Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Un saggio di riduzione solubile a base di tetrazolio per valutare l'effetto degli anticorpi sui biofilm di Candida tropicalis

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64425
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Roorkee
* These authors contributed equally

Summary

Un protocollo basato su piastre di microtitolazione a 96 pozzetti che utilizza un saggio di riduzione di 2,3-bis(2-metossi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-carbossilide-2H-tetrazolio (XTT) è descritto nel presente documento, per studiare gli effetti degli anticorpi sui biofilm formati da C. tropicalis. Questo protocollo in vitro può essere utilizzato per verificare l'effetto di potenziali nuovi composti antifungini sull'attività metabolica delle cellule della specie Candida nei biofilm.

Abstract

Le specie di Candida sono la quarta causa più comune di infezioni nosocomiali sistemiche. La candidosi sistemica o invasiva comporta frequentemente la formazione di biofilm su dispositivi impiantati o cateteri, che è associata ad un aumento della virulenza e della mortalità. I biofilm prodotti da diverse specie di Candida mostrano una maggiore resistenza contro vari farmaci antifungini. Pertanto, vi è la necessità di sviluppare immunoterapie efficaci o trattamenti aggiuntivi contro i biofilm di Candida . Mentre il ruolo dell'immunità cellulare è ben stabilito nella protezione anti-Candida , il ruolo dell'immunità umorale è stato studiato meno.

È stato ipotizzato che l'inibizione della formazione e della maturazione del biofilm sia una delle principali funzioni degli anticorpi protettivi, e gli anticorpi del tubo germinale di Candida albicans (CAGTA) hanno dimostrato di sopprimere la crescita in vitro e la formazione di biofilm di C. albicans in precedenza. Questo articolo delinea un protocollo dettagliato per valutare il ruolo degli anticorpi sui biofilm formati da C. tropicalis. La metodologia per questo protocollo prevede la formazione di biofilm di C. tropicalis in piastre di microtitolazione a 96 pozzetti, che sono state poi incubate in presenza o assenza di anticorpi antigene-specifici, seguite da un saggio 2,3-bis(2-metossi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-carbossilide-2H-tetrazolio (XTT) per misurare l'attività metabolica delle cellule fungine nel biofilm.

La specificità è stata confermata utilizzando appropriati controlli sierici, incluso il siero impoverito di anticorpi Sap2. I risultati dimostrano che gli anticorpi presenti nel siero di animali immunizzati possono inibire la maturazione del biofilm di Candida in vitro. In sintesi, questo articolo fornisce importanti approfondimenti sul potenziale degli anticorpi nello sviluppo di nuove immunoterapie e trattamenti sinergici o aggiuntivi contro i biofilm durante la candidosi invasiva. Questo protocollo in vitro può essere utilizzato per verificare l'effetto di potenziali nuovi composti antifungini sull'attività metabolica delle cellule della specie Candida nei biofilm.

Introduction

La candidosi sistemica è la quarta causa principale di infezioni nosocomiali, che sono associate ad alti tassi di morbilità e mortalità in tutto il mondo. A livello globale, la candidosi sistemica colpisce circa 700.000 individui1. Le specie di Candida, vale a dire C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata e C. auris, sono la causa più comune di infezioni invasive da Candida 2. Le specie di Candida sono patogeni opportunisti che producono biofilm3. I biofilm sono prevalentemente associati alla virulenza della Candida e la Candida può resistere a condizioni di stress ossidativo e osmotico inducendo la formazione di biofilm4. I biofilm modulano ulteriormente l'espressione dei fattori di virulenza e dei componenti della parete cellulare e formano una matrice protettiva esopolimerica, aiutando la Candida ad adattarsi a diverse nicchie ospiti4. I biofilm contribuiscono all'aderenza del lievito sui tessuti ospiti e sugli strumenti medici5. Come tale, la formazione di biofilm è associata a un vantaggio per i lieviti, poiché le cellule di lievito all'interno dei biofilm possono eludere la risposta immunitaria dell'ospite6. La formazione di biofilm protegge anche i lieviti patogeni dall'azione dei farmaci antifungini5. La ridotta suscettibilità dei biofilm di C. albicans all'amfotericina B è stata dimostrata da Pierce et al.7,8. Inoltre, i biofilm dimostrano la resistenza dei farmaci antifungini al fluconazolo, che compromette la gestione efficace della candidosi sistemica 9,10.

I microbi hanno una tendenza intrinseca ad aderire a varie superfici biotiche e abiotiche, che si traduce nella formazione di biofilm. La Candida albicans, che è un fungo dimorfico, esiste in forme di lievito e ife e la sua formazione di biofilm è stata caratterizzata in vari sistemi modello in vitro e in vivo 11. Le fasi della formazione del biofilm includono l'adesione delle cellule di Candida al substrato, la filamento, la proliferazione e la maturazione del biofilm11. Inizialmente, la forma di lievito di C. albicans aderisce ai substrati, compresi i dispositivi medici e il tessuto umano, seguita dalla filamento e dalla proliferazione di C. albicans in forme ifali e pseudoifali e infine dalla maturazione dei biofilm incorporati nella matrice extracellulare11. La formazione di biofilm contribuisce in gran parte ai meccanismi di patogenesi di C. albicans 12. Le specie di Candida formano biofilm resistenti ai farmaci, il che rende difficile la loro eradicazione13. Un piccolo sottogruppo della popolazione produttrice di biofilm di C. albicans è stato descritto come altamente resistente ai farmaci antifungini amfotericina B e clorexidina14. Da notare che le cellule di lievito nei biofilm mostrano un'elevata resistenza alla terapia multifarmaco rispetto alle cellule di lievito nella fase planctonica e nella fasedi proliferazione 14. È stato suggerito che le cellule di lievito esistenti nei biofilm sono altamente tolleranti ai farmaci antifungini, il che contribuisce alla sopravvivenza di C. albicans nei biofilm14. Queste cellule esistenti sono state riportate come varianti fenotipiche di C. albicans e non mutanti14. Inoltre, le cellule dei biofilm di Candida note come "cellule persistenti" sono tolleranti ad alte dosi di trattamento con amfotericina-B e contribuiscono alla sopravvivenza della Candida, ponendo così un grande carico di infezioni sistemiche ricorrenti da Candida in individui ad alto rischio15.

L'aumento della resistenza ai farmaci antifungini nei ceppi di Candida richiede la ricerca di nuovi agenti antifungini e immunoterapie. Come evidente dagli studi sopra menzionati, i biofilm di Candida mostrano una ridotta suscettibilità ai farmaci antifungini. Pertanto, vi è la necessità di immunoterapie migliorate per controllare la formazione di biofilm di Candida. Studi precedenti hanno dimostrato che CAGTA può fornire una protezione efficace contro le infezioni sistemiche da Candida inibendo la formazione di biofilm di C. albicans in vitro16. Un altro studio ha riportato che l'immunizzazione dei topi con la proteina RAls3-N di C. albicans induce alti titoli anticorpali che interferiscono con la formazione del biofilm di C. albicans in vitro17. Gli anticorpi anti-Als3-N hanno anche esercitato un effetto inibitorio sulla dispersione di C. albicans dai biofilm17. Il vaccino NDV-3A basato su C. albicans è attualmente in fase di sperimentazione clinica e sono stati trovati anche sieri anti-NDV-3A per ridurre la formazione di biofilm di C. auris 18. Uno studio recente ha identificato l'inibizione della formazione di biofilm da parte degli anticorpi Sap2 come meccanismo di protezione in un modello murino di candidosi sistemica19.

Questo articolo delinea un protocollo dettagliato in vitro per valutare l'effetto degli anticorpi antigene-specifici presenti nel siero policlonale ottenuto da diversi gruppi di topi vaccinati con Sap2 su biofilm preformati di Candida tropicalis . Per raggiungere questo obiettivo, è stato ottimizzato e sviluppato in laboratorio un metodo basato su un saggio di riduzione XTT, in grado di misurare la vitalità del biofilm in modo rapido, sensibile e ad alta produttività, in presenza o assenza di anticorpi.

Il test XTT viene utilizzato per misurare l'attività metabolica cellulare come indicatore di vitalità cellulare, proliferazione cellulare e citotossicità20. Questo saggio colorimetrico si basa sulla riduzione di un sale giallo di tetrazolio, sodio 3'-[1-(fenilamminocarbonil)-3,4-tetrazolio]-bis (4-metossi-6-nitro) benzene solfonico idrato (XTT) ad un colorante formazan arancione da cellule metabolicamente attive. Poiché solo le cellule vitali possono ridurre XTT, la quantità di formazan XTT ridotta è proporzionale all'intensità del colore e alla vitalità cellulare. Il colorante formazan formato è solubile in acqua e viene quantificato direttamente utilizzando un lettore di piastre. Grazie alla sua natura solubile in acqua, il test XTT consente lo studio di biofilm intatti, nonché l'esame della suscettibilità ai farmaci da biofilm, senza interruzione della struttura del biofilm21. Inoltre, questo metodo è implementato nelle valutazioni di vitalità fungina della Candida grazie alla sua facilità d'uso, velocità, precisione, elevata produttività e alto grado di riproducibilità 7,22.

Oltre al test di riduzione XTT, sono state identificate anche numerose tecniche alternative per la misurazione della quantità di biofilm. Alcuni di questi includono l'uso del saggio di riduzione MTT, la colorazione viola cristallina, la quantificazione del DNA, la PCR quantitativa, la quantificazione delle proteine, la misurazione del peso delle cellule secche e il conteggio delle colonie vitali. Queste procedure variano ampiamente in termini di requisiti di tempo e costi. Taff et al. hanno eseguito un'analisi comparativa di sette diversi saggi di quantificazione del biofilm di Candida e hanno scoperto che il test XTT ha fornito il metodo più riproducibile, accurato ed efficiente per la stima quantitativa dei biofilm di C. albicans 23. Le tecniche di colorazione come il viola cristallo hanno alcune limitazioni; Il test del cristallo violetto determina indirettamente la quantità di biofilm misurando la densità ottica della matrice e delle cellule del biofilm colorato di cristallo violetto. Sebbene il saggio del cristallo violetto fornisca una buona misura della massa del biofilm, non fornisce una misura della vitalità del biofilm in quanto colora sia le cellule microbiche che la matrice extracellulare24. Dhale et al. hanno inoltre riferito che il test di riduzione XTT era il metodo più sensibile, riproducibile, accurato, efficiente e specifico per rilevare la produzione di biofilm rispetto al saggio di cristallo violetto25. I rapporti di letteratura hanno dimostrato che il test XTT correla bene con il parametro CFU/mL nel metodo di conteggio CFU. Tuttavia, rispetto al test XTT, il metodo CFU è laborioso e lento26. Inoltre, la frazione di cellule vive distaccate potrebbe non essere rappresentativa della popolazione iniziale di biofilm27. Sebbene il test di riduzione XTT sembri la migliore opzione disponibile per quantificare la fattibilità, ci sono alcune limitazioni di questa tecnica. Mentre il metodo XTT è utile per i confronti che coinvolgono un ceppo fungino, il suo uso può essere limitato quando si confrontano diversi ceppi e specie fungine. I confronti tra deformazioni possono essere difficili in assenza di una standardizzazione dettagliata poiché ceppi diversi metabolizzano substrati con capacità diverse21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

I topi BALB/c sono stati ospitati nella Small Animal Facility di IIT Roorkee. Tutti gli animali sono stati mantenuti in un ciclo luce:buio di 12 h:12 h a 25 °C e sono stati sottoposti a una dieta a pellet e acqua ad libitum. Tutte le procedure animali sono state approvate dall'Institutional Animal Ethics Committee (IAEC) di IIT Roorkee.

1. Preparazione di C. tropicalis

NOTA: Il fungo Candida tropicalis appartiene ai patogeni del gruppo di rischio 2 ed è classificato come microrganismo BSL2. Utilizzare sempre armadi di sicurezza biologica di classe II certificati quando si lavora con specie di Candida . Praticare tecniche asettiche e sterili durante il lavoro con C. tropicalis e seguire le procedure di biosicurezza raccomandate per il corretto smaltimento di questo agente patogeno.

  1. Striscia C. tropicalis (ceppo ATCC 750) su una piastra di agar destrosio Sabouraud (SAB).
  2. Preparare una coltura di C. tropicalis coltivata durante la notte inoculando una singola colonia dalla piastra di agar SAB in un tubo conico sterile da 50 mL contenente 10 mL di terreno di brodo SAB. In alternativa, utilizzare una scorta congelata di glicerolo di C. tropicalis e inoculare 100 μL del brodo di glicerolo in un matraccio conico sterile da 250 mL contenente 50 mL di terreno di brodo SAB.
  3. Incubare la coltura di C. tropicalis in uno shaker orbitale a 180 rpm a 30 °C per 24-48 h.
  4. Centrifugare la coltura fungina (cellule in fase logaritmica) a 2.150 × g per 15 minuti a 21 °C.
  5. Scartare il surnatante e aggiungere 50 ml di 1x PBS sterile al pellet. Lavare e risospendere il pellet in 1x PBS sterile con vortice delicato.
  6. Centrifugare nuovamente a 2.150 × g per 15 minuti a 21 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet fungino in 10 ml di 1x PBS sterile.
  7. Calcolare la concentrazione delle cellule contando con un emocitometro.
  8. Preparare gli stock fungini ad una densità finale di 1,0 × 106 cellule/ml in mezzo RPMI 1640 acido morfolinopropansolfonico (MOPS). Utilizzare immediatamente la sospensione cellulare dal punto 1.6.
    NOTA: Per impostare una piastra da 96 pozzetti, il volume totale di stock fungino necessario è di 10 ml (100 μL/pozzetto). Ridimensiona in base alle esigenze.

2. Formazione di biofilm di C. tropicalis

  1. Preparare i biofilm di Candida in una micropiastra di microtitolazione in polistirene a fondo piatto a 96 pozzetti come descritto in precedenza (Figura 1)28,29.
  2. Aggiungere 100 μL di coltura di C. tropicalis (da 106 cellule/mL di stock, preparati come sopra) in una piastra di microtitolazione a 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale (Figura 2A). Mantieni le ultime due colonne (11 e 12) come controlli negativi "nessun fungo più siero" e "nessun fungo e nessun siero" non aggiungendo cellule fungine. Riempire le colonne 11 e 12 con 100 μL di RPMI 1640 MOPS da solo.
  3. Coprire la piastra del titolo con un coperchio e un foglio di alluminio. Incubare la piastra per 24 ore a 37 °C in condizioni stazionarie.
  4. Il giorno successivo, aspirare il mezzo con attenzione utilizzando una pipetta multicanale (senza toccare o interrompere i biofilm). Picchiettare delicatamente la piastra in posizione invertita sui fogli assorbenti per rimuovere qualsiasi mezzo residuo.
  5. Lavare la piastra con 200 μL di 1x PBS (per pozzetto) utilizzando una pipetta multicanale. Aggiungere PBS molto delicatamente lungo le pareti laterali del pozzo per evitare di interrompere i biofilm. Aspirare attentamente il PBS utilizzando una pipetta multicanale. Ripetere il lavaggio PBS 2x (per un totale di tre lavaggi).
  6. Per rimuovere il PBS in eccesso, asciugare all'aria la piastra (senza coperchio) per 30 minuti a temperatura ambiente, all'interno di un armadio di sicurezza biologica.

3. Trattamento del biofilm con anticorpi

NOTA: I biofilm possono ora essere elaborati per valutare l'inibizione della maturazione del biofilm da parte degli anticorpi. Il siero murino è stato utilizzato come fonte di anticorpi policlonali. Diversi gruppi di topi immunizzati Sap2 (Sap2-albicans, Sap2-tropicalis e Sap2-parapsilosis) insieme a topi immunizzati sham sono stati dissanguati retro-orbitalmente e il siero è stato isolato come descritto in precedenza19. La presenza di anticorpi anti-Sap2 è stata confermata utilizzando ELISA Sap2-specifico come descritto in precedenza19.

  1. Eseguire l'inattivazione termica del siero (fonte di anticorpi policlonali) a 56 °C per 30 minuti prima dell'uso per escludere il ruolo del complemento nell'attività inibitoria. Inattivare a caldo il siero prima di effettuare la diluizione del siero.
    NOTA: Utilizzare siero di topi immunizzati fittizi, topi preimmuni e siero impoverito di anticorpi specifici per Sap2 come controlli aggiuntivi19. Il siero impoverito di anticorpi è stato preparato secondo uno studio precedente19. Tra le diluizioni seriali (1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1.600, 1:3.200, 1:6.400 e 1:12.800) per il siero testato in questo protocollo, l'inibizione della maturazione del biofilm è stata osservata a 1:25, 1:50 e 1:100; Quindi, 1:50 è stato selezionato per trovare un equilibrio tra inibizione e consumo di siero.
  2. Preparare diluizioni seriali di campioni di siero inattivati dal calore in terreno RPMI 1640 MOPS sterile (1:50). Utilizzare una comune diluizione del siero (1:50) per tutti i campioni di siero da testare per l'inibizione della maturazione del biofilm30.
  3. Aggiungere 100 μL della diluizione del siero selezionata a ciascun pozzetto della piastra di microtitolazione a 96 pozzetti. Per ogni campione, aggiungere le diluizioni di siero in duplice copia, secondo il layout allegato (Figura 2B).
    1. Nella colonna 10, non aggiungere diluizione del siero; aggiungere solo il mezzo RPMI 1640 MOPS per il controllo positivo solo fungo .
      NOTA: La colonna 10, le righe G1-G8 e H1-H8 inizialmente avevano cellule fungine in RPMI-MOPS. Tuttavia, mentre RPMI-MOPS è stato aggiunto alla colonna 10 anche dopo 24 ore, le righe G1-G8 sono servite come controllo PBS e le righe H1-H8 come controllo senza siero dopo 24 ore.
    2. Nella colonna 11, aggiungere una diluizione 1:50 di siero a tutti i pozzetti per fungere da controllo senza fungo più siero negativo.
    3. Nella colonna 12, non aggiungere la diluizione del siero a nessun pozzetto; Mantenere questo come il nessun fungo nessun controllo negativo del siero.
  4. Coprire la piastra con un coperchio e un foglio di alluminio. Incubare la piastra per 24 ore a 37 °C.

4. Stima dell'attività metabolica del biofilm

  1. Il giorno successivo, aspirare accuratamente il siero utilizzando una pipetta multicanale (senza toccare o interrompere i biofilm). Picchiettare delicatamente la piastra in posizione invertita sui fogli assorbenti per rimuovere eventuali residui di siero.
  2. Lavare la piastra con 200 μL di 1x PBS (per pozzetto) utilizzando una pipetta multicanale, aggiungendo il PBS lungo le pareti laterali del pozzetto per evitare di interrompere i biofilm. Aspirare con attenzione il PBS utilizzando una pipetta multicanale e ripetere il lavaggio PBS 2x (per un totale di tre lavaggi). Asciugare all'aria la piastra (senza coperchio) per 30 minuti a temperatura ambiente, all'interno di un armadio di sicurezza biologica per asciugare eventuali PBS in eccesso.
  3. Preparazione di XTT/menadione:
    1. Preparare XTT in Ringers Lactate sterili come soluzione da 0,5 g/L. Sciogliere 25 mg di XTT in 50 ml di Ringers Lattato sterilizzato con filtro. Aliquote 10 mL in provette separate ricoperte di fogli di alluminio e conservare a -80 °C.
    2. Preparare il menadione come brodo da 10 mM. Sciogliere 8,6 mg di menadione in 5 ml di acetone e distribuire 50 μL in 100 microtubi separati. Conservare le aliquote a -80 °C.
    3. Preparare la soluzione XTT/menadione appena prima dell'uso prendendo 10 mL di XTT e aggiungendo 1 μL di menadione per ottenere una soluzione di lavoro da 1 μM.
  4. Aggiungere 100 μL della soluzione XTT/menadione per pozzetto della piastra di microtitolazione a 96 pozzetti. Coprire la piastra con un coperchio e un foglio di alluminio. Incubare la piastra per 2 ore a 37 °C al buio.
  5. Trasferire 80 μL del surnatante colorato da ciascun pozzetto in una nuova piastra da 96 pozzetti. Leggi la piastra a 490 nm.
  6. Calcolare la media dei valori di assorbanza dei pozzetti nella colonna 10 (controllo positivo solo fungo), che servirà come valore di riferimento per calcolare la percentuale di inibizione del biofilm da parte di ciascun campione di siero utilizzando l'equazione (1).
    % inibizione del biofilm = 100 - Equation 1× 100 (1)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I biofilm di Candida tropicalis sono stati coltivati in piastre di microtitolazione a 96 pozzetti e sono stati ripresi a 40x utilizzando un microscopio invertito (Figura 1A). Il biofilm è stato ulteriormente colorato usando viola cristallino e osservato a 40x usando un microscopio invertito (Figura 1B). La microscopia elettronica a scansione mostra un'immagine rappresentativa del biofilm di C. tropicalis (Figura 1C). Per eseguire il test di inibizione del biofilm, 105 cellule di Candida sono state aggiunte ai pozzetti della piastra di microtitolazione a 96 pozzetti al tempo 0, come da layout (Figura 2A). Dopo 24 ore, la piastra è stata lavata e i campioni di siero sono stati aggiunti ai biofilm preformati. Una diluizione sierica comune di 1:50 è stata selezionata per confrontare diversi campioni di siero ottenuti da diversi gruppi di topi immunizzati Sap2 e sham-immunizzati secondo uno studio pilota e un rapporto precedentemente pubblicato30.

Diversi campioni di siero sono stati aggiunti alla piastra di microtitolazione a 96 pozzetti come da layout (Figura 2B) e valutati in duplice copia. I sieri ottenuti al giorno 30 dopo l'immunizzazione da tre topi per gruppo (Sap2-albicans immunizzati, Sap2-tropicalis immunizzati, Sap2-parapsilosis immunizzati, sham-immunizzati gruppo, topi preimmuni e campione di controllo Sap2-impoverito) sono stati analizzati con una diluizione 1:50. La piastra è stata letta a 490 nm di lunghezza d'onda utilizzando un lettore ELISA per ottenere letture colorimetriche XTT (valori OD490 ) per biofilm di C. tropicalis formati in presenza o assenza di siero (Tabella 1). Il bianco negativo è stato calcolato utilizzando la media delle colonne 11 e 12 (0,04). Il controllo positivo è stato calcolato calcolando una media dei pozzetti di soli funghi (colonna 10; 0,8165). Prima dei calcoli, il valore medio di assorbanza dei pozzetti di controllo nelle colonne 11 e 12 (0,04) è stato sottratto dalle misurazioni di assorbanza dei pozzi sperimentali. Pertanto, il valore di riferimento del controllo positivo del biofilm (colonna 10) è stato fissato a 0,7765 (= 0,8165 − 0,04).

I valori (media meno bianco) ottenuti per i pozzi sperimentali sono stati poi divisi per questo controllo positivo (0,7765) e la percentuale è stata ottenuta moltiplicando per 100. La percentuale di inibizione del biofilm è stata calcolata sottraendo ulteriormente il valore ottenuto da 100. Un grafico a barre mostra tutti i valori tracciati (Figura 3). L'ANOVA unidirezionale ordinario seguito dal test post hoc di Dunnett per confronti multipli è stato utilizzato per calcolare i valori p per valutare le differenze statistiche tra diversi gruppi sierici. Un valore p di <0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Il siero di topi immunizzati con parapsilosis Sap2 potrebbe impedire la maturazione dei biofilm preformati di C. tropicalis del 65%, rispetto al siero di topi immunizzati Sap2-albicans (45%) e Sap2-tropicalis (55%). In generale, l'inibizione del biofilm da parte del siero immunescente Sap2 era significativamente superiore a quella del siero immuni sham (16%) e del siero preimmune (13%), rispettivamente. Depauperando gli anticorpi Sap2-specifici dal siero come descritto altrove19, la capacità di inibizione del biofilm è stata ridotta al 10%. L'inibizione del biofilm è stata quasi trascurabile con l'uso di PBS (5%) e il controllo senza siero (5%).

Figure 1
Figura 1: Imaging del biofilm di Candida tropicalis . (A) Visualizzazione del biofilm di Candida tropicalis formato sul fondo di una piastra di microtitolazione a 96 pozzetti dopo la rimozione del mezzo RPMI, utilizzando un microscopio invertito. L'immagine è stata catturata utilizzando la microscopia a campo chiaro (non è stata utilizzata alcuna macchia). (B) Visualizzazione del biofilm di C. tropicalis formatosi sul fondo di una piastra di microtitolazione a 96 pozzetti dopo colorazione viola cristallina. (C) Visualizzazione del biofilm di C. tropicalis formato su vetrini mediante microscopia elettronica a scansione. Barre della scala = 100 μm (A,B), 10 μm (C). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Layout del formato della piastra a 96 pozzetti. Aggiunta di (A) cellule fungine ai pozzetti e (B) diluizioni di siero da diversi gruppi di topi (Sap2-albicans immunizzati, Sap2-tropicalis immunizzati, Sap2-parapsilosis immunizzati e sham-immunizzati; n = 3) valutati in duplice copia ad una diluizione 1:50. Ulteriori controlli includevano siero impoverito di Sap2, siero preimmune, PBS e controllo senza siero. La colonna 10 non aveva siero aggiunto (cellule fungine presenti, controllo positivo). Alla colonna 11 non sono state aggiunte cellule fungine (siero presente). La colonna 12 non aveva cellule fungine aggiunte (siero assente). Abbreviazioni: PBS = soluzione salina tamponata con fosfato; Sap2 = aspartile proteinasi secreta 2. I termini m1, m2 e m3 si riferiscono a topi diversi in ciascun gruppo (n = 3). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Grafico che mostra l'efficacia degli anticorpi policlonali specifici di Sap2 contro i biofilm preformati di C. tropicalis. La fonte di siero immunitario è mostrata sull'asse x, mentre la percentuale di inibizione della maturazione del biofilm di C. tropicalis è mostrata sull'asse y. Le barre rappresentano la media ± SEM (n = 3). Per calcolare i valori p è stato utilizzato un normale ANOVA unidirezionale seguito dal test post hoc di Dunnett per confronti multipli. Barre e simboli rappresentano le differenze tra i gruppi di topi immunizzati Sap2 con topi immunizzati sham. , p < 0,0001. Abbreviazioni: PBS = soluzione salina tamponata con fosfato; Sap2 = aspartile proteinasi secreta 2. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

<> 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Un 0.475 0.4141 0.0441 0.4637 0.485 0.0484 0.5179 0.4068 0.0442 0.8826 0.0452 0.0404
B 0.3848 0.3773 0.0428 0.369 0.3781 0.0465 0.4105 0.3773 0.0447 0.8428 0.0426 0.041
C 0.2754 0.2728 0.0427 0.305 0.3083 0.0415 0.3531 0.3213 0.0432 0.9661 0.0444 0.0453
D 0.6965 0.7185 0.043 0.6681 0.6711 0.0403 0.6346 0.728 0.0433 0.8643 0.0384 0.0358
E 0.7031 0.7117 0.0481 0.7806 0.688 0.0521 0.7095 0.6998 0.0525 0.7883 0.0491 0.0416
F 0.7588 0.7441 0.0456 0.7173 0.7233 0.0437 0.7733 0.6808 0.0462 0.7256 0.0468 0.0354
G 0.7681 0.7708 0.0435 0.7949 0.7496 0.0445 0.7695 0.7898 0.0451 0.7335 0.0429 0.0371
H 0.7652 0.7855 0.0469 0.7818 0.7766 0.0428 0.7592 0.7765 0.0445 0.7295 0.044 0.0341

Tabella 1: Letture di assorbanza a 490 nm per la piastra di microtitolazione a 96 pozzetti. Per ottenere le letture di assorbanza è stato utilizzato un lettore di piastre standard (Tecan) e le letture sono state abbinate al layout descritto nella Figura 2. I calcoli successivi sono stati eseguiti utilizzando questi dati.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Le infezioni fungine causate dalle specie di Candida sono associate ad alti tassi di morbilità e mortalità in tutto il mondo. La crescente minaccia di infezione fungina invasiva richiede la gestione precoce di tali malattie potenzialmente letali. La maggior parte delle infezioni da Candida comporta la formazione di biofilm, che aderiscono a una varietà di dispositivi medici e sono responsabili della persistenza e della recidiva delle infezioni fungine in ambito ospedaliero31. I biofilm sono composti da cellule di lievito o ifali e mostrano una notevole resistenza alla maggior parte dei farmaci antifungini convenzionali32. La resistenza antifungina da parte dei biofilm di Candida è stata attribuita a diversi meccanismi, tra cui la diminuzione della penetrazione antifungina, la presenza di matrice extracellulare, la sovraespressione delle pompe di efflusso di farmaci, l'alterata composizione dello sterolo della membrana cellulare, la crescita lenta e l'eterogeneità spaziale, l'attivazione di varie vie di segnalazione e la presenza di cellule persistenti tolleranti ai farmaci33,34. L'inibizione dell'adesione della Candida e la formazione di biofilm sono le strategie più importanti per prevenire l'infezione da Candida.

Vari saggi in vitro, come saggi di vitalità cellulare, saggi di micropiastre e saggi di misurazione del peso secco, sono stati utilizzati per studiare la formazione di biofilm di Candida, che si basano sulla valutazione specifica dei punti temporali dei biofilm23. Sono stati sviluppati saggi più avanzati come saggi basati su dispositivi microfluidici, che possono essere utilizzati per valutare la formazione di biofilm in tempo reale35. Finora, la formazione di biofilm è stata studiata utilizzando saggi in vitro, ma è necessario comprendere anche il processo dinamico di formazione del biofilm in condizioni in vivo 36,37. Attualmente, la maggior parte degli studi di inibizione del biofilm si applicano a C. albicans e pochi studi sono disponibili per l'eradicazione dei biofilm di Candida non albicani. Lo spettro delle infezioni da Candida è cambiato gradualmente negli ultimi decenni e le specie emergenti di Candida non albicans rappresentano un elevato carico di morbilità e mortalità in tutto il mondo. Pertanto, vi è una necessità emergente per lo sviluppo di nuove strategie per controllare la formazione di biofilm e lo sviluppo di saggi di inibizione del biofilm incentrati su specie di Candida non albicane. L'immunoterapia, in particolare gli anticorpi, ha un grande potenziale per inibire la formazione di biofilm e può essere usata per trattare l'infezione sistemica da Candida 38. Diversi studi hanno dimostrato il ruolo degli anticorpi nell'inibizione del biofilm nelle prime fasi della formazione del biofilm. È stato riportato che gli anticorpi policlonali generati in risposta all'immunizzazione della proteina 3-correlata al recettore del complemento (CR3-RP, che ha un ruolo potenziale nell'aderenza fungina) nei conigli hanno ridotto l'aderenza e la formazione di biofilm di C. albicans sulle cellule epiteliali buccali39. Inoltre, i ceppi di Candida, inclusi gli isolati del catetere, sono stati preincubati con anticorpi policlonali anti-CR3-RP e anticorpi monoclonali, OKM1, che hanno ridotto l'aderenza e la formazione di biofilm. La vitalità cellulare di C. albicans è stata valutata utilizzando il test XTT durante la fase di aderenza e la fase di formazione del biofilm40. Pochi studi hanno valutato il ruolo degli anticorpi contro la formazione di biofilm della specie Candida non albicans. Chupacova et al. hanno valutato l'efficacia degli anticorpi policlonali anti-CR3-RP contro C. albicans insieme a C. dubliniensis utilizzando il test XTT. Gli anticorpi policlonali anti-CR3-RP hanno inibito l'aderenza e la formazione di biofilm sia di C. albicans che di C. dubliniensis41.

In questo studio, viene descritto un protocollo semplice, rapido e intuitivo per valutare l'effetto degli anticorpi sulla maturazione e sullo sviluppo del biofilm. Questo test di riduzione XTT basato su piastre di microtitolazione a 96 pozzetti misura l'attività metabolica delle cellule vitali nei biofilm ed è stato adattato da studi precedenti 7,8. Il test XTT qui descritto è ampiamente utilizzato per stimare la crescita praticabile del biofilm. È diventato un test di vitalità cellulare comunemente usato perché è rapido, conveniente e può essere utilizzato in formato ad alta produttività come una piastra a 96 pozzetti. Inoltre, può essere utilizzato per quantificare sia il lievito che le forme ifali dei biofilm di Candida. Può anche essere utilizzato per la misurazione di biofilm di Candida su una varietà di substrati come dispositivi medici (ad esempio, cateteri) e lenti a contatto.

Alcuni dei passaggi critici di questo protocollo includono il vortice vigoroso delle sospensioni cellulari prima del pipettaggio in tutti i passaggi, per evitare l'aggregazione fungina7. È probabile che si sviluppino biofilm poveri quando le densità cellulari sono troppo alte o troppo basse. Pertanto, gli utenti dovrebbero seguire la densità delle cellule fungine ideale nell'inoculo iniziale7. Le fasi di lavaggio sono molto critiche e un eccessivo lavaggio cellulare dovrebbe essere evitato per evitare di interrompere il biofilm22. Lo strato inferiore del biofilm non deve essere disturbato durante il processo di lavaggio. Il test deve sempre essere eseguito in condizioni di oscurità ed è necessario includere più repliche22. Una nuova soluzione di XTT deve essere preparata ogni volta appena prima dell'uso. Poiché la differenza di tempo tra due reazioni può distorcere i risultati, gli utenti dovrebbero lavorare velocemente per garantire una differenza di tempo minima quando si aggiunge la soluzione XTT al primo e all'ultimo pozzetto della piastra42 a 96 pozzetti. L'uso di un foglio o di un parafilm è raccomandato per prevenire l'evaporazione. Se necessario, è possibile eseguire diversi passaggi per la risoluzione dei problemi. Nel caso in cui la crescita del biofilm sia assente o insoddisfacente, è necessario utilizzare la diluizione e i calcoli appropriati dell'inoculo di semina. Per una migliore formazione del biofilm, le condizioni di subcoltura possono essere modificate e la crescita del biofilm può essere provata utilizzando diversi materiali di superficie. Per migliorare significativamente la sensibilità del test XTT, si potrebbe ridurre il tempo necessario per la formazione del biofilm, aumentare la concentrazione dell'agente antifungino o abbreviare il periodo di incubazione del test7. Per evitare di interrompere il biofilm, è necessario evitare un eccessivo lavaggio cellulare22. Si possono evitare i pozzetti esterni per evitare che gli agenti di analisi siano esposti alla luce o aggiungere liquido ai pozzetti esterni per impedire agli agenti di evaporare dai pozzi interni. Devono essere somministrati lavaggi delicati se il biofilm viene interrotto durante il lavaggio22. Mentre questo protocollo testa l'effetto del siero su biofilm preformati di 24 ore per valutare l'inibizione della maturazione del biofilm, gli utenti possono anche modificare questo protocollo per aggiungere siero al tempo 0 per valutare l'inibizione della formazione di biofilm, come da un precedente rapporto30.

Rispetto ad altri metodi alternativi per quantificare la crescita del biofilm, il metodo XTT è il metodo più sensibile, riproducibile, accurato, economico e specifico. Sebbene il test XTT sia una tecnica rapida e semplice comunemente usata per valutare i biofilm, ha alcune limitazioni. Mentre è utile per determinare il dosaggio o gli effetti di vari agenti in un biofilm di una singola specie, dovrebbe essere usato con cautela per confrontare più isolati contemporaneamente a causa della variabilità metabolica tra isolati21. Per i confronti tra biofilm tra deformazione, è necessario eseguire una standardizzazione tecnica dettagliata21. Inoltre, mentre il prodotto XTT formazan si dissolve facilmente in soluzione, alcuni ceppi possono trattenere una certa quantità all'interno della cellula21. Poiché vi è una mancanza di chiarezza che coinvolge variabili, come la scelta del mezzo, il tempo di sviluppo del biofilm e le specifiche del siero, è consigliabile eseguire saggi biologici di conferma oltre al test XTT, ad esempio, la misurazione dello spessore del biofilm / biomassa (utilizzando il viola cristallino) o la vitalità cellulare (utilizzando il metodo CFU)43. Da notare che i risultati di questo test XTT sono ben correlati con il saggio crystal violet e il metodo CFU (dati non mostrati). Nonostante le limitazioni sopra menzionate, questo metodo può essere estrapolato per valutare diversi gruppi di campioni di siero (fonte di anticorpi policlonali), anticorpi monoclonali o immunoterapie aggiuntive. Sebbene il protocollo di riduzione XTT qui presentato mostri solo l'effetto degli anticorpi sui biofilm di C. tropicalis, è stato utilizzato dai ricercatori per studiare l'effetto degli anticorpi sui biofilm di C. auris e18. Inoltre, questo protocollo deriva da precedenti studi condotti con altre specie di Candida come C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. dubliniensis, C. tropicalis e C. auris, che possono meritare l'estensione di questo protocollo al genere Candida 16,41,44,45,46,47.

L'ottimizzazione, la standardizzazione e il miglioramento regolare dei saggi di quantificazione del biofilm possono migliorare l'accuratezza, la produttività e la riproducibilità. Il test di riduzione XTT su cui si basa questo protocollo è stato ampiamente utilizzato per la valutazione dell'attività metabolica e della vitalità dei biofilm. Poiché il biofilm di Candida è spesso resistente ai farmaci antifungini, l'esplorazione di nuovi farmaci e nuove combinazioni è una necessità urgente33. Per combattere il problema delle infezioni associate al biofilm, è necessario esplorare più composti antibiofilm utilizzando saggi di screening del biofilm48. Questo protocollo in vitro può essere utilizzato per verificare l'effetto di potenziali nuovi composti antifungini sull'attività metabolica delle cellule della specie Candida nei biofilm. La ricerca futura basata sulla standardizzazione e sul miglioramento del test di riduzione XTT che coinvolge immunoterapie basate su anticorpi può aiutare nello sviluppo di terapie migliorate per una gestione e un controllo efficaci della malattia.

L'inibizione del biofilm da parte di anticorpi Sap2-specifici è stata riportata come meccanismo di protezione mediata da anticorpi nella protezione mediata dal vaccino Sap2 durante la candidosi sistemica murina causata da C. tropicalis19. Uno studio precedente ha anche dimostrato che CAGTA potenzialmente riconoscendo gli antigeni Sap riduce la crescita e la formazione di biofilm di C. albicans in vitro16. In un altro studio, i mutanti con cancellazione di Sap2 hanno mostrato un difetto di crescita del biofilm in presenza di pepstatina A49. Inoltre, durante la formazione del biofilm, l'antigene Sap2 ha svolto un ruolo nell'elaborazione proteolitica della mucina Msb2 mediata attraverso la via di segnalazione50 della proteina chinasi attivata da mitogeni Cek1. Pertanto, si può ipotizzare che l'elaborazione di Msb2 sia inibita dalla neutralizzazione Sap2 mediata da anticorpi, che influisce sull'integrità del biofilm. In sintesi, questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per valutare il ruolo degli anticorpi sierici nella maturazione e nello sviluppo del biofilm di C. tropicalis , che può essere applicato per la determinazione dell'attività metabolica del biofilm in diversi contesti, utilizzando diversi ceppi fungini o fonti di anticorpi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal Ramalingaswami grant DBT-843-BIO (Department of Biotechnology, Government of India) e Early Career Research Award SER-1058-BIO (Science and Engineering Research Board, Government of India) a S.R. Gli autori riconoscono una sovvenzione ICMR-JRF a P.C e una sovvenzione DBT-JRF a P.S. Gli autori ringraziano il Dr. Ravikant Ranjan per i suggerimenti sul manoscritto e l'assistenza tecnica del Sig. Pradeep Singh Thakur durante il SEM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical centrifuge tubes BD Falcon 546021
1x PBS - Prepared in lab NaCl : 4 g
KCl : 0.1 g
Na2HPO4:  0.72 g
KH2PO4 : 0.12 g
Water 500 mL. Adjust pH to 7.4
50 mL conical centrifuge tubes BD Falcon 546041
96-well microtiter plates Nunc 442404
Incubator Generic
Menadione Sigma M5625
Microtiter Plate Reader Generic
Multichannel pipette and tips Generic
Petri dishes Tarson 460090
Ringers Lactate - Prepared in lab sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0 
RPMI 1640 MOPS Himedia AT180
Sabouraud dextrose Agar SRL 24613
Sabouraud dextrose Broth SRL 24835
XTT  Invitrogen X6493

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R. O., Denning, D. W. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).
  2. Pappas, P., Lionakis, M., Arendrup, M., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. Invasive candidiasis. Nature Reviews Disease Primers. 4, 18026 (2018).
  3. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  4. Pemmaraju, S. C., Padmapriya, K., Pruthi, P. A., Prasad, R., Pruthi, V. Impact of oxidative and osmotic stresses on Candida albicans biofilm formation. Biofouling. 32 (8), 897-909 (2016).
  5. Cavalheiro, M., Teixeira, M. C. Candida biofilms: threats, challenges, and promising strategies. Frontiers in Medicine. 5, 28 (2018).
  6. Roilides, E., Simitsopoulou, M., Katragkou, A., Walsh, T. J. How biofilms evade host defenses. Microbiology Spectrum. 3 (3), 3 (2015).
  7. Pierce, C. G., et al. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nature Protocols. 3 (9), 1494-1500 (2008).
  8. Pierce, C. G., Uppuluri, P., Tummala, S., Lopez-Ribot, J. L. A 96 well microtiter plate-based method for monitoring formation and antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Journal of Visualized Experiments. (44), e2287 (2010).
  9. Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 49 (6), 973-980 (2002).
  10. Quindós, G. Epidemiology of candidaemia and invasive candidiasis. A changing face. Revista Iberoamericana de Micología. 31 (1), 42-48 (2014).
  11. Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofilms and the host: models and new concepts for eradication. International Journal of Microbiology. 2012, 845352 (2012).
  12. Wall, G., Montelongo-Jauregui, D., Vidal Bonifacio, B., Lopez-Ribot, J., Uppuluri, P. Candida albicans biofilm growth and dispersal: contributions to pathogenesis. Current Opinion in Microbiology. 52, 1-6 (2019).
  13. Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, M. J. S. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62, 10-24 (2013).
  14. LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).
  15. Galdiero, E., et al. Eradication of Candida albicans persister cell biofilm by the membranotropic peptide gH625. Scientific Reports. 10 (1), 5780 (2020).
  16. Carrano, G., et al. Anti-Candida albicans germ tube antibodies reduce in vitro growth and biofilm formation of C. albicans. Revista Iberoamericana de Micología. 36 (1), 9-16 (2019).
  17. Alqarihi, A., Singh, S., Edwards, J. E., Ibrahim, A. S., Uppuluri, P. NDV-3A vaccination prevents C. albicans colonization of jugular vein catheters in mice. Scientific Reports. 9 (1), 6194 (2019).
  18. Singh, S., et al. The NDV-3A vaccine protects mice from multidrug resistant Candida auris infection. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007460 (2019).
  19. Shukla, M., Rohatgi, S. Vaccination with secreted aspartyl proteinase 2 protein from Candida parapsilosis can enhance survival of mice during C. tropicalis-mediated systemic candidiasis. Infection and Immunity. 88 (10), 00312-00320 (2020).
  20. Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT. Journal of Immunological Methods. 142 (2), 257-265 (1991).
  21. Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism. Journal of Clinical Microbiology. 41 (1), 506-508 (2003).
  22. Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. Journal of Clinical Microbiology. 49 (4), 1426-1433 (2011).
  23. Taff, H. T., Nett, J. E., Andes, D. R. Comparative analysis of Candida biofilm quantitation assays. Medical Mycology. 50 (2), 214-218 (2012).
  24. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
  25. Dhale, R. P., Ghorpade, M. V., Dharmadhikari, C. A. Comparison of various methods used to detect biofilm production of Candida species. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 8 (11), 18-20 (2014).
  26. Moffa, E. B., et al. Interaction between XTT assay and candida albicans or streptococcus mutans viability. Journal of International Oral Health. 8 (1), 12 (2016).
  27. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
  28. Harriott, M. M., Noverr, M. C. Ability of Candida albicans mutants to induce Staphylococcus aureus vancomycin resistance during polymicrobial biofilm formation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (9), 3746-3755 (2010).
  29. Pierce, C. G., et al. A novel small molecule inhibitor of Candida albicans biofilm formation, filamentation and virulence with low potential for the development of resistance. NPJ Biofilms and Microbiomes. 1, 15012 (2015).
  30. Dekkerová, J., Lopez-Ribot, J. L., Bujdáková, H. Activity of anti-CR3-RP polyclonal antibody against biofilms formed by Candida auris, a multidrug-resistant emerging fungal pathogen. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 101-108 (2019).
  31. Muzny, C. A., Schwebke, J. R. Biofilms: an underappreciated mechanism of treatment failure and recurrence in vaginal infections. Clinical Infectious Diseases. 61 (4), 601-606 (2015).
  32. Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 14-19 (2004).
  33. Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiology. 8 (10), 1325-1337 (2013).
  34. Singh, R., Kumari, A., Kaur, K., Sethi, P., Chakrabarti, A. Relevance of antifungal penetration in biofilm-associated resistance of Candida albicans and non-albicans Candida species. Journal of Medical Microbiology. 67 (7), 922-926 (2018).
  35. Gulati, M., Ennis, C. L., Rodriguez, D. L., Nobile, C. J. Visualization of biofilm formation in Candida albicans using an automated microfluidic device. Journal of Visualized Experiments. (130), e56743 (2017).
  36. Krom, B. P., Willems, H. M. In vitro models for Candida biofilm development. Candida Species. , Humana Press. New York, NY. 95-105 (2016).
  37. Gu, W., Xu, D., Guo, D., Zhang, L., Sun, S. In vivo models for Candida albicans biofilms study, research & reviews. Journal of Microbiology and Biotechnology. 5 (1), 26-31 (2016).
  38. Shukla, M., Chandley, P., Rohatgi, S. The role of B-cells and antibodies against Candida vaccine antigens in invasive candidiasis. Vaccines. 9 (10), 1159 (2021).
  39. Bujdáková, H., et al. Antibody response to the 45 kDa Candida albicans antigen in an animal model and potential role of the antigen in adherence. Journal of Medical Microbiology. 57 (12), 1466-1472 (2008).
  40. Bujdáková, H., Paulovicová, E., Paulovicová, L., Simová, Z. Participation of the Candida albicans surface antigen in adhesion, the first phase of biofilm development. FEMS Immunology & Medical Microbiology. 59 (3), 485-492 (2010).
  41. Chupácová, J., Borghi, E., Morace, G., Los, A., Bujdáková, H. Anti-biofilm activity of antibody directed against surface antigen complement receptor 3-related protein-comparison of Candida albicans and Candida dubliniensis. Pathogens and Disease. 76 (1), 127 (2018).
  42. Gulati, M., et al. In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), 60 (2018).
  43. Ramage, G. Comparing apples and oranges: considerations for quantifying candidal biofilms with XTT [2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide] and the need for standardized testing. Journal of Medical Microbiology. 65 (4), 259-260 (2016).
  44. Kovács, R., et al. Synergistic effect of nikkomycin Z with caspofungin and micafungin against Candida albicans and Candida parapsilosis biofilms. Letters in Applied Microbiology. 69 (4), 271-278 (2019).
  45. Fernández-Calderón, M. C., et al. Antifungal and anti-biofilm activity of a new Spanish extract of propolis against Candida glabrata. BMC Complementary Medicine and Therapies. 21 (1), 1-10 (2021).
  46. Li, Z., et al. Synergistic effect of pseudolaric acid B with fluconazole against resistant isolates and biofilm of Candida tropicalis. Infection and Drug Resistance. 13, 2733-2743 (2020).
  47. Chatzimoschou, A., Giampani, A., Meis, J. F., Roilides, E. Activities of nine antifungal agents against Candida auris biofilms. Mycoses. 64 (4), 381-384 (2021).
  48. Haney, E. F., Trimble, M. J., Cheng, J. T., Vallé, Q., Hancock, R. Critical assessment of methods to quantify biofilm growth and evaluate antibiofilm activity of host defence peptides. Biomolecules. 8 (2), 29 (2018).
  49. Puri, S., et al. Secreted aspartic protease cleavage of Candida albicans Msb2 activates Cek1 MAPK signaling affecting biofilm formation and oropharyngeal candidiasis. PLoS One. 7, 46020 (2012).
  50. Staib, P., et al. Tetracycline-inducible expression of individual secreted aspartic proteases in Candida albicans allows isoenzyme-specific inhibitor screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (1), 146-156 (2008).

Tags

Immunologia e infezione numero 187
Un saggio di riduzione solubile a base di tetrazolio per valutare l'effetto degli anticorpi sui biofilm <em>di Candida tropicalis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chandley, P., Subba, P., Rohatgi, S. … More

Chandley, P., Subba, P., Rohatgi, S. A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms. J. Vis. Exp. (187), e64425, doi:10.3791/64425 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter