Summary
Le milieu sans sérum de veau fœtal sans rouge de phénol est une meilleure option que le RPMI avancé pour éliminer les hormones exogènes sans altérer la fonction normale des cellules caliciformes conjonctivales dans l’étude des différences basées sur le sexe.
Abstract
La sécheresse oculaire est une maladie multifactorielle affectant la santé de la surface oculaire, avec une prévalence profondément plus élevée chez les femmes. La perturbation de la mucine gélifiante qui est sécrétée par les cellules caliciformes conjonctivales (CGC) sur la surface oculaire contribue à de multiples maladies de la surface oculaire. L’élimination des hormones sexuelles exogènes est essentielle pour obtenir des résultats cohérents lors de l’étude in vitro des différences entre les sexes dans les CCG. Cet article décrit une méthode permettant de minimiser la présence d’hormones exogènes dans l’étude des différences fondées sur le sexe dans les CGC tout en maintenant leur fonction physiologique. Des CGC provenant de donneurs humains post-mortem des deux sexes ont été cultivés à partir de morceaux de conjonctive dans un milieu RPMI avec 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) (appelé milieu complet) jusqu’à la confluence. Près de 48 h avant le début des expériences, les CCG ont été transférés dans un milieu RPMI sans rouge de phénol ni FBS, mais avec 1 % de BSA (appelé milieu sans rouge de phénol). La fonction cellulaire normale a été étudiée en mesurant l’augmentation de la stimulation intracellulaire [Ca2+] ([Ca2+]i) après stimulation par carbachol (Cch, 1 x 10-4 M) à l’aide de la microscopie fura 2/acétoxyméthyle (AM). Le résultat montre que les CCG ont maintenu un fonctionnement normal dans le milieu sans rouge de phénol après 48 h. Aucune différence significative dans la réponse [Ca2+]i n’a été observée entre le milieu RPMI sans rouge de phénol et le milieu complet lors de la stimulation de Cch. Par conséquent, nous recommandons d’utiliser le milieu RPMI sans phénol avec 1% de BSA pour éliminer les hormones exogènes sans altérer le fonctionnement normal des CGC dans l’étude des différences basées sur le sexe.
Introduction
Les différences fondées sur le sexe affectent de multiples processus de la surface oculaire 1,2,3. La manifestation clinique de ces différences fondées sur le sexe est la différence de prévalence de nombreuses maladies de la surface oculaire entre les hommes et les femmes, telles que la sécheresse oculaire et la conjonctivite 4,5,6. Les preuves suggèrent que les différences fondées sur le sexe proviennent de plusieurs niveaux biologiques, y compris les différents profils de gènes sur les chromosomes X et Y7 et les effets des hormones8. L’étude des bases moléculaires des différences fondées sur le sexe peut permettre de mieux comprendre la maladie et, éventuellement, d’améliorer la médecine personnalisée.
La surface oculaire comprend le film lacrymal sus-jacent, la cornée et la conjonctive. Des différences fondées sur le sexe sont observées dans plusieurs composants de la surface oculaire, y compris le film lacrymal 9,10, la cornée 11, la glande lacrymale 12,13 et les glandes de Meibomius qui sécrètent également des larmes 12. De nombreuses études mécanistiques ont étudié l’effet des hormones sexuelles sur la cornée et ses composants associés14,15 ; Cependant, on sait peu de choses sur les différences entre les sexes dans la conjonctive et ses cellules caliciformes. La conjonctive est une muqueuse qui recouvre la sclérotique et la surface interne de la paupière. L’épithélium de la conjonctive est composé de cellules squameuses stratifiées, multicouches et non kératinisées16.
Parmi les cellules pavimenteuses stratifiées de la conjonctive, il y a des cellules caliciformes (CGC) intercalées à la surface apicale de l’épithélium. Ces cellules caliciformes sont caractérisées par le grand nombre de granules sécrétoires situés au pôle apical17. Les CGC synthétisent et sécrètent la mucine gélifiante MUC5AC pour hydrater la surface oculaire et la lubrifier pendant le clignement des yeux17. La sécrétion de mucine est étroitement régulée par le [Ca 2+] intracellulaire ([Ca2+]i) et l’activation de la kinase régulée par le signal extracellulaire dépendant de Ras (ERK1/2)18. L’incapacité à sécréter de la mucine entraîne une sécheresse de la surface oculaire et des séquelles d’anomalies pathologiques. Sur une surface oculaire enflammée, cependant, une sécrétion importante de mucine stimulée par des médiateurs inflammatoires entraîne une perception d’adhérence et de démangeaisons de l’œil19. Ces conditions avec une sécrétion de mucine perturbée finiront par entraîner une détérioration de la surface oculaire.
Le rôle des cellules caliciformes en tant que principale source de mucine oculaire est reconnu depuis longtemps20, cependant, les différences fondées sur le sexe dans la régulation de la mucine dans les états physiologiques et pathologiques restent à découvrir. Un système in vitro serait utile pour surveiller la fonction des cellules caliciformes sans effet hormonal ou avec un niveau d’hormones sexuelles précisément contrôlé. Même si une lignée cellulaire épithéliale conjonctivale s’est développée21, il n’existe pas de lignée cellulaire caliciforme avec une sécrétion de mucine fonctionnelle. Par conséquent, nous avons modifié notre culture de CCG humaine primaire développée pour établir une méthode d’analyse de la différence fondée sur le sexe in vitro16, et la présenter comme ci-dessous.
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Protocol
Tous les tissus humains ont été donnés à la banque d’yeux avec le consentement éclairé préalable et l’autorisation du donneur pour utilisation dans la recherche scientifique. L’utilisation du tissu conjonctival humain a été examinée par le Massachusetts Eye and Ear Human Studies Committee et a été jugée exemptée et ne répondant pas à la définition de la recherche sur des sujets humains.
1. Culture primaire de cellules caliciformes humaines
- À partir de la banque d’yeux, prélever du tissu conjonctival humain16.
- Préparer le milieu de culture, le milieu de culture RPMI-1640 complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 2 mM de glutamine, 2 mM d’acides aminés non essentiels (NEAA), 2 mM de pyruvate de sodium, 100 μg/mL de pénicilline-streptomycine et 2 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES).
- Effectuez la culture cellulaire primaire comme décrit ci-dessous.
- Émincez le tissu en3 morceaux de 1 mm à l’aide d’un scalpel stérile et épépinez-le sur des plaques de culture dans une hotte de culture. Ensemencer quatre morceaux dans chaque puits d’une plaque à 6 puits, dans 1 mL de milieu RPMI complet. Bien que l’orientation du morceau de tissu n’ait pas d’impact sur la croissance cellulaire, assurez-vous que les morceaux adhèrent à la plaque de culture pour assurer la croissance à l’aide de la lame du scalpel.
- Placez les morceaux de tissu dans l’incubateur contenant 95 % d’air et 5 % de CO2 à 37 °C. Rafraîchir le même milieu de culture tous les deux jours jusqu’à ce que les cellules caliciformes atteignent une confluence de 70 % à 80 % en environ 14 jours. Retirez le bouchon de tissu environ 72 h après l’ensemencement.
REMARQUE : L’épithélium conjonctival humain contient principalement des cellules pavimenteuses stratifiées et des cellules caliciformes. Le RPMI est un milieu sélectif pour les cellules caliciformes. Rarement dans la culture humaine de CCG, les fibroblastes peuvent se développer vers le 7e jour. La méthode de purification de la culture a été décrite dans une publication antérieure 22. - Vérifier la pureté de la culture GC à l’aide de la microscopie à immunofluorescence (IFM) ciblant la cytokératine (CK)7 et la lectine d’Helix pomatia-1 (HPA-1)22 en suivant la méthode IFM standard décrite en19 ; Voir des résultats représentatifs.
2. Passage des cellules caliciformes conjonctivales humaines et préparation expérimentale
- Rincez les cellules avec du PBS (pH = 7,4) et détachez les cellules avec une trypsinisation en utilisant 0,05% de trypsine dans 1x EDTA. Observez les cellules toutes les minutes au microscope. Une fois que les cellules se détachent du bas, désactivez la trypsine à l’aide d’un milieu RPMI complet.
- Centrifuger les cellules à 150 × g pendant 5 min à température ambiante. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans le milieu de culture RPMI complet et réensemencer sur des boîtes de culture à fond de verre pour la mesure de [Ca2+]i . Le volume total du milieu est de 300 μL par boîte. Gardez le support au centre de la partie en verre du plat.
- Élimination des hormones dans les milieux de culture : Le milieu de culture peut contenir des hormones sexuelles, en particulier le FBS. Comme le rouge de phénol contenu dans le RPMI-1640 a une activité œstrogénique 23,24, remplacez le milieu RPMI par un milieu RPMI sans rouge de phénol et ajustez le pH à 7,45 à l’aide de bandelettes de pH après avoir préparé le milieu complet. Le HEPES contenu dans le milieu complet maintient le pH à une plage relativement faible.
3. Dosage du fura-2/acétoxyméthyle (AM) pour la mesure du [Ca2+]i
- Effectuez le chargement Fura-2/AM comme décrit ci-dessous.
- Incuber les cellules dans des boîtes à fond en verre pendant 1 h à 37 °C, atmosphère ambiante, et à l’abri de la lumière avec un tampon bicarbonate Krebs-Ringer (KRB ; contenant 119 mM de NaCl, 4,8 mM de KCl, 1,0 mM de CaCl 2, 1,2 mM de MgSO4 et 25 mM de NaHCO3) avec 0,5 % de HEPES (tableau 1), plus 0,5 % de BSA, 0,5 μM de fura-2/AM, 8 μM d’acide pluronique F127 et 250 μM de sulfinpyrazone.
- Ajustez le pH à 7,45 à l’aide d’un pH-mètre avant utilisation. Après le chargement avec fura-2/AM, laver les cellules avec du KRB contenant 250 μM de sulfinpyrazone immédiatement avant la mesure de [Ca2+]i .
- Effectuez la mesure [Ca2+]i comme décrit ci-dessous.
- Placez les boîtes contenant les cellules chargées de fura-2 sous le microscope, localisez un champ représentatif contenant entre 20 et 50 cellules à un grossissement de 200x et utilisez la fonction Main levée pour dessiner un contour autour de chaque cellule afin d’indiquer au logiciel ce qui est et ce qui n’est pas la fluorescence de fond.
- Attendez que le logiciel soustrait automatiquement la fluorescence de fond de la mesure et cliquez sur le bouton Démarrer l’expérience .
- Ensuite, attendez entre 8 s et 15 s pour établir les niveaux de calcium basal dans les cellules avant de pipeter soigneusement l’agoniste d’intérêt. Continuez à mesurer pendant au moins 120 s après l’ajout de l’agoniste ou jusqu’à ce que les taux de calcium soient revenus à la ligne de base.
- Effectuez l’analyse des données comme décrit ci-dessous.
- Utilisez le changement de crête [Ca2+]i pour représenter les actions des stimuli. Calculez le taux moyen de calcium basal dans chaque cellule à partir des 8 à 15 premières secondes de mesures. Si ce nombre est égal ou supérieur à 500 nM, supprimez cette cellule du jeu de données car elle subit une apoptose ou une nécrose.
- Une fois que le niveau basal de chaque cellule a été calculé, soustrayez cette quantité du maximum mesuré [Ca2+]i pour la même cellule. Calculez la moyenne de la variation du pic [Ca2+]I pour toutes les cellules d’une boîte donnée.
- Pour assurer la cohérence, enregistrez les réponses de chaque stimulus en double et calculez la valeur moyenne des changements de pic [Ca2+]i obtenus à partir des doublons comme un point de données de l’échantillon humain individuel. Comparez les données de différents groupes à l’aide d’une méthode d’analyse de données appropriée basée sur le plan de l’étude.
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Representative Results
Les CCG humains en culture primaire atteignent 80 % de confluence en environ 14 jours. Le type de cellule a été confirmé par coloration par immunofluorescence avec des anticorps dirigés contre les marqueurs cellulaires caliciformes CK7 et HPA-125 (Figure 1). Même si l’élimination du FBS du milieu peut éliminer les hormones sexuelles, l’absence de FBS pourrait potentiellement affecter la réponse cellulaire. Pour vérifier la méthode d’élimination hormonale, un agoniste cholinergique (carbachol, Cch 1 × 10-4 M) a été utilisé comme stimulus pour imiter la sécrétion physiologique des cellules caliciformes médiée par différentes terminaisons nerveuses entourant les cellules caliciformes26. Aucune différence dans l’ampleur du changement de calcium n’a été observée dans le milieu de contrôle complet RPMI, ce qui indique que cette méthode peut être appliquée pour étudier la différence de réponse cellulaire basée sur le sexe.
Le test Fura-2/AM décrit dans la section sur le protocole a été effectué sur des boîtes traitées avec un milieu RPMI complet + 10 % FBS, un milieu RPMI avancé (RPMI a fourni une concentration exclusive d’insuline) complétée avec 1 % de BSA, et un RPMI sans rouge de phénol avec 1 % de BSA. Les résultats sont obtenus à partir de quatre individus. Aucune différence significative n’a été trouvée en comparant les cellules incubées dans un RPMI sans rouge de phénol avec 1% de BSA et un milieu RPMI complet. Cependant, une augmentation significative de la réponse [Ca2+]i à Cch 1 × 10-4 M a été observée en comparant le groupe de milieu RPMI avancé au groupe de milieu RPMI complet (Figure 2). En résumé, le RPMI sans rouge de phénol avec 1% de BSA n’affecte pas la réponse cellulaire des cellules caliciformes, surpassant même le milieu RPMI avancé dans le cadre de recherche actuel.
Figure 1 : Culture primaire de cellules caliciformes conjonctivales humaines. Les cellules caliciformes conjonctivales ont été passées sur des lamelles après 14 jours de culture, et une coloration par immunofluorescence à l’aide d’anticorps primaires contre CK7 (rouge) et de lectine conjuguée à la fluorescéine HPA-1 (vert) a été effectuée. (A) Les images ont été prises sous un grossissement de 200x, et (B) les images ont été prises sous un grossissement de 630x. CK7 se présente sous la forme d’un signal fluorescent périnucléaire (panneau de gauche) ; HPA-1 présente un motif ponctué de manière pérénuée (panneau central). Le signal d’immunofluorescence positif de CK7 et HPA-1 indique une cellule caliciforme. Le contrôle négatif est l’incubation en l’absence de l’anticorps primaire (C). Barres d’échelle = 50 μm (A) et 8 μm (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Effets de différents milieux sur la réponse [Ca2+]i induite par Cch. Les cellules ont été incubées avec du RPMI sans rouge de phénol avec 1 % de BSA, des milieux RPMI avec 10 % de FBS ou des RPMI avancés avec 1 % de BSA pendant 48 h d’incubation avant l’ajout de 1 × 10-4 M Cch. [Ca 2+]i a été mesuré par le test Fura2 et la variation du pic [Ca2+]i a été calculée et représentée dans le graphique. La barre noire indique un milieu complet avec du rouge phénolique et 10 % de FBS. La barre orange indique un niveau moyen avancé avec 1 % de BSA, et la barre grise indique le RPMI sans phénol rouge et avec 1 % de BSA. Les données sont en moyenne ± MEB, n = 4. L’ANOVA à un facteur avec correction de Dunnett a été utilisée dans les comparaisons de plusieurs groupes, p < 0,05 a été défini comme statistiquement significatif. * indique une différence significative entre les groupes. Abréviations : Cch = carbachol ; [Ca2+] i = concentration intracellulaire de Ca2+. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Composant de stock | Quantité pour 250 mL de KRB | Concentration finale |
| Glucose | 0,25 gramme | 0,1 % p/v |
| 1 M de NaCl | 30 ml | 119 millions d’euros |
| 0,5 M NaHCO3 | 12,5 ml | 25 mM |
| 1 Acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinééthanesulfonique (HEPES) | 2,5 mL | 10 mM |
| 1 M KCl | 1,2 mL | 4,8 millimètres |
| 1 M KH2PO4 | 300 μL | 1,2 millimètre métrique |
| 1 M de MgSO4 | 300 μL | 1,2 millimètre métrique |
| 1 M CaCl2 | 250 μL | 1 mM |
Tableau 1 : Matériau et formule pour le KRB. Abréviation : w/v, poids/volume.
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Discussion
L’étude des différences entre les sexes dans les tissus oculaires aide à comprendre les processus des maladies, en particulier la sécheresse oculaire et la conjonctivite allergique, qui affectent de manière disproportionnée un sexe 4,5,6. Même si des modèles animaux peuvent être utilisés pour ces études, les données obtenues directement à partir de tissus humains sont essentielles en raison de la plus grande similitude avec les cellules humaines in vivo. Les tissus conjonctivaux utilisés dans le cadre expérimental actuel proviennent de donneurs décédés âgés de 70 à 85 ans (ménopausés), ce qui facilite le contrôle de l’effet hormonal ante mortem. Ici, nous avons présenté une méthode rentable pour étudier les différences fondées sur le sexe dans les CCG humaines.
L’étape critique pour l’acquisition de données cohérentes est l’élimination du FBS et du rouge phénolique pendant 48 heures avant les expériences visant à éliminer les effets des hormones sexuelles. Les actions des hormones sexuelles dans les cellules peuvent être classées en effets non transcriptionnels et transcriptionnels. Les effets non transcriptionnels sont rapidement médiés par les protéines G en quelques secondes à quelques minutes, et l’effet transcriptionnel dans lequel certains gènes sont activés prend de 30 min à plusieurs heures27 ; la demi-vie du récepteur alpha des œstrogènes induit par les œstrogènes (ERα) est de 2 à 6 h28,29. Même si les taux de renouvellement d’autres types de protéines induites par les hormones sexuelles sont rarement rapportés, les résultats des études existantes indiquent que les protéines induites par les hormones sexuelles sont synthétisées et dégradées en quelques heures. Par conséquent, 48 h sont suffisantes pour éliminer l’effet potentiel des hormones contenues dans le FBS tout en maintenant une fonction cellulaire normale. En utilisant la méthode actuelle, nous avons réussi à rapporter des différences basées sur le sexe dans l’expression des récepteurs hormonaux sexuels et des fonctions cellulaires dans les CGC30.
Le FBS est un facteur essentiel pour que les cultures cellulaires caliciformes restent saines et viables. Le remplacement du FBS normal inactivé par la chaleur par du FBS dénudé de charbon de bois est un autre moyen possible d’éliminer les hormones sexuelles dans le système de culture. La limite de l’utilisation du FBS dénudé au charbon de bois est le coût et la composition complexe du FBS. La suppression complète de FBS élimine également l’incohérence potentielle des composants de support non définis de FBS.
L’étape critique pour la mesure du [Ca2+]i consiste à stabiliser le pH et la température. Malgré le supplément HEPES, nous avons remarqué un changement de pH dans le tampon KRB au fil du temps lorsqu’il est stocké à température ambiante. Ainsi, un réajustement du pH du tampon est recommandé pour une expérience longue, toutes les 3 h environ. La même méthode [Ca2+]i s’applique également à d’autres types de cellules telles que les cellules pavimenteuses stratifiées de la conjonctive, les cellules de l’endothélium vasculaire, les cellules microgliales et les neurones pour étudier l’action de différents stimuli.
La liaison de Fura-2 au calcium libre dans la cellule provoque un changement de sa longueur d’onde d’absorption maximale de 380 nm (non lié) à 340 nm (lié). Cependant, la longueur d’onde d’émission reste à 510 nm et ces émissions sont capturées par la caméra sous forme d’images en noir et blanc. Le rapport entre l’intensité d’émission excitée par la lumière de 340 nm et de 380 nm est enregistré. En plus de comparer le rapport 340/380 à une courbe de peuplement pour calculer une concentration de [Ca2+]i , on peut également rapporter le changement de pli du rapport sans avoir à créer une courbe standard, donc sans concentration réelle. Les chercheurs peuvent choisir l’une ou l’autre façon en fonction de la configuration de leur équipement et de la conception expérimentale.
En conclusion, les cellules caliciformes conjonctivales primaires en culture peuvent être utilisées comme modèle pour étudier les différences entre les sexes dans les maladies de la surface oculaire. L’incubation pendant 48 h dans un milieu RPMI sans rouge de phénol avec 1 % de BSA avant d’effectuer toute expérience est une méthode cohérente et rentable pour éliminer les effets potentiels des hormones dans les milieux de culture et peut être utilisée comme milieu basal pour contrôler les niveaux d’hormones.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Les travaux sont financés par le National Eye Institute Grant EY019470 (D.A.D).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin with 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
| Advanced RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
| carbachol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
| Fetal Bovin Serum | R&D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
| Fura-2- acetoxymethyl ester | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
| Human conjunctival tissue | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
| inorganic salt for KRB buffer | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Any brand will work | |
| L-glutamine | Lonza Group (Basel, Switzerland) | 17-605F | |
| non-essential amino acids | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
| phenol red-free RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
| Pluronic acid F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
| scalpel | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | Any sterile surgical scalpel can work |
| sodium pyruvate | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
| sulfinpyrazone | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |
References
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