Summary
La semilla de tomate es un modelo importante para estudiar la genética y la biología del desarrollo durante la reproducción de las plantas. Este protocolo es útil para limpiar las semillas de tomate en diferentes etapas de desarrollo para observar la estructura embrionaria más fina.
Abstract
El tomate (Solanum lycopersicum L.) es uno de los principales cultivos comerciales en todo el mundo. La semilla de tomate es un modelo importante para estudiar la genética y la biología del desarrollo durante la reproducción de las plantas. La visualización de la estructura embrionaria más fina dentro de una semilla de tomate a menudo se ve obstaculizada por el mucílago de la capa de semillas, el tegumento de capas múltiples y un endospermo de paredes gruesas, que debe resolverse mediante una laboriosa sección de incrustación. Una alternativa más simple es emplear técnicas de limpieza de tejidos que hacen que la semilla sea casi transparente utilizando agentes químicos. Aunque los procedimientos convencionales de limpieza permiten una visión profunda de las semillas más pequeñas con una capa de semilla más delgada, la limpieza de las semillas de tomate sigue siendo un desafío técnico, especialmente en las últimas etapas de desarrollo.
Aquí se presenta un protocolo de limpieza rápido y que ahorra mano de obra para observar el desarrollo de las semillas de tomate de 3 a 23 días después de la floración, cuando la morfología embrionaria está casi completa. Este método combina la solución de limpieza a base de hidrato de cloral ampliamente utilizada en Arabidopsis con otras modificaciones, incluida la omisión de la fijación de formalina-aceto-alcohol (FAA), la adición del tratamiento con hipoclorito de sodio de las semillas, la eliminación del mucílago de la cubierta de semilla ablandada y el lavado y el tratamiento al vacío. Este método se puede aplicar para la limpieza eficiente de semillas de tomate en diferentes etapas de desarrollo y es útil en el monitoreo completo del proceso de desarrollo de semillas mutantes con buena resolución espacial. Este protocolo de limpieza también se puede aplicar a imágenes profundas de otras especies comercialmente importantes en las solanáceas.
Introduction
El tomate (S. lycopersicum L.) es uno de los cultivos hortícolas más importantes del mundo, con una producción de 186,8 millones de toneladas de frutos carnosos de 5,1 millones de hectáreas en 20201. Pertenece a la gran familia Solanaceae con alrededor de 2.716 especies2, incluyendo muchos cultivos comercialmente importantes como berenjenas, pimientos, patatas y tabaco. El tomate cultivado es una especie diploide (2n = 2x = 24) con un tamaño de genoma de aproximadamente 900 Mb3. Durante mucho tiempo, se ha hecho un gran esfuerzo hacia la domesticación y reproducción del tomate mediante la selección de rasgos deseables de Solanum spp. silvestres. Hay más de 5.000 accesiones de tomate listadas en el Centro de Recursos Genéticos del Tomate y más de 80.000 germoplasma de tomates se almacenan en todo el mundo4. La planta de tomate es perenne en el invernadero y se propaga por semillas. Una semilla de tomate madura consta de tres compartimentos principales: un embrión adulto, endospermo residual de tipo celular y una capa dura de semilla 5,6 (Figura 1A). Después de la doble fertilización, el desarrollo del endospermo de tipo celular precede al desarrollo de cigotos. A ~ 5-6 días después de la floración (DAF), el proembrión bicelular se observa por primera vez cuando el endospermo consta de seis a ocho núcleos7. En Solanum pimpinellifolium, el embrión se acerca a su tamaño final después de 20 DAF, y las semillas son viables para la germinación después de 32 DAF8. A medida que el embrión se desarrolla, el endospermo se absorbe gradualmente y solo queda una pequeña cantidad de endospermo en la semilla. El endospermo residual consiste en endospermo micropilar que rodea la punta de la radícula, y endospermo lateral en el resto de la semilla 9,10. La capa externa de la semilla se desarrolla a partir de la epidermis externa engrosada y lignificada del tegumento, y con las capas muertas de restos de tegumento, forman una cáscara dura para proteger el embrión y el endospermo5.
Figura 1: Representación esquemática de una semilla madura en Solanum lycopersicum y Arabidopsis thaliana. (A) Anatomía longitudinal de una semilla de tomate maduro. (B) Anatomía longitudinal de una semilla madura de Arabidopsis. Una semilla de tomate maduro es aproximadamente 70 veces más grande en tamaño que una semilla de Arabidopsis. Barras de escala = (A) 400 μm, (B) 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La producción de semillas de tomate de alta calidad depende de la coordinación entre el embrión, el endospermo y los componentes de la semilla materna11. La disección de genes y redes clave en el desarrollo de semillas requiere un registro fenotípico profundo y completo de semillas mutantes. Las técnicas convencionales de embutido-seccionamiento, como la sección semifina y la sección de parafina, se aplican ampliamente a las semillas de tomate para observar las estructuras locales y más finas del embrión12,13,14,15. Sin embargo, analizar el desarrollo de la semilla a partir de secciones delgadas suele ser laborioso y carece de resolución espacial del eje z. En comparación, la limpieza del tejido es un método rápido y eficiente para identificar la etapa de desarrollo de los defectos embrionarios que tienen más probabilidades de ocurrir16. El método de depuración reduce la opacidad del tejido interno homogeneizando el índice de refracción con uno o más agentes bioquímicos16. El aclaramiento de tejido completo permite observar la estructura de un tejido vegetal sin destruir su integridad, y la combinación de la tecnología de limpieza y la imagen tridimensional se ha convertido en una solución ideal para obtener información sobre la morfología y el estado de desarrollo de un órgano vegetal17,18. A lo largo de los años, las técnicas de limpieza de semillas se han utilizado en varias especies de plantas, incluyendo Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare y Beta vulgaris 19,20,21,22,23. Entre estos, la tecnología de limpieza de óvulos de montaje completo ha sido un enfoque eficiente para estudiar el desarrollo de semillas de Arabidopsis, debido a su pequeño tamaño, 4-5 capas de la célula de recubrimiento de la semilla y el endospermo de tipo nuclear24,25. Con la actualización continua de diferentes mezclas de aclaramiento, como la aparición de la solución de Hoyer26, las estructuras internas del óvulo de cebada fueron fotografiadas con un alto grado de claridad, aunque su endospermo constituye la mayor parte de las semillas. La embriogénesis de la remolacha azucarera se puede observar mediante la limpieza combinada con el tratamiento al vacío y el ablandamiento con ácido clorhídrico19. Sin embargo, a diferencia de las especies mencionadas anteriormente, no se han reportado observaciones embriológicas mediante protocolos de limpieza en semillas de tomate. Esto impide una investigación detallada sobre el desarrollo embrionario y de semillas de los tomates.
El hidrato de cloral se utiliza comúnmente como una solución de limpieza que permite que los tejidos y células sumergidos se muestren en diferentes planos ópticos, y preserva sustancialmente las células o componentes tisulares27,28,29. El protocolo de limpieza basado en hidrato de cloral se ha utilizado con éxito para el aclaramiento de semillas de montaje completo para observar el embrión y el endospermo de Arabidopsis21,28. Sin embargo, esta solución de limpieza no es eficiente para limpiar las semillas de tomate, que son más impermeables que las semillas de Arabidopsis. Las barreras físicas incluyen: (1) el tegumento del tomate tiene casi 20 capas celulares de 3 a 15 DAF 30,31, (2) el endospermo del tomate es de tipo celular, no de tipo nuclear 32, y (3) las semillas de tomate son aproximadamente 70 veces más grandes en tamaño33,34 y (4) producen grandes cantidades de mucílago de recubrimiento de semillas, lo que bloquea la penetración de los reactivos de limpieza y afecta la visualización de las células embrionarias.
Por lo tanto, este informe presenta un método optimizado de limpieza basado en hidrato de cloral para la limpieza de semillas de tomate de montaje completo en diferentes etapas, lo que permite obtener imágenes profundas del proceso de desarrollo embrionario (Figura 2).
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Protocol
1. Preparación de soluciones
- Prepare el fijador FAA agregando 2.5 ml de formaldehído al 37%, 2.5 ml de ácido acético glacial y 45 ml de etanol al 70% en un tubo de centrífuga de 50 ml. Vortex y almacénelo a 4 °C. Prepare el fijador FAA justo antes de usar.
PRECAUCIÓN: El formaldehído al 37% es corrosivo y potencialmente cancerígeno si se expone o inhala. El fijador debe realizarse en una campana extractora mientras se usa el equipo de protección personal adecuado. - Prepare la solución de limpieza agregando 5 ml de 100% de glicerol, 40 g de hidrato de cloral y 10 ml de agua destilada en una botella de vidrio de 100 ml envuelta con papel de aluminio. Disuelva con un agitador magnético durante la noche a temperatura ambiente. La solución preparada puede conservarse a 4 °C durante un máximo de 6 meses.
PRECAUCIÓN: El hidrato de cloral es cancerígeno y tiene un olor acre. Realice el experimento en una campana extractora y use el equipo de protección personal adecuado. El hidrato de cloral es fácil de delicuescencia en el aire y no debe almacenarse en grandes cantidades. La solución de limpieza puede descomponerse cuando se expone a la luz y debe mantenerse alejada de la luz. - Prepare la solución desinfectante agregando 10 ml de hipoclorito de sodio al 6%, 40 ml de agua destilada y 50 μL Tween-20 en un tubo de centrífuga de 50 ml. Vortex y guárdelo a temperatura ambiente. Prepare la solución desinfectante justo antes de usarla.
NOTA: El contenido efectivo de cloro del hipoclorito de sodio que se ha colocado durante mucho tiempo puede disminuir, y el contenido de hipoclorito de sodio al 6% puede aumentarse de acuerdo con la situación real.
2. Recogida de semillas
- Sembrar semillas de tomate (S. lycopersicum L. cv. Micro-Tom, ver Tabla de materiales) en cuencas cuadradas de 8 cm × 8 cm × 8 cm llenas con una mezcla 1:1 de tierra nutritiva de flores y sustrato (v/v) (ver Tabla de materiales), y cultivar en una sala de crecimiento con períodos claros/oscuros de 16/8 h a 24 ± 2 °C (día) y 18 ± 2 °C (noche), 60%-70% de humedad relativa, y una intensidad de luz de 4.000 Lux. Aproximadamente 6 semanas después, las plantas entraron en la etapa de floración.
- Etiquete la fecha de floración de las flores independientes en la antesis (el ángulo de apertura de los pétalos es de 90°) y registre el día después de la floración (DAF).
- Coseche los frutos de 3 a 23 plantas de tomate DAF e inmediatamente póngalas en hielo. Divida las frutas (semillas o embriones) de 3 a 23 DAF en frutas tempranas (3-10 DAF), medianas (11-16 DAF) y tardías (17-23 DAF) (semillas o embriones).
NOTA: No recoja demasiadas frutas a la vez y asegúrese de que las semillas de cada fruta se eliminen dentro de 1 h para un tratamiento posterior. - Para las frutas tempranas, rompa la fruta y colóquela en un portaobjetos, y recoja las semillas frescas cuidadosamente con pinzas de precisión bajo el microscopio estereoscópico (consulte la Tabla de materiales) con un aumento de 1x a 4x. Para frutas medias y tardías, rompa la fruta y recoja directamente las semillas frescas con pinzas de precisión.
3. Limpieza de semillas a base de hidrato de cloral
NOTA: En este estudio se compararon los protocolos convencionales35 y optimizados por su eficiencia de limpieza de semillas.
- Limpieza mediante un protocolo convencional
- Colocar inmediatamente las semillas frescas (obtenidas en el paso 2.4) en un tubo centrífugo de 2 ml que contenga 1,5 ml de fijador FAA e incubar en un agitador orbital (5 rpm, ver Tabla de materiales) durante 4 h a temperatura ambiente.
- Deshidratar estas semillas en una serie de etanol de 70%, 95% y 100% de etanol (v/v) durante 1 h cada una en un agitador orbital (5 rpm).
- Coloque las semillas en 3-5 gotas de solución transparente (~ 100 μL) en el portaobjetos y cubra suavemente la muestra con un cubreobjetos. Reemplace la diapositiva con una sola diapositiva cóncava (consulte la Tabla de materiales) para semillas medias y tardías.
- Mantenga estos portaobjetos o portaobjetos cóncavos individuales a temperatura ambiente durante 30 min (3 DAF), 2 h (6 DAF), 1 día (9 DAF), 3 días (12 DAF) o 7 días (14 a 22 DAF) dependiendo de las etapas de desarrollo del material de semilla (cuanto más jóvenes sean los materiales, más rápida será la velocidad de limpieza).
- Observe las muestras con un microscopio de contraste de interferencia diferencial (DIC) equipado con una cámara digital (consulte la Tabla de materiales) con un aumento de 10x, 20x y 40x. Ajuste y optimice el brillo de la luz transmitida, el control deslizante DIC y la apertura del condensador en tiempo real para cada muestra y capture imágenes.
- Borrado mediante el protocolo optimizado
- Colocar las semillas frescas (obtenidas en la etapa 2.4) directamente en un tubo de centrífuga de 2 ml que contenga 1,5 ml de solución desinfectante (paso 1.3).
NOTA: El número de semillas recolectadas en el tubo de centrífuga de 2 ml varía según la etapa de desarrollo de las semillas. Los detalles se enumeran en la Tabla 1. - Incubar las muestras en un agitador orbital (30 rpm) a temperatura ambiente durante 3 a 50 minutos hasta que el contorno de la cubierta de semilla más interna sea claramente visible. Deseche la solución desinfectante.
NOTA: El tiempo de incubación requerido depende de la etapa de desarrollo de la semilla (cuanto más tarde sean las semillas, mayor será el tiempo de incubación). Los detalles se enumeran en la Tabla 1. - Para semillas medias y tardías, transfiera las semillas a un portaobjetos y retire el mucílago de la semilla con fórceps y una aguja de disección bajo un microscopio estereoscópico con un aumento de 1x a 4x. Transfiera las semillas de nuevo al tubo de centrífuga original usando pinzas.
NOTA: Este paso no es necesario para las semillas tempranas. - Lave las semillas 5 veces con 1,5 ml de agua desionizada, 10 s cada vez. Deseche el agua desionizada.
- Agregue una solución de limpieza de 2 × el volumen de las semillas, seguido de un tratamiento al vacío de 0 a 50 minutos (Tabla 1) con una bomba de vacío (ver Tabla de materiales). El tratamiento de vacío intermitente se realiza con cada tratamiento de vacío durante 10 minutos espaciados a intervalos de 10 minutos.
- Reemplace con una solución fresca de aclaramiento de 2 × el volumen de las semillas. Mantenga el tubo de centrífuga de 2 ml que contiene las semillas a temperatura ambiente y protegido de la luz durante 30 minutos a 7 días para facilitar la limpieza (Tabla 1). Durante la incubación, para embriones tardíos, reemplace la solución de limpieza diariamente con solución fresca y someta las semillas a un tratamiento de vacío durante 10 minutos.
- Prepare las semillas limpias en portaobjetos o portaobjetos cóncavos individuales y observe con el microscopio DIC equipado con una cámara digital con aumentos de 10x, 20x y 40x. Ajuste y optimice el brillo de la luz transmitida, el control deslizante DIC y la apertura del condensador en tiempo real para cada muestra y capture imágenes.
- Colocar las semillas frescas (obtenidas en la etapa 2.4) directamente en un tubo de centrífuga de 2 ml que contenga 1,5 ml de solución desinfectante (paso 1.3).
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Representative Results
Cuando las semillas de tomate se eliminaron utilizando un método convencional como en Arabidopsis, las células densas del endospermo bloquearon la visualización de embriones de tomate tempranos a 3 DAF y 6 DAF (Figura 3A, B). A medida que aumentaba el volumen total del embrión, un embrión globular apenas se distinguía a 9 DAF (Figura 3C). Sin embargo, a medida que el tamaño de la semilla continuó aumentando, su permeabilidad disminuyó, lo que resultó en un embrión de corazón borroso a 12 DAF (Figura 3D). A partir de 13 DAF, el mucílago de la semilla y la cubierta de la semilla se volvieron gradualmente más densos, evitando la penetración de agentes de limpieza. El contorno del embrión dentro de 14-19 semillas DAF estaba extremadamente borroso incluso cuando el tiempo de tratamiento se extendió a 7 días (Figura 3E-G). En 22 semillas DAF, la estructura interna de la semilla era completamente invisible (Figura 3H).
Por lo tanto, el procedimiento convencional de limpieza a base de hidrato de cloral se optimizó para permitir la limpieza eficiente de las semillas de tomate. Los detalles sobre todos los pasos se enumeran en la Tabla 1. En primer lugar, los pasos de fijación y deshidratación de etanol de la FAA, que a menudo se requieren en los procedimientos de limpieza convencionales, se omitieron del protocolo. Si bien la fijación de FAA generalmente se usa para preservar la estructura morfológica y los componentes celulares de la descomposición, se encontró (en este estudio) que la estructura interna de las semillas de tomate no se deformaba fácilmente y estaba bien conservada a pesar de la ausencia de fijación de FAA y deshidratación de etanol.
En segundo lugar, el mucílago de la cubierta de la semilla producido por las células epidérmicas de la cubierta de la semilla es muy prominente desde 13 DAF en adelante (Figura 4). El mucílago de semilla rico en polisacáridos mostró una alta viscosidad y una permeabilidad significativamente baja35,36. Desafortunadamente, los ensayos iniciales para eliminarlo sin destruir la capa de la semilla con pinzas finas y agujas bajo un microscopio de disección fracasaron. Esto se debe a que la capa de la semilla es frágil y está conectada firmemente al mucílago. Además, la existencia de pigmento en la cubierta de la semilla conduce además a la disminución de la calidad de la imagen de campo claro37. Para superar este problema, las semillas se trataron con una solución desinfectante de hipoclorito de sodio al 1,2% y Tween 20 al 0,1%. El efecto blanqueador del hipoclorito de sodio permite una identificación clara de la cubierta interna de la semilla y crea un ambiente relativamente estéril que permitió que las muestras se almacenaran durante mucho tiempo. El uso del detergente Tween 20 podría reducir la tensión superficial y aumentar la permeabilidad de las semillas. Más importante aún, después de este paso, la mayor parte del mucílago adherente se puede separar de la semilla sin dañar la cubierta de la semilla (Figura 4). A partir de entonces, las semillas tratadas se agruparon en un tubo centrífugo de 2 ml y se incubaron a temperatura ambiente en un agitador orbital (30 rpm).
En tercer lugar, se utilizó el tratamiento con vacío para acelerar la penetración de la solución de limpieza a los embriones en las etapas media y tardía. Finalmente, debido a que las semillas de tomate son especialmente más grandes después de 12 DAF, las diapositivas convencionales fueron reemplazadas por diapositivas cóncavas individuales cuando se toman imágenes DIC.
Después del tratamiento de acuerdo con el protocolo de limpieza optimizado, las semillas de tomate mostraron una transparencia satisfactoria en todas las etapas de desarrollo probadas (Figura 5A-L). En contraste con los contornos celulares difusos obtenidos utilizando protocolos convencionales, distintas capas celulares de la cubierta de semilla a 3 DAF fueron visibles (Figura 5A). Las células del endospermo fueron más distinguibles a 5 DAF (Figura 5B). El embrión en forma de palo apareció a 7 DAF, y luego el embrión alcanzó la etapa globular a 9 DAF y la etapa cardíaca a 11 DAF (Figura 5C-E). Durante estas etapas de desarrollo, los contornos de las células dentro del embrión eran más claramente visibles. En comparación con el método convencional, el protocolo optimizado produjo imágenes de calidad significativamente mejor desde la etapa cardíaca hasta la etapa de embrión maduro. Cuando el desarrollo embrionario alcanzó la etapa temprana de torpedos a 13 DAF, la etapa de torpedo medio a 14 DAF, la etapa tardía de torpedos a 15 DAF, la etapa de cotiledón temprano a 16 DAF, la etapa de cotiledón doblado a 19 DAF y 21 DAF, y el embrión maduro a 23 DAF, el grado del rizo de los cotiledones y el meristemo apical del brote se capturó muy fácilmente (Figura 5F-L ). Sin embargo, más allá de 23 DAF, no fue posible visualizar los detalles en el embrión, incluso cuando el tratamiento de limpieza se prolongó a más de 1 semana.
Figura 2: Diagrama de flujo del protocolo convencional y protocolo optimizado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes de contraste de interferencia diferencial de óvulos de S. lycopersicum tratados con el método de aclaramiento convencional. (A) Un óvulo con saco embrionario difuso a 3 DAF. (B) Saco embrionario con células visibles del endospermo (puntas de flecha) a 6 DAF. (C) Un embrión globular apenas distinguible a 9 DAF. Un embrión difuso en (D) 12, (E) 14, (F) 16 y (G) 19 DAF. (H) La estructura interna de la semilla es completamente invisible a 22 DAF. Barras de escala = 25 μm; em = embrión; es = saco embrionario. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Desinfección de semillas de S. lycopersicum en diferentes etapas de desarrollo. Las imágenes superiores (A1-F1) son las semillas rayadas de los frutos en desarrollo en (A1) 11, (B1) 12, (C1) 14, (D1) 16, (E1) 18 y (F1) 21 DAF, mientras que las imágenes inferiores (A2-F2) son semillas tratadas con solución desinfectante. En A2-F2, el contorno interno de la cubierta de la semilla se puede identificar claramente. Barras de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Imágenes de contraste de interferencia diferencial de embriones de S. lycopersicum eliminados utilizando el protocolo optimizado. (A-L) Imágenes de microscopía DIC del óvulo de tomate con saco embrionario visible en (A) 3 DAF y (B) 5 DAF, (C) un embrión en forma de palo a 7 DAF, (D) un embrión globular a 9 DAF, (E) un embrión cardíaco a 11DAF, (F) un embrión de torpedo temprano a 13 DAF, (G) un embrión de torpedo medio 14 DAF, (H) un embrión de torpedo tardío a 15 DAF, (I) un embrión de cotiledón temprano a 16 DAF, un embrión de cotiledón doblado a (J) 19 DAF y (K) 21 DAF, y (L) un embrión maduro a 23 DAF. Barras de escala = 50 μm; em = embrión; sc = cubierta de la semilla; en = endospermo; es = saco embrionario; hy = hipocótilo; co = cotiledón; r = raízla; sa = disparar apical. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Procesamiento de tejidos | Desarrollo embrionario | ||||||
| 3-7 DAF | 8-10 DAF | 11-13 DAF | 14-16 DAF | 17-20 DAF | 21-23 DAF | ||
| 1 | Número de semillas frescas | 50 | 40 | 30 | 20 | 15 | 10 |
| 2 | Desinfección | 1.5 mL, 3 min | 1,5 ml, 10 minutos | 1,5 ml, 20 min | 1,5 ml, 30 min | 1,5 ml, 40 min | 1,5 ml, 50 minutos |
| 3 | Despegando el mucílago | No | No | Sí | Sí | Sí | Sí |
| 4 | Lavado | 5x 10 s | |||||
| 5 | Claro | 2 veces el volumen de semillas | |||||
| 6 | Aspirar | No | 1 x 10 min | 2 x 10 min | 3 x 10 minutos | 4 x 10 minutos | 5 x 10 minutos |
| 7 | Incubación | 30 minutos | 2 h | 3 h | 8 h | 1–4 días | 3–7 días |
Tabla 1: Optimización del protocolo para mejorar la eficacia del aclaramiento en semillas de tomate. 1 = Operaciones por lotes, observación de limpieza de un gran número de semillas a la vez; las semillas se colocaron en un tubo de centrífuga de 2 ml. 2 = Desinfección utilizando NaClO:dH6% O:Tween-20, en proporciones de 200:800:1 (v/v); Todos los pasos se realizaron en un agitador orbital con agitación de 30 rpm. 3 = Todos los pasos se realizaron bajo un microscopio de disección con fórceps y agujas de disección, a menos que se especifique lo contrario. 4 = Las semillas se lavaron con agua destilada después de cada paso. 5 = Aclaramiento con 100% glicerol:hidrato de cloral:dH2O, en proporciones de 1:8:2 (v/w/v). 6 = Cada tratamiento con vacío duró 10 min y se espació a intervalos de 10 min. 7 = Reemplácelo con una solución fresca para limpiar y almacene las semillas lejos de la luz a temperatura ambiente; para semillas de 17 DAF a 23 DAF, sustituya la solución de limpieza por una solución fresca y aspire durante 10 minutos todos los días durante todo el período de incubación.
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Discussion
En comparación con la sección mecánica, la tecnología de limpieza es más ventajosa para la obtención de imágenes tridimensionales, ya que conserva la integridad de los tejidos u órganos vegetales16. Los protocolos de limpieza convencionales a menudo se limitan a muestras pequeñas debido a la penetración más fácil de las soluciones químicas. La semilla de tomate es una muestra problemática para la limpieza de tejidos porque es aproximadamente 70 veces más grande que una semilla de Arabidopsis en tamaño y tiene más barreras de permeabilidad. La capa de semilla de Arabidopsis se compone de cuatro a cinco capas celulares vivas derivadas del tegumento externo y el tegumento interno24. Sin embargo, en comparación con Arabidopsis, hay 22-27 capas celulares parenquimatosas (en la etapa del embrión globular) en la capa de semilla de tomate6. La capa más interna de la capa de semilla de tomate está compuesta de suberina y se conoce como capa semipermeable, que ha demostrado ser una barrera para el movimiento de compuestos solubles en agua38. Además, el mucílago de semilla rico en polisacáridos mostró una alta viscosidad y una permeabilidad significativamente baja, lo que dificultó la penetración de la solución de aclaramiento. La capa de semilla rica en pigmentos del tomate también reduce la calidad de imagen35,36,37. Históricamente, la eliminación de pigmentos se resuelve mediante la aplicación de oxidantes acompañados de calentamiento o tratamiento prolongado 37,39,40,41. Sin embargo, apenas se ha informado de ninguna aplicación de oxidantes en el método de limpieza basado en hidrato de cloral.
En este estudio, las semillas fueron tratadas antes del proceso de limpieza con una solución desinfectante que contenía hipoclorito de sodio, complementada con un surfactante Tween 20. Sorprendentemente, después del tratamiento con la solución desinfectante (3 a 50 min), el mucílago de las semillas de tomate podría eliminarse fácilmente, mejorando en gran medida la permeabilidad de las semillas. El proceso de blanqueo de la cubierta de la semilla se puede observar en tiempo real y la duración de la desinfección de la semilla se ajusta en consecuencia. El proceso de blanqueo también mantiene un ambiente relativamente estéril, lo que permite el almacenamiento posterior de las semillas tratadas durante 8 meses sin contaminación.
El protocolo optimizado desarrollado en el estudio logró una transparencia general de las semillas de tomate de 3 DAF a 23 DAF. Las ventajas de este protocolo se reflejan principalmente en los siguientes aspectos: En primer lugar, la eliminación de la fijación de FAA y la posterior deshidratación del gradiente de etanol acortaron el tiempo de tratamiento en al menos 7 h. El uso del tratamiento con hipoclorito de sodio combinado con una solución de limpieza mejoró significativamente la permeabilidad de las semillas y la visualización de la capa más interna de la capa de la semilla. Finalmente, para embriones medios, se pueden adquirir imágenes de alta calidad de embriones después de 10 h, mientras que toma al menos 3 días con los protocolos tradicionales.
A pesar de las ventajas de este protocolo, tiene dos limitaciones importantes. Primero, a 5 DAF, no se observó el proembrión temprano en la etapa de dos a dieciséis células, lo que probablemente se debió a las células densas y más grandes del endospermo de tipo celular que dificultan la visualización de los embriones. En segundo lugar, aunque la morfología del embrión de tomate está casi completa en alrededor de 23 DAF, no se pudieron obtener imágenes distintas para semillas después de 24 DAF con este método optimizado. Es posible que a medida que el embrión se acerca a su tamaño completo, la cutícula en la superficie del endospermo se engrosa significativamente, los restos de células moribundas del parénquima del tegumento forman capas densas y las células externas de la epidermis del tegumento aumentan dramáticamente en lignificación6. Estos sugieren una reducción drástica en la capacidad de penetración de la semilla, lo que hace imposible visualizar el tejido interno con los métodos existentes.
En conclusión, este protocolo optimizado proporciona un medio eficaz para encontrar el período anormal de desarrollo embrionario, proporcionando la base para la observación de estructuras celulares más finas utilizando técnicas de corte. Además, hasta cierto punto, es probable que este método proporcione un esquema de referencia para otros cultivos comercialmente importantes en Solanaceae, como papas, berenjenas, pimientos y tabaco.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen al Dr. Jie Le y al Dr. Xiufen Song por sus útiles sugerencias sobre la microscopía de contraste de interferencia diferencial y el método de limpieza convencional, respectivamente. Esta investigación fue financiada por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31870299) y la Asociación de Promoción de la Innovación Juvenil de la Academia China de Ciencias. La figura 2 se creó con BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 µL pipette | GILSON | FA10006M | |
| 1,000 µL pipette tips | Corning | T-1000-B | |
| 2 ml centrifuge tube | Axygen | MCT-200-C | |
| 37% formaldehyde | DAMAO | 685-2013 | |
| 5,000 µL pipette | Eppendorf | 3120000275 | |
| 5,000 µL pipette tips | biosharp | BS-5000-TL | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Absolute Ethanol | BOYUAN | 678-2002 | |
| Bottle glass | Fisher | FB800-100 | |
| Chloral Hydrate | Meryer | M13315-100G | |
| Coverslip | Leica | 384200 | |
| DIC microscope | Zeiss | Axio Imager A1 | 10x, 20x and 40x magnification |
| Disinfectant | QIKELONGAN | 17-9185 | |
| Dissecting needle | Bioroyee | 17-9140 | |
| Flower nutrient soil | FANGJIE | ||
| Forceps | HAIOU | 4-94 | |
| Glacial Acetic Acid | BOYUAN | 676-2007 | |
| Glycerol | Solarbio | G8190 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RET basic | |
| Micro-Tom | Tomato Genetics Resource Center | LA3911 | |
| Orbital shaker | QILINBEIER | QB-206 | |
| Seeding substrate | PINDSTRUP | LV713/018-LV252 | Screening:0-10 mm |
| Single concave slide | HUABODEYI | HBDY1895 | |
| Slide | Leica | 3800381 | |
| Stereomicroscope | Leica | S8 APO | 1x to 4x magnification |
| Tin foil | ZAOWUFANG | 613 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Vacuum pump | SHIDING | SHB-III | |
| Vortex meter | Silogex | MX-S |
References
- FAOSTAT. , Available from: https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL (2022).
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