Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

En effektiv rydningsprotokol til undersøgelse af frøudvikling i tomat (Solanum lycopersicum L.)

Published: September 7, 2022 doi: 10.3791/64445
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1
1Key Laboratory of Plant Molecular Physiology, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, 2College of Life Science, University of Chinese Academy of Sciences, 3Innovative Academy of Seed Design, Chinese Academy of Sciences

Summary

Tomatfrøet er en vigtig model til undersøgelse af genetik og udviklingsbiologi under plantegengivelse. Denne protokol er nyttig til rydning af tomatfrø på forskellige udviklingsstadier for at observere den finere embryonale struktur.

Abstract

Tomat (Solanum lycopersicum L.) er en af de største salgsafgrøder på verdensplan. Tomatfrøet er en vigtig model til undersøgelse af genetik og udviklingsbiologi under plantegengivelse. Visualisering af finere embryonal struktur i et tomatfrø hæmmes ofte af frøbelægningslimhinde, flercellelags integument og en tykvægget endosperm, som skal løses ved besværlig indlejringssektion. Et enklere alternativ er at anvende vævsrensningsteknikker, der gør frøet næsten gennemsigtigt ved hjælp af kemiske agenser. Selvom konventionelle rydningsprocedurer giver mulighed for dyb indsigt i mindre frø med en tyndere frøbeklædning, er rydning af tomatfrø fortsat teknisk udfordrende, især i de sene udviklingsstadier.

Præsenteret her er en hurtig og arbejdsbesparende rydningsprotokol for at observere tomatfrøudvikling fra 3 til 23 dage efter blomstring, når embryonal morfologi er næsten færdig. Denne metode kombinerer klorhydratbaseret clearingopløsning, der i vid udstrækning anvendes i Arabidopsis med andre modifikationer, herunder udeladelse af formalin-aceto-alkohol (FAA) fiksering, tilsætning af natriumhypochloritbehandling af frø, fjernelse af den blødgjorte frøbeklædningslimhinde og vask og vakuumbehandling. Denne metode kan anvendes til effektiv rydning af tomatfrø på forskellige udviklingsstadier og er nyttig til fuld overvågning af udviklingsprocessen for mutante frø med god rumlig opløsning. Denne rydningsprotokol kan også anvendes til dyb billeddannelse af andre kommercielt vigtige arter i Solanaceae.

Introduction

Tomat (S. lycopersicum L.) er en af de vigtigste vegetabilske afgrøder rundt om i verden med en produktion på 186,8 millioner tons kødfulde frugter fra 5,1 millioner hektar i 20201. Det tilhører den store Solanaceae-familie med omkring 2.716 arter2, herunder mange kommercielt vigtige afgrøder som aubergine, peberfrugter, kartoffel og tobak. Den dyrkede tomat er en diploid art (2n = 2x = 24) med en genomstørrelse på ca. 900 Mb3. I lang tid er der gjort en stor indsats for tomat domesticering og avl ved at vælge ønskelige træk fra vilde Solanum spp. Der er over 5.000 tomattiltrædelser opført i Tomato Genetics Resource Center, og mere end 80.000 kimplasmer af tomater opbevares over hele verden4. Tomatplanten er flerårig i drivhuset og formeres af frø. Et modent tomatfrø består af tre hovedrum: et fuldvoksent embryo, endosperm af cellulær type og en hård frøbelægning 5,6 (figur 1A). Efter dobbelt befrugtning går udviklingen af endosperm af cellulær type forud for udviklingen af zygoter. Ved ~ 5-6 dage efter blomstring (DAF) observeres tocellet proembryo først, når endospermen består af seks til otte kerner7. I Solanum pimpinellifolium nærmer embryoet sin endelige størrelse efter 20 DAF, og frø er levedygtige til spiring efter 32 DAF8. Efterhånden som embryoet udvikler sig, absorberes endospermen gradvist, og kun en lille mængde endosperm forbliver i frøet. Den resterende endosperm består af mikropylar endosperm omkring radikelspidsen og lateral endosperm i resten af frøet 9,10. Den ydre frøbeklædning er udviklet fra fortykket og lignificeret ydre epidermis af integumentet, og med de døde lag af integumentrester danner de en hård skal for at beskytte embryoet og endospermen5.

Figure 1
Figur 1: Skematisk repræsentation af et modent frø i Solanum lycopersicum og Arabidopsis thaliana. (A) Langsgående anatomi af et modent tomatfrø. (B) Langsgående anatomi af et modent Arabidopsisfrø. Et modent tomatfrø er ca. 70 gange større end et Arabidopsisfrø. Skalabjælker = (A) 400 μm, (B) 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Produktion af tomatfrø af høj kvalitet afhænger af koordineringen mellem embryoet, endospermen og moderens frøkomponenter11. Dissekering af nøglegener og netværk i frøudvikling kræver en dyb og fuldsporet fænotypisk registrering af mutante frø. Konventionelle indlejrings-sektioneringsteknikker, såsom den halvtynde sektion og paraffinsektionen, anvendes bredt på tomatfrø for at observere de lokale og finere strukturer i embryoet12,13,14,15. Imidlertid er analyse af frøudviklingen fra tynde sektioner normalt besværlig og mangler z-akse rumlig opløsning. Til sammenligning er vævsrensning en hurtig og effektiv metode til at lokalisere udviklingsstadiet af embryodefekter, der mest sandsynligt vil forekomme16. Rydningsmetoden reducerer uigennemsigtigheden af internt væv ved at homogenisere brydningsindekset med et eller flere biokemiske midler16. Helvævsrensning tillader observation af en plantevævsstruktur uden at ødelægge dens integritet, og kombinationen af clearingteknologi og tredimensionel billeddannelse er blevet en ideel løsning til at få information om morfologien og udviklingstilstanden af et planteorgan17,18. I årenes løb er frørensningsteknikker blevet brugt i forskellige plantearter, herunder Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare og Beta vulgaris 19,20,21,22,23. Blandt disse har helmonteret ægløsningsteknologi været en effektiv tilgang til at studere frøudvikling af Arabidopsis på grund af dens lille størrelse, 4-5 lag af frøbeklædningscellen og endospermen af nuklear type24,25. Med den løbende opdatering af forskellige rydningsblandinger, såsom fremkomsten af Hoyers opløsning26, blev de indre strukturer af bygæglet afbildet med en høj grad af klarhed, selvom dets endosperm udgør størstedelen af frøene. Embryogenese af sukkerroer kan observeres ved rydning kombineret med vakuumbehandling og blødgøring med saltsyre19. I modsætning til ovennævnte arter er der imidlertid ikke rapporteret om embryologiske observationer ved rydning af protokoller i tomatfrø. Dette forhindrer detaljeret undersøgelse af tomaternes embryonale og frøudvikling.

Klorhydrat anvendes almindeligvis som en rydningsopløsning, der gør det muligt at vise de nedsænkede væv og celler på forskellige optiske planer og bevarer i væsentlig grad cellerne eller vævskomponenterne27,28,29. Klorhydratbaseret clearingprotokol er med succes blevet brugt til helmontering af frø for at observere embryoet og endospermen af Arabidopsis21,28. Denne rydningsløsning er imidlertid ikke effektiv til at rydde tomatfrø, som er mere uigennemtrængelige end Arabidopsisfrø. De fysiske barrierer omfatter: (1) tomatintegumentet har næsten 20 cellelag ved 3 til 15 DAF 30,31, (2) tomatendospermen er cellulær type, ikke nuklear type32, og (3) tomatfrø er ca. 70 gange større i størrelse33,34 og (4) producerer store mængder frøbelægningsslimhinde, som blokerer penetrationen af rydningsreagenser og påvirker visualiseringen af embryoceller.

Derfor præsenterer denne rapport en optimeret klorhydratbaseret rydningsmetode til helmonteringsrensning af tomatfrø på forskellige stadier, hvilket muliggør dyb billeddannelse af embryoudviklingsprocessen (figur 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af opløsninger

  1. Forbered FAA-fikseringsmiddel ved at tilsætte 2,5 ml 37% formaldehyd, 2,5 ml iseddike og 45 ml 70% ethanol i et 50 ml centrifugerør. Hvirvel og opbevar den ved 4 °C. Frisklavet FAA-fikseringsmiddel lige før brug.
    FORSIGTIG: 37% formaldehyd er ætsende og potentielt kræftfremkaldende, hvis det udsættes eller indåndes. Fikseringsmidlet skal udføres i en røghætte, mens du bærer passende personlige værnemidler.
  2. Forbered rydningsopløsning ved at tilsætte 5 ml 100% glycerol, 40 g chlorhydrat og 10 ml destilleret vand i en 100 ml glasflaske indpakket med stanniol. Opløses ved hjælp af en magnetisk omrører natten over ved stuetemperatur. Den tilberedte opløsning kan opbevares ved 4 °C i op til 6 måneder.
    FORSIGTIG: Klorhydrat er kræftfremkaldende og har en skarp lugt. Udfør eksperimentet i en røghætte og brug passende personlige værnemidler. Klorhydrat er let at deliquesce i luften og bør ikke opbevares i store mængder. Rydningsopløsningen kan nedbrydes, når den udsættes for lys og skal holdes væk fra lys.
  3. Forbered desinfektionsopløsningen ved at tilsætte 10 ml 6% natriumhypochlorit, 40 ml destilleret vand og 50 μL Tween-20 i et 50 ml centrifugerør. Vortex og opbevar den ved stuetemperatur. Forbered desinfektionsopløsningen frisk lige før brug.
    BEMÆRK: Det effektive klorindhold i natriumhypochlorit, der har været placeret i lang tid, kan falde, og indholdet af 6% natriumhypochlorit kan øges i henhold til den faktiske situation.

2. Indsamling af frø

  1. Så tomatfrø (S. lycopersicum L. cv. Micro-Tom, se Materialetabel) i 8 cm × 8 cm × 8 cm firkantede bassiner fulde med en 1:1 blanding af blomsternæringsjord og substrat (v/v) (se Materialetabel), og dyrk i et vækstrum med 16/8 timers lyse/mørke perioder ved 24 ± 2 °C (dag) og 18 ± 2 °C (nat), 60%-70% relativ luftfugtighed og en lysintensitet på 4.000 Lux. Ca. 6 uger senere kom planterne ind i blomstringsfasen.
  2. Tag blomstringsdatoen for uafhængige blomster ved anthesis (kronbladets åbningsvinkel er 90 °), og registrer dagen efter blomstringen (DAF).
  3. Høst frugterne fra 3 til 23 DAF tomatplanter og læg dem straks på is. Opdel frugter (frø eller embryoner) fra 3 til 23 DAF i tidlige (3-10 DAF), midterste (11-16 DAF) og sene (17-23 DAF) frugter (frø eller embryoner).
    BEMÆRK: Saml ikke for mange frugter ad gangen, og sørg for, at frøene i hver frugt fjernes inden for 1 time for yderligere behandling.
  4. For tidlige frugter skal du bryde frugten og lægge den på et dias og samle friske frø omhyggeligt med præcisionstang under stereomikroskopet (se Materialetabel) ved 1x til 4x forstørrelse. For midterste og sene frugter skal du bryde frugten og direkte samle friske frø ved hjælp af præcisionspincet.

3. Klorhydratbaseret rydning af frø

BEMÆRK: Konventionelle35 og optimerede protokoller blev sammenlignet i denne undersøgelse for deres frørydningseffektivitet.

  1. Rydning ved hjælp af en konventionel protokol
    1. Friske frø (opnået i trin 2.4) anbringes straks i et 2 ml centrifugerør indeholdende 1,5 ml FAA-fikseringsmiddel og inkuberes på en orbital shaker (5 o / min, se Materialetabel) i 4 timer ved stuetemperatur.
    2. Dehydrere disse frø i en ethanolserie på 70%, 95% og 100% ethanol (v / v) i 1 time hver på en orbital shaker (5 o / min).
    3. Frøene anbringes i 3-5 dråber rydningsopløsning (~ 100 μL) på diaset og dæk forsigtigt prøven med en dækslip. Udskift diaset med et enkelt konkavt dias (se Materialetabel) til mellem- og sene frø.
    4. Opbevar disse dias eller enkelte konkave dias ved stuetemperatur i 30 min (3 DAF), 2 timer (6 DAF), 1 dag (9 DAF), 3 dage (12 DAF) eller 7 dage (14 til 22 DAF) afhængigt af frømaterialets udviklingsstadier (jo yngre materialerne er, desto hurtigere er rydningshastigheden).
    5. Overhold prøverne med et DIC-mikroskop (Differential Interference Contrast) udstyret med et digitalkamera (se Materialetabel) ved 10x, 20x og 40x forstørrelse. Juster og optimer den transmitterede lysstyrke, DIC-skyder og kondensatorblænde i realtid for hver prøve og optagelse af billeder.
  2. Rydning ved hjælp af den optimerede protokol
    1. Friske frø (opnået i trin 2.4) anbringes direkte i et 2 ml centrifugerør indeholdende 1,5 ml desinfektionsmiddel (trin 1.3).
      BEMÆRK: Antallet af frø opsamlet i 2 ml centrifugerøret varierer afhængigt af frøets udviklingsstadium. Nærmere oplysninger fremgår af tabel 1.
    2. Prøverne inkuberes på en orbital shaker (30 o / min) ved stuetemperatur i 3 til 50 minutter, indtil den inderste frøbeklædning er tydeligt synlig. Kassér desinfektionsopløsningen.
      BEMÆRK: Den krævede inkubationstid afhænger af frøudviklingsstadiet (jo senere frøene er, jo længere bliver inkubationstiden). Nærmere oplysninger fremgår af tabel 1.
    3. For midterste og sene frø overføres frøene til et dias og fjernes frøslimhinden med tang og en dissekeringsnål under et stereomikroskop ved 1x til 4x forstørrelse. Overfør frøene tilbage til det originale centrifugerør ved hjælp af tang.
      BEMÆRK: Dette trin er ikke nødvendigt for tidlige frø.
    4. Vask frøene 5x med 1,5 ml deioniseret vand, 10 s hver gang. Kassér det deioniserede vand.
    5. Tilsæt en rydningsopløsning på 2 × frøets volumen efterfulgt af vakuumbehandling i 0 til 50 minutter (tabel 1) med en vakuumpumpe (se Materialetabel). Intermitterende vakuumbehandling udføres med hver vakuumbehandling i 10 minutter fordelt med 10 minutters intervaller.
    6. Erstat med en frisk rydningsopløsning på 2 × frøets volumen. Hold 2 ml centrifugerøret indeholdende frøene ved stuetemperatur og beskyttet mod lys i 30 minutter til 7 dage for at lette rydningen (tabel 1). Under inkubationen, for sene embryoner, udskift rydningsopløsningen dagligt med frisk opløsning og udsæt frøene for vakuumbehandling i 10 minutter.
    7. Forbered de ryddede frø på dias eller enkeltkonkave dias og observer med DIC-mikroskopet udstyret med et digitalt kamera ved 10x, 20x og 40x forstørrelse. Juster og optimer den transmitterede lysstyrke, DIC-skyder og kondensatorblænde i realtid for hver prøve og optagelse af billeder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Når tomatfrø blev ryddet ved hjælp af en konventionel metode som i Arabidopsis, blokerede tætte endospermceller visualiseringen af tidlige tomatembryoner ved 3 DAF og 6 DAF (figur 3A, B). Da embryonets samlede volumen steg, kunne et kugleformet embryo næppe skelnes ved 9 DAF (figur 3C). Men da frøstørrelsen fortsatte med at stige, faldt dens permeabilitet, hvilket resulterede i et uklart hjerteembryo ved 12 DAF (figur 3D). Fra 13 DAF og fremefter blev frøslimhinde og frøbeklædning gradvist tættere, hvilket forhindrede indtrængen af rydningsmidler. Omridset af embryoet inde i 14-19 DAF-frø var ekstremt sløret, selv når behandlingstiden blev forlænget til 7 dage (figur 3E-G). I 22 DAF-frø var frøets indre struktur helt usynlig (figur 3H).

Derfor blev den konventionelle klorhydratbaserede rydningsprocedure optimeret for at muliggøre effektiv rydning af tomatfrø. Nærmere oplysninger om alle trin fremgår af tabel 1. For det første blev FAA-fikserings- og ethanoldehydreringstrinnene, som ofte kræves i konventionelle clearingprocedurer, udeladt fra protokollen. Mens FAA-fiksering generelt bruges til at bevare den morfologiske struktur og cellulære komponenter fra forfald, blev det konstateret (i denne undersøgelse), at den indre struktur af tomatfrø ikke let blev deformeret og var velbevaret på trods af fraværet af FAA-fiksering og ethanoldehydrering.

For det andet er frøbelægningsslimhinde produceret af frøbeklædningens epidermale celler meget fremtrædende fra 13 DAF og fremefter (figur 4). Den polysaccharidrige frøslimhinde viste en høj viskositet og en signifikant lav permeabilitet35,36. Indledende forsøg med at fjerne det uden at ødelægge frøbeklædningen ved hjælp af fine tang og nåle under et dissekerende mikroskop mislykkedes desværre. Dette skyldes, at frøbeklædningen er skør og tæt forbundet med slimhinden. Desuden fører eksistensen af pigment i frøbeklædningen yderligere til faldet i kvaliteten af lysfeltbilledet37. For at overvinde dette problem blev frøene behandlet med en desinfektionsmiddelopløsning af 1,2% natriumhypochlorit og 0,1% Tween 20. Blegningseffekten af natriumhypochlorit muliggør en klar identifikation af den indre frøbeklædning og skaber et relativt sterilt miljø, der gjorde det muligt at opbevare prøver i lang tid. Brug af vaskemiddel Tween 20 kan sænke overfladespændingen og øge frøpermeabiliteten. Endnu vigtigere, efter dette trin kan det meste af det vedhængende slimhinde løsnes fra frøet uden at beskadige frøbeklædningen (figur 4). Fremover blev de behandlede frø samlet i et 2 ml centrifugerør og blev inkuberet ved stuetemperatur i en orbital shaker (30 o / min).

For det tredje blev vakuumbehandling brugt til at fremskynde indtrængningen af clearingopløsningen til embryonerne i mellem- og sene stadier. Endelig, fordi tomatfrø er særligt større efter 12 DAF, blev konventionelle dias erstattet med enkelte konkave dias, når DIC-billeddannelse.

Efter behandling i henhold til den optimerede rydningsprotokol viste tomatfrø tilfredsstillende gennemsigtighed i alle testede udviklingsstadier (figur 5A-L). I modsætning til fuzzy cellekonturer opnået ved hjælp af konventionelle protokoller var forskellige cellelag af frøbeklædningen ved 3 DAF synlige (figur 5A). Endospermceller var mere skelnelige ved 5 DAF (figur 5B). Det pindformede embryo optrådte ved 7 DAF, og derefter nåede embryoet det kugleformede stadium ved 9 DAF og hjertestadiet ved 11 DAF (figur 5C-E). I disse udviklingsstadier var konturerne af cellerne inde i embryoet tydeligst synlige. Sammenlignet med den konventionelle metode producerede den optimerede protokol betydeligt bedre kvalitetsbilleder fra hjertestadiet til det modne embryostadium. Da embryonal udvikling nåede det tidlige torpedostadium ved 13 DAF, det midterste torpedostadium ved 14 DAF, det sene torpedostadium ved 15 DAF, det tidlige cotyledonstadium ved 16 DAF, det bøjede cotyledon-stadium ved 19 DAF og 21 DAF og det modne embryo ved 23 DAF, blev graden af krøllen af cotyledoner og skyde apikal meristem meget let fanget (figur 5F-L ). Men ud over 23 DAF var det ikke muligt at visualisere detaljerne i embryoet, selv når rydningsbehandlingen blev forlænget til over 1 uge.

Figure 2
Figur 2: Rutediagram over konventionel protokol og optimeret protokol. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Differentialinterferenskontrastbilleder af S. lycopericum æg behandlet ved hjælp af den konventionelle rydningsmetode. (A) En ægløsning med fuzzy embryosæk ved 3 DAF. (B) Embryosæk med synlige endospermceller (pilespidser) ved 6 DAF. (C) Et næppe skelneligt kugleformet embryo ved 9 DAF. Et uklart embryo ved (D) 12, (E) 14, (F) 16 og (G) 19 DAF. (H) Frøets indre struktur er fuldstændig usynlig ved 22 DAF. Skala søjler = 25 μm; em = embryo; es = embryosæk. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Desinfektion af S. lycopersicum frø på forskellige udviklingsstadier. De øverste billeder (A1-F1) er de stribede frø fra de udviklende frugter ved (A1) 11, (B1) 12, (C1) 14, (D1) 16, (E1) 18 og (F1) 21 DAF, mens de nederste billeder (A2-F2) er frø behandlet med desinfektionsmiddelopløsning. I A2-F2 kan den indre frøbeklædningskontur identificeres tydeligt. Skalastænger = 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Differentialinterferenskontrastbilleder af S. lycopericiumembryoner ryddet ved hjælp af den optimerede protokol. (A-L) DIC-mikroskopibilleder af tomatægget med synlig embryosæk ved (A) 3 DAF og (B) 5 DAF, (C) et pindformet embryo ved 7 DAF, (D) et kugleformet embryo ved 9 DAF, (E) et hjerteembryo ved 11DAF, (F) et tidligt torpedoembryo ved 13 DAF, (G) et mellemtorpedoembryo 14 DAF, (H) et sent torpedoembryo ved 15 DAF, (I) et tidligt cotyledonembryo ved 16 DAF, et bøjet cotyledonembryo ved (J) 19 DAF og (K) 21 DAF og (L) et modent embryo ved 23 DAF. Skala søjler = 50 μm; em = embryo; sc = frøfrakke; en = endosperm; es = embryosæk; hy = hypocotyl; co = cotyledon; r = radikel; sa = skyd apikalsk. Klik her for at se en større version af denne figur.

Vævsbehandling Embryo udvikling
3-7 DAF 8-10 DAF 11-13 DAF 14-16 DAF 17-20 DAF 21-23 DAF
1 Antal friske frø 50 40 30 20 15 10
2 Desinfektion 1,5 ml, 3 min 1,5 ml, 10 min 1,5 ml, 20 min 1,5 ml, 30 min 1,5 ml, 40 min 1,5 ml, 50 min
3 Afskalning af slimhinden Nej Nej Ja Ja Ja Ja
4 Vask 5x 10 sek.
5 Clearing 2x mængden af frø
6 Støvsugning Nej 1 x 10 min 2 x 10 min 3 x 10 min 4 x 10 min 5 x 10 min
7 Inkubation 30 minutter 2 timer 3 timer 8 timer 1-4 dage 3-7 dage

Tabel 1: Optimering af protokollen til forbedring af rydningseffektiviteten i tomatfrø. 1 = Batchoperationer, rydning af observation af et stort antal frø på én gang; frø blev anbragt i et 2 ml centrifugerør. 2 = Desinfektion med 6% NaClO:dH2O:Tween-20, i forholdet 200:800:1 (v/v); Alle trin blev udført på en orbital shaker med 30 o / min rystelse. 3 = Alle trin blev udført under et dissekeringsmikroskop med tang og dissekeringsnåle, medmindre andet er angivet. 4 = Frøene blev vasket med destilleret vand efter hvert trin. 5 = Rydning ved hjælp af 100% glycerol: chlorhydrat: dH 2 O, i proportioner på 1: 8:2(v / w / v). 6 = Hver vakuumbehandling varede 10 minutter og blev fordelt med 10 minutters intervaller. 7 = Erstat med frisk rydningsopløsning, og opbevar frø væk fra lys ved stuetemperatur; for frø fra 17 DAF til 23 DAF udskiftes rydningsopløsningen med frisk opløsning og støvsuges i 10 minutter hver dag i inkubationsperioden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sammenlignet med mekanisk sektionering er clearingteknologien mere fordelagtig til tredimensionel billeddannelse, da den bevarer integriteten af plantevæv eller organer16. Konventionelle rydningsprotokoller er ofte begrænset til små prøver på grund af lettere indtrængning af kemiske opløsninger. Tomatfrø er en problematisk prøve til vævsrensning, fordi den er ca. 70 gange større end et Arabidopsis-frø i størrelse og har flere permeabilitetsbarrierer. Arabidopsis frøbeklædningen består af fire til fem levende cellelag afledt af det ydre integument og det indre integument24. Sammenlignet med Arabidopsis er der imidlertid 22-27 parenkymale cellelag (i stadiet af det kugleformede embryo) i tomatfrøbeklædningen6. Det inderste lag af tomatfrøbelægningen består af suberin og er kendt som det semipermeable lag, som har vist sig at være en barriere for bevægelsen af vandopløselige forbindelser38. Derudover viste den polysaccharidrige frøslimhinde en høj viskositet og en signifikant lav permeabilitet, hvilket hæmmede indtrængningen af rydningsopløsningen. Den pigmentrige tomatfrakke reducerer også billedkvaliteten35,36,37. Historisk set løses fjernelsen af pigmenter ved anvendelse af oxidanter ledsaget af opvarmning eller langvarig behandling 37,39,40,41. Imidlertid er der næsten ikke rapporteret om nogen anvendelse af oxidanter i clearingmetoden baseret på chlorhydrat.

I denne undersøgelse blev frøene behandlet før rydningsprocessen med en desinfektionsopløsning indeholdende natriumhypochlorit suppleret med et overfladeaktivt stof Tween 20. Overraskende, efter behandling med desinfektionsopløsningen (3 til 50 minutter), kunne slimhinden af tomatfrø let fjernes, hvilket i høj grad forbedrer frøets permeabilitet. Blegningsprocessen af frøbeklædningen kan observeres i realtid, og varigheden af frødesinfektion justeres i overensstemmelse hermed. Blegningsprocessen opretholder også et relativt sterilt miljø, hvilket muliggør efterfølgende opbevaring af de behandlede frø i 8 måneder uden forurening.

Den optimerede protokol, der blev udviklet i undersøgelsen, opnåede generel gennemsigtighed af tomatfrø fra 3 DAF til 23 DAF. Fordelene ved denne protokol afspejles hovedsageligt i følgende aspekter: For det første forkortede eliminering af FAA-fiksering og efterfølgende ethanolgradientdehydrering behandlingstiden med mindst 7 timer. Anvendelsen af natriumhypochloritbehandling kombineret med rydningsopløsning forbedrede frøets permeabilitet betydeligt og visualisering af det inderste lag af frøbeklædningen. Endelig kan billeder af høj kvalitet af embryoner erhverves efter 10 timer, mens det tager mindst 3 dage med traditionelle protokoller.

På trods af fordelene ved denne protokol har den to vigtige begrænsninger. For det første blev det tidlige proembryo på to- til sekstencellestadiet ikke observeret ved 5 DAF, hvilket sandsynligvis skyldtes de tætte og større endospermceller af cellulær type, der hindrede visualisering af embryoner. For det andet, selvom tomatembryonets morfologi er næsten komplet omkring 23 DAF, kunne forskellige billeder for frø efter 24 DAF ikke opnås med denne optimerede metode. Det er muligt, at når embryoet nærmer sig sin fulde størrelse, tykner neglebåndet på overfladen af endospermen betydeligt, resterne af døende integumentparenchymceller danner tætte lag, og de ydre epidermisceller i integumentet øges dramatisk i lignifikation6. Disse tyder på en drastisk reduktion i frøindtrængningskapaciteten, hvilket gør det umuligt at visualisere det indre væv med de eksisterende metoder.

Afslutningsvis giver denne optimerede protokol et effektivt middel til at finde den unormale periode med embryonal udvikling, hvilket giver grundlaget for observation af finere cellestrukturer ved hjælp af udskæringsteknikker. Desuden vil denne metode til en vis grad sandsynligvis udgøre en referenceordning for andre kommercielt vigtige afgrøder i Solanaceae, såsom kartofler, aubergine, peberfrugter og tobak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne er taknemmelige for Dr. Jie Le og Dr. Xiufen Song for deres nyttige forslag til henholdsvis differentiel interferenskontrastmikroskopi og konventionel clearingmetode. Denne forskning blev finansieret af National Natural Science Foundation of China (31870299) og Youth Innovation Promotion Association fra det kinesiske videnskabsakademi. Figur 2 blev oprettet med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,000 µL pipette GILSON FA10006M
1,000 µL pipette tips Corning T-1000-B
2 ml centrifuge tube Axygen MCT-200-C
37% formaldehyde DAMAO 685-2013
5,000 µL pipette Eppendorf 3120000275
5,000 µL pipette tips biosharp BS-5000-TL
50 ml centrifuge tube Corning 430829
Absolute Ethanol BOYUAN 678-2002
Bottle glass Fisher FB800-100
Chloral Hydrate Meryer M13315-100G
Coverslip Leica 384200
DIC microscope Zeiss Axio Imager A1 10x, 20x and 40x magnification
Disinfectant QIKELONGAN 17-9185
Dissecting needle Bioroyee 17-9140
Flower nutrient soil FANGJIE
Forceps HAIOU 4-94
Glacial Acetic Acid BOYUAN 676-2007
Glycerol Solarbio G8190
Magnetic stirrer IKA RET basic
Micro-Tom Tomato Genetics Resource Center LA3911
Orbital shaker QILINBEIER QB-206
Seeding substrate PINDSTRUP LV713/018-LV252 Screening:0-10 mm
Single concave slide HUABODEYI HBDY1895
Slide Leica 3800381
Stereomicroscope Leica S8 APO 1x to 4x magnification
Tin foil ZAOWUFANG 613
Tween 20 Sigma P1379
Vacuum pump SHIDING SHB-III
Vortex meter Silogex MX-S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. FAOSTAT. , Available from: https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL (2022).
  2. Olmstead, R. G., Bohs, L. A summary of molecular systematic research in Solanaceae: 1982-2006. Acta Horticulturae. 745, 255-268 (2007).
  3. Consortium, T. G. The tomato genome sequence provides insights into fleshy fruit evolution. Nature. 485 (7400), 635-641 (2012).
  4. Ebert, A. W., Chou, Y. Y. The tomato collection maintained by AVRDC - The World Vegetable Center: composition, germplasm dissemination and use in breeding. Acta Horticulturae. 1101, 169-176 (2015).
  5. Hilhorst, H., Groot, S., Bino, R. J. The tomato seed as a model system to study seed development and germination. Acta Botanica Neerlandica. 47, 169-183 (1998).
  6. Chaban, I. A., Gulevich, A. A., Kononenko, N. V., Khaliluev, M. R., Baranova, E. N. Morphological and structural details of tomato seed coat formation: A different functional role of the inner and outer epidermises in unitegmic ovule. Plants-Basel. 11 (9), 1101 (2022).
  7. Iwahori, S. High temperature injuries in tomato. V. Fertilization and development of embryo with special reference to the abnormalities caused by high temperature. Journal of The Japanese Society for Horticultural Science. 35 (4), 379-386 (1966).
  8. Xiao, H., et al. Integration of tomato reproductive developmental landmarks and expression profiles, and the effect of SUN. on fruit shape. BMC Plant Biology. 9 (1), 49 (2009).
  9. Karssen, C. M., Haigh, A. M., Toorn, P., Weges, R. Physiological mechanisms involved in seed priming. Recent advances in the development and germination of seeds. NATO ASI Series. Taylorson, R. B. 187, Springer. Boston, MA. (1989).
  10. Nonogaki, H. Seed dormancy and germination-emerging mechanisms and new hypotheses. Frontiers in Plant Science. 5, 233 (2014).
  11. Doll, N. M., Ingram, G. C. Embryo-endosperm interactions. Annual Review of Plant Biology. 73, 293-321 (2022).
  12. Serrani, J. C., Fos, M., Atarés, A., García-Martínez, J. L. Effect of gibberellin and auxin on parthenocarpic fruit growth induction in the cv micro-tom of tomato. Journal of Plant Growth Regulation. 26 (3), 211-221 (2007).
  13. Yang, C., et al. A regulatory gene induces trichome formation and embryo lethality in tomato. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (29), 11836-11841 (2011).
  14. Goetz, S., et al. Role of cis-12-oxo-phytodienoic acid in tomato embryo development. Plant Physiology. 158 (4), 1715-1727 (2012).
  15. Ko, H. Y., Ho, L. H., Neuhaus, H. E., Guo, W. J. Transporter SlSWEET15 unloads sucrose from phloem and seed coat for fruit and seed development in tomato. Plant Physiology. 187 (4), 2230-2245 (2021).
  16. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  17. Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
  18. Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), (2021).
  19. Kwiatkowska, M., Kadłuczka, D., Wędzony, M., Dedicova, B., Grzebelus, E. Refinement of a clearing protocol to study crassinucellate ovules of the sugar beet (Beta vulgaris L., Amaranthaceae). Plant Methods. 15, 71 (2019).
  20. Ponitka, A., Ślusarkiewicz-Jarzina, A. Cleared-ovule technique used for rapid access to early embryo development in Secale cereale × Zea mays crosses. Acta Biologica Cracoviensia. Series Botanica. 46, 133-137 (2014).
  21. Ceccato, L., et al. Maternal control of PIN1 is required for female gametophyte development in Arabidopsis. PLoS One. 8 (6), 66148 (2013).
  22. Wilkinson, L. G., Tucker, M. R. An optimised clearing protocol for the quantitative assessment of sub-epidermal ovule tissues within whole cereal pistils. Plant Methods. 13, 67 (2017).
  23. Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. Whole-mount clearing and staining of Arabidopsis flower organs and Siliques. Journal of Visualized Experiments. (134), e56441 (2018).
  24. Creff, A., Brocard, L., Ingram, G. A mechanically sensitive cell layer regulates the physical properties of the Arabidopsis seed coat. Nature Communications. 6, 6382 (2015).
  25. Yang, T., et al. The B3 domain-containing transcription factor ZmABI19 coordinates expression of key factors required for maize seed development and grain filling. Plant Cell. 33 (1), 104-128 (2021).
  26. Anderson, L. E. Hoyer's solution as a rapid permanent mounting medium for bryophytes. Bryologist. 57 (3), 242-244 (1954).
  27. Herr, J. M. A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms. American Journal of Botany. 58 (8), 785-790 (1971).
  28. Yadegari, R., et al. Cell differentiation and morphogenesis are uncoupled in Arabidopsis raspberry embryos. The Plant Cell. 6 (12), 1713-1729 (1995).
  29. Grini, P. E., Jurgens, G., Hulskamp, M. Embryo and endosperm development is disrupted in the female gametophytic capulet mutants of Arabidopsis. Genetics. 162 (4), 1911-1925 (2002).
  30. Kataoka, K., Uemachi, A., Yazawa, S. Fruit growth and pseudoembryo development affected by uniconazole, an inhibitor of gibberellin biosynthesis, in pat-2 and auxin-Induced parthenocarpic tomato fruits. Scientia Horticulturae. 98 (1), 9-16 (2003).
  31. de Jong, M., Wolters-Arts, M., Feron, R., Mariani, C., Vriezen, W. H. The Solanum lycopersicum auxin response factor 7 (SlARF7) regulates auxin signaling during tomato fruit set and development. Plant Journal. 57 (1), 160-170 (2009).
  32. Roth, M., Florez-Rueda, A. M., Paris, M., Stadler, T. Wild tomato endosperm transcriptomes reveal common roles of genomic imprinting in both nuclear and cellular endosperm. Plant Journal. 95 (6), 1084-1101 (2018).
  33. Orsi, C. H., Tanksley, S. D. Natural variation in an ABC transporter gene associated with seed size evolution in tomato species. PLoS Genetics. 5 (1), 1000347 (2009).
  34. Herridge, R. P., Day, R. C., Baldwin, S., Macknight, R. C. Rapid analysis of seed size in Arabidopsis for mutant and QTL discovery. Plant Methods. 7 (1), 3 (2011).
  35. Xu, T. T., Ren, S. C., Song, X. F., Liu, C. M. CLE19 expressed in the embryo regulates both cotyledon establishment and endosperm development in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany. 66 (17), 5217-5227 (2015).
  36. Ghadiri Alamdari, N., Salmasi, S., Almasi, H. Tomato seed mucilage as a new source of biodegradable film-forming material: effect of glycerol and cellulose nanofibers on the characteristics of resultant films. Food and Bioprocess Technology. 14 (12), 2380-2400 (2021).
  37. Gardner, R. O. An overview of botanical clearing technique. Stain Technology. 50 (2), 99-105 (1975).
  38. Beresniewicz, M. M., Taylor, A. G., Goffinet, M. C., Terhune, B. T. Characterization and location of a semipermeable layer in seed coats of leek and onion (Liliaceae), tomato and pepper (Solanaceae). Seed Science and Technology. 23 (1), 123-134 (1995).
  39. Stebbins, G. L. A bleaching and clearing method for plant tissues. Science. 87 (2245), 21-22 (1938).
  40. Debenham, E. M. A modified technique for the microscopic examination of the xylem of whole plants or plant organs. Annals of Botany. 3 (2), 369-373 (1939).
  41. Morley, T. Accelerated clearing of plant leaves by NaOH in association with oxygen. Stain Technology. 43 (6), 315-319 (1968).

Tags

Udviklingsbiologi udgave 187
En effektiv rydningsprotokol til undersøgelse af frøudvikling i tomat (<em>Solanum lycopersicum</em> L.)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feng, Y., Wang, T., Liu, L. An… More

Feng, Y., Wang, T., Liu, L. An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato (Solanum lycopersicum L.). J. Vis. Exp. (187), e64445, doi:10.3791/64445 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter