Summary

פרוטוקול ניקוי יעיל לחקר התפתחות זרעים בעגבניות (Solanum lycopersicum L.)

Published: September 07, 2022
doi:

Summary

זרעי העגבנייה הם מודל חשוב לחקר גנטיקה וביולוגיה התפתחותית במהלך רבייה של צמחים. פרוטוקול זה שימושי לניקוי זרעי עגבניות בשלבי התפתחות שונים כדי לבחון את המבנה העוברי העדין יותר.

Abstract

עגבניות (Solanum lycopersicum L.) הוא אחד מגידולי המזומנים העיקריים בעולם. זרעי העגבנייה הם מודל חשוב לחקר גנטיקה וביולוגיה התפתחותית במהלך רבייה של צמחים. הדמיה של מבנה עוברי עדין יותר בתוך זרע עגבנייה נפגעת לעתים קרובות על ידי רירית ציפוי זרעים, כסות רב-שכבתית ואנדוספרם בעל דופן עבה, אשר צריך להיפתר על ידי חתך הטבעה מייגע. חלופה פשוטה יותר היא להשתמש בטכניקות ניקוי רקמות שהופכות את הזרע לכמעט שקוף באמצעות חומרים כימיים. למרות שהליכי ניקוי קונבנציונליים מאפשרים תובנה עמוקה לגבי זרעים קטנים יותר עם שכבת זרעים דקה יותר, ניקוי זרעי עגבניות ממשיך להיות מאתגר מבחינה טכנית, במיוחד בשלבי ההתפתחות המאוחרים.

מוצג כאן פרוטוקול ניקוי מהיר וחוסך עבודה לצפייה בהתפתחות זרעי עגבניות בין 3 ל -23 ימים לאחר הפריחה כאשר המורפולוגיה העוברית כמעט הושלמה. שיטה זו משלבת תמיסת ניקוי מבוססת כלור הידרט הנמצאת בשימוש נרחב בערבידופסיס עם שינויים אחרים, כולל השמטת קיבוע פורמלין-אצטו-אלכוהול (FAA), הוספת טיפול בנתרן היפוכלוריט בזרעים, הסרת רירית שכבת הזרעים המרוככת, וטיפול בשטיפה ואקום. שיטה זו יכולה להיות מיושמת לניקוי יעיל של זרעי עגבניות בשלבי התפתחות שונים והיא שימושית במעקב מלא אחר התהליך ההתפתחותי של זרעים מוטנטיים ברזולוציה מרחבית טובה. פרוטוקול ניקוי זה עשוי להיות מיושם גם על הדמיה עמוקה של מינים חשובים מסחריים אחרים בסולניים.

Introduction

עגבניות (S. lycopersicum L.) הוא אחד מגידולי הירקות החשובים ביותר ברחבי העולם, עם תפוקה של 186.8 מיליון טונות של פירות בשרניים מ 5.1 מיליון דונם בשנת 20201. הוא שייך למשפחת Solanaceae הגדולה עם כ-2,716 מינים2, כולל גידולים רבים בעלי חשיבות מסחרית כגון חצילים, פלפלים, תפוחי אדמה וטבק. העגבנייה המעובדת היא מין דיפלואידי (2n = 2x = 24) עם גודל גנום של כ 900 Mb3. במשך זמן רב, נעשה מאמץ רב לקראת ביות עגבניות ורבייה על ידי בחירת תכונות רצויות מסולנום פראי spp. יש יותר מ-5,000 עגבניות במרכז המשאבים לגנטיקה של עגבניות ויותר מ-80,000 נבטים של עגבניות מאוחסנים ברחבי העולם4. צמח העגבנייה הוא רב שנתי בחממה ומתפשט על ידי זרעים. זרע עגבנייה בוגר מורכב משלושה תאים עיקריים: עובר בגידול מלא, אנדוספרם מסוג תאי שיורי ושכבת זרע קשה 5,6 (איור 1A). לאחר הפריה כפולה, התפתחות אנדוספרם מסוג תאי מקדימה את התפתחות הזיגוטים. ב~5-6 ימים לאחר הפריחה (DAF), פרומבריו דו-תאי נצפה לראשונה כאשר האנדוספרם מורכב משישה עד שמונה גרעינים7. ב- Solanum pimpinellifolium, העובר מתקרב לגודלו הסופי לאחר 20 DAF, וזרעים הם בני קיימא לנביטה לאחר 32 DAF8. ככל שהעובר מתפתח, האנדוספרם נספג בהדרגה ורק כמות קטנה של אנדוספרם נשארת בזרע. האנדוספרם השיורי מורכב מאנדוספרם מיקרופילרי המקיף את קצה הרדיקל, ואנדוספרם לרוחב בשאר הזרע 9,10. ציפוי הזרע החיצוני מפותח מאפידרמיס חיצוני מעובה ומכובד של הכסות, ועם השכבות המתות של שרידי הכסות, הם יוצרים קליפה קשה כדי להגן על העובר והאנדוספרם5.

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של זרע בוגר בסולנום ליקופרסיום ובערבידופסיס תאליאנה. (A) אנטומיה אורכית של זרעי עגבנייה בוגרים. (B) אנטומיה אורכית של זרע ערבידופסיס בוגר. גודלו של זרע עגבנייה בוגר גדול בערך פי 70 מזרע ערבידופסיס. פסי קנה מידה = (A) 400 μm, (B) 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

ייצור זרעי עגבניות איכותיים תלוי בתיאום בין העובר, האנדוספרם ומרכיבי הזרע האימהי11. ניתוח גנים ורשתות מפתח בהתפתחות זרעים דורש רישום פנוטיפי עמוק ומלא של זרעים מוטנטיים. טכניקות חיתוך הטמעה קונבנציונליות, כגון חתך דק למחצה וחתך פרפין, מיושמות באופן נרחב על זרעי עגבניות כדי לבחון את המבנים המקומיים והעדינים יותר של העובר12,13,14,15. עם זאת, ניתוח התפתחות הזרעים מקטעים דקים הוא בדרך כלל מייגע וחסר רזולוציה מרחבית של ציר z. לשם השוואה, ניקוי רקמות הוא שיטה מהירה ויעילה לאיתור השלב ההתפתחותי של פגמים בעוברים שסביר ביותר שיתרחשו16. שיטת הניקוי מפחיתה את האטימות של הרקמה הפנימית על ידי הומוגניזציה של מקדם השבירה עם חומר ביוכימי אחד או יותר16. ניקוי רקמות שלמות מאפשר תצפית על מבנה רקמה צמחית מבלי להרוס את שלמותה, והשילוב של טכנולוגיית ניקוי והדמיה תלת מימדית הפך לפתרון אידיאלי לקבלת מידע על המורפולוגיה והמצב ההתפתחותי של איבר צמחי17,18. במהלך השנים, טכניקות ניקוי זרעים שימשו במיני צמחים שונים, כולל Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare, ו– Beta vulgaris 19,20,21,22,23. בין אלה, טכנולוגיית ניקוי הביציות בהרכבה שלמה הייתה גישה יעילה לחקר התפתחות זרעים של Arabidopsis, בשל גודלו הקטן, 4-5 שכבות של תא ציפוי הזרע, והאנדוספרם מסוג גרעיני24,25. עם העדכון המתמשך של תערובות ניקוי שונות, כגון הופעת הפתרון של Hoyer26, מבנים פנימיים של ביצית השעורה צולמו עם רמה גבוהה של בהירות למרות אנדוספרם שלה מהווה את עיקר הזרעים. Embryogenesis של סלק סוכר ניתן לראות על ידי ניקוי בשילוב עם טיפול ואקום ריכוך עם חומצה הידרוכלורית19. עם זאת, בניגוד למינים שהוזכרו לעיל, לא דווח על תצפיות אמבריולוגיות על ידי ניקוי פרוטוקולים בזרעי עגבניות. זה מונע חקירה מפורטת של התפתחות עוברית וזרעים של עגבניות.

כלורל הידרט משמש בדרך כלל כתמיסת ניקוי המאפשרת להציג את הרקמות והתאים השקועים במישורים אופטיים שונים, ומשמרת באופן משמעותי את התאים או מרכיבי הרקמה27,28,29. פרוטוקול ניקוי מבוסס כלורל הידרט שימש בהצלחה לניקוי שלם של זרעים כדי לבחון את העובר והאנדוספרם של Arabidopsis21,28. עם זאת, פתרון ניקוי זה אינו יעיל בניקוי זרעי עגבניות, שהם אטומים יותר מזרעי ערבידופסיס. המחסומים הפיזיים כוללים: (1) לכסות העגבניות יש כמעט 20 שכבות תאים ב-3 עד 15 DAF 30,31, (2) אנדוספרם העגבניות הוא מסוג תאים, לא מסוג גרעיני 32, ו-(3) זרעי עגבניות גדולים בערך פי 70 בגודל33,34 ו-(4) מייצרים כמויות גדולות של רירית ציפוי זרעים, מה שחוסם את החדירה של ריאגנטים לניקוי ומשפיע על הדמיה של תאי עובר.

לכן, דוח זה מציג שיטת ניקוי אופטימלית המבוססת על כלור הידרט לניקוי שלם של זרעי עגבניות בשלבים שונים, המאפשרת הדמיה עמוקה של תהליך התפתחות העובר (איור 2).

Protocol

1. הכנת פתרונות הכינו את ה-FAA על ידי הוספת 2.5 מ”ל של 37% פורמלדהיד, 2.5 מ”ל של חומצה אצטית קרחונית ו-45 מ”ל של 70% אתנול בצינור צנטריפוגה של 50 מ”ל. מערבולת ולאחסן אותו ב 4 מעלות צלזיוס. יש להכין את FAA באופן קבוע ממש לפני השימוש.אזהרה: 37% פורמלדהיד הוא קורוזיבי ועלול להיות מסרטן אם נחשף או…

Representative Results

כאשר זרעי עגבניות נוקו בשיטה קונבנציונלית כמו בערבידופסיס, תאי אנדוספרם צפופים חסמו את ההדמיה של עוברי עגבניות מוקדמים ב-3 DAF ו-6 DAF (איור 3A,B). ככל שהנפח הכולל של העובר גדל, בקושי ניתן היה להבחין בעובר כדורי ב-9 DAF (איור 3C). עם זאת, ככל שגודל הזרע המש?…

Discussion

בהשוואה לחיתוך מכני, טכנולוגיית הסליקה מועילה יותר להדמיה תלת מימדית מכיוון שהיא שומרת על שלמות רקמות הצמח או איברים16. פרוטוקולי ניקוי קונבנציונליים מוגבלים לעתים קרובות לדגימות קטנות בשל חדירה קלה יותר של תמיסות כימיות. זרעי עגבניות הם דגימה בעייתית לניקוי רקמות מכיוון שה?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים לד”ר ג’יה לה ולד”ר שיופן סונג על הצעותיהם המועילות למיקרוסקופיה של ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות ולשיטת הניקוי הקונבנציונלית, בהתאמה. מחקר זה מומן על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31870299) והאגודה לקידום חדשנות לנוער של האקדמיה הסינית למדעים. איור 2 נוצר עם BioRender.com.

Materials

1,000 µL pipette GILSON FA10006M
1,000 µL pipette tips Corning T-1000-B
2 ml centrifuge tube Axygen MCT-200-C
37% formaldehyde DAMAO 685-2013
5,000 µL pipette Eppendorf 3120000275
5,000 µL pipette tips biosharp BS-5000-TL
50 ml centrifuge tube Corning 430829
Absolute Ethanol BOYUAN 678-2002
Bottle glass Fisher FB800-100
Chloral Hydrate Meryer M13315-100G
Coverslip Leica 384200
DIC microscope Zeiss Axio Imager A1 10x, 20x and 40x magnification
Disinfectant QIKELONGAN 17-9185
Dissecting needle Bioroyee 17-9140
Flower nutrient soil FANGJIE
Forceps HAIOU 4-94
Glacial Acetic Acid BOYUAN 676-2007
Glycerol Solarbio G8190
Magnetic stirrer IKA RET basic
Micro-Tom Tomato Genetics Resource Center LA3911
Orbital shaker QILINBEIER QB-206
Seeding substrate PINDSTRUP LV713/018-LV252 Screening:0-10 mm
Single concave slide HUABODEYI HBDY1895
Slide Leica 3800381
Stereomicroscope Leica S8 APO 1x to 4x magnification
Tin foil ZAOWUFANG 613
Tween 20 Sigma P1379
Vacuum pump SHIDING SHB-III
Vortex meter Silogex MX-S

References

  1. . FAOSTAT Available from: https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL (2022)
  2. Olmstead, R. G., Bohs, L. A summary of molecular systematic research in Solanaceae: 1982-2006. Acta Horticulturae. 745, 255-268 (2007).
  3. Consortium, T. G. The tomato genome sequence provides insights into fleshy fruit evolution. Nature. 485 (7400), 635-641 (2012).
  4. Ebert, A. W., Chou, Y. Y. The tomato collection maintained by AVRDC – The World Vegetable Center: composition, germplasm dissemination and use in breeding. Acta Horticulturae. 1101, 169-176 (2015).
  5. Hilhorst, H., Groot, S., Bino, R. J. The tomato seed as a model system to study seed development and germination. Acta Botanica Neerlandica. 47, 169-183 (1998).
  6. Chaban, I. A., Gulevich, A. A., Kononenko, N. V., Khaliluev, M. R., Baranova, E. N. Morphological and structural details of tomato seed coat formation: A different functional role of the inner and outer epidermises in unitegmic ovule. Plants-Basel. 11 (9), 1101 (2022).
  7. Iwahori, S. High temperature injuries in tomato. V. Fertilization and development of embryo with special reference to the abnormalities caused by high temperature. Journal of The Japanese Society for Horticultural Science. 35 (4), 379-386 (1966).
  8. Xiao, H., et al. Integration of tomato reproductive developmental landmarks and expression profiles, and the effect of SUN. on fruit shape. BMC Plant Biology. 9 (1), 49 (2009).
  9. Karssen, C. M., Haigh, A. M., Toorn, P., Weges, R., Taylorson, R. B. Physiological mechanisms involved in seed priming. Recent advances in the development and germination of seeds. NATO ASI Series. 187, (1989).
  10. Nonogaki, H. Seed dormancy and germination-emerging mechanisms and new hypotheses. Frontiers in Plant Science. 5, 233 (2014).
  11. Doll, N. M., Ingram, G. C. Embryo-endosperm interactions. Annual Review of Plant Biology. 73, 293-321 (2022).
  12. Serrani, J. C., Fos, M., Atarés, A., García-Martínez, J. L. Effect of gibberellin and auxin on parthenocarpic fruit growth induction in the cv micro-tom of tomato. Journal of Plant Growth Regulation. 26 (3), 211-221 (2007).
  13. Yang, C., et al. A regulatory gene induces trichome formation and embryo lethality in tomato. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (29), 11836-11841 (2011).
  14. Goetz, S., et al. Role of cis-12-oxo-phytodienoic acid in tomato embryo development. Plant Physiology. 158 (4), 1715-1727 (2012).
  15. Ko, H. Y., Ho, L. H., Neuhaus, H. E., Guo, W. J. Transporter SlSWEET15 unloads sucrose from phloem and seed coat for fruit and seed development in tomato. Plant Physiology. 187 (4), 2230-2245 (2021).
  16. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  17. Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
  18. Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), (2021).
  19. Kwiatkowska, M., Kadłuczka, D., Wędzony, M., Dedicova, B., Grzebelus, E. Refinement of a clearing protocol to study crassinucellate ovules of the sugar beet (Beta vulgaris L., Amaranthaceae). Plant Methods. 15, 71 (2019).
  20. Ponitka, A., Ślusarkiewicz-Jarzina, A. Cleared-ovule technique used for rapid access to early embryo development in Secale cereale × Zea mays crosses. Acta Biologica Cracoviensia. Series Botanica. 46, 133-137 (2014).
  21. Ceccato, L., et al. Maternal control of PIN1 is required for female gametophyte development in Arabidopsis. PLoS One. 8 (6), 66148 (2013).
  22. Wilkinson, L. G., Tucker, M. R. An optimised clearing protocol for the quantitative assessment of sub-epidermal ovule tissues within whole cereal pistils. Plant Methods. 13, 67 (2017).
  23. Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. Whole-mount clearing and staining of Arabidopsis flower organs and Siliques. Journal of Visualized Experiments. (134), e56441 (2018).
  24. Creff, A., Brocard, L., Ingram, G. A mechanically sensitive cell layer regulates the physical properties of the Arabidopsis seed coat. Nature Communications. 6, 6382 (2015).
  25. Yang, T., et al. The B3 domain-containing transcription factor ZmABI19 coordinates expression of key factors required for maize seed development and grain filling. Plant Cell. 33 (1), 104-128 (2021).
  26. Anderson, L. E. Hoyer’s solution as a rapid permanent mounting medium for bryophytes. Bryologist. 57 (3), 242-244 (1954).
  27. Herr, J. M. A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms. American Journal of Botany. 58 (8), 785-790 (1971).
  28. Yadegari, R., et al. Cell differentiation and morphogenesis are uncoupled in Arabidopsis raspberry embryos. The Plant Cell. 6 (12), 1713-1729 (1995).
  29. Grini, P. E., Jurgens, G., Hulskamp, M. Embryo and endosperm development is disrupted in the female gametophytic capulet mutants of Arabidopsis. Genetics. 162 (4), 1911-1925 (2002).
  30. Kataoka, K., Uemachi, A., Yazawa, S. Fruit growth and pseudoembryo development affected by uniconazole, an inhibitor of gibberellin biosynthesis, in pat-2 and auxin-Induced parthenocarpic tomato fruits. Scientia Horticulturae. 98 (1), 9-16 (2003).
  31. de Jong, M., Wolters-Arts, M., Feron, R., Mariani, C., Vriezen, W. H. The Solanum lycopersicum auxin response factor 7 (SlARF7) regulates auxin signaling during tomato fruit set and development. Plant Journal. 57 (1), 160-170 (2009).
  32. Roth, M., Florez-Rueda, A. M., Paris, M., Stadler, T. Wild tomato endosperm transcriptomes reveal common roles of genomic imprinting in both nuclear and cellular endosperm. Plant Journal. 95 (6), 1084-1101 (2018).
  33. Orsi, C. H., Tanksley, S. D. Natural variation in an ABC transporter gene associated with seed size evolution in tomato species. PLoS Genetics. 5 (1), 1000347 (2009).
  34. Herridge, R. P., Day, R. C., Baldwin, S., Macknight, R. C. Rapid analysis of seed size in Arabidopsis for mutant and QTL discovery. Plant Methods. 7 (1), 3 (2011).
  35. Xu, T. T., Ren, S. C., Song, X. F., Liu, C. M. CLE19 expressed in the embryo regulates both cotyledon establishment and endosperm development in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany. 66 (17), 5217-5227 (2015).
  36. Ghadiri Alamdari, N., Salmasi, S., Almasi, H. Tomato seed mucilage as a new source of biodegradable film-forming material: effect of glycerol and cellulose nanofibers on the characteristics of resultant films. Food and Bioprocess Technology. 14 (12), 2380-2400 (2021).
  37. Gardner, R. O. An overview of botanical clearing technique. Stain Technology. 50 (2), 99-105 (1975).
  38. Beresniewicz, M. M., Taylor, A. G., Goffinet, M. C., Terhune, B. T. Characterization and location of a semipermeable layer in seed coats of leek and onion (Liliaceae), tomato and pepper (Solanaceae). Seed Science and Technology. 23 (1), 123-134 (1995).
  39. Stebbins, G. L. A bleaching and clearing method for plant tissues. Science. 87 (2245), 21-22 (1938).
  40. Debenham, E. M. A modified technique for the microscopic examination of the xylem of whole plants or plant organs. Annals of Botany. 3 (2), 369-373 (1939).
  41. Morley, T. Accelerated clearing of plant leaves by NaOH in association with oxygen. Stain Technology. 43 (6), 315-319 (1968).

Play Video

Cite This Article
Feng, Y., Wang, T., Liu, L. An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato (Solanum lycopersicum L.). J. Vis. Exp. (187), e64445, doi:10.3791/64445 (2022).

View Video