Summary

En løselig tetrazoliumbasert reduksjonsanalyse for å evaluere effekten av antistoffer på candida tropicalis biofilmer

Published: September 16, 2022
doi:

Summary

En 96-brønns mikrotiterplatebasert protokoll ved bruk av en 2,3-bis (2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenyl)-5-karboksanilid-2H-tetrazolium (XTT) reduksjonsanalyse er beskrevet her, for å studere antistoffers effekter på biofilmer dannet av C. tropicalis. Denne in vitro-protokollen kan brukes til å kontrollere effekten av potensielle nye antifungale forbindelser på den metabolske aktiviteten til Candida-artsceller i biofilmer.

Abstract

Candida-arter er den fjerde vanligste årsaken til systemiske nosokomiale infeksjoner. Systemisk eller invasiv candidiasis involverer ofte biofilmdannelse på implanterte enheter eller katetre, som er forbundet med økt virulens og dødelighet. Biofilmer produsert av forskjellige Candida-arter utviser forbedret motstand mot ulike antifungale stoffer. Derfor er det behov for å utvikle effektive immunterapier eller tilleggsbehandlinger mot Candida biofilmer. Mens rollen som cellulær immunitet er godt etablert i anti-Candida-beskyttelse , har rollen som humoral immunitet blitt studert mindre.

Det har blitt antatt at hemming av biofilmdannelse og modning er en av hovedfunksjonene til beskyttende antistoffer, og Candida albicans bakterierørantistoffer (CAGTA) har vist seg å undertrykke in vitro vekst og biofilmdannelse av C. albicans tidligere. Dette papiret skisserer en detaljert protokoll for å evaluere rollen som antistoffer på biofilmer dannet av C. tropicalis. Metodikken for denne protokollen involverer C. tropicalis biofilmdannelse i 96-brønns mikrotiterplater, som deretter ble inkubert i nærvær eller fravær av antigenspesifikke antistoffer, etterfulgt av en 2,3-bis (2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenyl) -5-karboksanilid-2H-tetrazolium (XTT) analyse for måling av metabolsk aktivitet av soppceller i biofilmen.

Spesifisiteten ble bekreftet ved bruk av egnede serumkontroller, inkludert Sap2-spesifikt antistoffutarmet serum. Resultatene viser at antistoffer tilstede i serum av immuniserte dyr kan hemme Candida biofilmmodning in vitro. Oppsummert gir denne artikkelen viktig innsikt i potensialet for antistoffer i utviklingen av nye immunterapier og synergistiske eller tilleggsbehandlinger mot biofilm under invasiv candidiasis. Denne in vitro-protokollen kan brukes til å kontrollere effekten av potensielle nye antifungale forbindelser på den metabolske aktiviteten til Candida-artsceller i biofilmer.

Introduction

Systemisk candidiasis er den fjerde hovedårsaken til nosokomiale infeksjoner, som er forbundet med høy sykelighet og dødelighet over hele verden. Globalt påvirker systemisk candidiasis ca. 700 000 individer1. Candida-arter, nemlig C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata og C. auris, er den vanligste årsaken til invasive Candida-infeksjoner 2. Candida-arter er opportunistiske patogener som produserer biofilmer3. Biofilmer er hovedsakelig assosiert med Candida virulens, og Candida tåler oksidative og osmotiske spenningsforhold ved å indusere biofilmdannelse4. Biofilmer modulerer videre uttrykket av virulensfaktorer og celleveggkomponenter og danner en eksopolymer beskyttelsesmatrise, som hjelper Candida til å tilpasse seg forskjellige vertsnisjer4. Biofilmer bidrar til gjærtilslutning på vertsvev og medisinske instrumenter5. Som sådan er biofilmdannelse forbundet med en fordel for gjær, da gjærceller i biofilmene kan unngå vertsimmunresponsen6. Biofilmdannelse beskytter også de patogene gjærene mot virkningen av antifungale stoffer5. Redusert følsomhet av C. albicans biofilmer til amfotericin B har blitt demonstrert av Pierce et al.7,8. Videre viser biofilmer antifungal stoffresistens mot flukonazol, noe som svekker effektiv behandling av systemisk candidiasis 9,10.

Mikrober har en iboende tendens til å feste seg til forskjellige biotiske og abiotiske overflater, noe som resulterer i biofilmdannelse. Candida albicans, som er en dimorf sopp, finnes i gjær- og hyphalformer, og biofilmdannelsen har blitt karakterisert i forskjellige in vitro og in vivo modellsystemer11. Trinnene i biofilmdannelse inkluderer adhesjon av Candida-celler til substratet, filamentasjon, proliferasjon og biofilmmodning11. I utgangspunktet holder gjærformen av C. albicans seg til substrater, inkludert medisinsk utstyr og humant vev, etterfulgt av filamentasjon og spredning av C. albicans i hyphal- og pseudohyphalformer, og til slutt modning av biofilmer innebygd i ekstracellulær matrise11. Biofilmdannelse bidrar i stor grad til C. albicans patogenesemekanismer12. Candida-arter danner stoffresistente biofilmer, noe som gjør utryddelsen utfordrende13. En liten delmengde av C. albicans biofilmproduserende populasjon har blitt beskrevet som svært motstandsdyktig mot antifungale legemidler amfotericin B og klorhexidin14. Det er verdt å merke seg at gjærceller i biofilm har høy motstand mot multimedikamentell behandling sammenlignet med gjærceller i planktonfasen og proliferasjonsfasen14. Det har blitt foreslått at gjærceller som finnes i biofilmer er svært tolerante mot antifungale stoffer, noe som bidrar til C. albicans overlevelse i biofilmer14. Disse eksisterende cellene ble rapportert å være fenotypiske varianter av C. albicans og ikke mutanter14. Videre er celler av Candida-biofilmer kjent som “persisterceller” tolerante overfor høye doser amfotericin-B-behandling og bidrar til Candida-overlevelse, og utgjør dermed en stor byrde av tilbakevendende systemiske Candida-infeksjoner hos høyrisikopersoner15.

Økningen i antifungal stoffresistens i Candida-stammer krever forskning for nye antifungale midler og immunterapier. Som det fremgår av de ovennevnte studiene, viser Candida biofilmer redusert følsomhet for antifungale stoffer. Derfor er det behov for forbedrede immunterapier for å kontrollere dannelsen av Candida biofilm. Tidligere studier har vist at CAGTA kan gi effektiv beskyttelse mot systemiske Candida-infeksjoner ved å hemme C. albicans biofilmdannelse in vitro16. En annen studie rapporterte at immunisering av mus med C. albicans rAls3-N-protein induserer høye antistofftitere som forstyrrer C. albicans biofilmdannelse in vitro17. Anti-Als3-N antistoffer utøvde også en hemmende effekt på C. albicans spredning fra biofilm17. NDV-3A-vaksine basert på C. albicans er for tiden under klinisk utprøving, og anti-NDV-3A sera ble også funnet å redusere C. auris biofilmdannelse18. En nylig studie identifiserte inhibering av biofilmdannelse av Sap2-antistoffer som en beskyttelsesmekanisme i en murinmodell av systemisk candidiasis19.

Dette papiret skisserer en detaljert in vitro-protokoll for å evaluere effekten av antigenspesifikke antistoffer tilstede i polyklonalt serum oppnådd fra forskjellige grupper av Sap2-vaksinerte mus på preformerte Candida tropicalis biofilmer. For å oppnå dette ble en metode basert på en XTT-reduksjonsanalyse optimalisert og utviklet i laboratoriet, som kan måle biofilmens levedyktighet på en rask, sensitiv og høy gjennomstrømningsmåte, i nærvær eller fravær av antistoffer.

XTT-analysen brukes til å måle cellulær metabolsk aktivitet som en indikator på cellens levedyktighet, cellulær proliferasjon og cytotoksisitet20. Denne kolorimetriske analysen er basert på reduksjonen av et gult tetrazoliumsalt, natrium 3′-[1-(fenylaminokarbonyl)-3,4-tetrazolium]-bis (4-metoksy-6-nitro) benzensulfonsyrehydrat (XTT) til et oransje formazanfargestoff av metabolsk aktive celler. Siden bare levedyktige celler kan redusere XTT, er mengden redusert XTT-formazan proporsjonal med intensiteten av farge og celle levedyktighet. Formazanfargestoffet som dannes er vannløselig og kvantifiseres direkte ved hjelp av en plateleser. På grunn av sin vannløselige natur tillater XTT-analysen studier av intakte biofilmer, samt undersøkelse av biofilmmedikamentfølsomhet, uten forstyrrelse av biofilmstruktur21. I tillegg er denne metoden implementert i Candida fungal levedyktighetsvurderinger på grunn av brukervennlighet, hastighet, nøyaktighet, høy gjennomstrømning og høy grad av reproduserbarhet 7,22.

I tillegg til XTT-reduksjonsanalysen er det også identifisert mange alternative teknikker for måling av biofilmmengde. Noen av disse inkluderer bruk av MTT-reduksjonsanalysen, krystallfiolettfarging, DNA-kvantifisering, kvantitativ PCR, proteinkvantifisering, tørrcellevektmåling og levedyktig kolonitelling. Disse prosedyrene varierer mye når det gjelder tids- og kostnadskrav. Taff og medarbeidere utførte en komparativ analyse av syv forskjellige Candida biofilmkvantifiseringsanalyser og fant at XTT-analysen ga den mest reproduserbare, nøyaktige og effektive metoden for kvantitativ estimering av C. albicans biofilmer23. Fargingsteknikker som krystallfiolett har visse begrensninger; Krystallfioletttesten bestemmer indirekte mengden biofilm ved å måle den optiske tettheten til den krystallfiolettfargede biofilmmatrisen og cellene. Selv om krystallfiolettanalysen gir et godt mål på biofilmmasse, gir den ikke et mål på biofilmens levedyktighet, da den flekker både mikrobielle celler og den ekstracellulære matrisen24. Dhale og medarbeidere rapporterte videre at XTT-reduksjonsanalysen var den mest følsomme, reproduserbare, nøyaktige, effektive og spesifikke metoden for å oppdage biofilmproduksjon sammenlignet med krystallfiolett analyse25. Litteraturrapporter har vist at XTT-analysen korrelerer godt med CFU / ml-parameteren i CFU-tellemetoden. Imidlertid, sammenlignet med XTT-analysen, er CFU-metoden arbeidsintensiv og langsom26. Videre kan det hende at fraksjonen av frittliggende levende celler ikke er representativ for den opprinnelige biofilmpopulasjonen27. Selv om XTT-reduksjonsanalysen virker som det beste tilgjengelige alternativet for å kvantifisere levedyktighet, er det noen begrensninger i denne teknikken. Mens XTT-metoden er nyttig for sammenligninger som involverer en soppstamme, kan bruken være begrenset når man sammenligner forskjellige soppstammer og arter. Interstrain sammenligninger kan være vanskelig i fravær av detaljert standardisering siden forskjellige stammer metaboliserer substrater med forskjellige evner21.

Protocol

BALB / c mus ble plassert i Small Animal Facility på IIT Roorkee. Alle dyrene ble vedlikeholdt i en 12 t: 12 h lys: mørk syklus ved 25 ° C og ble forsynt med pelletsdiett og vann ad libitum. Alle dyreprosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Ethics Committee (IAEC) i IIT Roorkee. 1. Fremstilling av C. tropicalis MERK: Soppen Candida tropicalis tilhører risikogruppe 2 patogener og er klassifisert som en BSL2 mikroor…

Representative Results

Candida tropicalis biofilmer ble dyrket i 96-brønns mikrotiterplater og avbildet ved 40x ved hjelp av et omvendt mikroskop (figur 1A). Biofilmen ble videre farget ved hjelp av krystallfiolett og observert ved 40x ved hjelp av et omvendt mikroskop (figur 1B). Scanning elektronmikroskopi viser et representativt bilde av C. tropicalis biofilm (figur 1C). For å utføre biofilmhemmingsanalysen ble 105 celle…

Discussion

Svampinfeksjoner forårsaket av Candida-arter er forbundet med høy sykelighet og dødelighet over hele verden. Den økende trusselen om invasiv soppinfeksjon krever tidlig behandling av slike livstruende sykdommer. De fleste Candida-infeksjoner involverer dannelse av biofilmer, som holder seg til en rekke medisinske enheter og er ansvarlige for utholdenhet og tilbakefall av soppinfeksjoner i sykehusinnstillinger31. Biofilmer består av gjær- eller hyphalceller, og de utviser be…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av Ramalingaswami-stipendet DBT-843-BIO (Institutt for bioteknologi, Indias regjering) og Early Career Research Award SER-1058-BIO (Science and Engineering Research Board, Indias regjering) til SR Forfatterne anerkjenner et ICMR-JRF-tilskudd til PC og DBT-JRF-tilskudd til PS. Forfatterne takker Dr. Ravikant Ranjan for forslag til manuskriptet og teknisk assistanse av Mr. Pradeep Singh Thakur under SEM.

Materials

15 mL conical centrifuge tubes BD Falcon 546021
1x PBS Prepared in lab NaCl : 4 g
KCl : 0.1 g
Na2HPO4:  0.72 g
KH2PO4 : 0.12 g
Water 500 mL. Adjust pH to 7.4
50 mL conical centrifuge tubes BD Falcon 546041
96-well microtiter plates Nunc 442404
Incubator Generic
Menadione Sigma M5625
Microtiter Plate Reader Generic
Multichannel pipette and tips Generic
Petri dishes Tarson 460090
Ringers Lactate Prepared in lab sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0 
RPMI 1640 MOPS Himedia AT180
Sabouraud dextrose Agar SRL 24613
Sabouraud dextrose Broth SRL 24835
XTT  Invitrogen X6493

References

  1. Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R. O., Denning, D. W. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).
  2. Pappas, P., Lionakis, M., Arendrup, M., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. Invasive candidiasis. Nature Reviews Disease Primers. 4, 18026 (2018).
  3. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  4. Pemmaraju, S. C., Padmapriya, K., Pruthi, P. A., Prasad, R., Pruthi, V. Impact of oxidative and osmotic stresses on Candida albicans biofilm formation. Biofouling. 32 (8), 897-909 (2016).
  5. Cavalheiro, M., Teixeira, M. C. Candida biofilms: threats, challenges, and promising strategies. Frontiers in Medicine. 5, 28 (2018).
  6. Roilides, E., Simitsopoulou, M., Katragkou, A., Walsh, T. J. How biofilms evade host defenses. Microbiology Spectrum. 3 (3), 3 (2015).
  7. Pierce, C. G., et al. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nature Protocols. 3 (9), 1494-1500 (2008).
  8. Pierce, C. G., Uppuluri, P., Tummala, S., Lopez-Ribot, J. L. A 96 well microtiter plate-based method for monitoring formation and antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Journal of Visualized Experiments. (44), e2287 (2010).
  9. Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 49 (6), 973-980 (2002).
  10. Quindós, G. Epidemiology of candidaemia and invasive candidiasis. A changing face. Revista Iberoamericana de Micología. 31 (1), 42-48 (2014).
  11. Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofilms and the host: models and new concepts for eradication. International Journal of Microbiology. 2012, 845352 (2012).
  12. Wall, G., Montelongo-Jauregui, D., Vidal Bonifacio, B., Lopez-Ribot, J., Uppuluri, P. Candida albicans biofilm growth and dispersal: contributions to pathogenesis. Current Opinion in Microbiology. 52, 1-6 (2019).
  13. Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, M. J. S. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62, 10-24 (2013).
  14. LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).
  15. Galdiero, E., et al. Eradication of Candida albicans persister cell biofilm by the membranotropic peptide gH625. Scientific Reports. 10 (1), 5780 (2020).
  16. Carrano, G., et al. Anti-Candida albicans germ tube antibodies reduce in vitro growth and biofilm formation of C. albicans. Revista Iberoamericana de Micología. 36 (1), 9-16 (2019).
  17. Alqarihi, A., Singh, S., Edwards, J. E., Ibrahim, A. S., Uppuluri, P. NDV-3A vaccination prevents C. albicans colonization of jugular vein catheters in mice. Scientific Reports. 9 (1), 6194 (2019).
  18. Singh, S., et al. The NDV-3A vaccine protects mice from multidrug resistant Candida auris infection. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007460 (2019).
  19. Shukla, M., Rohatgi, S. Vaccination with secreted aspartyl proteinase 2 protein from Candida parapsilosis can enhance survival of mice during C. tropicalis-mediated systemic candidiasis. Infection and Immunity. 88 (10), 00312-00320 (2020).
  20. Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT. Journal of Immunological Methods. 142 (2), 257-265 (1991).
  21. Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism. Journal of Clinical Microbiology. 41 (1), 506-508 (2003).
  22. Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. Journal of Clinical Microbiology. 49 (4), 1426-1433 (2011).
  23. Taff, H. T., Nett, J. E., Andes, D. R. Comparative analysis of Candida biofilm quantitation assays. Medical Mycology. 50 (2), 214-218 (2012).
  24. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
  25. Dhale, R. P., Ghorpade, M. V., Dharmadhikari, C. A. Comparison of various methods used to detect biofilm production of Candida species. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 8 (11), 18-20 (2014).
  26. Moffa, E. B., et al. Interaction between XTT assay and candida albicans or streptococcus mutans viability. Journal of International Oral Health. 8 (1), 12 (2016).
  27. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
  28. Harriott, M. M., Noverr, M. C. Ability of Candida albicans mutants to induce Staphylococcus aureus vancomycin resistance during polymicrobial biofilm formation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (9), 3746-3755 (2010).
  29. Pierce, C. G., et al. A novel small molecule inhibitor of Candida albicans biofilm formation, filamentation and virulence with low potential for the development of resistance. NPJ Biofilms and Microbiomes. 1, 15012 (2015).
  30. Dekkerová, J., Lopez-Ribot, J. L., Bujdáková, H. Activity of anti-CR3-RP polyclonal antibody against biofilms formed by Candida auris, a multidrug-resistant emerging fungal pathogen. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 101-108 (2019).
  31. Muzny, C. A., Schwebke, J. R. Biofilms: an underappreciated mechanism of treatment failure and recurrence in vaginal infections. Clinical Infectious Diseases. 61 (4), 601-606 (2015).
  32. Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 14-19 (2004).
  33. Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiology. 8 (10), 1325-1337 (2013).
  34. Singh, R., Kumari, A., Kaur, K., Sethi, P., Chakrabarti, A. Relevance of antifungal penetration in biofilm-associated resistance of Candida albicans and non-albicans Candida species. Journal of Medical Microbiology. 67 (7), 922-926 (2018).
  35. Gulati, M., Ennis, C. L., Rodriguez, D. L., Nobile, C. J. Visualization of biofilm formation in Candida albicans using an automated microfluidic device. Journal of Visualized Experiments. (130), e56743 (2017).
  36. Krom, B. P., Willems, H. M. In vitro models for Candida biofilm development. Candida Species. , 95-105 (2016).
  37. Gu, W., Xu, D., Guo, D., Zhang, L., Sun, S. In vivo models for Candida albicans biofilms study, research & reviews. Journal of Microbiology and Biotechnology. 5 (1), 26-31 (2016).
  38. Shukla, M., Chandley, P., Rohatgi, S. The role of B-cells and antibodies against Candida vaccine antigens in invasive candidiasis. Vaccines. 9 (10), 1159 (2021).
  39. Bujdáková, H., et al. Antibody response to the 45 kDa Candida albicans antigen in an animal model and potential role of the antigen in adherence. Journal of Medical Microbiology. 57 (12), 1466-1472 (2008).
  40. Bujdáková, H., Paulovicová, E., Paulovicová, L., Simová, Z. Participation of the Candida albicans surface antigen in adhesion, the first phase of biofilm development. FEMS Immunology & Medical Microbiology. 59 (3), 485-492 (2010).
  41. Chupácová, J., Borghi, E., Morace, G., Los, A., Bujdáková, H. Anti-biofilm activity of antibody directed against surface antigen complement receptor 3-related protein-comparison of Candida albicans and Candida dubliniensis. Pathogens and Disease. 76 (1), 127 (2018).
  42. Gulati, M., et al. In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), 60 (2018).
  43. Ramage, G. Comparing apples and oranges: considerations for quantifying candidal biofilms with XTT [2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide] and the need for standardized testing. Journal of Medical Microbiology. 65 (4), 259-260 (2016).
  44. Kovács, R., et al. Synergistic effect of nikkomycin Z with caspofungin and micafungin against Candida albicans and Candida parapsilosis biofilms. Letters in Applied Microbiology. 69 (4), 271-278 (2019).
  45. Fernández-Calderón, M. C., et al. Antifungal and anti-biofilm activity of a new Spanish extract of propolis against Candida glabrata. BMC Complementary Medicine and Therapies. 21 (1), 1-10 (2021).
  46. Li, Z., et al. Synergistic effect of pseudolaric acid B with fluconazole against resistant isolates and biofilm of Candida tropicalis. Infection and Drug Resistance. 13, 2733-2743 (2020).
  47. Chatzimoschou, A., Giampani, A., Meis, J. F., Roilides, E. Activities of nine antifungal agents against Candida auris biofilms. Mycoses. 64 (4), 381-384 (2021).
  48. Haney, E. F., Trimble, M. J., Cheng, J. T., Vallé, Q., Hancock, R. Critical assessment of methods to quantify biofilm growth and evaluate antibiofilm activity of host defence peptides. Biomolecules. 8 (2), 29 (2018).
  49. Puri, S., et al. Secreted aspartic protease cleavage of Candida albicans Msb2 activates Cek1 MAPK signaling affecting biofilm formation and oropharyngeal candidiasis. PLoS One. 7, 46020 (2012).
  50. Staib, P., et al. Tetracycline-inducible expression of individual secreted aspartic proteases in Candida albicans allows isoenzyme-specific inhibitor screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (1), 146-156 (2008).

Play Video

Cite This Article
Chandley, P., Subba, P., Rohatgi, S. A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms. J. Vis. Exp. (187), e64425, doi:10.3791/64425 (2022).

View Video