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Biology

अंतःपात्र नेत्रश्लेष्मला गोब्लेट कोशिकाओं में सेक्स-आधारित अंतर का अध्ययन करने की विधि

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/64456
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Ophthalmology Schepens Eye Research Institute, Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School

Summary

भ्रूण गोजातीय सीरम-मुक्त माध्यम सेक्स-आधारित मतभेदों के अध्ययन में नेत्रश्लेष्मला गोब्लेट कोशिकाओं के सामान्य कार्य को बदले बिना बहिर्जात हार्मोन को खत्म करने के लिए उन्नत आरपीएमआई की तुलना में एक बेहतर विकल्प है।

Abstract

सूखी आंख एक बहु-कारक बीमारी है जो ओकुलर सतह स्वास्थ्य को प्रभावित करती है, जिसमें महिलाओं में गहराई से उच्च प्रसार होता है। नेत्र संबंधी सतह पर नेत्रश्लेष्मला गोब्लेट कोशिकाओं (सीजीसी) द्वारा स्रावित जेल बनाने वाले म्यूसिन का विघटन कई ओकुलर सतह रोगों में योगदान देता है। सीजीसी में सेक्स-आधारित मतभेदों के इन विट्रो अध्ययन के दौरान लगातार परिणाम प्राप्त करने के लिए बहिर्जात सेक्स हार्मोन का उन्मूलन आवश्यक है। यह पेपर सीजीसी में उनके शारीरिक कार्य को बनाए रखते हुए सेक्स-आधारित मतभेदों के अध्ययन में बहिर्जात हार्मोन की उपस्थिति को कम करने की एक विधि का वर्णन करता है। दोनों लिंगों के पोस्टमॉर्टम मानव दाताओं से सीजीसी को आरपीएमआई माध्यम में नेत्रश्लेष्मला के टुकड़ों से 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) (पूर्ण माध्यम के रूप में संदर्भित) के साथ संवर्धित किया गया था। प्रयोगों की शुरुआत से लगभग 48 घंटे पहले, सीजीसी को फिनोल लाल या एफबीएस के बिना आरपीएमआई माध्यम में स्थानांतरित कर दिया गया था, लेकिन 1% बीएसए (फिनोल-लाल-मुक्त माध्यम के रूप में संदर्भित) के साथ। सामान्य सेलुलर फ़ंक्शन का अध्ययन फुरा 2/एसिटोक्सीमिथाइल (एएम) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कार्बाकोल (सीसीएच, 1 x 10-4 एम) उत्तेजना के बाद इंट्रासेल्युलर [सीए 2+] ([सीए2+]आई) में वृद्धि को मापकर किया गया था। परिणाम से पता चलता है कि सीजीसी ने 48 घंटे के बाद फिनोल-लाल-मुक्त मीडिया में सामान्य कार्य बनाए रखा। [सीए2 +] आई प्रतिक्रिया में कोई महत्वपूर्ण अंतर फिनोल लाल-मुक्त आरपीएमआई माध्यम और सीसीएच उत्तेजना पर पूर्ण माध्यम के बीच नहीं देखा गया था। इसलिए, हम सेक्स-आधारित मतभेदों के अध्ययन में सीजीसी के सामान्य कार्य को बदलने के बिना बहिर्जात हार्मोन को खत्म करने के लिए 1% बीएसए के साथ फिनोल-लाल मुक्त आरपीएमआई माध्यम का उपयोग करने की सलाह देते हैं।

Introduction

सेक्स-आधारित मतभेद ओकुलर सतह 1,2,3 की कई प्रक्रियाओं को प्रभावित करते हैं। इन सेक्स-आधारित मतभेदों की नैदानिक अभिव्यक्ति पुरुषों और महिलाओं के बीच कई ओकुलर सतह रोगों के प्रसार में अंतर है, जैसे कि सूखी आंख और नेत्रश्लेष्मलाशोथ 4,5,6। साक्ष्य बताते हैं कि सेक्स-आधारित अंतर कई जैविक स्तरों से उत्पन्न होते हैं, जिसमें एक्स और वाई क्रोमोसोम7 पर जीन के विभिन्न प्रोफाइल और हार्मोन8 के प्रभाव शामिल हैं। सेक्स-आधारित मतभेदों के आणविक आधार का अध्ययन बीमारी की बेहतर समझ प्रदान कर सकता है और अंततः, व्यक्तिगत चिकित्सा में सुधार कर सकता है।

ओकुलर सतह में आंसू फिल्म, कॉर्निया और नेत्रश्लेष्मला शामिल हैं। ओकुलर सतह के कई घटकों में सेक्स-आधारित अंतर देखे जाते हैं, जिनमें आंसू फिल्म 9,10, कॉर्निया 11, लैक्रिमल ग्रंथि 12,13, और मेइबोमियन ग्रंथियां शामिल हैं जो आँसू 12 का स्राव भी करती हैं। कई यांत्रिक अध्ययनों ने कॉर्निया और इसके संबंधित घटकों पर सेक्स हार्मोन के प्रभाव की जांच की है14,15; हालांकि, नेत्रश्लेष्मला और इसकी गोब्लेट कोशिकाओं में सेक्स-आधारित अंतर के बारे में बहुत कम जानकारी है। नेत्रश्लेष्मला एक श्लेष्म झिल्ली है जो श्वेतपटल और पलक की आंतरिक सतह को कवर करती है। नेत्रश्लेष्मला के उपकला में नॉनकेराटिनाइजिंग, बहु-स्तरित, स्तरीकृत स्क्वैमस कोशिकाएंशामिल हैं।

नेत्रश्लेष्मला की स्तरीकृत स्क्वैमस कोशिकाओं में, एपिथेलियम की एपिकल सतह पर फैले गोब्लेट कोशिकाएं (सीजीसी) होती हैं। इन गोब्लेट कोशिकाओं को एपिकल पोल17 पर स्थित स्रावी कणिकाओं की बड़ी संख्या की विशेषता है। सीजीसी ओकुलर सतह को मॉइस्चराइज करने औरपलक झपकने के दौरान इसे चिकनाई देने के लिए जेल बनाने वाले म्यूसिन एमयूसी 5एसी को संश्लेषित और स्रावित करते हैं। म्यूसिन स्राव को इंट्रासेल्युलर [सीए 2+] ([सीए2+]आई) और रास-निर्भर बाह्य संकेत-विनियमित किनेज (ईआरके 1/2)18 के सक्रियण द्वारा कसकर नियंत्रित किया जाता है। श्लेष्म को स्रावित करने में असमर्थता के परिणामस्वरूप ओकुलर सतह का सूखापन और रोग संबंधी असामान्यताओं की अगली कड़ी होती है। एक सूजन ओकुलर सतह पर, हालांकि, भड़काऊ मध्यस्थों द्वारा उत्तेजित व्यापक श्लेष्म स्राव आंख की चिपचिपाहट और खुजली की धारणा की ओर जाताहै। परेशान श्लेष्म स्राव के साथ ये स्थितियां अंततः ओकुलर सतह की गिरावट का कारण बनेंगी।

ओकुलर म्यूसिन के प्रमुख स्रोत के रूप में गोब्लेट कोशिकाओं की भूमिका को लंबे समयसे मान्यता दी गई है, हालांकि, शारीरिक और रोग संबंधी दोनों राज्यों में म्यूसिन विनियमन में सेक्स-आधारित अंतर अज्ञात हैं। हार्मोनल प्रभाव के बिना या सेक्स हार्मोन के ठीक से नियंत्रित स्तर के साथ गोब्लेट कोशिकाओं के कार्य की निगरानी के लिए एक इन विट्रो सिस्टम उपयोगी होगा। भले ही एक नेत्रश्लेष्मला उपकला कोशिका लाइन21 विकसित हुई है, लेकिन कार्यात्मक श्लेष्म स्राव के साथ कोई गोब्लेट सेल लाइन उपलब्ध नहीं है। इसलिए, हमने विट्रो16 में सेक्स-आधारित अंतर का विश्लेषण करने के लिए एक विधि स्थापित करने के लिए अपनी विकसित प्राथमिक मानव सीजीसी संस्कृति को संशोधित किया, और इसे नीचे प्रस्तुत किया।

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Protocol

सभी मानव ऊतक ों को वैज्ञानिक अनुसंधान में उपयोग के लिए दाता की पूर्व सूचित सहमति और प्राधिकरण के साथ नेत्र बैंक को दान किया गया था। मानव नेत्रश्लेष्मला ऊतक के उपयोग की समीक्षा मैसाचुसेट्स आंख और कान मानव अध्ययन समिति द्वारा की गई थी और मानव विषयों के साथ अनुसंधान की परिभाषा को पूरा नहीं करने के लिए छूट दी गई थी।

1. प्राथमिक मानव गोब्लेट सेल संस्कृति

  1. नेत्र बैंक से, मानव नेत्रश्लेष्मला ऊतकप्राप्त करें।
  2. कल्चर माध्यम, आरपीएमआई -1640 कल्चर माध्यम तैयार करें जो 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 2 एमएम ग्लूटामाइन, 2 एमएम गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (एनईएए), 2 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 100 μg / mL पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 2 mM 4-(2-हाइड्रॉक्सीथाइल)-1- पिपेराज़िनीथेनसल्फोनिक एसिड (HEPES) के साथ पूरक है।
  3. नीचे वर्णित के रूप में प्राथमिक सेल संस्कृति करें।
    1. ऊतक को एक बाँझ स्केलपेल के साथ 1 मिमी3 टुकड़ों में काट लें और एक कल्चर हुड में कल्चर प्लेटों पर बीज डालें। पूर्ण आरपीएमआई मीडिया के 1 मिलीलीटर में, 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में चार टुकड़े बोएं। यद्यपि ऊतक के टुकड़े का अभिविन्यास सेल के विकास को प्रभावित नहीं करता है, सुनिश्चित करें कि टुकड़े स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करके आउटग्रोथ सुनिश्चित करने के लिए कल्चर प्लेट का पालन करते हैं।
    2. ऊतक के टुकड़ों को इनक्यूबेटर में रखें जिसमें 37 डिग्री सेल्सियस पर 95% हवा और 5% सीओ2 हो। हर दूसरे दिन एक ही संस्कृति माध्यम को ताज़ा करें जब तक कि गोब्लेट कोशिकाएं लगभग 14 दिनों में 70% -80% कंफ्लुएंसी तक न पहुंच जाएं। बीज बोने के लगभग 72 घंटे बाद ऊतक प्लग को हटा दें।
      नोट: मानव नेत्रश्लेष्मला उपकला में मुख्य रूप से स्तरीकृत स्क्वैमस कोशिकाएं और गोब्लेट कोशिकाएं होती हैं। आरपीएमआई गोब्लेट कोशिकाओं के लिए एक चयनात्मक मीडिया है। मानव सीजीसी संस्कृति में शायद ही कभी, फाइब्रोब्लास्ट दिन 7 के आसपास बढ़ सकते हैं। संस्कृति को शुद्ध करने की विधि पिछले प्रकाशन 22 में वर्णित की गई थी।
    3. 19 में वर्णित मानक आईएफएम विधि के बाद साइटोकेराटिन (सीके)7 और हेलिक्स पोमाटिया लेक्टिन -1 (एचपीए -1)22 को लक्षित करने वाले इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (आईएफएम) का उपयोग करके जीसी संस्कृति की शुद्धता को सत्यापित करें; प्रतिनिधि परिणाम देखें.

2. मानव नेत्रश्लेष्मला गोब्लेट कोशिका मार्ग और प्रयोगात्मक तैयारी

  1. पीबीएस (पीएच = 7.4) के साथ कोशिकाओं को कुल्ला करें और 1x EDTA में 0.05% ट्रिप्सिन का उपयोग करके ट्रिप्सिनाइजेशन के साथ कोशिकाओं को अलग करें। माइक्रोस्कोप के तहत हर मिनट कोशिकाओं का निरीक्षण करें। एक बार जब कोशिकाएं नीचे से अलग हो जाती हैं, तो पूर्ण आरपीएमआई मीडिया का उपयोग करके ट्रिप्सिन को निष्क्रिय कर दें।
  2. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 150 × ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। पूर्ण आरपीएमआई संस्कृति माध्यम में सेल गोली को पुन: निलंबित करें और [सीए2 +] आई माप के लिए ग्लास-बॉटम कल्चर व्यंजनों पर फिर से बीज दें। माध्यम की कुल मात्रा 300 μL प्रति डिश है। डिश के कांच के हिस्से के केंद्र में मीडिया रखें।
  3. संस्कृति मीडिया में हार्मोन का उन्मूलन: संस्कृति माध्यम में सेक्स हार्मोन, विशेष रूप से एफबीएस शामिल हो सकते हैं। चूंकि आरपीएमआई -1640 में निहित फिनोल लाल में एस्ट्रोजेनिक गतिविधि 23,24 है, इसलिए आरपीएमआई माध्यम को फिनोल लाल-मुक्त आरपीएमआई माध्यम से बदलें और पूर्ण माध्यम तैयार करने के बाद पीएच स्ट्रिप्स का उपयोग करके पीएच को 7.45 तक समायोजित करें। पूर्ण माध्यम में निहित एचईपीईएस पीएच को अपेक्षाकृत छोटी सीमा तक बनाए रखता है।

3. [सीए 2 +] आई माप के लिए फुरा -2 / एसिटोक्सीमिथाइल (एएम) परख।

  1. नीचे वर्णित के रूप में Fura-2 / AM लोडिंग करें।
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए कांच के तल के व्यंजनों में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, परिवेश ी वातावरण, और क्रेब्स-रिंगर बाइकार्बोनेट बफर (केआरबी; जिसमें 119 एमएम एनएसीएल, 4.8 एमएम केसीएल, 1.0 एमएम सीएसीएल 2, 1.2 एमएम एमजीएसओ 4, और 25 एमएम एनएएचसीओ3) के साथ 0.5% एचईपीईएस (तालिका 1), प्लस 0.5% बीएसए, 0.5% बीएसए, 0.5% बीएसए, 0.5 एमएम फ्यूरा -2 के साथ प्रकाश से संरक्षित करें। 8 μM प्लूरोनिक एसिड F127, और 250 μM सल्फिनपायराज़ोन।
    2. उपयोग करने से पहले पीएच मीटर का उपयोग करके पीएच को 7.45 तक समायोजित करें। फुरा -2 / एएम के साथ लोड होने के बाद, कोशिकाओं को केआरबी के साथ धो लें जिसमें 250 μM सल्फिनपायराज़ोन होता है [Ca2+] i माप से तुरंत पहले।
  2. नीचे वर्णित के रूप में [Ca2+]i माप निष्पादित करें।
    1. माइक्रोस्कोप के नीचे फुरा -2 से भरी कोशिकाओं वाले व्यंजन रखें, 200x आवर्धन पर 20 कोशिकाओं और 50 कोशिकाओं के बीच एक प्रतिनिधि क्षेत्र का पता लगाएं, और सॉफ्टवेयर को इंगित करने के लिए प्रत्येक सेल के चारों ओर एक रूपरेखा खींचने के लिए फ्रीहैंड फ़ंक्शन का उपयोग करें कि पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति क्या है और क्या नहीं है।
    2. सॉफ़्टवेयर के माप से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को स्वचालित रूप से घटाने की प्रतीक्षा करें और प्रयोग प्रारंभ करें बटन पर क्लिक करें।
    3. फिर, रुचि के एगोनिस्ट में सावधानीपूर्वक पाइप िंग करने से पहले कोशिकाओं में बेसल कैल्शियम के स्तर को स्थापित करने के लिए 8 एस और 15 सेकंड के बीच प्रतीक्षा करें। एगोनिस्ट जोड़ने के बाद कम से कम 120 सेकंड के लिए मापना जारी रखें या जब तक कैल्शियम का स्तर बेसलाइन पर वापस नहीं आ जाता।
  3. नीचे वर्णित के रूप में डेटा विश्लेषण करें।
    1. उत्तेजनाओं के कार्यों का प्रतिनिधित्व करने के लिए पीक [सीए2 +] आई में परिवर्तन का उपयोग करें। माप के पहले 8-15 सेकंड से प्रत्येक कोशिका में औसत बेसल कैल्शियम स्तर की गणना करें। यदि वह संख्या 500 एनएम के बराबर या उससे ऊपर है, तो उस सेल को डेटासेट से हटा दें क्योंकि यह एपोप्टोसिस या नेक्रोसिस से गुजर रहा है।
    2. एक बार प्रत्येक सेल के बेसल स्तर की गणना हो जाने के बाद, उसी सेल के लिए अधिकतम मापा गया [सीए2 +] आई से उस राशि को घटाएं। किसी दिए गए पकवान में सभी कोशिकाओं के लिए पीक [सीए2 +] आई में परिवर्तन का औसत निकालें।
    3. स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए, प्रत्येक उत्तेजना की प्रतिक्रियाओं को डुप्लिकेट में रिकॉर्ड करें, और व्यक्तिगत मानव नमूने से एक डेटा बिंदु के रूप में डुप्लिकेट से प्राप्त पीक [सीए2 +] आई में परिवर्तन के औसत मूल्य की गणना करें। अध्ययन डिजाइन के आधार पर एक उपयुक्त डेटा विश्लेषण विधि का उपयोग करके विभिन्न समूहों से डेटा की तुलना करें।

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Representative Results

प्राथमिक संस्कृति में मानव सीजीसी लगभग 14 दिनों में 80% तक बढ़ जाता है। सेल प्रकार की पुष्टि गोब्लेट सेल मार्कर सीके 7 और एचपीए -125 (चित्रा 1) के एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग द्वारा की गई थी। भले ही माध्यम से एफबीएस को हटाने से सेक्स हार्मोन खत्म हो सकते हैं, एफबीएस की कमी संभावित रूप से सेलुलर प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकती है। हार्मोन उन्मूलन विधि को सत्यापित करने के लिए, एक कोलीनर्जिक एगोनिस्ट (कार्बाचोल, सीसीएच 1 × 10-4 एम) का उपयोग गोब्लेटकोशिकाओं के आसपास विभिन्न तंत्रिका अंत द्वारा मध्यस्थ शारीरिक गोब्लेट सेल स्राव की नकल करने के लिए उत्तेजना के रूप में किया गया था। नियंत्रण पूर्ण आरपीएमआई माध्यम से कैल्शियम में परिवर्तन के परिमाण में कोई अंतर नहीं देखा गया था, यह दर्शाता है कि इस विधि को सेल प्रतिक्रिया में लिंग-आधारित अंतर का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित फुरा -2 / एएम परख को पूर्ण आरपीएमआई + 10% एफबीएस माध्यम, उन्नत आरपीएमआई माध्यम (आरपीएमआई ने इंसुलिन की मालिकाना एकाग्रता की आपूर्ति की) के साथ 1% बीएसए के साथ पूरक और 1% बीएसए के साथ फिनोल लाल-मुक्त आरपीएमआई के साथ इलाज किए गए व्यंजनों पर प्रदर्शन किया गया था। परिणाम चार व्यक्तियों से प्राप्त किए जाते हैं। 1% बीएसए और पूर्ण आरपीएमआई माध्यम के साथ फिनोल लाल-मुक्त आरपीएमआई में इनक्यूबेट की गई कोशिकाओं की तुलना करते समय कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया। हालांकि, उन्नत आरपीएमआई मध्यम समूह की तुलना पूर्ण आरपीएमआई मध्यम समूह (चित्रा 2) से करते समय सीसीएच 1 × 10-4 एम के लिए काफी वृद्धि [सीए2 +] आई प्रतिक्रिया देखी गई। सारांश में, 1% बीएसए के साथ फिनोल लाल-मुक्त आरपीएमआई गोब्लेट कोशिकाओं की सेलुलर प्रतिक्रिया को प्रभावित नहीं करता है, यहां तक कि वर्तमान शोध सेटिंग में उन्नत आरपीएमआई माध्यम से भी बेहतर प्रदर्शन करता है।

Figure 1
चित्र 1: मानव नेत्रश्लेष्मला गोब्लेट सेल प्राथमिक संस्कृति। नेत्रश्लेष्मला गोब्लेट कोशिकाओं को कल्चर में 14 दिनों के बाद कवरलिप्स पर पारित किया गया था, और सीके 7 (लाल), और फ्लोरेसिन-संयुग्मित लेक्टिन एचपीए -1 (हरा) के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग का प्रदर्शन किया गया था। (ए) छवियों को 200x आवर्धन के तहत लिया गया था, और (B) छवियों को 630x आवर्धन के तहत लिया गया था। सीके 7 एक पेरिन्यूक्लियर फ्लोरोसेंट सिग्नल (बाएं पैनल) के रूप में प्रस्तुत करता है; एचपीए -1 एक छिद्रित पैटर्न प्रस्तुत करता है पेरिनुक्लियर (मध्य पैनल)। सीके 7 और एचपीए -1 दोनों के सकारात्मक इम्यूनोफ्लोरेसेंस सिग्नल एक गोब्लेट सेल को इंगित करता है। प्राथमिक एंटीबॉडी (सी) की अनुपस्थिति में नकारात्मक नियंत्रण इनक्यूबेशन है। स्केल सलाखों = 50 μm (A) और 8 μm (B)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: सीसीएच-प्रेरित [सीए2 +] आई प्रतिक्रिया पर विभिन्न मीडिया के प्रभाव। कोशिकाओं को 1% बीएसए के साथ फिनोल लाल-मुक्त आरपीएमआई, 10% एफबीएस के साथ आरपीएमआई मीडिया, या 1% बीएसए के साथ उन्नत आरपीएमआई के साथ 48 घंटे इनक्यूबेशन के लिए 1 × 10-4 एमसीएच को जोड़ने से पहले इनक्यूबेट किया गया था। काली पट्टी फिनोल लाल और 10% एफबीएस के साथ पूर्ण माध्यम को इंगित करती है। नारंगी पट्टी 1% बीएसए के साथ उन्नत माध्यम को इंगित करती है, और ग्रे बार फिनोल लाल के बिना आरपीएमआई और 1% बीएसए के साथ इंगित करता है। डेटा का मतलब एसईएम, एन = 4 ± है। डंनेट सुधार के साथ एक-तरफा एनोवा का उपयोग कई समूह तुलनाओं में किया गया था, पी < 0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण के रूप में सेट किया गया था। * समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर इंगित करता है। संक्षेप: सीसीएच = कार्बाचोल; [सीए2+] i = इंट्रासेल्युलर Ca2+ एकाग्रता। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

स्टॉक घटक केआरबी के 250 एमएल के लिए राशि अंतिम एकाग्रता
ग्‍लूकोज़ 0.25 ग्राम 0.1% w/v
1 M NaCl 30 एमएल 119 mM
0.5 M NaHCO3 12.5 एमएल 25 mM
1 एम 4-(2-हाइड्रॉक्सीथाइल)-1- पाइपराज़िनेथेनसल्फोनिक एसिड (एचईपीईएस) 2.5 एमएल 10 mM
1 M KCl 1.2 एमएल 4.8 mM
1 M KH2PO4 300 μL 1.2 mM
1 एम एमजीएसओ4 300 μL 1.2 mM
1 M CaCl2 250 μL 1 mM

तालिका 1: केआरबी के लिए सामग्री और सूत्र। संक्षिप्त नाम: डब्ल्यू / वी, वजन / मात्रा।

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Discussion

ओकुलर ऊतकों में सेक्स-आधारित मतभेदों की जांच करने से बीमारियों की प्रक्रियाओं को समझने में मदद मिलती है, विशेष रूप से सूखी आंख और एलर्जी नेत्रश्लेष्मलाशोथ, जो एक लिंग 4,5,6 को असमान रूप से प्रभावित करते हैं। भले ही इन अध्ययनों के लिए पशु मॉडल का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन विवो में मानव कोशिकाओं के लिए उच्चतम समानता के कारण मानव ऊतक से सीधे प्राप्त डेटा आवश्यक है। वर्तमान प्रयोगात्मक सेटिंग में उपयोग किए जाने वाले नेत्रश्लेष्मला ऊतक 70-85 वर्ष (पोस्टमेनोपॉज़ल) की आयु सीमा वाले मृत दाताओं से हैं, जिससे हार्मोनल प्रभाव को नियंत्रित करना आसान हो जाता है। यहां, हमने मानव सीजीसी में सेक्स-आधारित मतभेदों का अध्ययन करने के लिए एक लागत प्रभावी विधि प्रस्तुत की।

लगातार डेटा प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण कदम सेक्स हार्मोन के प्रभाव को खत्म करने के लिए प्रयोगों से पहले 48 घंटे के लिए एफबीएस और फिनोल लाल को हटाना है। कोशिकाओं में सेक्स हार्मोन के कार्यों को गैर-ट्रांसक्रिप्शनल और ट्रांसक्रिप्शनल प्रभावों में वर्गीकृत किया जा सकता है। गैर-ट्रांसक्रिप्शनल प्रभाव ों को कुछ सेकंड से मिनटों में जी-प्रोटीन के माध्यम से तेजी से मध्यस्थ किया जाता है, और ट्रांसक्रिप्शनल प्रभाव जिसमें कुछ जीन सक्रिय हो जाते हैं, 30 मिनट से कई घंटे27 लगते हैं; एस्ट्रोजेन-प्रेरित एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा (ईआर) का आधा जीवन 2-6 घंटे28,29 है। भले ही अन्य प्रकार के सेक्स हार्मोन-प्रेरित प्रोटीन की टर्नओवर दर शायद ही कभी रिपोर्ट की जाती है, मौजूदा अध्ययनों के परिणाम बताते हैं कि सेक्स हार्मोन-प्रेरित प्रोटीन घंटों के भीतर संश्लेषित और अवक्रमित होते हैं। इसलिए, सामान्य सेलुलर फ़ंक्शन को बनाए रखते हुए एफबीएस में निहित हार्मोन के संभावित प्रभाव को धोने के लिए 48 घंटे पर्याप्त समय है। वर्तमान विधि का उपयोग करते हुए, हमने सीजीसी30 में सेक्स हार्मोन रिसेप्टर्स और सेलुलर कार्यों की अभिव्यक्ति में सेक्स-आधारित मतभेदों की सफलतापूर्वक सूचना दी।

स्वस्थ और व्यवहार्य रहने के लिए गोब्लेट सेल संस्कृतियों के लिए एफबीएस एक आवश्यक कारक है। सामान्य गर्मी-निष्क्रिय एफबीएस को चारकोल-स्ट्रिप्ड एफबीएस के साथ बदलना संस्कृति प्रणाली में सेक्स हार्मोन को खत्म करने का एक और संभावित तरीका है। एफबीएस की लागत और जटिल संरचना लकड़ी का कोयला छीन लेने की सीमा एफबीएस की लागत और जटिल संरचना है। एफबीएस को पूरी तरह से हटाने से एफबीएस के अपरिभाषित मध्यम घटकों से संभावित असंगति भी समाप्त हो जाती है।

[Ca2+] i माप के लिए महत्वपूर्ण कदम पीएच और तापमान को स्थिर करना है। एचईपीईएस पूरक के बावजूद, हमने कमरे के तापमान पर संग्रहीत होने पर समय के साथ केआरबी बफर में पीएच का बदलाव देखा है। इस प्रकार, बफर के पीएच के पुन: समायोजन की सिफारिश एक लंबे प्रयोग के लिए की जाती है, लगभग हर 3 घंटे। वही [सीए2 +] आई विधि अन्य प्रकार की कोशिकाओं पर भी लागू होती है जैसे कि नेत्रश्लेष्मला की स्तरीकृत स्क्वैमस कोशिकाएं, संवहनी एंडोथेलियम कोशिकाएं, माइक्रोग्लियल कोशिकाएं और न्यूरॉन्स विभिन्न उत्तेजनाओं की कार्रवाई का अध्ययन करने के लिए।

कोशिका में कैल्शियम को मुक्त करने के लिए फुरा -2 के बंधन से इसकी चरम अवशोषण तरंग दैर्ध्य में 380 एनएम (अनबाउंड) से 340 एनएम (बाध्य) तक परिवर्तन होता है। हालांकि, उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य 510 एनएम पर रहता है और इन उत्सर्जनों को कैमरे द्वारा काले और सफेद छवियों के रूप में कैप्चर किया जाता है। 340 एनएम और 380 एनएम प्रकाश से उत्तेजित उत्सर्जन तीव्रता का अनुपात दर्ज किया गया है। [सीए2+] आई एकाग्रता की गणना करने के लिए 340/380 अनुपात की तुलना स्टैंड वक्र से करने के अलावा, कोई मानक वक्र बनाए बिना अनुपात के गुना परिवर्तन की रिपोर्ट भी कर सकता है, इसलिए, वास्तविक एकाग्रता के बिना। जांचकर्ता अपने उपकरण सेटअप और प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर किसी भी तरह से चुन सकते हैं।

निष्कर्ष में, सुसंस्कृत प्राथमिक नेत्रश्लेष्मला गोब्लेट कोशिकाओं का उपयोग ओकुलर सतह रोगों के सेक्स-आधारित मतभेदों का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में किया जा सकता है। किसी भी प्रयोग को करने से पहले 1% बीएसए के साथ फिनोल लाल-मुक्त आरपीएमआई माध्यम में 48 घंटे के लिए इनक्यूबेशन संस्कृति मीडिया में हार्मोन के संभावित प्रभावों को खत्म करने के लिए एक सुसंगत और लागत प्रभावी तरीका है और हार्मोन के स्तर को नियंत्रित करने के लिए बेसल माध्यम के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

काम राष्ट्रीय नेत्र संस्थान अनुदान EY019470 (डीएडी) द्वारा वित्त पोषित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% trypsin with 1x EDTA Gibco (Grand Island, NY) 25300-054
4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) BP310-500
Advanced RPMI media Gibco (Grand Island, NY) 12633020
carbachol Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) 144.86
Fetal Bovin Serum R&D (Minneapolis, MN) S11150H
Fura-2- acetoxymethyl ester  Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) F1221
Human conjunctival tissue Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) N/A
inorganic salt for KRB buffer Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) Any brand will work
L-glutamine  Lonza Group (Basel, Switzerland) 17-605F
non-essential amino acids Gibco (Grand Island, NY) 11140-050
penicillin/streptomycin Gibco (Grand Island, NY) 15140-122
phenol red-free RPMI media  Gibco (Grand Island, NY) 11835055
Pluronic acid F127 MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) P2443-250G
RPMI-1640 culture medium Gibco (Grand Island, NY) 21875034
scalpel Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) 12460451 Any sterile surgical scalpel can work
sodium pyruvate Gibco (Grand Island, NY) 11360-070
sulfinpyrazone MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) S9509-5G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Bair, J. A., Dartt, D. A., Yang, M. In Vitro Method to Study Sex-Based Differences in Conjunctival Goblet Cells. J. Vis. Exp. (197), e64456, doi:10.3791/64456 (2023).

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