Summary
El medio libre de rojo fenol/fetal libre de suero bovino es una mejor opción que el RPMI avanzado para eliminar hormonas exógenas sin alterar la función normal de las células caliciformes conjuntivales en el estudio de las diferencias basadas en el sexo.
Abstract
El ojo seco es una enfermedad multifactorial que afecta a la salud de la superficie ocular, con una prevalencia profundamente mayor en las mujeres. La alteración de la mucina gelificadora que secretan las células caliciformes conjuntivales (CGC) en la superficie ocular contribuye a múltiples enfermedades de la superficie ocular. La eliminación de hormonas sexuales exógenas es esencial para obtener resultados consistentes durante el estudio in vitro de las diferencias basadas en el sexo en las CGC. En este trabajo se describe un método para minimizar la presencia de hormonas exógenas en el estudio de las diferencias basadas en el sexo en los CGC, manteniendo su función fisiológica. Los CGC de donantes humanos postmortem de ambos sexos se cultivaron a partir de trozos de la conjuntiva en medio RPMI con un 10% de suero fetal bovino (FBS) (denominado medio completo) hasta la confluencia. Casi 48 h antes del inicio de los experimentos, los CGC se transfirieron al medio RPMI sin rojo de fenol o FBS, pero con un 1% de BSA (lo que se conoce como medio libre de rojo de fenol). La función celular normal se estudió midiendo el aumento de [Ca 2+] ([Ca 2+]i) intracelular después de la estimulación con carbachol (Cch, 1 x 10-4 M) mediante microscopía de fura 2/acetoximetilo (AM). El resultado muestra que los CGC mantuvieron una función normal en los medios libres de rojo de fenol después de 48 h. No se observaron diferencias significativas en la respuesta [Ca2+]i entre el medio RPMI libre de rojo de fenol y el medio completo tras la estimulación con Cc. Por lo tanto, recomendamos utilizar el medio RPMI libre de rojo fenol con BSA al 1% para eliminar hormonas exógenas sin alterar la función normal de las CGC en el estudio de las diferencias basadas en el sexo.
Introduction
Las diferencias basadas en el sexo afectan a múltiples procesos de la superficie ocular 1,2,3. La manifestación clínica de estas diferencias basadas en el sexo es la diferencia en la prevalencia de muchas enfermedades de la superficie ocular entre hombres y mujeres, como el ojo seco y la conjuntivitis 4,5,6. La evidencia sugiere que las diferencias basadas en el sexo surgen de múltiples niveles biológicos, incluidos los diferentes perfiles de genes en los cromosomas X e Y7 y los efectos de las hormonas8. El estudio de las bases moleculares de las diferencias basadas en el sexo puede proporcionar una mejor comprensión de la enfermedad y, eventualmente, mejorar la medicina personalizada.
La superficie ocular comprende la película lagrimal suprayacente, la córnea y la conjuntiva. Se observan diferencias basadas en el sexo en múltiples componentes de la superficie ocular, incluyendo la película lagrimal 9,10, la córnea 11, la glándula lagrimal 12,13 y las glándulas de Meibomio que también secretan lágrimas 12. Numerosos estudios mecanicistas han investigado el efecto de las hormonas sexuales sobre la córnea y sus componentes asociados14,15; Sin embargo, se sabe poco sobre las diferencias basadas en el sexo en la conjuntiva y sus células caliciformes. La conjuntiva es una membrana mucosa que recubre la esclerótica y la superficie interna del párpado. El epitelio de la conjuntiva está compuesto por células escamosas estratificadas, estratificadas, no queratinizantes16.
Entre las células escamosas estratificadas de la conjuntiva, hay células caliciformes (CGC) intercaladas en la superficie apical del epitelio. Estas células caliciformes se caracterizan por el gran número de gránulos secretores localizados en el polo apical17. Los CGC sintetizan y secretan la mucina gelificadora MUC5AC para hidratar la superficie ocular y lubricarla durante el parpadeo17. La secreción de mucina está estrechamente regulada por la [Ca 2+] intracelular ([Ca 2+]i) y la activación de la quinasa regulada por señales extracelulares dependiente de Ras (ERK1/2)18. La incapacidad para secretar mucina provoca sequedad de la superficie ocular y secuelas de anomalías patológicas. Sin embargo, en una superficie ocular inflamada, la secreción extensa de mucina estimulada por mediadores inflamatorios conduce a una percepción de pegajosidad y picazón del ojo19. Estas condiciones con alteración de la secreción de mucina eventualmente conducirán al deterioro de la superficie ocular.
El papel de las células caliciformes como la principal fuente de mucina ocular ha sido reconocido desde hace mucho tiempo20, sin embargo, las diferencias basadas en el sexo en la regulación de la mucina tanto en estados fisiológicos como patológicos siguen sin descubrirse. Un sistema in vitro sería útil para monitorizar la función de las células caliciformes sin el efecto hormonal o con un nivel de hormonas sexuales controlado con precisión. A pesar de que se ha desarrollado una línea celular epitelial conjuntival21, no hay ninguna línea celular caliciforme con secreción funcional de mucina disponible. Por lo tanto, modificamos nuestro cultivo primario de CGC humano desarrollado para establecer un método para analizar la diferencia basada en el sexo in vitro16, y la presentamos como se muestra a continuación.
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Protocol
Todo el tejido humano fue donado al banco de ojos con el consentimiento informado previo y la autorización del donante para su uso en investigación científica. El uso del tejido conjuntival humano fue revisado por el Comité de Estudios Humanos de Ojos y Oídos de Massachusetts y se determinó que estaba exento y no cumplía con la definición de investigación con sujetos humanos.
1. Cultivo primario de células caliciformes humanas
- Del banco de ojos, obtener tejido conjuntival humano16.
- Prepare el medio de cultivo, medio de cultivo RPMI-1640 suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10%, 2 mM de glutamina, 2 mM de aminoácidos no esenciales (NEAA), 2 mM de piruvato de sodio, 100 μg/mL de penicilina-estreptomicina y 2 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES).
- Realice el cultivo celular primario como se describe a continuación.
- Picar el tejido entrozos de 1 mm y 3 con un bisturí estéril y sembrar en placas de cultivo en una campana de cultivo. Siembre cuatro piezas en cada pocillo de una placa de 6 pocillos, en 1 mL de medio RPMI completo. Aunque la orientación de la pieza de tejido no afecta al crecimiento celular, asegúrese de que las piezas se adhieran a la placa de cultivo para asegurar el crecimiento con la hoja de bisturí.
- Coloque los trozos de tejido en la incubadora que contenga un 95% de aire y un 5% de CO2 a 37 °C. Refresque el mismo medio de cultivo cada dos días hasta que las células caliciformes alcancen el 70%-80% de confluencia en aproximadamente 14 días. Retire el tapón de tejido aproximadamente 72 h después de la siembra.
NOTA: El epitelio conjuntival humano contiene principalmente células escamosas estratificadas y células caliciformes. RPMI es un medio selectivo para las células caliciformes. En raras ocasiones, en el cultivo humano de CGC, los fibroblastos pueden crecer alrededor del día 7. El método para purificar el cultivo fue descrito en una publicación anterior 22. - Verificar la pureza del cultivo de GC mediante microscopía de inmunofluorescencia (IFM) dirigida a la citoqueratina (CK)7 y a la lectina-1 de Helix pomatia (HPA-1)22 siguiendo el método estándar de IFM descrito en19; Ver resultados representativos.
2. Paso de células caliciformes conjuntivales humanas y preparación experimental
- Enjuagar las células con PBS (pH = 7,4) y separar las células con tripsinización utilizando tripsina al 0,05% en 1x EDTA. Observa las células cada minuto bajo un microscopio. Una vez que las células se desprenden de la parte inferior, desactive la tripsina utilizando medios RPMI completos.
- Centrifugar las células a 150 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Vuelva a suspender el gránulo celular en el medio de cultivo RPMI completo y vuelva a sembrar en placas de cultivo con fondo de vidrio para la medición de [Ca2+]i . El volumen total del medio es de 300 μL por plato. Mantenga el medio en el centro de la parte de vidrio del plato.
- Eliminación de hormonas en medios de cultivo: El medio de cultivo puede contener hormonas sexuales, especialmente el FBS. Como el rojo de fenol contenido en RPMI-1640 tiene actividad estrogénica 23,24, reemplace el medio RPMI con medio RPMI sin rojo de fenol y ajuste el pH a 7.45 usando tiras de pH después de preparar el medio completo. El HEPES contenido en el medio completo mantiene el pH en un rango relativamente pequeño.
3. Ensayo de fura-2/acetoximetilo (AM) para la medición de [Ca2+]i
- Realice la carga de Fura-2/AM como se describe a continuación.
- Incubar las células en placas con fondo de vidrio durante 1 h a 37 °C, atmósfera ambiente, y protegidas de la luz con tampón de bicarbonato Krebs-Ringer (KRB; que contiene 119 mM de NaCl, 4,8 mM de KCl, 1,0 mM de CaCl 2, 1,2 mM de MgSO4 y 25 mM de NaHCO3) con 0,5 % de HEPES (Tabla 1), más 0,5 % de BSA, 0,5 μM de fura-2/AM, 8 μM de ácido plurónico F127 y 250 μM de sulfinpirazona.
- Ajuste el pH a 7.45 usando un medidor de pH antes de usar. Después de cargar con fura-2/AM, lavar las células con KRB que contenga 250 μM de sulfinpirazona inmediatamente antes de la medición de [Ca2+]i .
- Realice la medición [Ca2+]i como se describe a continuación.
- Coloque las placas que contienen las células cargadas con fura-2 bajo el microscopio, localice un campo representativo que contenga entre 20 y 50 células con un aumento de 200x, y utilice la función Mano alzada para dibujar un contorno alrededor de cada célula para indicar al software qué es y qué no es fluorescencia de fondo.
- Espere a que el software reste automáticamente la fluorescencia de fondo de la medición y haga clic en el botón Iniciar experimento .
- A continuación, espere entre 8 s y 15 s para establecer los niveles de calcio basal en las células antes de pipetear cuidadosamente el agonista de interés. Continúe midiendo durante al menos 120 s después de agregar el agonista o hasta que los niveles de calcio hayan regresado a la línea de base.
- Realice el análisis de datos como se describe a continuación.
- Utilice el cambio en el pico [Ca2+]i para representar las acciones de los estímulos. Calcule el nivel medio de calcio basal en cada célula a partir de los primeros 8-15 s de mediciones. Si ese número es igual o superior a 500 nM, elimine esa celda del conjunto de datos, ya que está experimentando apoptosis o necrosis.
- Una vez que se ha calculado el nivel basal de cada celda, reste esa cantidad del máximo medido [Ca2+]i para la misma celda. Promedie el cambio en el pico [Ca2+]I para todas las celdas de un plato dado.
- Para garantizar la coherencia, registre las respuestas de cada estímulo por duplicado y calcule el valor medio de los cambios en el pico [Ca2+]i obtenidos a partir de los duplicados como un punto de datos de la muestra humana individual. Compare los datos de diferentes grupos utilizando un método de análisis de datos apropiado basado en el diseño del estudio.
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Representative Results
Los CGC humanos en cultivo primario crecen hasta el 80% de confluencia en aproximadamente 14 días. El tipo de célula se confirmó mediante tinción por inmunofluorescencia con anticuerpos contra los marcadores caliciformes CK7 y HPA-125 (Figura 1). A pesar de que la eliminación de FBS del medio puede eliminar las hormonas sexuales, la falta de FBS podría afectar potencialmente la respuesta celular. Para verificar el método de eliminación hormonal, se utilizó un agonista colinérgico (carbachol, Cch 1 × 10-4 M) como estímulo para imitar la secreción fisiológica de las células caliciformes mediada por diferentes terminaciones nerviosas que rodean a las células caliciformes26. No se observó ninguna diferencia en la magnitud del cambio en el calcio con respecto al medio RPMI completo de control, lo que indica que este método puede aplicarse para estudiar la diferencia basada en el sexo en la respuesta celular.
El ensayo Fura-2/AM descrito en la sección de protocolo se realizó en placas tratadas con RPMI completo + medio FBS al 10%, medio RPMI avanzado (RPMI suministró una concentración patentada de insulina) suplementado con BSA al 1% y RPMI libre de rojo de fenol con BSA al 1%. Los resultados se obtienen de cuatro individuos. No se encontraron diferencias significativas al comparar las células incubadas en RPMI libre de rojo de fenol con BSA al 1% y medio RPMI completo. Sin embargo, se observó un aumento significativo de la respuesta [Ca2+]i a Cch 1 × 10-4 M cuando se comparó el grupo medio RPMI avanzado con el grupo medio RPMI completo (Figura 2). En resumen, el RPMI libre de rojo de fenol con 1% de BSA no afecta a la respuesta celular de las células caliciformes, incluso superando al medio RPMI avanzado en el entorno de investigación actual.
Figura 1: Cultivo primario de células caliciformes conjuntivales humanas. Las células caliciformes conjuntivales se colocaron en cubreobjetos después de 14 días en cultivo, y se realizó una tinción de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos primarios contra CK7 (rojo) y lectina conjugada con fluoresceína HPA-1 (verde). (A) Las imágenes se tomaron con un aumento de 200x y (B) las imágenes se tomaron con un aumento de 630x. CK7 se presenta como una señal fluorescente perinuclear (panel izquierdo); HPA-1 presenta un patrón puntuado perinuclaramente (panel central). La señal de inmunofluorescencia positiva tanto de CK7 como de HPA-1 indica una célula caliciforme. El control negativo es la incubación en ausencia del anticuerpo primario (C). Barras de escala = 50 μm (A) y 8 μm (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Efectos de diferentes medios en la respuesta [Ca2+]i inducida por Ccha. Las células se incubaron con RPMI libre de rojo de fenol con 1% de BSA, medios RPMI con 10% de FBS o RPMI avanzado con 1% de BSA durante 48 h de incubación antes de la adición de 1 × 10-4 M Cch. [Ca 2+]i se midió mediante el ensayo Fura2 y se calculó el cambio en el pico [Ca2+]i y se mostró en el gráfico. La barra negra indica un medio completo con rojo fenol y 10% de FBS. La barra naranja indica medio avanzado con 1% de BSA, y la barra gris indica RPMI sin rojo fenol y con 1% de BSA. Los datos son medias ± SEM, n = 4. Se utilizó ANOVA de un factor con corrección de Dunnett en comparaciones de grupos múltiples, p < 0,05 se estableció como estadísticamente significativo. * indica diferencia significativa entre los grupos. Abreviaturas: Cch = carbachol; [Ca2+] i = concentración intracelular de Ca2+. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Componente de stock | Cantidad por 250 ml de KRB | Concentración final |
| Glucosa | 0,25 g | 0.1% p/v |
| 1 M de NaCl | 30 mL | 119 mM |
| 0,5 M NaHCO3 | 12,5 ml | 25 mM |
| Ácido 1 M 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES) | 2,5 ml | 10 mM |
| 1 M KCl | 1,2 ml | 4,8 mM |
| 1 M KH2PO4 | 300 μL | 1,2 mM |
| 1 M MgSO4 | 300 μL | 1,2 mM |
| 1 M CaCl2 | 250 μL | 1 mM |
Tabla 1: Material y fórmula para KRB. Abreviatura: p/v, peso/volumen.
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Discussion
La investigación de las diferencias basadas en el sexo en los tejidos oculares ayuda a comprender los procesos de las enfermedades, especialmente el ojo seco y la conjuntivitis alérgica, que afectan de manera desproporcionada a un sexo 4,5,6. Aunque se pueden utilizar modelos animales para estos estudios, los datos obtenidos directamente de tejido humano son esenciales debido a la mayor similitud con las células humanas in vivo. Los tejidos conjuntivales utilizados en el contexto experimental actual proceden de donantes fallecidos con un rango de edad de 70-85 años (postmenopáusicas), lo que facilita el control del efecto hormonal ante mortem. Aquí, presentamos un método costo-eficiente para estudiar las diferencias basadas en el sexo en los CGC humanos.
El paso crítico para adquirir datos consistentes es la eliminación del FBS y el rojo de fenol durante 48 h antes de los experimentos para eliminar los efectos de las hormonas sexuales. Las acciones de las hormonas sexuales en las células se pueden clasificar en efectos no transcripcionales y transcripcionales. Los efectos no transcripcionales están mediados rápidamente a través de las proteínas G en unos pocos segundos o minutos, y el efecto transcripcional en el que se activan ciertos genes tarda de 30 minutos a varias horas27; la vida media del receptor de estrógeno alfa (ERα) inducido por estrógenos es de 2-6 h28,29. A pesar de que las tasas de renovación de otros tipos de proteínas inducidas por hormonas sexuales rara vez se informan, los resultados de los estudios existentes indican que las proteínas inducidas por hormonas sexuales se sintetizan y degradan en cuestión de horas. Por lo tanto, 48 h es tiempo suficiente para eliminar el efecto potencial de las hormonas contenidas en el FBS mientras se mantiene la función celular normal. Utilizando el método actual, informamos con éxito las diferencias basadas en el sexo en la expresión de los receptores de hormonas sexuales y las funciones celulares en las CGC30.
El FBS es un factor esencial para que los cultivos de células caliciformes permanezcan sanos y viables. La sustitución del FBS normal inactivado por calor por FBS sin carbón vegetal es otra forma posible de eliminar las hormonas sexuales en el sistema de cultivo. La limitación del uso de FBS extraído con carbón vegetal es el costo y la composición compleja del FBS. La eliminación completa de FBS también elimina la posible inconsistencia de los componentes medios indefinidos de FBS.
El paso crítico para la medición de [Ca2+]i es estabilizar el pH y la temperatura. A pesar del suplemento HEPES, hemos notado un cambio de pH en el tampón KRB a lo largo del tiempo cuando se almacena a temperatura ambiente. Por lo tanto, se recomienda un reajuste del pH del tampón para un experimento largo, aproximadamente cada 3 h. El mismo método [Ca2+]i también se aplica a otros tipos de células, como las células escamosas estratificadas de la conjuntiva, las células del endotelio vascular, las células microgliales y las neuronas para estudiar la acción de diferentes estímulos.
La unión de Fura-2 al calcio libre en la célula provoca un cambio en su longitud de onda de absorción máxima de 380 nm (no unido) a 340 nm (unido). Sin embargo, la longitud de onda de emisión se mantiene en 510 nm y estas emisiones son capturadas por la cámara como imágenes en blanco y negro. Se registra la relación entre la intensidad de emisión excitada por la luz de 340 nm y 380 nm. Además de comparar la relación 340/380 con una curva de rodal para calcular una concentración de [Ca2+]i , también se puede informar del cambio de pliegue de la relación sin tener que crear una curva estándar, por lo tanto, sin una concentración real. Los investigadores pueden elegir cualquiera de las dos opciones en función de la configuración de su equipo y el diseño experimental.
En conclusión, las células caliciformes conjuntivales primarias cultivadas se pueden utilizar como modelo para estudiar las diferencias basadas en el sexo de las enfermedades de la superficie ocular. La incubación durante 48 h en un medio RPMI libre de rojo de fenol con BSA al 1% antes de realizar cualquier experimento es un método consistente y rentable para eliminar los efectos potenciales de las hormonas en los medios de cultivo y puede utilizarse como medio basal para controlar los niveles hormonales.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
El trabajo está financiado por el National Eye Institute Grant EY019470 (D.A.D).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin with 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
| Advanced RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
| carbachol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
| Fetal Bovin Serum | R&D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
| Fura-2- acetoxymethyl ester | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
| Human conjunctival tissue | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
| inorganic salt for KRB buffer | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Any brand will work | |
| L-glutamine | Lonza Group (Basel, Switzerland) | 17-605F | |
| non-essential amino acids | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
| phenol red-free RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
| Pluronic acid F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
| scalpel | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | Any sterile surgical scalpel can work |
| sodium pyruvate | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
| sulfinpyrazone | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |
References
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