Summary
Fenolrött/fetalt bovint serumfritt medium är ett bättre alternativ än avancerad RPMI för att eliminera exogena hormoner utan att förändra den normala funktionen hos konjunktival bägarceller i studien av könsbaserade skillnader.
Abstract
Torra ögon är en multifaktoriell sjukdom som påverkar ögonytans hälsa, med en mycket högre prevalens hos kvinnor. Störning av det gelbildande mucinet som utsöndras av konjunktival bägarceller (CGC) på ögonytan bidrar till flera sjukdomar på ögats yta. Eliminering av exogena könshormoner är avgörande för att uppnå konsekventa resultat under in vitro-studier av könsbaserade skillnader i CGC. Denna artikel beskriver en metod för att minimera förekomsten av exogena hormoner i studiet av könsbaserade skillnader i CGC samtidigt som deras fysiologiska funktion bibehålls. CGC från postmortem mänskliga donatorer av båda könen odlades från bitar av bindhinnan i RPMI-medium med 10 % fetalt bovint serum (FBS) (kallat det kompletta mediet) fram till sammanflöde. Nästan 48 timmar före experimentens start överfördes CGC:er till RPMI-medium utan fenolrött eller FBS men med 1 % BSA (kallat fenol-rödfritt medium). Den normala cellulära funktionen studerades genom att mäta ökningen av intracellulär [Ca 2+] ([Ca2+]i) efter karbakolstimulering (Cch, 1 x 10-4 M) med hjälp av fura 2/acetoximetyl (AM) mikroskopi. Resultatet visar att CGC bibehöll normal funktion i det fenol-röd-fria mediet efter 48 timmar. Ingen signifikant skillnad i [Ca2+]i-svar observerades mellan fenol-rödfritt RPMI-medium och komplett medium vid Cch-stimulering. Därför rekommenderar vi att du använder det fenolrödfria RPMI-mediet med 1 % BSA för att eliminera exogena hormoner utan att förändra CGC:s normala funktion i studien av könsbaserade skillnader.
Introduction
Könsbaserade skillnader påverkar flera processer på ögonytan 1,2,3. Den kliniska manifestationen av dessa könsbaserade skillnader är skillnaden i prevalens av många ögonytesjukdomar mellan män och kvinnor, såsom torra ögon och konjunktivit 4,5,6. Det finns belägg för att könsbaserade skillnader beror på flera biologiska nivåer, bland annat genernas olika profiler på X- och Y-kromosomerna7 och hormonernas effekter8. Att studera den molekylära grunden för könsbaserade skillnader kan ge en bättre förståelse för sjukdomar och så småningom förbättra personlig medicin.
Den okulära ytan består av den överliggande tårfilmen, hornhinnan och bindhinnan. Könsbaserade skillnader observeras i flera komponenter i ögonytan, inklusive tårfilmen 9,10, hornhinnan 11, tårkörteln 12,13 och meibomska körtlar som också utsöndrar tårar 12. Många mekanistiska studier har undersökt effekten av könshormoner på hornhinnan och dess associerade komponenter14,15; Det finns dock inte mycket kunskap om de könsbaserade skillnaderna i bindhinnan och dess bägarceller. Bindhinnan är en slemhinna som täcker sklera och ögonlockets inre yta. Bindhinnans epitel består av icke-keratiniserande, flerskiktade, stratifierade skivepitelceller16.
Bland de stratifierade skivepitelcellerna i bindhinnan finns det bägarceller (CGC) insprängda på epitelets apikala yta. Dessa bägarceller kännetecknas av det stora antalet sekretoriska granuler som ligger vid den apikala polen17. CGC syntetiserar och utsöndrar det gelbildande mucinet MUC5AC för att återfukta ögonytan och smörja den under blinkning17. Mucinsekretionen regleras noggrant av det intracellulära [Ca 2+] ([Ca2+]i) och aktiveringen av det Ras-beroende extracellulära signalreglerade kinaset (ERK1/2)18. Oförmåga att utsöndra mucin resulterar i torrhet på ögonytan och följdsjukdomar av patologiska avvikelser. På en inflammerad okulär yta leder dock omfattande mucinutsöndring stimulerad av inflammatoriska mediatorer till en upplevelse av klibbighet och klåda i ögat19. Dessa tillstånd med störd mucinutsöndring kommer så småningom att leda till försämring av ögonytan.
Bägarcellernas roll som den viktigaste källan till okulärt mucin har länge varit erkänd20, men de könsbaserade skillnaderna i mucinreglering i både fysiologiska och patologiska tillstånd är fortfarande oupptäckta. Ett in vitro-system skulle vara användbart för att övervaka bägarcellernas funktion utan hormonell effekt eller med en exakt kontrollerad nivå av könshormoner. Även om en konjunktival epitelcellinje har utvecklats21, finns det ingen bägarcellinje med funktionell mucinsekretion tillgänglig. Därför modifierade vi vår utvecklade primära humana CGC-kultur för att etablera en metod för att analysera den könsbaserade skillnaden in vitro16 och presentera den enligt nedan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All mänsklig vävnad donerades till ögonbanken med förhandsgodkännande och tillstånd från donatorn för användning i vetenskaplig forskning. Användning av mänsklig bindhinnevävnad granskades av Massachusetts Eye and Ear Human Studies Committee och bestämdes vara undantagen och inte uppfylla definitionen av forskning med mänskliga försökspersoner.
1. Primär human bägarcellodling
- Från ögonbanken, erhåll mänsklig konjunktival vävnad16.
- Bered odlingsmediet, RPMI-1640 odlingsmedium kompletterat med 10 % fetalt bovint serum (FBS), 2 mM glutamin, 2 mM icke-essentiella aminosyror (NEAA), 2 mM natriumpyruvat, 100 μg/ml penicillin-streptomycin och 2 mM 4-(2-hydroxietyl)-1-piperazinetansulfonsyra (HEPES).
- Utför primär cellodling enligt beskrivningen nedan.
- Finhacka vävnaden i 1 mm3 bitar med en steril skalpell och fröa ur den på odlingsplattor i en odlingshuva. Sådd fyra bitar i varje brunn på en 6-hålsplatta, i 1 ml komplett RPMI-media. Även om orienteringen av vävnadsbiten inte påverkar celltillväxten, se till att bitarna fäster vid odlingsplattan för att säkerställa utväxt med skalpellbladet.
- Placera vävnadsbitarna i inkubatorn som innehåller 95 % luft och 5 % CO2 vid 37 °C. Uppdatera samma odlingsmedium varannan dag tills bägarcellerna når 70%-80% sammanflöde på cirka 14 dagar. Ta bort vävnadspluggen cirka 72 timmar efter sådd.
OBS: Humant konjunktivalepitel innehåller huvudsakligen stratifierade skivepitelceller och bägarceller. RPMI är ett selektivt medium för bägarceller. I sällsynta fall i human CGC-kultur kan fibroblaster växa runt dag 7. Metoden för att rena grödan beskrevs i en tidigare publikation 22. - Kontrollera GC-kulturens renhet med hjälp av immunofluorescensmikroskopi (IFM) riktad mot cytokeratin (CK)7 och Helix pomatia lectin-1 (HPA-1)22 enligt den IFM-standardmetod som beskrivs ipunkt 19. Se representativa resultat.
2. Passage av bindhinnebägarceller och experimentell förberedelse
- Skölj cellerna med PBS (pH = 7,4) och lossa cellerna med trypsinisering med 0,05 % trypsin i 1x EDTA. Observera cellerna varje minut under ett mikroskop. När cellerna lossnar från botten, inaktivera trypsinet med hjälp av kompletta RPMI-medier.
- Centrifugera cellerna vid 150 × g i 5 minuter vid rumstemperatur. Återsuspendera cellpelleten i det kompletta RPMI-odlingsmediet och åter på glasbottnade odlingsskålar för [Ca2+]i-mätning . Mediets totala volym är 300 μL per maträtt. Håll mediet i mitten av skålens glasdel.
- Eliminering av hormoner i odlingsmedia: Odlingsmediet kan innehålla könshormoner, särskilt FBS. Eftersom fenolrött i RPMI-1640 har östrogen aktivitet 23,24, byt ut RPMI-mediet mot fenolrött RPMI-medium och justera pH till 7.45 med pH-remsor efter beredning av hela mediet. HEPES som finns i det kompletta mediet håller pH-värdet till ett relativt litet intervall.
3. Fura-2/acetoximetyl (AM)-analys för [Ca2+]i-mätning
- Utför Fura-2/AM-laddning enligt beskrivningen nedan.
- Inkubera cellerna i glasbottnar i 1 timme vid 37 °C, omgivande atmosfär och skyddad från ljus med Krebs-Ringer bikarbonatbuffert (KRB; innehållande 119 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1,0 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO4 och 25 mM NaHCO3) med 0,5 % HEPES (tabell 1), plus 0,5 % BSA, 0,5 μM fura-2/AM, 8 μM pluronsyra F127 och 250 μM sulfinpyrazon.
- Justera pH-värdet till 7.45 med en pH-mätare före användning. Efter laddning med fura-2/AM, tvätta cellerna med KRB innehållande 250 μM sulfinpyrazon omedelbart före [Ca2+]i-mätningen .
- Utför [Ca2+]i-mätning enligt beskrivningen nedan.
- Placera skålarna som innehåller cellerna laddade med fura-2 under mikroskopet, leta reda på ett representativt fält som innehåller mellan 20 celler och 50 celler vid 200x förstoring och använd Freehand-funktionen för att rita en kontur runt varje cell för att indikera för programvaran vad som är och vad som inte är bakgrundsfluorescens.
- Vänta tills programvaran automatiskt subtraherar bakgrundsfluorescens från mätningen och klicka på knappen Starta experiment .
- Vänta sedan mellan 8 s och 15 s för att fastställa de basala kalciumnivåerna i cellerna innan du försiktigt pipetterar in den aktuella agonisten. Fortsätt att mäta i minst 120 sekunder efter tillsats av agonisten eller tills kalciumnivåerna har återgått till baslinjen.
- Utför dataanalys enligt beskrivningen nedan.
- Använd förändringen i topp [Ca2+]i för att representera stimulins handlingar. Beräkna den genomsnittliga basala kalciumnivån i varje cell från de första 8-15 s av mätningarna. Om det talet är lika med eller över 500 nM tar du bort cellen från datauppsättningen eftersom den genomgår apoptos eller nekros.
- När basnivån för varje cell har beräknats, subtrahera den mängden från det maximala uppmätta [Ca2+]i för samma cell. Medelvärdet av förändringen i topp [Ca2+]I för alla celler i en given maträtt.
- För att säkerställa konsekvens, registrera responsen från varje stimulus i duplikat och beräkna medelvärdet av förändringarna i topp [Ca2+]i som erhålls från dubbletterna som en datapunkt från det enskilda mänskliga provet. Jämföra data från olika grupper med hjälp av en lämplig dataanalysmetod baserad på studiedesignen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Humana CGC:er i primärodling växer till 80 % sammanflöde på cirka 14 dagar. Celltypen bekräftades genom immunofluorescensfärgning med antikroppar mot bägarcellmarkörerna CK7 och HPA-125 (Figur 1). Även om avlägsnandet av FBS från mediet kan eliminera könshormonerna, kan bristen på FBS potentiellt påverka det cellulära svaret. För att verifiera hormonelimineringsmetoden användes en kolinerg agonist (karbachol, Cch 1 × 10-4 M) som stimulus för att efterlikna den fysiologiska bägarcellssekretionen medierad av olika nervändar som omger bägarcellerna26. Ingen skillnad i storleken på förändringen i kalcium observerades från kontrollens kompletta RPMI-medium, vilket tyder på att denna metod kan användas för att studera den könsbaserade skillnaden i cellsvar.
Fura-2/AM-analysen som beskrivs i protokollavsnittet utfördes på rätter som behandlats med komplett RPMI + 10 % FBS-medium, avancerat RPMI-medium (RPMI levererade en proprietär koncentration av insulin) kompletterat med 1 % BSA och fenol-rödfri RPMI med 1 % BSA. Resultaten kommer från fyra personer. Ingen signifikant skillnad hittades vid jämförelse av cellerna inkuberade i fenolrödfri RPMI med 1% BSA och komplett RPMI-medium. En signifikant ökad [Ca2+]i-respons på Cch 1 × 10-4 M observerades dock vid jämförelse mellan den avancerade RPMI-mediumgruppen och den kompletta RPMI-mediumgruppen (Figur 2). Sammanfattningsvis påverkar fenol-rödfri RPMI med 1 % BSA inte det cellulära svaret hos bägarceller, till och med bättre än det avancerade RPMI-mediet i den nuvarande forskningsmiljön.
Figur 1: Primär odling av humana bindhinnebägarceller. De konjunktivala bägarcellerna passerade på täckglas efter 14 dagar i odling, och immunofluorescensfärgning med primär antikropp mot CK7 (röd) och fluoresceinkonjugerat lektin HPA-1 (grönt) utfördes. (A) Bilderna togs med 200x förstoring och (B) bilderna togs med 630x förstoring. CK7 presenteras som en perinukleär fluorescerande signal (vänster panel); HPA-1 uppvisar ett punktionsmönster perinutydligt (mittpanelen). Positiv immunofluorescenssignal för både CK7 och HPA-1 indikerar en bägarcell. Negativ kontroll är inkubation i frånvaro av den primära antikroppen (C). Skalstreck = 50 μm (A) och 8 μm (B). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Effekter av olika medier på Cch-inducerad [Ca2+]i-respons. Cellerna inkuberades med fenol-rödfri RPMI med 1 % BSA, RPMI-media med 10 % FBS eller avancerad RPMI med 1 % BSA under 48 timmars inkubation innan 1 × 10-4 M Cch tillsattes. [Ca 2+]i mättes med Fura2-analys och förändringen i topp [Ca 2+]i beräknades och visades i grafen. Den svarta stapeln indikerar komplett medium med fenolrött och 10 % FBS. Den orange stapeln indikerar avancerat medium med 1 % BSA, och den grå stapeln indikerar RPMI utan fenolrött och med 1 % BSA. Data är medelvärde ± SEM, n = 4. Envägs ANOVA med Dunnett-korrigering användes i multipla gruppjämförelser, p < 0,05 sattes som statistiskt signifikant. * indikerar signifikant skillnad mellan grupperna. Förkortningar: Cch = karbachol; [Ca2+] i = intracellulär Ca2+ koncentration. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Lagerkomponent | Mängd för 250 ml KRB | Slutlig koncentration |
| Glukos | 0,25 gr | 0.1% w/v |
| 1 M NaCl | 30 ml | 119 mM |
| 0,5 M NaHCO3 | 12,5 ml | 25 mM |
| 1 M 4-(2-hydroxietyl)-1--piperazinetansulfonsyra (HEPES) | 2,5 ml | 10 mM |
| 1 M KCl | 1,2 ml | 4,8 mM |
| 1 M KH2PO4 | 300 μL | 1,2 mM |
| 1 M MgSO4 | 300 μL | 1,2 mM |
| 1 M CaCl2 | 250 μL | 1 mM |
Tabell 1: Material och formel för KRB. Förkortning: w/v, vikt/volym.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Att undersöka könsbaserade skillnader i ögonvävnader hjälper till att förstå processerna för sjukdomar, särskilt torra ögon och allergisk konjunktivit, som oproportionerligt drabbar det ena könet 4,5,6. Även om djurmodeller kan användas för dessa studier är data som erhålls direkt från mänsklig vävnad viktiga på grund av den högsta likheten med de mänskliga cellerna in vivo. De konjunktivalvävnader som används i den aktuella experimentmiljön kommer från avlidna donatorer med ett åldersintervall på 70-85 år (postmenopausal), vilket gör det lättare att kontrollera den hormonella effekten före döden. Här presenterade vi en kostnadseffektiv metod för att studera könsbaserade skillnader i CGC hos människa.
Det kritiska steget för att få konsekventa data är att ta bort FBS och fenolrött i 48 timmar före experiment för att eliminera effekterna av könshormoner. Könshormonernas verkan i cellerna kan kategoriseras i icke-transkriptionella och transkriptionella effekter. De icke-transkriptionella effekterna medieras snabbt genom G-proteiner på några sekunder till minuter, och transkriptionseffekten där vissa gener aktiveras tar 30 minuter till flera timmar27; halveringstiden för östrogeninducerad östrogenreceptor alfa (ERα) är 2-6 h28,29. Även om omsättningshastigheten för andra typer av könshormoninducerade proteiner sällan rapporteras, tyder resultat från de befintliga studierna på att könshormoninducerade proteiner syntetiseras och bryts ned inom några timmar. Därför är 48 timmar tillräckligt med tid för att tvätta bort den potentiella effekten av hormoner som finns i FBS samtidigt som normal cellulär funktion bibehålls. Med hjälp av den aktuella metoden har vi framgångsrikt rapporterat könsbaserade skillnader i uttrycket av könshormonreceptorer och cellulära funktioner i CGC30.
FBS är en viktig faktor för att bägarcellkulturer ska förbli friska och livskraftiga. Att ersätta den normala värmeinaktiverade FBS med kolstrippad FBS är ett annat möjligt sätt att eliminera könshormoner i odlingssystemet. Begränsningen med att använda träkolsstrippad FBS är kostnaden och den komplexa sammansättningen av FBS. Att helt ta bort FBS eliminerar också den potentiella inkonsekvensen från de odefinierade mediekomponenterna i FBS.
Det kritiska steget för [Ca2+]i-mätning är att stabilisera pH och temperatur. Trots HEPES-tillskottet har vi märkt en förskjutning av pH i KRB-bufferten över tid när den förvaras i rumstemperatur. Således rekommenderas en justering av buffertens pH för ett långt experiment, ungefär var 3:e timme. Samma [Ca2+]i-metod gäller även för andra typer av celler såsom stratifierade skivepitelceller i bindhinnan, vaskulära endotelceller, mikrogliaceller och neuroner för att studera verkan av olika stimuli.
Bindning av Fura-2 till fritt kalcium i cellen orsakar en förändring av dess maximala absorptionsvåglängd från 380 nm (obundet) till 340 nm (bundet). Emissionsvåglängden ligger dock kvar på 510 nm och dessa emissioner fångas av kameran som svartvita bilder. Förhållandet mellan strålningsintensiteten som exciteras av 340 nm och 380 nm ljus registreras. Förutom att jämföra 340/380-kvoten med en beståndskurva för att beräkna en [Ca2+]i-koncentration , kan man också rapportera kvotens vikningsförändring utan att behöva skapa en standardkurva, alltså utan en faktisk koncentration. Forskare kan välja båda sätten baserat på deras utrustningsuppsättning och den experimentella designen.
Sammanfattningsvis kan odlade primära konjunktivala bägarceller användas som en modell för att studera könsbaserade skillnader mellan sjukdomar på ögats yta. Inkubation i 48 timmar i fenolrött RPMI-medium med 1 % BSA innan några experiment utförs är en konsekvent och kostnadseffektiv metod för att eliminera de potentiella effekterna av hormoner i odlingssubstrat och kan användas som ett basalmedium för att kontrollera hormonnivåerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Arbetet finansieras av National Eye Institute Grant EY019470 (D.A.D).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin with 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
| Advanced RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
| carbachol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
| Fetal Bovin Serum | R&D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
| Fura-2- acetoxymethyl ester | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
| Human conjunctival tissue | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
| inorganic salt for KRB buffer | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Any brand will work | |
| L-glutamine | Lonza Group (Basel, Switzerland) | 17-605F | |
| non-essential amino acids | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
| phenol red-free RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
| Pluronic acid F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
| scalpel | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | Any sterile surgical scalpel can work |
| sodium pyruvate | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
| sulfinpyrazone | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |
References
- Gao, Y., et al. Female-specific downregulation of tissue polymorphonuclear neutrophils drives impaired regulatory T cell and amplified effector T cell responses in autoimmune dry eye disease. Journal of Immunology. 195, 3086-3099 (2015).
- Wang, S. B., et al. Estrogen negatively regulates epithelial wound healing and protective lipid mediator circuits in the cornea. FASEB Journal. 26, 1506-1516 (2012).
- Sullivan, D. A., Block, L., Pena, J. D. Influence of androgens and pituitary hormones on the structural profile and secretory activity of the lacrimal gland. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 74, 421-435 (1996).
- Schaumberg, D. A., Dana, R., Buring, J. E., Sullivan, D. A. Prevalence of dry eye disease among US men: estimates from the Physicians' Health Studies. Archives of Ophthalmology. 127, 763-768 (2009).
- Tellefsen Nøland, S., et al. Sex and age differences in symptoms and signs of dry eye disease in a Norwegian cohort of patients. The Ocular Surface. 19, 68-73 (2021).
- Sullivan, D. A., et al. TFOS DEWS II Sex, gender, and hormones report. The Ocular Surface. 15, 284-333 (2017).
- Meester, I., et al. SeXY chromosomes and the immune system: reflections after a comparative study. Biology of Sex Differences. 11, 3 (2020).
- Yang, J. -H., et al. Hormone replacement therapy reverses the decrease in natural killer cytotoxicity but does not reverse the decreases in the T-cell subpopulation or interferon-gamma production in postmenopausal women. Fertility and Sterility. 74, 261-267 (2000).
- Orucoglu, F., Akman, M., Onal, S. Analysis of age, refractive error and gender related changes of the cornea and the anterior segment of the eye with Scheimpflug imaging. Contact Lens & Anterior Eye. 38, 345-350 (2015).
- Strobbe, E., Cellini, M., Barbaresi, U., Campos, E. C. Influence of age and gender on corneal biomechanical properties in a healthy Italian population. Cornea. 33, 968-972 (2014).
- Sullivan, D. A., Jensen, R. V., Suzuki, T., Richards, S. M. Do sex steroids exert sex-specific and/or opposite effects on gene expression in lacrimal and meibomian glands. Molecular Vision. 15, 1553-1572 (2009).
- Bukhari, A. A., Basheer, N. A., Joharjy, H. I. Age, gender, and interracial variability of normal lacrimal gland volume using MRI. Ophthalmic Plastic and Reconstructive Surgery. 30, 388-391 (2014).
- Sullivan, B. D., Evans, J. E., Dana, M. R., Sullivan, D. A. Influence of aging on the polar and neutral lipid profiles in human meibomian gland secretions. Archives of Ophthalmology. 124, 1286-1292 (2006).
- Ebeigbe, J. A., Ebeigbe, P. N. The influence of sex hormone levels on tear production in postmenopausal Nigerian women. African Journal of Medicine and Medical Sciences. 43, 205-211 (2014).
- Suzuki, T., et al. Estrogen's and progesterone's impact on gene expression in the mouse lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, 158-168 (2006).
- Shatos, M. A., et al. Isolation and characterization of cultured human conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 2477-2486 (2003).
- Huang, A. J., Tseng, S. C., Kenyon, K. R. Morphogenesis of rat conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 29, 969-975 (1988).
- Li, D., et al. Resolvin D1 and aspirin-triggered resolvin D1 regulate histamine-stimulated conjunctival goblet cell secretion. Mucosal Immunology. 6, 1119-1130 (2013).
- Dartt, D. A., Masli, S. Conjunctival epithelial and goblet cell function in chronic inflammation and ocular allergic inflammation. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 14, 464-470 (2014).
- Mantelli, F., Argüeso, P. Functions of ocular surface mucins in health and disease. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 8, 477-483 (2008).
- García-Posadas, L., et al. Characterization and functional performance of a commercial human conjunctival epithelial cell line. Experimental Eye Research. 223, 109220 (2022).
- Shatos, M. A., et al. Isolation, characterization, and propagation of rat conjunctival goblet cells in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42, 1455-1464 (2001).
- Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C.
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 2496-2500 (1986).
- García-Posadas, L., et al. Interaction of IFN-γ with cholinergic agonists to modulate rat and human goblet cell function. Mucosal Immunology. 9, 206-217 (2016).
- Li, D., Jiao, J., Shatos, M. A., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Effect of VIP on intracellular [Ca2 ], extracellular regulated kinase 1/2, and secretion in cultured rat conjunctival goblet cells. Investigative Opthalmology & Visual Science. 54, 2872-2884 (2013).
- Contrò, V., et al. Sex steroid hormone receptors, their ligands, and nuclear and non-nuclear pathways. AIMS Molecular Science. 2, 294-310 (2015).
- Valley, C. C., Solodin, N. M., Powers, G. L., Ellison, S. J., Alarid, E. T. Temporal variation in estrogen receptor-alpha protein turnover in the presence of estrogen. Journal of Molecular Endocrinology. 40, 23-34 (2008).
- Campen, C. A., Gorski, J. Anomalous behavior of protein synthesis inhibitors on the turnover of the estrogen receptor as measured by density labeling. Endocrinology. 119, 1454-1461 (1986).
- Yang, M., et al. Sex-based differences in conjunctival goblet cell responses to pro-inflammatory and pro-resolving mediators. Scientific Reports. 12, 16305 (2022).
