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Immunology and Infection

Essai de réduction soluble à base de tétrazolium pour évaluer l’effet des anticorps sur les biofilms de Candida tropicalis

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64425
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Roorkee
* These authors contributed equally

Summary

Un protocole à base de plaques de microtitrage à 96 puits utilisant un test de réduction du 2,3-bis(2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophényl)-5-carboxanilide-2H-tétrazolium (XTT) est décrit ici, pour étudier les effets des anticorps sur les biofilms formés par C. tropicalis. Ce protocole in vitro peut être utilisé pour vérifier l’effet de nouveaux composés antifongiques potentiels sur l’activité métabolique des cellules de l’espèce Candida dans les biofilms.

Abstract

Les espèces de Candida sont la quatrième cause la plus fréquente d’infections nosocomiales systémiques. La candidose systémique ou invasive implique souvent la formation de biofilm sur des dispositifs implantés ou des cathéters, ce qui est associé à une virulence et une mortalité accrues. Les biofilms produits par différentes espèces de Candida présentent une résistance accrue contre divers médicaments antifongiques. Par conséquent, il est nécessaire de développer des immunothérapies efficaces ou des traitements d’appoint contre les biofilms de Candida . Alors que le rôle de l’immunité cellulaire est bien établi dans la protection anti-Candida , le rôle de l’immunité humorale a été moins étudié.

On a émis l’hypothèse que l’inhibition de la formation et de la maturation du biofilm est l’une des principales fonctions des anticorps protecteurs, et il a été démontré que les anticorps du tube germal de Candida albicans (CAGTA) suppriment la croissance in vitro et la formation de biofilm de C. albicans plus tôt. Cet article décrit un protocole détaillé pour évaluer le rôle des anticorps sur les biofilms formés par C. tropicalis. La méthodologie de ce protocole implique la formation de biofilm de C. tropicalis dans des plaques de microtitrage à 96 puits, qui ont ensuite été incubées en présence ou en l’absence d’anticorps spécifiques de l’antigène, suivie d’un test de 2,3-bis(2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophényl)-5-carboxanilide-2H-tétrazolium (XTT) pour mesurer l’activité métabolique des cellules fongiques dans le biofilm.

La spécificité a été confirmée en utilisant des témoins sériques appropriés, y compris un sérum appauvri en anticorps spécifiques de Sap2. Les résultats démontrent que les anticorps présents dans le sérum des animaux immunisés peuvent inhiber la maturation du biofilm de Candida in vitro. En résumé, cet article fournit des informations importantes sur le potentiel des anticorps dans le développement de nouvelles immunothérapies et de traitements synergiques ou d’appoint contre les biofilms au cours de la candidose invasive. Ce protocole in vitro peut être utilisé pour vérifier l’effet de nouveaux composés antifongiques potentiels sur l’activité métabolique des cellules de l’espèce Candida dans les biofilms.

Introduction

La candidose systémique est la quatrième cause majeure d’infections nosocomiales, qui sont associées à des taux élevés de morbidité et de mortalité dans le monde entier. À l’échelle mondiale, la candidose systémique touche environ 700 000 personnes1. Les espèces de Candida, à savoir C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata et C. auris, sont la cause la plus fréquente d’infections invasives à Candida 2. Les espèces de Candida sont des pathogènes opportunistes qui produisent des biofilms3. Les biofilms sont principalement associés à la virulence de Candida, et Candida peut résister à des conditions de stress oxydatif et osmotique en induisant la formation de biofilm4. Les biofilms modulent davantage l’expression des facteurs de virulence et des composants de la paroi cellulaire et forment une matrice protectrice exopolymère, aidant Candida à s’adapter à différentes niches hôtes4. Les biofilms contribuent à l’adhérence des levures sur les tissus de l’hôte et les instruments médicaux5. En tant que telle, la formation de biofilm est associée à un avantage pour les levures, car les cellules de levure dans les biofilms peuvent échapper à la réponse immunitaire de l’hôte6. La formation de biofilm protège également les levures pathogènes de l’action des médicaments antifongiques5. Pierce et coll.7,8 ont démontré une diminution de la sensibilité des biofilms de C. albicans à l’amphotéricine B. 7,8. De plus, les biofilms démontrent une résistance aux médicaments antifongiques au fluconazole, ce qui nuit à la prise en charge efficace de la candidose systémique 9,10.

Les microbes ont une tendance intrinsèque à adhérer à diverses surfaces biotiques et abiotiques, ce qui entraîne la formation de biofilm. Candida albicans, qui est un champignon dimorphe, existe sous forme de levure et d’hyphes, et sa formation de biofilm a été caractérisée dans divers systèmes modèles in vitro et in vivo 11. Les étapes de la formation du biofilm comprennent l’adhésion des cellules Candida au substrat, la filamentation, la prolifération et la maturation du biofilm11. Initialement, la forme de levure de C. albicans adhère aux substrats, y compris les dispositifs médicaux et les tissus humains, suivie par la filamentation et la prolifération de C. albicans en formes hyphales et pseudohyphes, et enfin la maturation des biofilms intégrés dans la matrice extracellulaire11. La formation de biofilm contribue largement aux mécanismes de pathogenèse de C. albicans 12. Les espèces de Candida forment des biofilms résistants aux médicaments, ce qui rend leur éradication difficile13. Un petit sous-ensemble de la population productrice de biofilm de C. albicans a été décrit comme étant très résistant aux médicaments antifongiques amphotéricine B et chlorhexidine14. Il convient de noter que les cellules de levure dans les biofilms présentent une résistance élevée à la multithérapie par rapport aux cellules de levure en phase planctonique et en phasede prolifération 14. Il a été suggéré que les cellules de levure existant dans les biofilms sont très tolérantes aux médicaments antifongiques, ce qui contribue à la survie de C. albicans dans les biofilms14. Ces cellules existantes ont été signalées comme étant des variantes phénotypiques de C. albicans et non des mutants14. En outre, les cellules des biofilms de Candida connues sous le nom de « cellules persistantes » sont tolérantes à de fortes doses de traitement à l’amphotéricine-B et contribuent à la survie de Candida, ce qui représente un lourd fardeau d’infections systémiques récurrentes à Candida chez les personnes à haut risque15.

L’augmentation de la résistance aux médicaments antifongiques dans les souches de Candida nécessite la recherche de nouveaux agents antifongiques et d’immunothérapies. Comme le montrent les études susmentionnées, les biofilms de Candida montrent une sensibilité réduite aux médicaments antifongiques. Par conséquent, il est nécessaire d’améliorer les immunothérapies pour contrôler la formation de biofilm de Candida. Des études antérieures ont montré que CAGTA peut fournir une protection efficace contre les infections systémiques à Candida en inhibant la formation de biofilm de C. albicans in vitro16. Une autre étude a rapporté que l’immunisation de souris avec la protéine RAls3-N de C. albicans induit des titres élevés d’anticorps qui interfèrent avec la formation du biofilm de C. albicans in vitro17. Les anticorps anti-Als3-N ont également exercé un effet inhibiteur sur la dispersion de C. albicans à partir de biofilms17. Le vaccin NDV-3A à base de C. albicans fait actuellement l’objet d’essais cliniques et des sérums anti-NDV-3A ont également permis de réduire la formation de biofilm de C. auris 18. Une étude récente a identifié l’inhibition de la formation de biofilm par les anticorps Sap2 comme mécanisme de protection dans un modèle murin de candidose systémique19.

Cet article décrit un protocole in vitro détaillé pour évaluer l’effet des anticorps spécifiques de l’antigène présents dans le sérum polyclonal obtenu à partir de différents groupes de souris vaccinées Sap2 sur des biofilms préformés de Candida tropicalis . Pour ce faire, une méthode basée sur un test de réduction XTT a été optimisée et développée en laboratoire, qui peut mesurer la viabilité du biofilm de manière rapide, sensible et à haut débit, en présence ou en l’absence d’anticorps.

Le test XTT est utilisé pour mesurer l’activité métabolique cellulaire en tant qu’indicateur de viabilité cellulaire, de prolifération cellulaire et de cytotoxicité20. Ce dosage colorimétrique est basé sur la réduction d’un sel de tétrazolium jaune, l’hydrate d’acide benzène sulfonique (XTT) 3'-[1-(phénylaminocarbonyl)-3,4-tétrazolium]-bis (4-méthoxy-6-nitro)benzène sulfonique (XTT) de sodium en un colorant formazan orange par des cellules métaboliquement actives. Étant donné que seules les cellules viables peuvent réduire la XTT, la quantité de formazan XTT réduite est proportionnelle à l’intensité de la couleur et à la viabilité cellulaire. Le colorant formazan formé est soluble dans l’eau et est directement quantifié à l’aide d’un lecteur de plaques. En raison de sa nature soluble dans l’eau, le test XTT permet l’étude de biofilms intacts, ainsi que l’examen de la sensibilité aux médicaments du biofilm, sans perturbation de la structure du biofilm21. De plus, cette méthode est mise en œuvre dans les évaluations de viabilité fongique de Candida en raison de sa facilité d’utilisation, de sa vitesse, de sa précision, de son débit élevé et de son haut degré de reproductibilité 7,22.

En plus du test de réduction XTT, de nombreuses techniques alternatives ont également été identifiées pour la mesure de la quantité de biofilm. Certains d’entre eux comprennent l’utilisation du test de réduction MTT, la coloration au violet cristallin, la quantification de l’ADN, la PCR quantitative, la quantification des protéines, la mesure du poids des cellules sèches et le comptage des colonies viables. Ces procédures varient considérablement en termes de temps et de coûts. Taff et al. ont effectué une analyse comparative de sept tests différents de quantification du biofilm de Candida et ont constaté que le test XTT fournissait la méthode la plus reproductible, précise et efficace pour l’estimation quantitative des biofilms de C. albicans 23. Les techniques de coloration telles que le cristal violet ont certaines limites; Le test du violet cristallin détermine indirectement la quantité de biofilm en mesurant la densité optique de la matrice et des cellules de biofilm colorées au violet cristallin. Bien que le test du cristal violet fournisse une bonne mesure de la masse du biofilm, il ne donne pas une mesure de la viabilité du biofilm car il colore à la fois les cellules microbiennes et la matrice extracellulaire24. Dhale et coll. ont en outre indiqué que le test de réduction XTT était la méthode la plus sensible, reproductible, précise, efficace et spécifique pour détecter la production de biofilm par rapport au test de violetcristallin 25. Les rapports de littérature ont montré que le test XTT est bien corrélé avec le paramètre UFC/mL dans la méthode de comptage CFU. Cependant, par rapport au test XTT, la méthode CFU est laborieuse et lente26. De plus, la fraction de cellules vivantes détachées peut ne pas être représentative de la population initiale de biofilms27. Bien que le test de réduction XTT semble la meilleure option disponible pour quantifier la viabilité, cette technique présente quelques limites. Bien que la méthode XTT soit utile pour les comparaisons impliquant une souche fongique, son utilisation peut être limitée lors de la comparaison de différentes souches et espèces fongiques. Les comparaisons entre souches peuvent être difficiles en l’absence d’une normalisation détaillée, car différentes souches métabolisent des substrats ayant des capacités différentes21.

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Protocol

Les souris BALB/c ont été logées dans l’installation pour petits animaux de l’IIT Roorkee. Tous les animaux ont été maintenus dans un cycle lumière:obscurité de 12 h:12 h à 25 °C et ont reçu un régime de granulés et de l’eau ad libitum. Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel d’éthique animale (IAEC) de l’IIT Roorkee.

1. Préparation de C. tropicalis

REMARQUE : Le champignon Candida tropicalis appartient aux agents pathogènes du groupe de risque 2 et est classé comme microorganisme BSL2. Utilisez toujours des enceintes de sécurité biologique certifiées de classe II lorsque vous travaillez avec des espèces de Candida . Pratiquez des techniques aseptiques et stériles pendant le travail avec C. tropicalis et suivez les procédures de biosécurité recommandées pour l’élimination appropriée de cet agent pathogène.

  1. Streak C. tropicalis (souche ATCC 750) sur une plaque de gélose au dextrose Sabouraud (SAB).
  2. Préparer une culture de C. tropicalis cultivée pendant la nuit en inoculant une seule colonie de la plaque de gélose SAB dans un tube conique stérile de 50 mL contenant 10 ml de milieu de bouillon SAB. Sinon, utiliser un bouillon de glycérol congelé de C. tropicalis et inoculer 100 μL du stock de glycérol dans une fiole conique stérile de 250 mL contenant 50 mL de milieu de bouillon SAB.
  3. Incuber la culture de C. tropicalis dans un agitateur orbital à 180 rpm à 30 °C pendant 24-48 h.
  4. Centrifuger la culture fongique (cellules en phase logarithmique) à 2 150 × g pendant 15 min à 21 °C.
  5. Jeter le surnageant et ajouter 50 ml de PBS 1x stérile à la pastille. Lavez et remettez en suspension la pastille dans 1x PBS stérile avec un léger vortex.
  6. Centrifuger à nouveau à 2 150 × g pendant 15 min à 21 °C. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille fongique dans 10 mL de PBS 1x stérile.
  7. Calculer la concentration des cellules en comptant avec un hémocytomètre.
  8. Préparer les souches fongiques à une densité finale de 1,0 × 106 cellules/ml dans un milieu d’acide morpholinepropanesulfonique (MOPS) RPMI 1640. Utilisez immédiatement la suspension cellulaire de l’étape 1.6.
    REMARQUE : Pour installer une plaque de 96 puits, le volume total de matériel fongique nécessaire est de 10 mL (100 μL/puits). Mettez à l’échelle selon vos besoins.

2. Formation de biofilm de C. tropicalis

  1. Préparer les biofilms de Candida dans une plaque de microtitrage en polystyrène à fond plat à 96 puits, comme décrit précédemment (figure 1)28,29.
  2. Ajouter 100 μL de culture de C. tropicalis (à partir de 106 cellules/mL de stock, préparé comme ci-dessus) dans une plaque de microtitrage de 96 puits à l’aide d’une pipette multicanal (figure 2A). Conservez les deux dernières colonnes (11 et 12) comme contrôles négatifs « pas de champignon plus sérum » et « pas de champignon et pas de sérum » en n’ajoutant pas de cellules fongiques. Remplir les colonnes 11 et 12 avec 100 μL de milieu RPMI 1640 MOPS seul.
  3. Couvrir la plaque de microtitrage avec un couvercle et une feuille d’aluminium. Incuber la plaque pendant 24 h à 37 °C dans des conditions stationnaires.
  4. Le lendemain, aspirez soigneusement le milieu à l’aide d’une pipette multicanal (sans toucher ni perturber les biofilms). Tapotez doucement la plaque en position inversée sur des buvards pour éliminer tout milieu résiduel.
  5. Lavez la plaque avec 200 μL de 1x PBS (par puits) à l’aide d’une pipette multicanal. Ajouter du PBS très doucement le long des parois latérales du puits pour éviter de perturber les biofilms. Aspirez soigneusement le PBS à l’aide d’une pipette multicanal. Répétez le lavage PBS 2x (un total de trois lavages).
  6. Pour enlever l’excès de PBS, sécher la plaque à l’air (sans le couvercle) pendant 30 minutes à température ambiante, à l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique.

3. Traitement du biofilm avec des anticorps

REMARQUE: Les biofilms peuvent maintenant être traités pour évaluer l’inhibition de la maturation du biofilm par les anticorps. Le sérum murin a été utilisé comme source d’anticorps polyclonaux. Différents groupes de souris immunisées contre Sap2 (Sap2-albicans, Sap2-tropicalis et Sap2-parapsilosis) ainsi que des souris immunisées contre un simulacre ont été saignées rétro-orbitalement et le sérum a été isolé comme décrit précédemment19. La présence d’anticorps anti-Sap2 a été confirmée à l’aide d’ELISA spécifique à Sap2, comme décrit précédemment19.

  1. Effectuer une inactivation thermique du sérum (source d’anticorps polyclonaux) à 56 °C pendant 30 min avant utilisation pour exclure le rôle du complément dans l’activité inhibitrice. Inactiver le sérum à la chaleur avant de procéder à la dilution du sérum.
    REMARQUE : Utilisez du sérum de souris immunisées simulées, de souris pré-immunes et de sérum appauvri en anticorps spécifiques de Sap2 comme témoins supplémentaires19. Le sérum appauvri en anticorps a été préparé selon une étude précédente19. Parmi les dilutions en série (1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1 600, 1:3 200, 1:6 400 et 1:12 800) pour le sérum testé dans ce protocole, une inhibition de la maturation du biofilm a été observée à 1:25, 1:50 et 1:100; Par conséquent, 1:50 a été choisi pour trouver un équilibre entre l’inhibition et la consommation de sérum.
  2. Préparer des dilutions en série d’échantillons de sérum inactivés par la chaleur dans un milieu stérile RPMI 1640 MOPS (1:50). Utiliser une dilution sérique commune (1:50) pour tous les échantillons de sérum à tester pour l’inhibition de la maturation du biofilm30.
  3. Ajouter 100 μL de la dilution sérique sélectionnée à chaque puits de la plaque de microtitrage à 96 puits. Pour chaque échantillon, ajouter les dilutions sériques en double, conformément à la disposition ci-jointe (figure 2B).
    1. Dans la colonne 10, ne pas ajouter la dilution sérique; ajouter uniquement le milieu RPMI 1640 MOPS pour le témoin positif contenant uniquement des champignons .
      REMARQUE : La colonne 10, lignes G1-G8 et H1-H8 avait initialement des cellules fongiques dans RPMI-MOPS. Cependant, alors que RPMI-MOPS a été ajouté à la colonne 10 même après 24 heures, les rangées G1-G8 ont servi de contrôle PBS et les rangées H1-H8 de contrôle sans sérum après 24 heures.
    2. Dans la colonne 11, ajouter une dilution de sérum de 1:50 à tous les puits pour servir de témoin négatif sans champignon et sérum.
    3. Dans la colonne 12, ne pas ajouter de dilution sérique dans un puits; Gardez ceci comme le contrôle négatif sans champignon pas de sérum.
  4. Couvrez la plaque avec un couvercle et une feuille d’aluminium. Incuber la plaque pendant 24 h à 37 °C.

4. Estimation de l’activité métabolique du biofilm

  1. Le lendemain, aspirez soigneusement le sérum à l’aide d’une pipette multicanal (sans toucher ni perturber les biofilms). Tapotez doucement la plaque en position inversée sur des feuilles de buvard pour enlever tout sérum résiduel.
  2. Lavez la plaque avec 200 μL de 1x PBS (par puits) à l’aide d’une pipette multicanal, en ajoutant le PBS le long des parois latérales du puits pour éviter de perturber les biofilms. Aspirez soigneusement le PBS à l’aide d’une pipette multicanal et répétez le lavage PBS 2x (un total de trois lavages). Sécher la plaque à l’air (sans le couvercle) pendant 30 minutes à température ambiante, à l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique pour sécher tout excès de PBS.
  3. Préparation de XTT/ménadione:
    1. Préparer XTT dans du lactate Ringers stérile sous forme de solution à 0,5 g/L. Dissoudre 25 mg de XTT dans 50 mL de lactate Ringers stérilisé par filtre. Aliquote 10 mL dans des tubes séparés recouverts d’une feuille d’aluminium et conserver à -80 °C.
    2. Préparer la ménadione comme un bouillon de 10 mM. Dissoudre 8,6 mg de ménadione dans 5 mL d’acétone et distribuer 50 μL dans 100 microtubes séparés. Conserver les aliquotes à -80 °C.
    3. Préparer la solution XTT/ménadione juste avant utilisation en prenant 10 mL de XTT et en ajoutant 1 μL de ménadione pour obtenir une solution de travail de 1 μM.
  4. Ajouter 100 μL de la solution XTT/ménadione par puits de la plaque de microtitrage à 96 puits. Couvrez la plaque avec un couvercle et une feuille d’aluminium. Incuber la plaque pendant 2 h à 37 °C dans l’obscurité.
  5. Transférer 80 μL du surnageant coloré de chaque puits dans une nouvelle plaque de 96 puits. Lire la plaque à 490 nm.
  6. Calculer la moyenne des valeurs d’absorbance des puits dans la colonne 10 (témoin positif uniquement contre les champignons), qui servira de valeur de référence pour calculer le pourcentage d’inhibition du biofilm par chaque échantillon de sérum à l’aide de l’équation (1).
    % d’inhibition du biofilm = 100 - Equation 1× 100 (1)

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Representative Results

Les biofilms de Candida tropicalis ont été cultivés dans des plaques de microtitrage à 96 puits et imagés à 40x à l’aide d’un microscope inversé (Figure 1A). Le biofilm a ensuite été coloré à l’aide de cristal violet et observé à 40x à l’aide d’un microscope inversé (Figure 1B). La microscopie électronique à balayage montre une image représentative du biofilm de C. tropicalis (Figure 1C). Pour effectuer le test d’inhibition du biofilm, 10 à 5 cellules de Candida ont été ajoutées aux puits de la plaque de microtitrageà 96 puits au temps 0, conformément à la disposition (figure 2A). Après 24 h, la plaque a été lavée et des échantillons de sérum ont été ajoutés aux biofilms préformés. Une dilution sérique commune de 1:50 a été sélectionnée pour comparer différents échantillons de sérum provenant de différents groupes de souris immunisées contre le Sap2 et de souris immunisées contre un simulacre, conformément à une étude pilote et à un rapport publié antérieurement30.

Différents échantillons de sérum ont été ajoutés à la plaque de microtitrage à 96 puits conformément à la disposition (figure 2B) et évalués en double. Les sérums obtenus au jour 30 après l’immunisation à partir de trois souris par groupe (Sap2-albicans immunisée, Sap2-tropicalis immunisée, Sap2-parapsilose immunisée, groupe vacciné contre placebo, souris pré-immunes et échantillon témoin appauvri en Sap2) ont été analysés à une dilution de 1:50. La plaque a été lue à une longueur d’onde de 490 nm à l’aide d’un lecteur ELISA pour obtenir des lectures colorimétriques XTT (valeurs OD490 ) pour les biofilms de C. tropicalis formés en présence ou en l’absence de sérum (tableau 1). Le blanc négatif a été calculé à l’aide de la moyenne des colonnes 11 et 12 (0,04). Le contrôle positif a été calculé en calculant une moyenne de puits contenant uniquement des champignons (colonne 10; 0,8165). Avant les calculs, la valeur d’absorbance moyenne des puits témoins dans les colonnes 11 et 12 (0,04) a été soustraite des mesures d’absorbance des puits expérimentaux. Ainsi, la valeur de référence du témoin positif au biofilm (colonne 10) a été fixée à 0,7765 (= 0,8165 − 0,04).

Les valeurs (moyenne moins blanc) obtenues pour les puits expérimentaux ont ensuite été divisées par ce témoin positif (0,7765) et le pourcentage a été obtenu en multipliant par 100. Le pourcentage d’inhibition du biofilm a été calculé en soustrayant davantage la valeur obtenue de 100. Un graphique à barres montre toutes les valeurs tracées (Figure 3). L’ANOVA unidirectionnelle ordinaire suivie du test post hoc de Dunnett pour les comparaisons multiples a été utilisée pour calculer les valeurs p afin d’évaluer les différences statistiques entre différents groupes de sérums. Une valeur p de < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative. Le sérum de souris immunisées contre la parapsilose Sap2 pourrait empêcher la maturation des biofilms préformés de C. tropicalis de 65%, par rapport au sérum de souris immunisées Sap2-albicans (45%) et Sap2-tropicalis (55%). En général, l’inhibition du biofilm par le sérum immunitaire Sap2 était significativement plus élevée que celle par le sérum anti-immunité simulée (16%) et le sérum pré-immun (13%), respectivement. Lors de l’épuisement des anticorps spécifiques de Sap2 du sérum comme décrit ailleurs 19, la capacité d’inhibition du biofilm a été réduite à10%. L’inhibition du biofilm était presque négligeable lors de l’utilisation du PBS (5%) et de l’absence de contrôle sérique (5%).

Figure 1
Figure 1 : Imagerie du biofilm de Candida tropicalis . (A) Visualisation du biofilm de Candida tropicalis formé au fond d’une plaque de microtitrage de 96 puits après retrait du milieu RPMI, à l’aide d’un microscope inversé. L’image a été capturée à l’aide de la microscopie à fond clair (aucune coloration n’a été utilisée). (B) Visualisation du biofilm de C. tropicalis formé au fond d’une plaque de microtitrage de 96 puits après coloration au violet cristallin. (C) Visualisation du biofilm de C. tropicalis formé sur des lames de verre par microscopie électronique à balayage. Barres d’échelle = 100 μm (A,B), 10 μm (C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Disposition du format de plaque à 96 puits. Ajout (A) de cellules fongiques aux puits et (B) de dilutions sériques de différents groupes de souris (Sap2-albicans immunisés, Sap2-tropicalis immunisés, Sap2-parapsilosis immunisés et immunisés contre placebo; n = 3) évalués en double à une dilution de 1:50. Les contrôles supplémentaires comprenaient le sérum appauvri en Sap2, le sérum pré-immun, le PBS et le contrôle sans sérum. Aucun sérum n’a été ajouté à la colonne 10 (présence de cellules fongiques, témoin positif). Aucune cellule fongique n’a été ajoutée à la colonne 11 (présence de sérum). Aucune cellule fongique n’a été ajoutée à la colonne 12 (absence de sérum). Abréviations : PBS = solution saline tamponnée au phosphate; Sap2 = aspartyl protéinase 2 sécrétée. Les termes m1, m2 et m3 désignent différentes souris de chaque groupe (n = 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Graphique montrant l’efficacité des anticorps polyclonaux spécifiques de Sap2 contre les biofilms préformés de C. tropicalis. La source de sérum immunitaire est indiquée sur l’axe des x, tandis que le pourcentage d’inhibition de la maturation du biofilm de C. tropicalis est indiqué sur l’axe des y. Les barres représentent la moyenne ± SEM (n = 3). L’ANOVA unidirectionnelle ordinaire suivie du test post hoc de Dunnett pour les comparaisons multiples a été utilisée pour calculer les valeurs p. Les barres et les symboles représentent les différences entre les groupes de souris immunisées par Sap2 et les souris immunisées contre un simulacre. , p < 0,0001. Abréviations : PBS = solution saline tamponnée au phosphate; Sap2 = aspartyl protéinase 2 sécrétée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

<> 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Un 0.475 0.4141 0.0441 0.4637 0.485 0.0484 0.5179 0.4068 0.0442 0.8826 0.0452 0.0404
B 0.3848 0.3773 0.0428 0.369 0.3781 0.0465 0.4105 0.3773 0.0447 0.8428 0.0426 0.041
C 0.2754 0.2728 0.0427 0.305 0.3083 0.0415 0.3531 0.3213 0.0432 0.9661 0.0444 0.0453
D 0.6965 0.7185 0.043 0.6681 0.6711 0.0403 0.6346 0.728 0.0433 0.8643 0.0384 0.0358
E 0.7031 0.7117 0.0481 0.7806 0.688 0.0521 0.7095 0.6998 0.0525 0.7883 0.0491 0.0416
F 0.7588 0.7441 0.0456 0.7173 0.7233 0.0437 0.7733 0.6808 0.0462 0.7256 0.0468 0.0354
G 0.7681 0.7708 0.0435 0.7949 0.7496 0.0445 0.7695 0.7898 0.0451 0.7335 0.0429 0.0371
H 0.7652 0.7855 0.0469 0.7818 0.7766 0.0428 0.7592 0.7765 0.0445 0.7295 0.044 0.0341

Tableau 1 : Valeurs d’absorbance à 490 nm pour la plaque de microtitrage à 96 puits. Un lecteur de plaques standard (Tecan) a été utilisé pour obtenir les lectures d’absorbance et les lectures ont été adaptées à la disposition décrite à la figure 2. Des calculs ultérieurs ont été effectués à l’aide de ces données.

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Discussion

Les infections fongiques causées par les espèces de Candida sont associées à des taux élevés de morbidité et de mortalité dans le monde entier. La menace croissante d’une infection fongique invasive nécessite la prise en charge précoce de ces maladies potentiellement mortelles. La plupart des infections à Candida impliquent la formation de biofilms, qui adhèrent à une variété de dispositifs médicaux et sont responsables de la persistance et de la récurrence des infections fongiques en milieu hospitalier31. Les biofilms sont composés de cellules de levure ou d’hyphes, et ils présentent une résistance considérable à la majorité des médicaments antifongiques conventionnels32. La résistance antifongique des biofilms de Candida a été attribuée à plusieurs mécanismes, notamment la diminution de la pénétration antifongique, la présence de matrice extracellulaire, la surexpression de pompes d’efflux médicamenteux, la modification de la composition des stérols de la membrane cellulaire, la croissance lente et l’hétérogénéité spatiale, l’activation de diverses voies de signalisation et la présence de cellules persistantes tolérantes aux médicaments33,34. L’inhibition de l’adhésion à Candida et la formation de biofilm sont les stratégies les plus importantes pour prévenir l’infection à Candida.

Divers essais in vitro, tels que des essais de viabilité cellulaire, des essais sur plaque de microtitrage et des essais de mesure du poids sec, ont été utilisés pour étudier la formation de biofilms de Candida, qui sont basés sur l’évaluation ponctuelle spécifique des biofilms23. Des essais plus avancés, tels que des essais microfluidiques basés sur des dispositifs, ont été mis au point, qui peuvent être utilisés pour évaluer la formation de biofilms en temps réel35. Jusqu’à présent, la formation de biofilm a été étudiée à l’aide d’essais in vitro, mais il est nécessaire de comprendre le processus dynamique de formation du biofilm dans des conditions in vivo 36,37. Actuellement, la plupart des études d’inhibition du biofilm s’appliquent à C. albicans et peu d’études sont disponibles pour l’éradication des biofilms de Candida non-albicans. Le spectre des infections à Candida a changé progressivement au cours des dernières décennies et les espèces émergentes de Candida non albicans représentent un fardeau élevé de morbidité et de mortalité dans le monde entier. Par conséquent, il existe un besoin émergent pour le développement de nouvelles stratégies pour contrôler la formation de biofilm et le développement de tests d’inhibition du biofilm axés sur les espèces de Candida non albicans. L’immunothérapie, en particulier les anticorps, a un grand potentiel pour inhiber la formation de biofilm et peut être utilisée pour traiter l’infection systémique à Candida 38. Plusieurs rapports ont démontré le rôle des anticorps dans l’inhibition du biofilm aux stades précoces de la formation du biofilm. Il a été rapporté que les anticorps polyclonaux générés en réponse à l’immunisation liée à la protéine liée au récepteur 3 du complément (CR3-RP, ayant un rôle potentiel dans l’observance fongique) chez le lapin réduisaient l’observance et la formation de biofilm de C. albicans sur les cellules épithéliales buccales39. De plus, les souches de Candida, y compris les isolats de cathéter, ont été préincubées avec un anticorps polyclonal anti-CR3-RP et un anticorps monoclonal, OKM1, ce qui a réduit l’adhérence et la formation de biofilm. La viabilité cellulaire de C. albicans a été évaluée à l’aide du test XTT pendant la phase d’adhérence et la phase de formation du biofilm40. Peu d’études ont évalué le rôle des anticorps contre la formation de biofilm d’espèces Candida non albicans. Chupacova et al. ont évalué l’efficacité des anticorps polyclonaux anti-CR3-RP contre C. albicans avec C. dubliniensis en utilisant le test XTT. Les anticorps polyclonaux anti-CR3-RP ont inhibé l’adhérence et la formation de biofilm de C. albicans et de C. dubliniensis41.

Dans cette étude, un protocole simple, rapide et convivial est décrit pour évaluer l’effet des anticorps sur la maturation et le développement du biofilm. Ce test de réduction XTT à base de plaques de microtitrage à 96 puits mesure l’activité métabolique des cellules viables dans les biofilms et a été adapté à partir d’études antérieures 7,8. Le test XTT décrit ici est largement utilisé pour estimer la croissance du biofilm viable. Il est devenu un test de viabilité cellulaire couramment utilisé car il est rapide, pratique et peut être utilisé dans un format à haut débit tel qu’une plaque de 96 puits. En outre, il peut être utilisé pour quantifier les formes de levure et d’hyphes des biofilms de Candida. Il peut également être utilisé pour la mesure des biofilms de Candida sur une variété de substrats tels que les dispositifs médicaux (par exemple, les cathéters) et les lentilles de contact.

Certaines des étapes critiques de ce protocole comprennent le tourbillon vigoureux des suspensions cellulaires avant le pipetage à toutes les étapes, afin d’éviter l’agrégation fongique7. Des biofilms pauvres sont susceptibles de se développer lorsque les densités cellulaires sont trop élevées ou trop faibles. Par conséquent, les utilisateurs doivent suivre la densité cellulaire fongique idéale dans l’inoculum initial7. Les étapes de lavage sont très critiques et le lavage excessif des cellules doit être évité pour éviter de perturber le biofilm22. La couche inférieure du biofilm ne doit pas être perturbée pendant le processus de lavage. Le test doit toujours être effectué dans des conditions sombres, et il est nécessaire d’inclure plusieurs répétitions22. Une solution fraîche de XTT doit être préparée à chaque fois juste avant utilisation. Comme la différence de temps entre deux réactions peut fausser les résultats, les utilisateurs doivent travailler rapidement pour assurer une différence de temps minimale lors de l’ajout de la solution XTT au premier et au dernier puits de la plaque42 à 96 puits. L’utilisation de papier d’aluminium ou de parafilm est recommandée pour prévenir l’évaporation. Plusieurs étapes de dépannage peuvent être effectuées si nécessaire. Si la croissance du biofilm est absente ou insatisfaisante, une dilution appropriée de l’inoculum d’ensemencement et des calculs doivent être utilisés. Pour une meilleure formation du biofilm, les conditions de sous-culture peuvent être modifiées et la croissance du biofilm peut être essayée en utilisant différents matériaux de surface. Pour améliorer significativement la sensibilité du test XTT, on pourrait réduire le temps nécessaire à la formation du biofilm, augmenter la concentration de l’agent antifongique ou raccourcir la période d’incubationdu test 7. Pour éviter de perturber le biofilm, un lavage excessif des cellules doit être évité22. On peut soit éviter les puits extérieurs pour empêcher les agents de dosage d’être exposés à la lumière, soit ajouter du liquide aux puits extérieurs pour empêcher les agents de s’évaporer des puits intérieurs. Des lavages doux doivent être effectués si le biofilm est perturbé pendant le lavage22. Bien que ce protocole teste l’effet du sérum sur des biofilms préformés de 24 h pour évaluer l’inhibition de la maturation du biofilm, les utilisateurs peuvent également modifier ce protocole pour ajouter du sérum au temps 0 afin d’évaluer l’inhibition de la formation de biofilm, selon un rapport antérieur30.

Comparée à d’autres méthodes alternatives pour quantifier la croissance du biofilm, la méthode XTT est la méthode la plus sensible, reproductible, précise, rentable et spécifique. Bien que le test XTT soit une technique rapide et facile couramment utilisée pour évaluer les biofilms, il présente certaines limites. Bien qu’il soit utile pour déterminer la posologie ou les effets de divers agents dans un biofilm d’une seule espèce, il doit être utilisé avec prudence pour comparer plusieurs isolats simultanément en raison de la variabilité métabolique entre les isolats21. Pour les comparaisons de biofilms entre souches, une normalisation technique détaillée doit être effectuée21. De plus, alors que le produit XTT formazan se dissout facilement dans la solution, certaines souches peuvent conserver une certaine quantité dans la cellule21. Étant donné qu’il y a un manque de clarté impliquant des variables, telles que le choix des milieux, le moment du développement du biofilm et les spécificités du sérum, il est conseillé d’effectuer des essais biologiques de confirmation en plus du test XTT, par exemple, la mesure de l’épaisseur du biofilm / biomasse (à l’aide de cristal violet) ou de la viabilité cellulaire (en utilisant la méthode CFU)43. Il convient de noter que les résultats de ce test XTT étaient bien corrélés avec le test au violet cristallin et la méthode CFU (données non présentées). Malgré les limites mentionnées ci-dessus, cette méthode peut être extrapolée pour évaluer différents groupes d’échantillons de sérum (source d’anticorps polyclonaux), d’anticorps monoclonaux ou d’immunothérapies d’appoint. Bien que le protocole de réduction XTT présenté ici ne montre que l’effet des anticorps sur les biofilms de C. tropicalis, il a été utilisé par les chercheurs pour étudier l’effet des anticorps sur les biofilms de C. auris 18. De plus, ce protocole découle d’études antérieures réalisées avec d’autres espèces de Candida telles que C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. dubliniensis, C. tropicalis et C. auris, qui peuvent mériter l’extension de ce protocole au genre Candida 16,41,44,45,46,47.

L’optimisation, la normalisation et l’amélioration régulière des essais de quantification du biofilm peuvent améliorer la précision, le débit et la reproductibilité. Le test de réduction XTT sur lequel ce protocole est basé a été largement utilisé pour l’évaluation de l’activité métabolique et de la viabilité des biofilms. Étant donné que le biofilm de Candida est souvent résistant aux médicaments antifongiques, l’exploration de nouveaux médicaments et de nouvelles combinaisons est une nécessité urgente33. Pour lutter contre le problème des infections associées au biofilm, davantage de composés antibiofilms doivent être explorés à l’aide de tests de criblage du biofilm48. Ce protocole in vitro peut être utilisé pour vérifier l’effet de nouveaux composés antifongiques potentiels sur l’activité métabolique des cellules de l’espèce Candida dans les biofilms. Les recherches futures basées sur la normalisation et l’amélioration du test de réduction XTT impliquant des immunothérapies à base d’anticorps pourraient aider à la mise au point de thérapies améliorées pour une gestion et un contrôle efficaces de la maladie.

L’inhibition du biofilm par des anticorps spécifiques de Sap2 a été rapportée comme un mécanisme de protection médié par les anticorps dans la protection médiée par le vaccin Sap2 au cours de la candidose systémique murine causée par C. tropicalis19. Une étude antérieure a également montré que CAGTA reconnaissant potentiellement les antigènes Sap réduit la croissance et la formation de biofilm de C. albicans in vitro16. Dans une autre étude, les mutants supprimés par Sap2 ont présenté un défaut de croissance du biofilm en présence de pepstatine A49. De plus, lors de la formation du biofilm, l’antigène Sap2 a joué un rôle dans le traitement protéolytique de la mucine Msb2 médiée par la voie de signalisation de la protéine kinase activée par les mitogènesCek1 50. Par conséquent, on peut supposer que le traitement Msb2 est inhibé par la neutralisation Sap2 médiée par les anticorps, ce qui affecte l’intégrité du biofilm. En résumé, cet article fournit un protocole détaillé pour évaluer le rôle des anticorps sériques dans la maturation et le développement du biofilm de C. tropicalis , qui peut être appliqué pour la détermination de l’activité métabolique du biofilm dans différents contextes, en utilisant différentes souches fongiques ou sources d’anticorps.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la subvention Ramalingaswami DBT-843-BIO (Département de biotechnologie, gouvernement de l’Inde) et le prix de recherche en début de carrière SER-1058-BIO (Science and Engineering Research Board, gouvernement de l’Inde) à S.R. Les auteurs reconnaissent une subvention ICMR-JRF à P.C et une subvention DBT-JRF à P.S. Les auteurs remercient le Dr Ravikant Ranjan pour les suggestions sur le manuscrit et l’assistance technique de M. Pradeep Singh Thakur pendant le SEM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical centrifuge tubes BD Falcon 546021
1x PBS - Prepared in lab NaCl : 4 g
KCl : 0.1 g
Na2HPO4:  0.72 g
KH2PO4 : 0.12 g
Water 500 mL. Adjust pH to 7.4
50 mL conical centrifuge tubes BD Falcon 546041
96-well microtiter plates Nunc 442404
Incubator Generic
Menadione Sigma M5625
Microtiter Plate Reader Generic
Multichannel pipette and tips Generic
Petri dishes Tarson 460090
Ringers Lactate - Prepared in lab sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0 
RPMI 1640 MOPS Himedia AT180
Sabouraud dextrose Agar SRL 24613
Sabouraud dextrose Broth SRL 24835
XTT  Invitrogen X6493

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Immunologie et infection numéro 187
Essai de réduction soluble à base de tétrazolium pour évaluer l’effet des anticorps sur les biofilms de <em>Candida tropicalis</em>
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Chandley, P., Subba, P., Rohatgi, S. A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms. J. Vis. Exp. (187), e64425, doi:10.3791/64425 (2022).

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