Summary
O meio livre de vermelho fenol/soro fetal bovino é uma opção melhor do que o RPMI avançado para eliminar hormônios exógenos sem alterar a função normal das células caliciformes da conjuntiva no estudo de diferenças baseadas no sexo.
Abstract
O olho seco é uma doença multifatorial que afeta a saúde da superfície ocular, com prevalência profundamente maior em mulheres. A ruptura da mucina formadora de gel que é secretada pelas células caliciformes conjuntivais (CGCs) na superfície ocular contribui para múltiplas doenças da superfície ocular. A eliminação de hormônios sexuais exógenos é essencial para a obtenção de resultados consistentes durante o estudo in vitro de diferenças sexuais em CGCs. Este trabalho descreve um método para minimizar a presença de hormônios exógenos no estudo de diferenças baseadas no sexo em CGCs, mantendo sua função fisiológica. CGCs de doadores humanos post-mortem de ambos os sexos foram cultivados a partir de pedaços da conjuntiva em meio RPMI com 10% de soro fetal bovino (SFB) (referido como meio completo) até a confluência. Cerca de 48 h antes do início dos experimentos, as CGCs foram transferidas para o meio RPMI sem vermelho de fenol ou SFB, mas com BSA a 1% (referido como meio livre de vermelho fenol). A função celular normal foi estudada medindo-se o aumento da [Ca 2+] ([Ca 2+]i) intracelular após estimulação com carbacol (Cch, 1 x 10-4 M) usando microscopia de fura 2/acetoximetil (AM). O resultado mostra que os CGCs mantiveram função normal no meio livre de fenol após 48 h. Nenhuma diferença significativa na resposta [Ca2+]i foi observada entre o meio RPMI livre de fenol vermelho e o meio completo após estimulação com Cch. Portanto, recomendamos o uso do meio RPMI livre de vermelho fenol com BSA a 1% para eliminar hormônios exógenos sem alterar a função normal das CGCs no estudo de diferenças baseadas no sexo.
Introduction
Diferenças baseadas no sexo afetam múltiplos processos da superfície ocular 1,2,3. A manifestação clínica dessas diferenças baseadas no sexo é a diferença na prevalência de muitas doenças da superfície ocular entre homens e mulheres, como olho seco e conjuntivite4,5,6. Evidências sugerem que as diferenças baseadas no sexo surgem de múltiplos níveis biológicos, incluindo os diferentes perfis de genes nos cromossomos X e Y7 e os efeitos dos hormônios8. Estudar a base molecular das diferenças baseadas no sexo pode fornecer uma melhor compreensão da doença e, eventualmente, melhorar a medicina personalizada.
A superfície ocular compreende o filme lacrimal sobrejacente, córnea e conjuntiva. Diferenças baseadas no sexo são observadas em múltiplos componentes da superfície ocular, incluindo o filme lacrimal 9,10, a córnea 11, a glândula lacrimal 12,13 e as glândulas meibomianas que também secretam lágrimas 12. Numerosos estudos mecanísticos têm investigado o efeito dos hormônios sexuais sobre a córnea e seus componentes associados14,15; no entanto, pouco se sabe sobre as diferenças baseadas no sexo na conjuntiva e suas células caliciformes. A conjuntiva é uma membrana mucosa que cobre a esclera e a superfície interna da pálpebra. O epitélio da conjuntiva é composto por células escamosas estratificadas, não queratinizantes, multicamadas16.
Dentre as células escamosas estratificadas da conjuntiva, encontram-se as células caliciformes (CGCs) intercaladas na superfície apical do epitélio. Essas células caliciformes caracterizam-se pelo grande número de grânulos secretores localizados no polo apical17. Os CGCs sintetizam e secretam a mucina formadora de gel MUC5AC para hidratar a superfície ocular e lubrificá-la durante o piscar17. A secreção de mucina é fortemente regulada pela [Ca 2+] intracelular ([Ca2+]i) e pela ativação da quinase regulada por sinal extracelular dependente de Ras (ERK1/2)18. A incapacidade de secretar mucina resulta em ressecamento da superfície ocular e sequelas de anormalidades patológicas. Em uma superfície ocular inflamada, entretanto, a extensa secreção de mucina estimulada por mediadores inflamatórios leva à percepção de aderência e coceira ocular19. Essas condições com secreção perturbada de mucina acabarão levando à deterioração da superfície ocular.
O papel das células caliciformes como a principal fonte de mucina ocular tem sido reconhecidohá muito tempo20, no entanto, as diferenças baseadas no sexo na regulação da mucina em ambos os estados fisiológicos e patológicos permanecem desconhecidas. Um sistema in vitro seria útil para monitorar a função das células caliciformes sem o efeito hormonal ou com um nível precisamente controlado de hormônios sexuais. Embora uma linhagem celular epitelial conjuntival tenha se desenvolvido21, não há linhagem de células caliciformes com secreção funcional de mucina disponível. Portanto, modificamos nossa cultura primária de CGC humana desenvolvida para estabelecer um método para analisar a diferença baseada em sexo in vitro16, e apresentá-la como abaixo.
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Protocol
Todo tecido humano foi doado ao banco de olhos com consentimento prévio informado e autorização do doador para uso em pesquisas científicas. O uso do tecido conjuntival humano foi revisado pelo Massachusetts Eye and Ear Human Studies Committee e determinado como isento e não atendendo à definição de pesquisa com seres humanos.
1. Cultura primária de células caliciformes humanas
- Do banco de olhos, obtém-se tecido conjuntival humano16.
- Preparar o meio de cultura, meio de cultura RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB), 2 mM de glutamina, 2 mM de aminoácidos não essenciais (NEAA), 2 mM de piruvato de sódio, 100 μg/mL de penicilina-estreptomicina e 2 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES).
- Realizar cultura de células primárias conforme descrito abaixo.
- Pique o tecido em pedaços de 1 mm 3 com bisturi estéril e semente em placas de cultura em uma capelade cultura. Semeando quatro pedaços em cada poço de uma placa de 6 poços, em 1 mL de meio RPMI completo. Embora a orientação da peça de tecido não afete o crescimento celular, certifique-se de que as peças aderem à placa de cultura para garantir o crescimento usando a lâmina de bisturi.
- Colocar os pedaços de tecido na incubadora contendo 95% de ar e 5% de CO2 a 37 °C. Atualizar o mesmo meio de cultura a cada dois dias até que as células caliciformes atinjam 70%-80% de confluência em aproximadamente 14 dias. Remova o tampão de tecido aproximadamente 72 h após a semeadura.
NOTA: O epitélio conjuntival humano contém principalmente células escamosas estratificadas e células caliciformes. RPMI é um meio seletivo para células caliciformes. Raramente em cultura de CGC humano, os fibroblastos podem crescer por volta do 7º dia. O método de purificação da cultura foi descrito em publicação anterior 22. - Verificar a pureza da cultura de GC usando microscopia de imunofluorescência (IFM) visando citoqueratina (CK)7 e lectina-1 de Helix pomatia (HPA-1)22 seguindo o método padrão de IFM descrito em19; veja resultados representativos.
2. Passagem das células caliciformes da conjuntiva humana e preparação experimental
- Enxaguar as células com PBS (pH = 7,4) e desprender as células com tripsinização usando tripsina 0,05% em EDTA 1x. Observe as células a cada minuto sob um microscópio. Uma vez que as células se desprendem do fundo, desative a tripsina usando mídia RPMI completa.
- Centrifugar as células a 150 × g durante 5 minutos à temperatura ambiente. Ressuspenda o pellet de células no meio de cultura RPMI completo e resemeie em placas de cultura com fundo de vidro para medição de [Ca2+]i . O volume total do meio é de 300 μL por prato. Mantenha a mídia no centro da parte de vidro do prato.
- Eliminação de hormônios em meios de cultura: O meio de cultura pode conter hormônios sexuais, especialmente o SFB. Como o vermelho de fenol contido no RPMI-1640 tem atividade estrogênica 23,24, substitua o meio RPMI pelo meio RPMI livre de vermelho fenol e ajuste o pH para 7,45 usando tiras de pH após o preparo do meio completo. O HEPES contido no meio completo mantém o pH em uma faixa relativamente pequena.
3. Ensaio de fura-2/acetoximetil (AM) para medição de [Ca2+]i
- Execute o carregamento do Fura-2/AM conforme descrito abaixo.
- Incubar as células em placas com fundo de vidro por 1 h a 37 °C, atmosfera ambiente, e protegidas da luz com tampão de bicarbonato Krebs-Ringer (KRB; contendo 119 mM de NaCl, 4,8 mM de KCl, 1,0 mM de CaCl 2, 1,2 mM de MgSO4 e 25 mM de NaHCO3) com 0,5% de HEPES (Tabela 1), mais 0,5% de BSA, 0,5 μM de fura-2/AM, ácido plurônico F127 de 8 μM e sulfinpirazona de 250 μM.
- Ajuste o pH para 7,45 usando um medidor de pH antes de usar. Após o carregamento com fura-2/AM, lavar as células com KRB contendo 250 μM de sulfinpirazona imediatamente antes da medição de [Ca2+]i .
- Execute a medição de [Ca2+]i conforme descrito abaixo.
- Coloque as placas contendo as células carregadas com fura-2 sob o microscópio, localize um campo representativo contendo entre 20 células e 50 células em aumento de 200x e use a função Freehand para desenhar um contorno ao redor de cada célula para indicar ao software o que é e o que não é fluorescência de fundo.
- Aguarde até que o software subtraia automaticamente a fluorescência de fundo da medição e clique no botão Iniciar experimento .
- Em seguida, aguardar entre 8 s e 15 s para estabelecer os níveis basais de cálcio nas células antes de pipetar cuidadosamente no agonista de interesse. Continue a medir por pelo menos 120 s após a adição do agonista ou até que os níveis de cálcio tenham retornado à linha de base.
- Execute a análise de dados conforme descrito abaixo.
- Use a mudança no pico [Ca2+]i para representar as ações dos estímulos. Calcular o nível médio de cálcio basal em cada célula a partir dos primeiros 8-15 s de medidas. Se esse número for igual ou superior a 500 nM, remova essa célula do conjunto de dados, pois ela está passando por apoptose ou necrose.
- Uma vez calculado o nível basal de cada célula, subtraia essa quantidade do máximo medido [Ca2+]i para a mesma célula. Média da variação no pico [Ca2+]I para todas as células de um determinado prato.
- Para garantir a consistência, registre as respostas de cada estímulo em duplicata e calcule o valor médio das mudanças no pico [Ca2+]i obtidas das duplicatas como um ponto de dados da amostra humana individual. Comparar os dados de diferentes grupos usando um método apropriado de análise de dados baseado no desenho do estudo.
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Representative Results
Os CGCs humanos em cultura primária crescem até 80% de confluência em aproximadamente 14 dias. O tipo celular foi confirmado pela coloração por imunofluorescência com anticorpos contra os marcadores caliciformes CK7 e HPA-125 (Figura 1). Embora a remoção de FBS do meio possa eliminar os hormônios sexuais, a falta de FBS poderia potencialmente afetar a resposta celular. Para verificar o método de eliminação hormonal, um agonista colinérgico (carbachol, Cch 1 × 10-4 M) foi utilizado como estímulo para mimetizar a secreção fisiológica das células caliciformes mediada por diferentes terminações nervosas ao redor das células caliciformes26. Nenhuma diferença na magnitude da mudança no cálcio foi observada a partir do meio RPMI completo controle, indicando que este método pode ser aplicado para estudar a diferença baseada no sexo na resposta celular.
O ensaio de Fura-2/AM descrito na seção de protocolo foi realizado em placas tratadas com RPMI completo + meio FBS 10%, meio RPMI avançado (RPMI forneceu uma concentração proprietária de insulina) suplementado com BSA 1% e RPMI livre de fenol vermelho com BSA 1%. Os resultados são obtidos de quatro indivíduos. Nenhuma diferença significativa foi encontrada quando comparadas as células incubadas em RPMI livre de vermelho fenol com BSA 1% e meio RPMI completo. No entanto, uma resposta significativamente aumentada de [Ca2+]i para Cch 1 × 10-4 M foi observada ao comparar o grupo médio RPMI avançado com o grupo médio RPMI completo (Figura 2). Em resumo, o RPMI livre de vermelho fenólico com BSA a 1% não afeta a resposta celular das células caliciformes, mesmo superando o meio RPMI avançado no cenário atual de pesquisa.
Figura 1: Cultura primária de células caliciformes humanas. As células caliciformes conjuntivais foram passadas para as lamínulas após 14 dias em cultura, e a coloração por imunofluorescência usando anticorpo primário contra CK7 (vermelho) e lectina conjugada com fluoresceína HPA-1 (verde) foi realizada. (A) As imagens foram obtidas em aumento de 200x e (B) as imagens foram realizadas em aumento de 630x. A CK7 apresenta-se como um sinal fluorescente perinuclear (painel esquerdo); HPA-1 apresenta um padrão pontuado perinuclearmente (painel médio). O sinal de imunofluorescência positivo da CK7 e HPA-1 indica uma célula caliciforme. O controle negativo é a incubação na ausência do anticorpo primário (C). Barras de escala = 50 μm (A) e 8 μm (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Efeitos de diferentes meios na resposta [Ca2+]i induzida por Cch. As células foram incubadas com RPMI livre de vermelho fenol com BSA 1%, meio RPMI com 10% FBS ou RPMI avançado com BSA 1% por 48 h de incubação antes da adição de 1 × 10-4 M Cch. [Ca 2+]i foi medido pelo ensaio de Fura2 e a mudança no pico [Ca2+]i foi calculada e mostrada no gráfico. A barra preta indica meio completo com vermelho fenol e 10% de SFB. A barra laranja indica meio avançado com 1% de BSA, e a barra cinza indica RPMI sem vermelho fenol e com 1% de BSA. Os dados são médios ± EPM, n = 4. A ANOVA one-way com correção de Dunnett foi utilizada nas comparações entre os grupos, sendo considerado estatisticamente significante p < 0,05. * indica diferença significativa entre os grupos. Abreviações: Cch = carbachol; [Ca2+] i = concentração intracelular de Ca2+. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Componente de estoque | Quantidade para 250 mL de KRB | Concentração Final |
| Glicose | 0,25 gr | 0,1% p/v |
| NaCl de 1 M | 30 mL | 119 mM |
| 0,5 M NaHCO3 | 12,5 mL | 25 mM |
| 1 M ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico (HEPES) | 2,5 mL | 10 mM |
| 1 M KCl | 1,2 mL | 4,8 mM |
| 1 M KH2PO4 | 300 μL | 1,2 mM |
| 1 M MgSO4 | 300 μL | 1,2 mM |
| 1 M CaCl2 | 250 μL | 1 mM |
Tabela 1: Material e fórmula para KRB. Abreviação: p/v, peso/volume.
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Discussion
A investigação das diferenças sexuais nos tecidos oculares ajuda a compreender os processos das doenças, especialmente o olho seco e a conjuntivite alérgica, que afetam desproporcionalmente um sexo 4,5,6. Embora modelos animais possam ser utilizados para esses estudos, dados obtidos diretamente do tecido humano são essenciais devido à maior similaridade com as células humanas in vivo. Os tecidos conjuntivais utilizados no cenário experimental atual são de doadores falecidos com faixa etária de 70 a 85 anos (pós-menopausa), facilitando o controle do efeito hormonal ante mortem. Aqui, apresentamos um método custo-eficiente para estudar diferenças baseadas no sexo em CGCs humanos.
A etapa crítica para a obtenção de dados consistentes é a remoção de FBS e vermelho de fenol por 48 h antes de experimentos para eliminar os efeitos dos hormônios sexuais. As ações dos hormônios sexuais nas células podem ser categorizadas em efeitos não transcricionais e transcricionais. Os efeitos não transcricionais são rapidamente mediados pelas proteínas-G em poucos segundos a minutos, e o efeito transcricional no qual certos genes são ativados leva de 30 min a várias horas27; a meia-vida do receptor de estrogênio induzido pelo estrógeno alfa (REα) é de 2-6 h28,29. Embora as taxas de turnover de outros tipos de proteínas induzidas por hormônios sexuais sejam raramente relatadas, os resultados dos estudos existentes indicam que as proteínas induzidas por hormônios sexuais são sintetizadas e degradadas em poucas horas. Portanto, 48 h é tempo suficiente para lavar o efeito potencial dos hormônios contidos no FBS, mantendo a função celular normal. Usando o método atual, relatamos com sucesso diferenças baseadas no sexo na expressão de receptores de hormônios sexuais e funções celulares emCGCs 30.
A SFB é um fator essencial para que as culturas de células caliciformes permaneçam saudáveis e viáveis. Substituir o FBS normal inativado pelo calor por FBS despojado de carvão é outra maneira possível de eliminar hormônios sexuais no sistema de cultura. A limitação do uso de FBS descascado de carvão vegetal é o custo e a composição complexa do FBS. A remoção completa do FBS também elimina a potencial inconsistência dos componentes de meio indefinidos do FBS.
O passo crítico para a medição de [Ca2+]i é estabilizar o pH e a temperatura. Apesar do suplemento HEPES, notamos uma mudança de pH no tampão KRB ao longo do tempo quando armazenado à temperatura ambiente. Assim, recomenda-se um reajuste do pH do tampão para um longo experimento, aproximadamente a cada 3 h. O mesmo método [Ca2+]i também se aplica a outros tipos de células, como células escamosas estratificadas da conjuntiva, células do endotélio vascular, células da microglia e neurônios para estudar a ação de diferentes estímulos.
A ligação do Fura-2 ao cálcio livre na célula causa uma mudança no seu comprimento de onda de pico de absorção de 380 nm (não ligado) para 340 nm (ligado). No entanto, o comprimento de onda de emissão permanece em 510 nm e essas emissões são capturadas pela câmera como imagens em preto e branco. A razão entre a intensidade de emissão excitada por 340 nm e 380 nm de luz é registrada. Além de comparar a razão 340/380 com uma curva stand para calcular uma concentração de [Ca2+]i , pode-se também relatar a mudança de dobra da razão sem ter que criar uma curva padrão, portanto, sem uma concentração real. Os pesquisadores podem escolher qualquer um dos caminhos com base na configuração do equipamento e no desenho experimental.
Em conclusão, células caliciformes primárias da conjuntiva cultivadas podem ser usadas como modelo para estudar as diferenças baseadas no sexo das doenças da superfície ocular. A incubação por 48 h em meio RPMI livre de fenol vermelho com BSA 1% antes da realização de qualquer experimento é um método consistente e econômico para eliminar os efeitos potenciais dos hormônios em meios de cultura e pode ser usado como meio basal para controlar os níveis hormonais.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse.
Acknowledgments
O trabalho é financiado pelo National Eye Institute Grant EY019470 (D.A.D).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin with 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
| Advanced RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
| carbachol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
| Fetal Bovin Serum | R&D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
| Fura-2- acetoxymethyl ester | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
| Human conjunctival tissue | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
| inorganic salt for KRB buffer | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Any brand will work | |
| L-glutamine | Lonza Group (Basel, Switzerland) | 17-605F | |
| non-essential amino acids | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
| phenol red-free RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
| Pluronic acid F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
| scalpel | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | Any sterile surgical scalpel can work |
| sodium pyruvate | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
| sulfinpyrazone | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |
References
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