. FEMS Immunology & Medical Microbiology. 59 (3), 485-492 (2010).
  41. Chupácová, J., Borghi, E., Morace, G., Los, A., Bujdáková, H. Anti-biofilm activity of antibody directed against surface antigen complement receptor 3-related protein-comparison of Candida albicans and Candida dubliniensis. Pathogens and Disease. 76 (1), 127 (2018).
  42. Gulati, M., et al. In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), 60 (2018).
  43. Ramage, G. Comparing apples and oranges: considerations for quantifying candidal biofilms with XTT [2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide] and the need for standardized testing. Journal of Medical Microbiology. 65 (4), 259-260 (2016).
  44. Kovács, R., et al. Synergistic effect of nikkomycin Z with caspofungin and micafungin against Candida albicans and Candida parapsilosis biofilms. Letters in Applied Microbiology. 69 (4), 271-278 (2019).
  45. Fernández-Calderón, M. C., et al. Antifungal and anti-biofilm activity of a new Spanish extract of propolis against Candida glabrata. BMC Complementary Medicine and Therapies. 21 (1), 1-10 (2021).
  46. Li, Z., et al. Synergistic effect of pseudolaric acid B with fluconazole against resistant isolates and biofilm of Candida tropicalis. Infection and Drug Resistance. 13, 2733-2743 (2020).
  47. Chatzimoschou, A., Giampani, A., Meis, J. F., Roilides, E. Activities of nine antifungal agents against Candida auris biofilms. Mycoses. 64 (4), 381-384 (2021).
  48. Haney, E. F., Trimble, M. J., Cheng, J. T., Vallé, Q., Hancock, R. Critical assessment of methods to quantify biofilm growth and evaluate antibiofilm activity of host defence peptides. Biomolecules. 8 (2), 29 (2018).
  49. Puri, S., et al. Secreted aspartic protease cleavage of Candida albicans Msb2 activates Cek1 MAPK signaling affecting biofilm formation and oropharyngeal candidiasis. PLoS One. 7, 46020 (2012).
  50. Staib, P., et al. Tetracycline-inducible expression of individual secreted aspartic proteases in Candida albicans allows isoenzyme-specific inhibitor screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (1), 146-156 (2008).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 187
בדיקת הפחתה מסיסה המבוססת על טטרזוליום להערכת השפעת נוגדנים על ביופילמים <em>של קנדידה טרופיקליס</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chandley, P., Subba, P., Rohatgi, S. … More

Chandley, P., Subba, P., Rohatgi, S. A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms. J. Vis. Exp. (187), e64425, doi:10.3791/64425 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter