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Immunology and Infection

कैंडिडा ट्रॉपिकलिस बायोफिल्म पर एंटीबॉडी के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक घुलनशील टेट्राज़ोलियम-आधारित कमी परख

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64425
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Roorkee
* These authors contributed equally

Summary

सी ट्रॉपिकलिस द्वारा गठित बायोफिल्म पर एंटीबॉडी के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, 2,3-बीआईएस (2-मेथॉक्सी-4-नाइट्रो-5-सल्फोफिनाइल)-5-कार्बोक्सनिलाइड-2एच-टेट्राज़ोलियम (एक्सटीटी) कमी परख का उपयोग करके एक 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट-आधारित प्रोटोकॉल यहां वर्णित है। इस इन विट्रो प्रोटोकॉल का उपयोग बायोफिल्म में कैंडिडा प्रजातियों की कोशिकाओं की चयापचय गतिविधि पर संभावित नए एंटिफंगल यौगिकों के प्रभाव की जांच करने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

कैंडिडा प्रजातियां प्रणालीगत नोसोकोमियल संक्रमण का चौथा सबसे आम कारण हैं। प्रणालीगत या आक्रामक कैंडिडिआसिस में अक्सर प्रत्यारोपित उपकरणों या कैथेटर पर बायोफिल्म गठन शामिल होता है, जो बढ़ी हुई उग्रता और मृत्यु दर से जुड़ा होता है। विभिन्न कैंडिडा प्रजातियों द्वारा उत्पादित बायोफिल्म विभिन्न एंटिफंगल दवाओं के खिलाफ बढ़े हुए प्रतिरोध का प्रदर्शन करते हैं। इसलिए, कैंडिडा बायोफिल्म के खिलाफ प्रभावी इम्यूनोथेरेपी या सहायक उपचार विकसित करने की आवश्यकता है। जबकि एंटी-कैंडिडा संरक्षण में सेलुलर प्रतिरक्षा की भूमिका अच्छी तरह से स्थापित है, ह्यूमर इम्युनिटी की भूमिका का कम अध्ययन किया गया है।

यह अनुमान लगाया गया है कि बायोफिल्म गठन और परिपक्वता का निषेध सुरक्षात्मक एंटीबॉडी के प्रमुख कार्यों में से एक है, और कैंडिडा अल्बिकन्स जर्म ट्यूब एंटीबॉडी (सीएजीटीए) को पहले सी अल्बिकन्स के इन विट्रो विकास और बायोफिल्म गठन को दबाने के लिए दिखाया गया है। यह पेपर सी ट्रॉपिकलिस द्वारा गठित बायोफिल्म पर एंटीबॉडी की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल को रेखांकित करता है। इस प्रोटोकॉल की कार्यप्रणाली में 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेटों में सी ट्रॉपिकलिस बायोफिल्म गठन शामिल है, जिसे तब एंटीजन-विशिष्ट एंटीबॉडी की उपस्थिति या अनुपस्थिति में इनक्यूबेट किया गया था, इसके बाद बायोफिल्म में फंगल कोशिकाओं की चयापचय गतिविधि को मापने के लिए 2,3-बीआईएस (2-मेथॉक्सी-4-नाइट्रो-5-सल्फोफिनाइल) -5-कार्बोक्सनिलाइड-2एच-टेट्राज़ोलियम (एक्सटीटी) परख शामिल थी।

उपयुक्त सीरम नियंत्रणों का उपयोग करके विशिष्टता की पुष्टि की गई, जिसमें एसएपी 2-विशिष्ट एंटीबॉडी-क्षीण सीरम शामिल था। परिणाम बताते हैं कि प्रतिरक्षित जानवरों के सीरम में मौजूद एंटीबॉडी विट्रो में कैंडिडा बायोफिल्म परिपक्वता को रोक सकते हैं। सारांश में, यह पेपर आक्रामक कैंडिडिआसिस के दौरान बायोफिल्म के खिलाफ नए इम्यूनोथेरेपी और सहक्रियात्मक या सहायक उपचार विकसित करने में एंटीबॉडी की क्षमता के बारे में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। इस इन विट्रो प्रोटोकॉल का उपयोग बायोफिल्म में कैंडिडा प्रजातियों की कोशिकाओं की चयापचय गतिविधि पर संभावित नए एंटिफंगल यौगिकों के प्रभाव की जांच करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

प्रणालीगत कैंडिडिआसिस नोसोकोमियल संक्रमण का चौथा प्रमुख कारण है, जो दुनिया भर में उच्च रुग्णता और मृत्यु दर से जुड़ा हुआ है। विश्व स्तर पर, प्रणालीगत कैंडिडिआसिस लगभग 700,000 व्यक्तियों को प्रभावित करताहै। कैंडिडा प्रजातियां, अर्थात् सी अल्बिकन्स, सी ट्रॉपिकलिस, सी पैराप्सिलोसिस, सी ग्लेब्रैटा और सी ऑरिस, आक्रामक कैंडिडा संक्रमण2 का सबसे आम कारण हैं। कैंडिडा प्रजातियां अवसरवादी रोगजनक हैं जो बायोफिल्म का उत्पादन करती हैं। बायोफिल्म मुख्य रूप से कैंडिडा विषाणु से जुड़े होते हैं, और कैंडिडा बायोफिल्म गठन को प्रेरित करके ऑक्सीडेटिव और आसमाटिक तनाव की स्थिति का सामना कर सकता है। बायोफिल्म्स विषाणु कारकों और सेल दीवार घटकों की अभिव्यक्ति को और संशोधित करते हैं और एक एक्सोपॉलीमेरिक सुरक्षात्मक मैट्रिक्स बनाते हैं, जिससे कैंडिडा को विभिन्न मेजबान nichesके अनुकूल होने में मदद मिलती है। बायोफिल्म मेजबान ऊतकों और चिकित्सा उपकरणों पर खमीर पालन में योगदान करतेहैं। जैसे, बायोफिल्म गठन खमीर के लिए एक लाभ के साथ जुड़ा हुआ है, क्योंकि बायोफिल्म के भीतर खमीर कोशिकाएं मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से बच सकतीहैं। बायोफिल्म गठन भी रोगजनक खमीर को एंटिफंगल दवाओं की कार्रवाई से बचाताहै। एम्फोटेरिसिन बी के लिए सी अल्बिकन्स बायोफिल्म की संवेदनशीलता में कमी पियर्स एट अल.7,8 द्वारा प्रदर्शित की गई है। इसके अलावा, बायोफिल्म फ्लुकोनाज़ोल के लिए एंटिफंगल दवा प्रतिरोध का प्रदर्शन करते हैं, जो प्रणालीगत कैंडिडिआसिस 9,10 के प्रभावी प्रबंधन को बाधित करता है।

रोगाणुओं में विभिन्न जैविक और अजैविक सतहों का पालन करने की आंतरिक प्रवृत्ति होती है, जिसके परिणामस्वरूप बायोफिल्म का निर्माण होता है। कैंडिडा अल्बिकन्स, जो एक द्विरूपी कवक है, खमीर और हाइफल रूपों में मौजूद है, और इसके बायोफिल्म गठन को विभिन्न इन विट्रो और विवो मॉडल सिस्टम11 में विशेषता दी गई है। बायोफिल्म गठन के चरणों में कैंडिडा कोशिकाओं का सब्सट्रेट, फिलामेंटेशन, प्रसार और बायोफिल्म परिपक्वता11 में आसंजन शामिल है। अल्बिकन्स का खमीर रूप चिकित्सा उपकरणों और मानव ऊतक सहित सब्सट्रेट्स का पालन करता है, इसके बाद सी अल्बिकन्स का हाइफल और स्यूडोहाइफाल रूपों में फिलामेंटेशन और प्रसार होता है, और अंत में बाह्य मैट्रिक्स11 में एम्बेडेड बायोफिल्म की परिपक्वता होती है। बायोफिल्म गठन काफी हद तक सी अल्बिकन्स रोगजनन तंत्र12 में योगदान देता है। कैंडिडा प्रजातियां दवा प्रतिरोधी बायोफिल्म बनाती हैं, जो उनकेउन्मूलन को चुनौतीपूर्ण बनाती हैं। अल्बिकन्स बायोफिल्म उत्पादक आबादी के एक छोटे से उप-समूह को एंटिफंगल दवाओं एम्फोटेरिसिन बी और क्लोरहेक्सिडीन14 के लिए अत्यधिक प्रतिरोधी के रूप में वर्णित किया गया है। ध्यान दें, बायोफिल्म में खमीर कोशिकाएं प्लवक चरण और प्रसार चरण14 में खमीर कोशिकाओं की तुलना में मल्टीड्रग थेरेपी के लिए उच्च प्रतिरोध प्रदर्शित करती हैं। यह सुझाव दिया गया है कि बायोफिल्म में मौजूद खमीर कोशिकाएं एंटिफंगल दवाओं के प्रति अत्यधिक सहिष्णु हैं, जो बायोफिल्म14 में सी अल्बिकन्स के अस्तित्व में योगदान देती हैं। इन मौजूदा कोशिकाओं को सी अल्बिकन्स के फेनोटाइपिक वेरिएंट के रूप में रिपोर्ट किया गया था, न कि म्यूटेंट14। इसके अलावा, कैंडिडा बायोफिल्म की कोशिकाएं जिन्हें "परसिस्टर कोशिकाओं" के रूप में जाना जाता है, एम्फोटेरिसिन-बी उपचार की उच्च खुराक के प्रति सहिष्णु हैं और कैंडिडा के अस्तित्व में योगदान करते हैं, जिससे उच्च जोखिम वाले व्यक्तियों में आवर्ती प्रणालीगत कैंडिडा संक्रमण का एक बड़ा बोझ पैदा होताहै।

कैंडिडा उपभेदों में एंटिफंगल दवा प्रतिरोध में वृद्धि नए एंटिफंगल एजेंटों और इम्यूनोथेरेपी के लिए अनुसंधान की आवश्यकता है। जैसा कि उपर्युक्त अध्ययनों से स्पष्ट है, कैंडिडा बायोफिल्म एंटिफंगल दवाओं के लिए संवेदनशीलता में कमी दिखाते हैं। इसलिए, कैंडिडा बायोफिल्म गठन को नियंत्रित करने के लिए बेहतर इम्यूनोथेरेपी की आवश्यकता है। पहले के अध्ययनों से पता चला है कि सीएजीटीए विट्रो16 में सी अल्बिकन्स बायोफिल्म गठन को रोककर प्रणालीगत कैंडिडा संक्रमण के खिलाफ प्रभावी सुरक्षा प्रदान कर सकता है। एक अन्य अध्ययन में बताया गया है कि सी अल्बिकन्स आरएएल3-एन प्रोटीन के साथ चूहों का टीकाकरण उच्च एंटीबॉडी टिटर्स को प्रेरित करता है जो विट्रो17 में सी अल्बिकन्स बायोफिल्म गठन में हस्तक्षेप करते हैं। एंटी-एएलएस 3-एन एंटीबॉडी ने बायोफिल्म17 से सी अल्बिकन्स फैलाव पर एक निरोधात्मक प्रभाव भी डाला। सी अल्बिकन्स पर आधारित एनडीवी -3 ए वैक्सीन वर्तमान में नैदानिक परीक्षण के अधीन है और एंटी-एनडीवी -3 ए सेरा को सी ऑरिस बायोफिल्म गठन18 को कम करने के लिए भी पाया गया था। हाल के एक अध्ययन ने प्रणालीगत कैंडिडिआसिस19 के मुराइन मॉडल में एक सुरक्षा तंत्र के रूप में एसएपी 2-एंटीबॉडी द्वारा बायोफिल्म गठन के निषेध की पहचान की।

यह पेपर पूर्वनिर्मित कैंडिडा ट्रॉपिकलिस बायोफिल्म पर एसएपी 2 टीकाकरण वाले चूहों के विभिन्न समूहों से प्राप्त पॉलीक्लोनल सीरम में मौजूद एंटीजन-विशिष्ट एंटीबॉडी के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक विस्तृत इन विट्रो प्रोटोकॉल को रेखांकित करता है। इसे प्राप्त करने के लिए, एक एक्सटीटी कमी परख पर आधारित एक विधि को प्रयोगशाला में अनुकूलित और विकसित किया गया था, जो एंटीबॉडी की उपस्थिति या अनुपस्थिति में, एक तेज, संवेदनशील और उच्च-थ्रूपुट तरीके से बायोफिल्म व्यवहार्यता को माप सकता है।

एक्सटीटी परख का उपयोग सेल व्यवहार्यता, सेलुलर प्रसार और साइटोटॉक्सिसिटी20 के संकेतक के रूप में सेलुलर चयापचय गतिविधि को मापने के लिए किया जाता है। यह कलरिमेट्रिक परख एक पीले टेट्राज़ोलियम नमक, सोडियम 3'-[1-(फेनिलामिनोकार्बोनिल)-3,4-टेट्राज़ोलियम]-बिस (4-मेथॉक्सी-6-नाइट्रो) बेंजीन सल्फोनिक एसिड हाइड्रेट (एक्सटीटी) को चयापचय रूप से सक्रिय कोशिकाओं द्वारा नारंगी फॉर्माज़ान डाई में कम करने पर आधारित है। चूंकि केवल व्यवहार्य कोशिकाएं एक्सटीटी को कम कर सकती हैं, इसलिए कम एक्सटीटी फॉर्माज़ान की मात्रा रंग और सेल व्यवहार्यता की तीव्रता के आनुपातिक है। गठित फॉर्माज़ान डाई पानी में घुलनशील है और सीधे प्लेट रीडर का उपयोग करके निर्धारित की जाती है। इसकी पानी में घुलनशील प्रकृति के कारण, एक्सटीटी परख बरकरार बायोफिल्म के अध्ययन की अनुमति देता है, साथ ही बायोफिल्म संरचना 21 के व्यवधान के बिना बायोफिल्म दवा संवेदनशीलता की परीक्षा भीदेता है। इसके अतिरिक्त, इस विधि को कैंडिडा फंगल व्यवहार्यता आकलन में इसके उपयोग में आसानी, गति, सटीकता, उच्च थ्रूपुट और प्रजनन क्षमता की उच्च डिग्री 7,22 के कारण लागू किया गया है।

एक्सटीटी कमी परख के अलावा, बायोफिल्म मात्रा के माप के लिए कई वैकल्पिक तकनीकों की भी पहचान की गई है। इनमें से कुछ में एमटीटी रिडक्शन परख, क्रिस्टल वायलेट स्टेनिंग, डीएनए परिमाणीकरण, मात्रात्मक पीसीआर, प्रोटीन परिमाणीकरण, शुष्क सेल वजन माप और व्यवहार्य कॉलोनी गिनती का उपयोग शामिल है। ये प्रक्रियाएं उनके समय और लागत आवश्यकताओं के संदर्भ में व्यापक रूप से भिन्न होती हैं। टैफ एट अल ने सात अलग-अलग कैंडिडा बायोफिल्म की मात्रा का तुलनात्मक विश्लेषण किया और पाया कि एक्सटीटी परख ने सी अल्बिकन्स बायोफिल्म23 के मात्रात्मक अनुमान के लिए सबसे प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, सटीक और कुशल विधि प्रदान की। क्रिस्टल वायलेट जैसी धुंधला तकनीकों की कुछ सीमाएं हैं; क्रिस्टल वायलेट परीक्षण अप्रत्यक्ष रूप से क्रिस्टल बैंगनी-दाग वाले बायोफिल्म मैट्रिक्स और कोशिकाओं के ऑप्टिकल घनत्व को मापकर बायोफिल्म की मात्रा निर्धारित करता है। यद्यपि क्रिस्टल वायलेट परख बायोफिल्म द्रव्यमान का एक अच्छा उपाय प्रदान करता है, यह बायोफिल्म व्यवहार्यता का माप नहीं देता है क्योंकि यह माइक्रोबियल कोशिकाओं और बाह्य मैट्रिक्स24 दोनों को दाग देता है। ढाले एट अल ने आगे बताया कि क्रिस्टल वायलेट परख25 की तुलना में एक्सटीटी कमी परख बायोफिल्म उत्पादन का पता लगाने के लिए सबसे संवेदनशील, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, सटीक, कुशल और विशिष्ट विधि थी। साहित्य रिपोर्टों से पता चला है कि एक्सटीटी परख सीएफयू गिनती विधि में सीएफयू / एमएल पैरामीटर के साथ अच्छी तरह से संबंधित है। हालांकि, एक्सटीटी परख की तुलना में, सीएफयू विधि श्रम-गहन और धीमी26 है। इसके अलावा, अलग जीवित कोशिकाओं का अंश प्रारंभिक बायोफिल्म आबादी का प्रतिनिधि नहीं हो सकताहै। यद्यपि एक्सटीटी कमी परख व्यवहार्यता को निर्धारित करने के लिए सबसे अच्छा उपलब्ध विकल्प लगता है, इस तकनीक की कुछ सीमाएं हैं। जबकि एक्सटीटी विधि एक फंगल तनाव से जुड़ी तुलना के लिए उपयोगी है, विभिन्न फंगल उपभेदों और प्रजातियों की तुलना करते समय इसका उपयोग सीमित हो सकता है। विस्तृत मानकीकरण की अनुपस्थिति में इंटरस्ट्रेन तुलना मुश्किल हो सकती है क्योंकि विभिन्न उपभेदविभिन्न क्षमताओं के साथ सब्सट्रेट्स को चयापचय करते हैं।

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Protocol

बीएएलबी/सी चूहों को आईआईटी रुड़की में लघु पशु सुविधा में रखा गया था। सभी जानवरों को 25 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे: 12 घंटे प्रकाश: अंधेरे चक्र में बनाए रखा गया था और उन्हें पेलेट आहार और पानी एड लिबिटम प्रदान किया गया था। सभी पशु प्रक्रियाओं को आईआईटी रुड़की की संस्थागत पशु आचार समिति (आईएईसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. सी. ट्रॉपिकलिस की तैयारी

नोट: कवक कैंडिडा उष्णकटिबंधीय जोखिम समूह 2 रोगजनकों से संबंधित है और इसे बीएसएल 2 सूक्ष्मजीव के रूप में वर्गीकृत किया गया है। कैंडिडा प्रजातियों के साथ काम करते समय हमेशा प्रमाणित वर्ग द्वितीय जैविक सुरक्षा अलमारियाँ का उपयोग करें। उष्णकटिबंधीय के साथ काम के दौरान सड़न रोकनेवाला और बाँझ तकनीकों का अभ्यास करें और इस रोगज़नक़ के उचित निपटान के लिए अनुशंसित जैव सुरक्षा प्रक्रियाओं का पालन करें।

  1. ट्रॉपिकलिस (स्ट्रेन एटीसीसी 750) एक सबौरौड डेक्सट्रोज (एसएबी) एगर प्लेट पर।
  2. सब आगर प्लेट से एक एकल कॉलोनी को एक बाँझ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में इंजेक्ट करके सी ट्रॉपिकलिस की रात भर उगाई गई संस्कृति तैयार करें जिसमें 10 एमएल एसएबी शोरबा माध्यम होता है। वैकल्पिक रूप से, सी ट्रॉपिकलिस के जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक का उपयोग करें और ग्लिसरॉल स्टॉक के 100 μL को एक बाँझ 250 एमएल शंक्वाकार फ्लास्क में टीका लगाएं जिसमें 50 एमएल सब शोरबा माध्यम होता है।
  3. उष्णकटिबंधीय संस्कृति को 24-48 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर 180 आरपीएम पर एक कक्षीय शेकर में इनक्यूबेट करें ।
  4. 21 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 2,150 × ग्राम पर फंगल कल्चर (लघुगणकीय चरण में कोशिकाएं) को सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. सतह पर तैरने वाला छोड़ दें और गोली में बाँझ 1x PBS के 50 मिलीलीटर जोड़ें। कोमल भंवर के साथ बाँझ 1x PBS में गोली को धोएं और पुन: निलंबित करें।
  6. सेंट्रीफ्यूज फिर से 2,150 × ग्राम पर 15 मिनट के लिए 21 डिग्री सेल्सियस पर। सतह पर तैरने वाला छोड़ दें और फंगल पेलेट को बाँझ 1x PBS के 10 एमएल में पुन: निलंबित करें।
  7. हेमोसाइटोमीटर के साथ गिनती करके कोशिकाओं की एकाग्रता की गणना करें।
  8. आरपीएमआई1640 मोर्फोलिनप्रोपेनसल्फोनिक एसिड (एमओपीएस) माध्यम में 1.0 × 10 6 कोशिकाओं / एमएल के अंतिम घनत्व पर फंगल स्टॉक तैयार करें। चरण 1.6 से तुरंत सेल निलंबन का उपयोग करें।
    नोट: एक 96-वेल प्लेट स्थापित करने के लिए, आवश्यक कुल फंगल स्टॉक वॉल्यूम 10 एमएल (100 μL / आवश्यकतानुसार स्केल।

2. सी. ट्रॉपिकलिस बायोफिल्म गठन

  1. कैंडिडा बायोफिल्म को 96-अच्छी तरह से फ्लैट-बॉटम पॉलीस्टाइनिन माइक्रोटिटर प्लेट में तैयार करें जैसा कि पहले वर्णित है (चित्रा 1)28,29)।
  2. ट्रॉपिकलिस कल्चर (106 कोशिकाओं / एमएल स्टॉक से, ऊपर के रूप में तैयार) को मल्टीचैनल पिपेट (चित्रा 2 ए) का उपयोग करके 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट में 100 μL जोड़ें। अंतिम दो कॉलम (11 और 12) को फंगल कोशिकाओं को न जोड़कर 'नो फंगस प्लस सीरम' और 'नो फंगस और नो सीरम' नकारात्मक नियंत्रण के रूप में रखें। कॉलम 11 और 12 को अकेले आरपीएमआई 1640 एमओपीएस माध्यम के 100 μL के साथ भरें।
  3. माइक्रोटिटर प्लेट को ढक्कन और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करें। स्थिर परिस्थितियों में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  4. अगले दिन, मल्टीचैनल पिपेट (बायोफिल्म को छूने या बाधित किए बिना) का उपयोग करके माध्यम को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें। किसी भी अवशिष्ट माध्यम को हटाने के लिए ब्लोटिंग शीट पर एक उल्टे स्थिति में प्लेट को धीरे से टैप करें।
  5. मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके प्लेट को 1x PBS (प्रति कुएं) के 200 μL के साथ धो लें। बायोफिल्म को बाधित करने से बचने के लिए कुएं की साइड की दीवारों के साथ पीबीएस को बहुत धीरे से जोड़ें। मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके पीबीएस को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें। पीबीएस वॉश 2एक्स (कुल तीन वॉश) को दोहराएं।
  6. अतिरिक्त पीबीएस को हटाने के लिए, जैविक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए प्लेट (ढक्कन के बिना) को हवा में सुखाएं।

3. एंटीबॉडी के साथ बायोफिल्म का उपचार

नोट: बायोफिल्म को अब एंटीबॉडी द्वारा बायोफिल्म परिपक्वता के निषेध का आकलन करने के लिए संसाधित किया जा सकता है। मुराइन सीरम का उपयोग पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के स्रोत के रूप में किया गया था। सैप 2-प्रतिरक्षित (सैप 2-अल्बिकन्स, सैप 2-ट्रॉपिकलिस, और सैप 2-पैराप्सिलोसिस) के विभिन्न समूहों के साथ-साथ शाम-प्रतिरक्षित चूहों को रेट्रो-ऑर्बिटल रूप से लहूलुहान किया गया था और सीरमको अलग किया गया था जैसा कि पहले वर्णित किया गया था। एंटी-सैप 2 एंटीबॉडी की उपस्थिति की पुष्टि सैप 2-विशिष्ट एलिसा का उपयोग करके की गई थी जैसा कि पहलेवर्णित किया गया था।

  1. निरोधात्मक गतिविधि में पूरक की भूमिका का पता लगाने के लिए उपयोग करने से पहले 30 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर सीरम (पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी का स्रोत) की गर्मी-निष्क्रियता करें। सीरम तनुकरण करने से पहले सीरम को गर्म-निष्क्रिय करें।
    नोट:अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में शाम-प्रतिरक्षित चूहों, प्रीइम्यून चूहों और एसएपी 2-विशिष्ट एंटीबॉडी-क्षीण सीरम से सीरम का उपयोग करें। एंटीबॉडी-क्षीण सीरम पिछले अध्ययन19 के अनुसार तैयार किया गया था। इस प्रोटोकॉल में परीक्षण किए गए सीरम के लिए सीरियल कमजोर पड़ने (1: 25, 1: 50, 1: 100, 1: 200, 1: 400, 1: 800, 1: 1, 600, 1: 3, 200, 1: 6, 400, और 1: 12, 800) में, बायोफिल्म परिपक्वता का निषेध 1: 25, 1: 50 और 1: 100 पर देखा गया था; इसलिए, निषेध और सीरम खपत के बीच संतुलन बनाने के लिए 1:50 का चयन किया गया था।
  2. बाँझ आरपीएमआई 1640 एमओपीएस माध्यम (1: 50) में गर्मी-निष्क्रिय सीरम नमूनों के सीरियल कमजोर पड़ने तैयार करें। बायोफिल्म परिपक्वता 30 के निषेध के लिए परीक्षण किए जाने वाले सभी सीरम नमूनों के लिए एक सामान्य सीरम कमजोर पड़ने (1:50) का उपयोग करें।
  3. 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट के प्रत्येक कुएं में चयनित सीरम तनुकरण का 100 μL जोड़ें। प्रत्येक नमूने के लिए, संलग्न लेआउट (चित्रा 2 बी) के अनुसार डुप्लिकेट में सीरम कमजोर पड़ने जोड़ें।
    1. कॉलम 10 में, सीरम कमजोर पड़ने को न जोड़ें; कवक-केवल सकारात्मक नियंत्रण के लिए केवल आरपीएमआई 1640 एमओपीएस माध्यम जोड़ें।
      नोट: कॉलम 10, पंक्तियों जी 1-जी 8 और एच 1-एच 8 में शुरू में आरपीएमआई-एमओपीएस में फंगल कोशिकाएं थीं। हालांकि, जबकि आरपीएमआई-एमओपीएस को 24 घंटे के बाद भी कॉलम 10 में जोड़ा गया था, पंक्तियों जी 1-जी 8 ने पीबीएस नियंत्रण के रूप में और पंक्तियों एच 1-एच 8 ने 24 घंटे के बाद नो-सीरम नियंत्रण के रूप में कार्य किया।
    2. कॉलम 11 में, नो फंगस प्लस सीरम नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करने के लिए सभी कुओं में सीरम का 1:50 कमजोर पड़ना जोड़ें।
    3. कॉलम 12 में, किसी भी अच्छी तरह से सीरम कमजोर पड़ने को न जोड़ें; इसे नो फंगस के रूप में रखें कोई सीरम नकारात्मक नियंत्रण नहीं है।
  4. एक ढक्कन और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्लेट को कवर करें। प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।

4. बायोफिल्म चयापचय गतिविधि अनुमान

  1. अगले दिन, मल्टीचैनल पिपेट (बायोफिल्म को छूने या बाधित किए बिना) का उपयोग करके सीरम को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें। किसी भी अवशिष्ट सीरम को हटाने के लिए प्लेट को ब्लोटिंग शीट पर एक उल्टे स्थिति में धीरे से टैप करें।
  2. मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके प्लेट को 1x PBS (प्रति कुएं) के 200 μL के साथ धोएं, बायोफिल्म को बाधित करने से बचने के लिए कुएं की साइड की दीवारों के साथ पीबीएस जोड़ें। मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके पीबीएस को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें और पीबीएस वॉश 2एक्स (कुल तीन वॉश) को दोहराएं। किसी भी अतिरिक्त पीबीएस को सुखाने के लिए जैविक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर, कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए प्लेट (ढक्कन के बिना) को हवा में सुखाएं।
  3. एक्सटीटी / मेनाडियोन की तैयारी:
    1. 0.5 ग्राम / एल समाधान के रूप में बाँझ रिंगर्स लैक्टेट में एक्सटीटी तैयार करें। फिल्टर-स्टरलाइज़्ड रिंगर्स लैक्टेट के 50 एमएल में 25 मिलीग्राम एक्सटीटी को भंग करें। एल्यूमीनियम पन्नी से ढकी अलग ट्यूबों में एलिकोट 10 एमएल और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. मेनाडियोन को 10 mM स्टॉक के रूप में तैयार करें। एसीटोन के 5 एमएल में 8.6 मिलीग्राम मेनाडियोन को घोलें और 100 अलग-अलग माइक्रोट्यूब में 50 आरएल वितरित करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट स्टोर करें।
    3. उपयोग से ठीक पहले 10 एमएल एक्सटीटी लेकर और 1 μL मेनाडियोन जोड़कर 1 μM कार्यशील समाधान प्राप्त करके XTT / menadione समाधान तैयार करें।
  4. 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट के प्रति कुएं में एक्सटीटी / मेनाडियोन समाधान का 100 μL जोड़ें। एक ढक्कन और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्लेट को कवर करें। अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  5. प्रत्येक कुएं से रंगीन सतह पर तैरने वाले 80 μL को एक ताजा 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें। प्लेट को 490 एनएम पर पढ़ें।
  6. कॉलम 10 (कवक-केवल सकारात्मक नियंत्रण) में कुओं के अवशोषण मूल्यों के औसत की गणना करें, जो समीकरण (1) का उपयोग करके प्रत्येक सीरम नमूने द्वारा प्रतिशत बायोफिल्म निषेध की गणना के लिए एक संदर्भ मूल्य के रूप में काम करेगा।
    % बायोफिल्म निषेध = 100 - Equation 1× 100 (1)

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Representative Results

कैंडिडा ट्रॉपिकलिस बायोफिल्म को 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेटों में उगाया गया था और उल्टे माइक्रोस्कोप (चित्रा 1 ए) का उपयोग करके 40x पर चित्रित किया गया था। बायोफिल्म को क्रिस्टल वायलेट का उपयोग करके आगे दाग दिया गया था और उल्टे माइक्रोस्कोप (चित्रा 1 बी) का उपयोग करके 40x पर देखा गया था। स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सी ट्रॉपिकलिस बायोफिल्म (चित्रा 1 सी) की एक प्रतिनिधि छवि दिखाती है। बायोफिल्म निषेध परख करने के लिए, लेआउट (चित्रा 2 ए) के अनुसार, समय 0 पर 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट के कुओं में कैंडिडा की 105 कोशिकाओं को जोड़ा गया था। 24 घंटे के बाद, प्लेट को धोया गया, और सीरम नमूने पूर्वनिर्मित बायोफिल्म में जोड़े गए। एक पायलट अध्ययन और पहले प्रकाशित रिपोर्ट 30 के अनुसार सैप 2-प्रतिरक्षित और शाम-प्रतिरक्षित चूहों के विभिन्न समूहों से प्राप्त विभिन्न सीरम नमूनों की तुलना करने के लिए 1:50 के एक सामान्य सीरम कमजोर पड़ने का चयन किया गया था।

लेआउट (चित्रा 2 बी) के अनुसार 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट में विभिन्न सीरम नमूने जोड़े गए और डुप्लिकेट में मूल्यांकन किया गया। प्रति समूह तीन चूहों (Sap2-albicans प्रतिरक्षित, SAP2-उष्णकटिबंधीय प्रतिरक्षित, SAP2-पैराप्सिलोसिस प्रतिरक्षित, शाम-प्रतिरक्षित समूह, प्रीइम्यून चूहों, और SAP2-क्षीण नियंत्रण नमूने) से टीकाकरण के 30 वें दिन प्राप्त सेरा का विश्लेषण 1:50 कमजोर पड़ने पर किया गया था। सीरम की उपस्थिति या अनुपस्थिति में गठित सी ट्रॉपिकलिस बायोफिल्म के लिए एक्सटीटी-कलरमेट्रिक रीडिंग (ओडी 490 मान) प्राप्त करने के लिए एलिसा रीडर का उपयोग करके प्लेट को490 एनएम तरंग दैर्ध्य पर पढ़ा गया था (तालिका 1)। नकारात्मक रिक्त स्थान की गणना कॉलम 11 और 12 (0.04) के औसत का उपयोग करके की गई थी। सकारात्मक नियंत्रण की गणना कवक-केवल कुओं (कॉलम 10; 0.8165) के औसत की गणना करके की गई थी। गणना से पहले, कॉलम 11 और 12 (0.04) में नियंत्रण कुओं के औसत अवशोषण मूल्य को प्रयोगात्मक कुओं के अवशोषण माप से घटाया गया था। इस प्रकार, बायोफिल्म सकारात्मक नियंत्रण (कॉलम 10) का संदर्भ मूल्य 0.7765 (= 0.8165 − 0.04) पर सेट किया गया था।

प्रयोगात्मक कुओं के लिए प्राप्त मूल्यों (औसत माइनस रिक्त) को तब इस सकारात्मक नियंत्रण (0.7765) द्वारा विभाजित किया गया था और प्रतिशत को 100 से गुणा करके प्राप्त किया गया था। प्रतिशत बायोफिल्म निषेध की गणना 100 से प्राप्त मूल्य को और घटाकर की गई थी। एक बार ग्राफ प्लॉट किए गए सभी मानों को दिखाता है (चित्रा 3)। विभिन्न सीरम समूहों के बीच सांख्यिकीय अंतर का आकलन करने के लिए पी मानों की गणना करने के लिए कई तुलनाओं के लिए डंनेट के पोस्ट-हॉक परीक्षण के बाद साधारण एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग किया गया था। <0.05 का पी मान सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। सैप 2-पैराप्सिलोसिस प्रतिरक्षित चूहों से सीरम एसएपी 2-अल्बिकन्स (45%) और सैप 2-ट्रॉपिकलिस (55%) प्रतिरक्षित चूहों के सीरम की तुलना में पूर्वनिर्मित सी ट्रॉपिकलिस बायोफिल्म की परिपक्वता को 65% तक रोक सकता है। सामान्य तौर पर, Sap2-प्रतिरक्षा सीरम द्वारा बायोफिल्म निषेध क्रमशः शाम-प्रतिरक्षा सीरम (16%) और प्रीइम्यून सीरम (13%) की तुलना में काफी अधिक था। सीरम से एसएपी 2-विशिष्ट एंटीबॉडी को कम करने पर, जैसा कि कहीं और वर्णितहै, बायोफिल्म निषेध क्षमता 10% तक कम हो गई थी। पीबीएस (5%) और नो-सीरम कंट्रोल (5%) का उपयोग करने पर बायोफिल्म निषेध नगण्य के करीब था।

Figure 1
चित्रा 1: इमेजिंग कैंडिडा उष्णकटिबंधीय बायोफिल्म। (ए) उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके आरपीएमआई माध्यम को हटाने के बाद 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट के तल पर गठित कैंडिडा ट्रॉपिकलिस बायोफिल्म का विज़ुअलाइज़ेशन। छवि को ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कैप्चर किया गया था (कोई दाग का उपयोग नहीं किया गया था)। (बी) क्रिस्टल वायलेट धुंधला होने के बाद 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट के तल पर गठित सी ट्रॉपिकलिस बायोफिल्म का विज़ुअलाइज़ेशन। (ग) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके ग्लास स्लाइड्स पर गठित सी ट्रॉपिकलिस बायोफिल्म का विज़ुअलाइज़ेशन। स्केल सलाखों = 100 μm (A, B), 10 μm (C) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: 96-वेल प्लेट प्रारूप का लेआउट। कुओं में (ए) फंगल कोशिकाओं को जोड़ना और (बी) विभिन्न चूहों के समूहों से सीरम कमजोर पड़ना (एसएपी 2-अल्बिकन्स प्रतिरक्षित, एसएपी 2-उष्णकटिबंधीय प्रतिरक्षित, सैप 2-पैराप्सिलोसिस प्रतिरक्षित, और शाम-प्रतिरक्षित; एन = 3) 1:50 कमजोर पड़ने पर डुप्लिकेट में मूल्यांकन किया गया। अतिरिक्त नियंत्रणों में एसएपी 2-क्षीण सीरम, प्रीइम्यून सीरम, पीबीएस और नो-सीरम नियंत्रण शामिल थे। कॉलम 10 में कोई सीरम नहीं जोड़ा गया था (फंगल कोशिकाएं मौजूद हैं, सकारात्मक नियंत्रण)। कॉलम 11 में कोई फंगल कोशिकाएं नहीं जोड़ी गई थीं (सीरम मौजूद)। कॉलम 12 में कोई फंगल कोशिकाएं नहीं जोड़ी गई थीं (सीरम अनुपस्थित)। संक्षेप: पीबीएस = फॉस्फेट-बफर्ड खारा; Sap2 = स्रावित एस्पार्टिल प्रोटीन 2. शब्द m1, m2, और m3 प्रत्येक समूह (n = 3) में अलग-अलग चूहों को संदर्भित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: पूर्वनिर्मित सी ट्रॉपिकलिस बायोफिल्म के खिलाफ एसएपी 2-विशिष्ट पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी की प्रभावशीलता दिखाने वाला ग्राफ। प्रतिरक्षा सीरम का स्रोत एक्स-अक्ष पर दिखाया गया है, जबकि सी ट्रॉपिकलिस बायोफिल्म परिपक्वता के निषेध का प्रतिशत वाई-अक्ष पर दिखाया गया है। पट्टियाँ एसईएम (एन = 3) ± माध्य का प्रतिनिधित्व करती हैं। पी मानों की गणना करने के लिए कई तुलनाओं के लिए डनेट के पोस्ट-हॉक परीक्षण के बाद साधारण एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग किया गया था। सलाखों और प्रतीकों ने शाम-प्रतिरक्षित चूहों के साथ Sap2-प्रतिरक्षित चूहों समूहों के बीच अंतर का प्रतिनिधित्व किया। , पी < 0.0001. संक्षेप: पीबीएस = फॉस्फेट-बफर्ड खारा; Sap2 = स्रावित एस्पार्टिल प्रोटीन 2. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

<> 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
एक 0.475 0.4141 0.0441 0.4637 0.485 0.0484 0.5179 0.4068 0.0442 0.8826 0.0452 0.0404
B 0.3848 0.3773 0.0428 0.369 0.3781 0.0465 0.4105 0.3773 0.0447 0.8428 0.0426 0.041
C 0.2754 0.2728 0.0427 0.305 0.3083 0.0415 0.3531 0.3213 0.0432 0.9661 0.0444 0.0453
D 0.6965 0.7185 0.043 0.6681 0.6711 0.0403 0.6346 0.728 0.0433 0.8643 0.0384 0.0358
E 0.7031 0.7117 0.0481 0.7806 0.688 0.0521 0.7095 0.6998 0.0525 0.7883 0.0491 0.0416
F 0.7588 0.7441 0.0456 0.7173 0.7233 0.0437 0.7733 0.6808 0.0462 0.7256 0.0468 0.0354
G 0.7681 0.7708 0.0435 0.7949 0.7496 0.0445 0.7695 0.7898 0.0451 0.7335 0.0429 0.0371
H 0.7652 0.7855 0.0469 0.7818 0.7766 0.0428 0.7592 0.7765 0.0445 0.7295 0.044 0.0341

तालिका 1: 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट के लिए 490 एनएम पर अवशोषण रीडिंग। अवशोषण रीडिंग प्राप्त करने के लिए एक मानक प्लेट रीडर (टेकान) का उपयोग किया गया था और रीडिंग को चित्रा 2 में वर्णित लेआउट से मिलान किया गया था। इन आंकड़ों का उपयोग करके बाद की गणना की गई।

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Discussion

कैंडिडा प्रजातियों के कारण होने वाले फंगल संक्रमण दुनिया भर में उच्च रुग्णता और मृत्यु दर से जुड़े हैं। आक्रामक फंगल संक्रमण के बढ़ते खतरे के लिए ऐसी जानलेवा बीमारियों के शुरुआती प्रबंधन की आवश्यकता होती है। अधिकांश कैंडिडा संक्रमणों में बायोफिल्म का गठन शामिल होता है, जो विभिन्न प्रकार के चिकित्सा उपकरणों का पालन करते हैं और अस्पताल सेटिंग्स 31 में फंगल संक्रमण की दृढ़ता और पुनरावृत्ति के लिए जिम्मेदारहोते हैं। बायोफिल्म खमीर या हाइफल कोशिकाओं से बने होते हैं, और वे पारंपरिक एंटिफंगल दवाओं के बहुमत के लिए काफी प्रतिरोध प्रदर्शित करतेहैं। कैंडिडा बायोफिल्म द्वारा एंटिफंगल प्रतिरोध को कई तंत्रों के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है, जिसमें एंटिफंगल प्रवेश में कमी, बाह्य मैट्रिक्स की उपस्थिति, ड्रग-एफ्लक्स पंपों की अधिकता, परिवर्तित कोशिका झिल्ली स्टेरोल संरचना, धीमी वृद्धि और स्थानिक विषमता, विभिन्न सिग्नलिंग मार्गों की सक्रियता और दवा-सहिष्णु परसिस्टर कोशिकाओं की उपस्थिति33,34 शामिल है। कैंडिडा आसंजन और बायोफिल्म गठन का निषेध कैंडिडा संक्रमण को रोकने के लिए सबसे महत्वपूर्ण रणनीतियां हैं।

कैंडिडा बायोफिल्म गठन का अध्ययन करने के लिए विभिन्न इन विट्रो परख, जैसे सेल व्यवहार्यता परख, माइक्रोटिटर प्लेट परख, और शुष्क वजन माप परख का उपयोग किया गया है, जो बायोफिल्म23 के विशिष्ट समय बिंदु मूल्यांकन पर आधारित हैं। माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस-आधारित परख जैसे अधिक उन्नत परख विकसित किए गए हैं, जिनका उपयोग वास्तविक समय बायोफिल्म गठन का आकलन करने के लिए किया जा सकताहै। अब तक, इन विट्रो परखों का उपयोग करके बायोफिल्म गठन का अध्ययन किया गया है, लेकिन विवो स्थितियों के साथ-साथ36,37 के तहत बायोफिल्म गठन की गतिशील प्रक्रिया को समझने की आवश्यकता है। वर्तमान में, अधिकांश बायोफिल्म निषेध अध्ययन सी अल्बिकन्स पर लागू होते हैं और गैर-अल्बिकन्स कैंडिडा बायोफिल्म के उन्मूलन के लिए कुछ अध्ययन उपलब्ध हैं। कैंडिडा संक्रमण का स्पेक्ट्रम पिछले कुछ दशकों में धीरे-धीरे बदल गया है और उभरती हुई गैर-अल्बिकन्स कैंडिडा प्रजातियां दुनिया भर में रुग्णता और मृत्यु दर का एक उच्च बोझ पैदा करती हैं। इसलिए, बायोफिल्म गठन को नियंत्रित करने के लिए नई रणनीतियों के विकास और गैर-अल्बिकन्स कैंडिडा प्रजातियों पर ध्यान केंद्रित करने वाले बायोफिल्म निषेध परख के विकास की एक आकस्मिक आवश्यकता है। इम्यूनोथेरेपी, विशेष रूप से एंटीबॉडी, बायोफिल्म गठन को रोकने की एक बड़ी क्षमता है और इसका उपयोग प्रणालीगत कैंडिडा संक्रमण38 के इलाज के लिए किया जा सकता है। कई रिपोर्टों ने बायोफिल्म निर्माण के पहले चरणों में बायोफिल्म निषेध में एंटीबॉडी की भूमिका का प्रदर्शन किया है। यह बताया गया कि खरगोशों में पूरक रिसेप्टर 3-संबंधित प्रोटीन (सीआर 3-आरपी, फंगल पालन में संभावित भूमिका) टीकाकरण के जवाब में उत्पन्न पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी ने बीकल एपिथेलियल कोशिकाओं पर सी अल्बिकन्स के पालन और बायोफिल्म गठन को कम करदिया। इसके अलावा, कैथेटर आइसोलेट्स सहित कैंडिडा उपभेदों को पॉलीक्लोनल एंटी-सीआर 3-आरपी एंटीबॉडी और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, ओकेएम 1 के साथ प्रीक्यूबेट किया गया था, जिसने पालन और बायोफिल्म गठन को कम कर दिया था। अल्बिकन्स की सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन पालन चरण और बायोफिल्म गठन चरण40 के दौरान एक्सटीटी परख का उपयोग करके किया गया था। कुछ अध्ययनों ने गैर-अल्बिकन्स कैंडिडा प्रजाति बायोफिल्म गठन के खिलाफ एंटीबॉडी की भूमिका का मूल्यांकन किया है। चुपाकोवा एट अल ने एक्सटीटी परख का उपयोग करके सी डबलिनेंसिस के साथ सी अल्बिकन्स के खिलाफ पॉलीक्लोनल एंटी-सीआर 3-आरपी एंटीबॉडी की प्रभावशीलता का मूल्यांकन किया। पॉलीक्लोनल एंटी-सीआर 3-आरपी एंटीबॉडी ने सी अल्बिकन्स और सी डबलिनिएन्सिस41 दोनों के पालन और बायोफिल्म गठन को रोक दिया।

इस अध्ययन में, बायोफिल्म परिपक्वता और विकास पर एंटीबॉडी के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक सरल, तेजी से और उपयोगकर्ता के अनुकूल प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। यह 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट-आधारित एक्सटीटी कमी परख बायोफिल्म में व्यवहार्य कोशिकाओं की चयापचय गतिविधि को मापता है और इसे पहले केअध्ययनों 7,8 से अनुकूलित किया गया है। यहां वर्णित एक्सटीटी परख का उपयोग व्यवहार्य बायोफिल्म विकास का अनुमान लगाने के लिए बड़े पैमाने पर किया जाता है। यह आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला सेल व्यवहार्यता परीक्षण बन गया है क्योंकि यह तेजी से, सुविधाजनक है, और इसका उपयोग 96-वेल प्लेट जैसे उच्च-थ्रूपुट प्रारूप में किया जा सकता है। इसके अलावा, इसका उपयोग कैंडिडा बायोफिल्म के खमीर और हाइफल दोनों रूपों को मापने के लिए किया जा सकता है। इसका उपयोग विभिन्न प्रकार के सब्सट्रेट्स जैसे चिकित्सा उपकरणों (जैसे, कैथेटर) और संपर्क लेंस पर कैंडिडा बायोफिल्म के माप के लिए भी किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल के कुछ महत्वपूर्ण चरणों में फंगल एकत्रीकरण से बचने के लिए, सभी चरणों में पाइपिंग से पहले सेल निलंबन को सख्ती से भंवर करना शामिलहै। खराब बायोफिल्म विकसित होने की संभावना है जब सेल घनत्व या तो बहुत अधिक या बहुत कम होते हैं। इसलिए, उपयोगकर्ताओं को प्रारंभिक इनोकुलम7 में आदर्श फंगल सेल घनत्व का पालन करना चाहिए। धोने के कदम बहुत महत्वपूर्ण हैं और बायोफिल्म22 को बाधित करने से रोकने के लिए अत्यधिक सेल धोने से बचना चाहिए। धोने की प्रक्रिया के दौरान बायोफिल्म की निचली परत को परेशान नहीं किया जाना चाहिए। परख हमेशा अंधेरेपरिस्थितियों में किया जाना चाहिए, और इसमें कई प्रतिकृतियां शामिल करना आवश्यक है। उपयोग से ठीक पहले हर बार एक्सटीटी का एक ताजा समाधान तैयार किया जाना चाहिए। चूंकि दो प्रतिक्रियाओं के बीच समय का अंतर परिणामों को कम कर सकता है, उपयोगकर्ताओं को 96-वेल प्लेट42 के पहले और अंतिम कुएं में एक्सटीटी समाधान जोड़ते समय न्यूनतम समय अंतर सुनिश्चित करने के लिए तेजी से काम करना चाहिए। वाष्पीकरण को रोकने के लिए पन्नी या पैराफिल्म के उपयोग की सिफारिश की जाती है। यदि आवश्यक हो तो कई समस्या निवारण चरण किए जा सकते हैं। यदि बायोफिल्म वृद्धि अनुपस्थित या असंतोषजनक है, तो उपयुक्त सीडिंग इनोकुलम कमजोर पड़ने और गणना का उपयोग किया जाना चाहिए। बेहतर बायोफिल्म गठन के लिए, उप-संवर्धन स्थितियों को बदला जा सकता है, और विभिन्न सतह सामग्रियों का उपयोग करके बायोफिल्म विकास की कोशिश की जा सकती है। एक्सटीटी परख की संवेदनशीलता में काफी सुधार करने के लिए, कोई बायोफिल्म बनाने के लिए आवश्यक समय को कम कर सकता है, एंटिफंगल एजेंट की एकाग्रता बढ़ा सकता है, या परख की इनक्यूबेशन अवधि 7 को कम करसकता है। बायोफिल्म को बाधित करने से बचने के लिए, अत्यधिक सेल धोने से बचनाचाहिए। परख एजेंटों को प्रकाश के संपर्क में आने से रोकने के लिए या तो बाहरी कुओं से बचा सकते हैं या एजेंटों को आंतरिक कुओं से वाष्पित होने से बचाने के लिए बाहरी कुओं में तरल जोड़ सकते हैं। यदि धोने के दौरान बायोफिल्म बाधित हो रहा है तो कोमलधुलाई दी जानी चाहिए। जबकि यह प्रोटोकॉल बायोफिल्म परिपक्वता के निषेध का आकलन करने के लिए 24 घंटे पूर्वनिर्मित बायोफिल्म पर सीरम के प्रभाव का परीक्षण करता है, उपयोगकर्ता बायोफिल्म गठन के निषेध का आकलन करने के लिए समय 0 पर सीरम जोड़ने के लिए इस प्रोटोकॉल को संशोधित भी कर सकते हैं, जैसा कि पहले की रिपोर्ट30 के अनुसार है।

बायोफिल्म विकास को निर्धारित करने के लिए अन्य वैकल्पिक तरीकों की तुलना में, एक्सटीटी विधि सबसे संवेदनशील, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, सटीक, लागत प्रभावी और विशिष्ट विधि है। यद्यपि एक्सटीटी परख बायोफिल्म के मूल्यांकन के लिए आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली तेजी से और आसान तकनीक है, लेकिन इसकी कुछ सीमाएं हैं। हालांकि यह एक ही प्रजाति से बायोफिल्म में विभिन्न एजेंटों की खुराक या प्रभावों को निर्धारित करने के लिए उपयोगी है, लेकिन आइसोलेट्स21 के बीच चयापचय परिवर्तनशीलता के कारण एक साथ कई आइसोलेट्स की तुलना करने के लिए सावधानी के साथ इसका उपयोग किया जाना चाहिए। इंटरस्ट्रेन बायोफिल्म तुलना के लिए, विस्तृत तकनीक मानकीकरण किया जानाचाहिए। इसके अलावा, जबकि एक्सटीटी फॉर्माज़ान उत्पाद आसानी से समाधान में घुल जाता है, कुछ उपभेद सेल21 के भीतर कुछ मात्रा को बनाए रख सकते हैं। चूंकि मीडिया की पसंद, बायोफिल्म विकास का समय और सीरम की बारीकियों जैसे चर से जुड़ी स्पष्टता की कमी है, इसलिए एक्सटीटी परख के अलावा पुष्टित्मक बायोसेस करने की सलाह दी जाती है, उदाहरण के लिए, बायोफिल्म मोटाई / बायोमास (क्रिस्टल वायलेट का उपयोग करके) या सेल व्यवहार्यता (सीएफयू विधि का उपयोग करके) का माप। ध्यान दें, इस एक्सटीटी परख के परिणाम क्रिस्टल वायलेट परख और सीएफयू विधि (डेटा नहीं दिखाया गया) के साथ अच्छी तरह से सहसंबद्ध हैं। ऊपर उल्लिखित सीमाओं के बावजूद, इस विधि को सीरम नमूनों (पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी का स्रोत), मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, या सहायक इम्यूनोथेरेपी के विभिन्न समूहों का मूल्यांकन करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है। यद्यपि यहां प्रस्तुत एक्सटीटी कमी प्रोटोकॉल केवल सी उष्णकटिबंधीय बायोफिल्म पर एंटीबॉडी के प्रभाव को दर्शाता है, इसका उपयोग शोधकर्ताओं द्वारा सी ऑरिस बायोफिल्म पर एंटीबॉडी के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए किया गयाहै। इसके अतिरिक्त, यह प्रोटोकॉल अन्य कैंडिडा प्रजातियों जैसे सी अल्बिकन्स, सी पैरासिलोसिस, सी ग्लाब्राटा, सी डबलिनिएन्सिस, सी ट्रॉपिकलिस और सी ऑरिस के साथ किए गए पिछले अध्ययनों से निकला है, जो इस प्रोटोकॉल के विस्तार को जीनस कैंडिडा 16,41,44,45,46,47 तक बढ़ा सकते हैं।

अनुकूलन, मानकीकरण, और बायोफिल्म परिमाणीकरण परख में नियमित सुधार सटीकता, थ्रूपुट और प्रजनन क्षमता को बढ़ा सकता है। एक्सटीटी कमी परख जिस पर यह प्रोटोकॉल आधारित है, का व्यापक रूप से चयापचय गतिविधि और बायोफिल्म की व्यवहार्यता के आकलन के लिए उपयोग किया गया है। चूंकि कैंडिडा बायोफिल्म अक्सर एंटिफंगल दवाओं के लिए प्रतिरोधी होता है, इसलिए नई दवाओं और नए संयोजनों की खोज एकतत्काल आवश्यकता है। बायोफिल्म से जुड़े संक्रमणों के मुद्दे का मुकाबला करने के लिए, बायोफिल्म स्क्रीनिंग परख48 का उपयोग करके अधिक एंटीबायोफिल्म यौगिकों का पता लगाया जाना चाहिए। इस इन विट्रो प्रोटोकॉल का उपयोग बायोफिल्म में कैंडिडा प्रजातियों की कोशिकाओं की चयापचय गतिविधि पर संभावित नए एंटिफंगल यौगिकों के प्रभाव की जांच करने के लिए किया जा सकता है। एंटीबॉडी-आधारित इम्यूनोथेरेपी से जुड़े एक्सटीटी कमी परख के मानकीकरण और सुधार के आधार पर भविष्य के शोध प्रभावी रोग प्रबंधन और नियंत्रण के लिए बेहतर चिकित्सीय के विकास में सहायता कर सकते हैं।

सैप 2-विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा बायोफिल्म निषेध को सी ट्रॉपिकलिस19 के कारण मुराइन प्रणालीगत कैंडिडिआसिस के दौरान एसएपी 2-वैक्सीन मध्यस्थता सुरक्षा में एंटीबॉडी-मध्यस्थता सुरक्षा तंत्र के रूप में रिपोर्ट किया गया है। पहले के एक अध्ययन से यह भी पता चला है कि सीएजीटीए संभावित रूप से सैप एंटीजन को पहचानने से विट्रो 16 में सी अल्बिकन्स के विकास और बायोफिल्म गठन को कम करता है। एक अन्य अध्ययन में, Sap2-हटाए गए उत्परिवर्ती ने पेपस्टैटिन ए49 की उपस्थिति में एक बायोफिल्म विकास दोष का प्रदर्शन किया। इसके अतिरिक्त, बायोफिल्म गठन के दौरान, एसएपी 2 एंटीजन ने सेक 1 माइटोजन-सक्रिय प्रोटीन काइनेज सिग्नलिंग मार्ग50 के माध्यम से मध्यस्थता वाले म्यूसिन एमएसबी 2 के प्रोटियोलिटिक प्रसंस्करण में भूमिका निभाई। इसलिए, यह अनुमान लगाया जा सकता है कि एमएसबी 2 प्रसंस्करण एंटीबॉडी-मध्यस्थता एसएपी 2 न्यूट्रलाइजेशन द्वारा बाधित है, जो बायोफिल्म अखंडता को प्रभावित करता है। ट्रॉपिकलिस बायोफिल्म परिपक्वता और विकास में सीरम एंटीबॉडी की भूमिका का आकलन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है, जिसे विभिन्न फंगल उपभेदों या एंटीबॉडी स्रोतों का उपयोग करके विभिन्न सेटिंग्स में बायोफिल्म चयापचय गतिविधि के निर्धारण के लिए लागू किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस कार्य को रामलिंगस्वामी अनुदान डीबीटी-843-बायो (जैव प्रौद्योगिकी विभाग, भारत सरकार) और एस.आर. को प्रारंभिक कैरियर अनुसंधान पुरस्कार एसईआर-1058-बीआईओ (विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान बोर्ड, भारत सरकार) द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक ों ने पी.सी. को आईसीएमआर-जेआरएफ अनुदान और पी.एस. को डीबीटी-जेआरएफ अनुदान स्वीकार किया है। लेखक एसईएम के दौरान श्री प्रदीप सिंह ठाकुर द्वारा पांडुलिपि और तकनीकी सहायता पर सुझाव देने के लिए डॉ रविकांत रंजन को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical centrifuge tubes BD Falcon 546021
1x PBS - Prepared in lab NaCl : 4 g
KCl : 0.1 g
Na2HPO4:  0.72 g
KH2PO4 : 0.12 g
Water 500 mL. Adjust pH to 7.4
50 mL conical centrifuge tubes BD Falcon 546041
96-well microtiter plates Nunc 442404
Incubator Generic
Menadione Sigma M5625
Microtiter Plate Reader Generic
Multichannel pipette and tips Generic
Petri dishes Tarson 460090
Ringers Lactate - Prepared in lab sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0 
RPMI 1640 MOPS Himedia AT180
Sabouraud dextrose Agar SRL 24613
Sabouraud dextrose Broth SRL 24835
XTT  Invitrogen X6493

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 187
<em>कैंडिडा ट्रॉपिकलिस</em> बायोफिल्म पर एंटीबॉडी के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक घुलनशील टेट्राज़ोलियम-आधारित कमी परख
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Chandley, P., Subba, P., Rohatgi, S. A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms. J. Vis. Exp. (187), e64425, doi:10.3791/64425 (2022).

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