Summary
Fenol rødfritt / føtalt bovint serumfritt medium er et bedre alternativ enn avansert RPMI for å eliminere eksogene hormoner uten å endre den normale funksjonen til konjunktivale begerceller i studiet av kjønnsbaserte forskjeller.
Abstract
Tørre øyne er en multifaktoriell sykdom som påvirker okulær overflatehelse, med en dypt høyere prevalens hos kvinner. Forstyrrelse av det geldannende slimet som utskilles av konjunktivale begerceller (CGC) på den okulære overflaten bidrar til flere okulære overflatesykdommer. Eliminering av eksogene kjønnshormoner er avgjørende for å oppnå konsistente resultater under in vitro-studier av kjønnsbaserte forskjeller i CGC. Denne artikkelen beskriver en metode for å minimere tilstedeværelsen av eksogene hormoner i studiet av kjønnsbaserte forskjeller i CGC samtidig som deres fysiologiske funksjon opprettholdes. CGC fra post mortem menneskelige donorer av begge kjønn ble dyrket fra biter av bindehinnen i RPMI-medium med 10% føtalt bovint serum (FBS) (referert til som komplett medium) til sammenløp. Nesten 48 timer før starten av forsøkene ble CGC overført til RPMI-medium uten fenolrødt eller FBS, men med 1% BSA (referert til som fenol-rødfritt medium). Den normale cellulære funksjonen ble studert ved å måle økningen i intracellulær [Ca 2+] ([Ca2+]i) etter stimulering av karbachol (Cch, 1 x 10-4 M) ved bruk av fura 2/acetoksymetyl (AM) mikroskopi. Resultatet viser at CGC opprettholdt normal funksjon i fenolfrie medier etter 48 timer. Det ble ikke observert noen signifikant forskjell i [Ca2+]i respons mellom fenol rødfritt RPMI medium og komplett medium ved Cch-stimulering. Derfor anbefaler vi å bruke det fenolrøde frie RPMI-mediet med 1% BSA for å eliminere eksogene hormoner uten å endre den normale funksjonen til CGC i studien av kjønnsbaserte forskjeller.
Introduction
Kjønnsbaserte forskjeller påvirker flere prosesser på den okulære overflaten 1,2,3. Den kliniske manifestasjonen av disse kjønnsbaserte forskjellene er forskjellen i forekomsten av mange okulære overflatesykdommer mellom menn og kvinner, som tørre øyne og konjunktivitt 4,5,6. Bevis tyder på at kjønnsbaserte forskjeller oppstår fra flere biologiske nivåer, inkludert de forskjellige profilene av gener på X- og Y-kromosomer7 og effekten av hormoner8. Å studere det molekylære grunnlaget for kjønnsbaserte forskjeller kan gi en bedre forståelse av sykdom og til slutt forbedre personlig medisin.
Den okulære overflaten består av den overliggende tårfilmen, hornhinnen og bindehinden. Kjønnsbaserte forskjeller observeres i flere komponenter i den okulære overflaten, inkludert tårefilmen 9,10, hornhinnen 11, lacrimalkjertelen 12,13 og meibomiske kjertler som også utskiller tårer 12. Tallrike mekanistiske studier har undersøkt effekten av kjønnshormoner på hornhinnen og tilhørende komponenter14,15; Imidlertid er lite kjent om de kjønnsbaserte forskjellene i bindehinnen og dens begerceller. Konjunktivene er en slimhinne som dekker scleraen og den indre overflaten av øyelokket. Epitelet i konjunktivene består av ikke-keratiniserende, flerlags, stratifiserte plateepitelceller16.
Blant de stratifiserte plateepitelcellene i konjunktivene er det bobleceller (CGC) spredt på epitelets apikale overflate. Disse boblecellene er preget av det store antallet sekretoriske granulater som ligger ved den apikale polen17. CGC syntetiserer og utskiller det geldannende slimet MUC5AC for å fukte den okulære overflaten og smøre den under blinking17. Mucinsekresjon reguleres tett av den intracellulære [Ca 2+] ([Ca2+]i) og aktiveringen av den Ras-avhengige ekstracellulære signalregulerte kinasen (ERK1/2)18. Manglende evne til å utskille mucin resulterer i tørrhet i den okulære overflaten og følgetilstander av patologiske abnormiteter. På en betent okulær overflate fører imidlertid omfattende slimutskillelse stimulert av inflammatoriske mediatorer til en oppfatning av klebrighet og kløe i øyet19. Disse forholdene med forstyrret mucinsekresjon vil til slutt føre til forringelse av den okulære overflaten.
Rollen til begerceller som den viktigste kilden til okulær mucin, har lenge vært anerkjent20, men de kjønnsbaserte forskjellene i mucinregulering i både fysiologiske og patologiske tilstander forblir uoppdaget. Et in vitro-system ville være nyttig for å overvåke funksjonen av bobleceller uten hormonell effekt eller med et nøyaktig kontrollert nivå av kjønnshormoner. Selv om en konjunktival epitelcellelinje har utviklet21, er det ingen begercellelinje med funksjonell slimutskillelse tilgjengelig. Derfor modifiserte vi vår utviklede primære menneskelige CGC-kultur for å etablere en metode for å analysere den kjønnsbaserte forskjellen in vitro16, og presentere den som nedenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alt menneskelig vev ble donert til øyebanken med forutgående informert samtykke og autorisasjon fra donoren til bruk i vitenskapelig forskning. Bruk av det humane konjunktivvevet ble gjennomgått av Massachusetts Eye and Ear Human Studies Committee og fastslått å være unntatt og ikke oppfylle definisjonen av forskning med mennesker.
1. Primær human begercellekultur
- Fra øyebanken, få humant konjunktivvev16.
- Forbered kulturmediet, RPMI-1640 kulturmedium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM glutamin, 2 mM ikke-essensielle aminosyrer (NEAA), 2 mM natriumpyruvat, 100 μg / ml penicillin-streptomycin og 2 mM 4- (2-hydroksyetyl)-1- piperazineetansulfonsyre (HEPES).
- Utfør primær cellekultur som beskrevet nedenfor.
- Hakk vevet i 1 mm3 stykker med en steril skalpell og frø på kulturplater i en kulturhette. Frø fire stykker i hver brønn av en 6-brønns plate, i 1 ml komplett RPMI-medium. Selv om orienteringen av vevstykket ikke påvirker celleveksten, må du sørge for at stykkene fester seg til kulturplaten for å sikre utvekst ved hjelp av skalpellbladet.
- Plasser vevstykkene i inkubatoren som inneholder 95% luft og 5% CO2 ved 37 ° C. Oppdater det samme kulturmediet annenhver dag til begercellene når 70% -80% sammenløp på ca. 14 dager. Fjern vevpluggen ca. 72 timer etter såing.
MERK: Humant konjunktivepitel inneholder hovedsakelig stratifiserte plateepitelceller og begerceller. RPMI er et selektivt medium for begerceller. Sjelden i human CGC-kultur kan fibroblaster vokse rundt dag 7. Metoden for å rense kulturen ble beskrevet i en tidligere publikasjon 22. - Verifisere renheten av GC-kulturen ved hjelp av immunfluorescensmikroskopi (IFM) rettet mot cytokeratin (CK) 7 og Helix pomatia lektin-1 (HPA-1) 22 ved å følge standard IFM-metoden beskrevet i19; Se representative resultater.
2. Human konjunktival begercellepassasje og eksperimentell forberedelse
- Skyll cellene med PBS (pH = 7,4) og løsne cellene med trypsinisering ved hjelp av 0,05% trypsin i 1x EDTA. Observer cellene hvert minutt under et mikroskop. Når cellene løsner fra bunnen, deaktiver trypsinen ved hjelp av komplette RPMI-medier.
- Sentrifuge cellene ved 150 × g i 5 minutter ved romtemperatur. Resuspender cellepelleten i det komplette RPMI-dyrkningsmediet og frø på glassbunnede kulturretter for [Ca2+]i-måling . Det totale volumet av mediet er 300 μL per tallerken. Hold mediet i midten av glassdelen av fatet.
- Eliminering av hormoner i kulturmedier: Kulturmediet kan inneholde kjønnshormoner, spesielt FBS. Siden fenolrødt i RPMI-1640 har østrogen aktivitet 23,24, erstatt RPMI-mediet med fenolfritt RPMI-medium og juster pH til 7,45 ved hjelp av pH-striper etter tilberedning av hele mediet. HEPES inneholdt i hele mediet opprettholder pH til et relativt lite område.
3. Fura-2 / acetoksymetyl (AM) analyse for [Ca2 +] i måling
- Utfør Fura-2 / AM lasting som beskrevet nedenfor.
- Inkuber cellene i glassbunnsfat i 1 time ved 37 ° C, omgivende atmosfære og beskyttet mot lys med Krebs-Ringer bikarbonatbuffer (KRB; inneholdende 119 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1,0 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO4 og 25 mM NaHCO3) med 0,5% HEPES (tabell 1), pluss 0,5% BSA, 0,5 μM fura-2 / AM, 8 μM pluronsyre F127 og 250 μM sulfinpyrazon.
- Juster pH til 7,45 ved hjelp av en pH-måler før bruk. Etter tilsetting med fura-2/AM, vask cellene med KRB inneholdende 250 μM sulfinpyrazon umiddelbart før [Ca2+]i måling.
- Utfør [Ca2+]i-måling som beskrevet nedenfor.
- Plasser tallerkenene som inneholder cellene lastet med fura-2 under mikroskopet, finn et representativt felt som inneholder mellom 20 celler og 50 celler ved 200x forstørrelse, og bruk frihåndsfunksjonen til å tegne et omriss rundt hver celle for å indikere for programvaren hva som er og hva som ikke er bakgrunnsfluorescens.
- Vent til programvaren automatisk trekker bakgrunnsfluorescens fra målingen, og klikk på Start eksperiment-knappen .
- Vent deretter mellom 8 s og 15 s for å fastslå de basale kalsiumnivåene i cellene før du forsiktig pipetterer i agonisten av interesse. Fortsett å måle i minst 120 s etter tilsetning av agonisten eller til kalsiumnivået har returnert til baseline.
- Utfør dataanalyse som beskrevet nedenfor.
- Bruk endringen i topp [Ca2+]i for å representere handlingene til stimuliene. Beregn gjennomsnittlig basal kalsiumnivå i hver celle fra de første 8-15 s av målingene. Hvis dette tallet er lik eller over 500 nM, fjern den cellen fra datasettet da den gjennomgår apoptose eller nekrose.
- Når basalnivået til hver celle er beregnet, trekker du dette beløpet fra det maksimale målte [Ca2+] i for samme celle. Gjennomsnitt endringen i topp [Ca2+]I for alle cellene i en gitt tallerken.
- For å sikre konsistens, registrer responsene til hver stimulus i duplikat, og beregn gjennomsnittsverdien av endringene i topp [Ca2+]i oppnådd fra duplikatene som ett datapunkt fra den enkelte menneskelige prøven. Sammenlign data fra ulike grupper ved hjelp av en passende dataanalysemetode basert på studiedesignet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Humane CGC i primærkultur vokser til 80 % konfluens i løpet av ca. 14 dager. Celletypen ble bekreftet ved immunfluorescensfarging med antistoffer mot begercellemarkørene CK7 og HPA-125 (figur 1). Selv om fjerning av FBS fra mediet kan eliminere kjønnshormonene, kan mangelen på FBS potensielt påvirke den cellulære responsen. For å verifisere hormoneliminasjonsmetoden ble en kolinerg agonist (carbachol, Cch 1 × 10-4 M) brukt som stimulus for å etterligne den fysiologiske begercellesekresjonen mediert av forskjellige nerveender som omgir begercellene26. Ingen forskjell i størrelsen på endringen i kalsium ble observert fra kontrollkomplette RPMI-mediet, noe som indikerer at denne metoden kan brukes til å studere den kjønnsbaserte forskjellen i cellerespons.
Fura-2/AM-analysen beskrevet i protokollavsnittet ble utført på retter behandlet med komplett RPMI + 10 % FBS-medium, avansert RPMI-medium (RPMI leverte en proprietær konsentrasjon av insulin) supplert med 1 % BSA og fenolfritt RPMI med 1 % BSA. Resultatene er hentet fra fire personer. Det ble ikke funnet noen signifikant forskjell ved sammenligning av cellene inkubert i fenolfritt RPMI med 1 % BSA og komplett RPMI-medium. Imidlertid ble det observert en signifikant økt [Ca2+]i respons på Cch 1 × 10-4 M ved sammenligning av den avanserte RPMI-mediegruppen med hele RPMI-mediumgruppen (figur 2). Oppsummert påvirker fenolfri RPMI med 1% BSA ikke den cellulære responsen til begerceller, og overgår ikke det avanserte RPMI-mediet i den nåværende forskningsinnstillingen.
Figur 1: Human konjunktival begercelle primærkultur. Konjunktivbegercellene ble passert over på dekklapper etter 14 dager i dyrkning, og immunfluorescensfarging med primært antistoff mot CK7 (rød) og fluoresceinkonjugert lektin HPA-1 (grønn) ble utført. (A) Bildene ble tatt under en 200x forstørrelse, og (B) bildene ble tatt under en 630x forstørrelse. CK7 presenterer som et perinukleært fluorescerende signal (venstre panel); HPA-1 presenterer et punktert mønster perinu (midtpanel). Positivt immunfluorescenssignal av både CK7 og HPA-1 indikerer en begercelle. Negativ kontroll er inkubasjon i fravær av det primære antistoffet (C). Skalastenger = 50 μm (A) og 8 μm (B). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Effekter av ulike medier på Cch-indusert [Ca2+]i respons. Cellene ble inkubert med fenolfri RPMI med 1 % BSA, RPMI-medier med 10 % FBS eller avansert RPMI med 1 % BSA i 48 timers inkubasjon før tilsetning av 1 × 10-4 M Cch. [Ca 2+]i ble målt ved Fura2-analyse og endringen i peak [Ca 2+]i ble beregnet og vist i grafen. Den svarte linjen indikerer komplett medium med fenolrødt og 10% FBS. Den oransje linjen indikerer avansert medium med 1 % BSA, og den grå linjen indikerer RPMI uten fenolrødt og med 1 % BSA. Data er gjennomsnittlige ± SEM, n = 4. Enveis ANOVA med Dunnett-korreksjon ble brukt i flere gruppesammenlikninger, p < 0,05 ble satt som statistisk signifikant. * indikerer signifikant forskjell mellom gruppene. Forkortelser: Cch = carbachol; [Ca2+] i = intracellulær Ca2+ konsentrasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Lager komponent | Beløp for 250 ml KRB | Endelig konsentrasjon |
| Glukose | 0,25 g | 0,1 % w/v |
| 1 M NaCl | 30 ml | 119 mM |
| 0,5 m NaHCO3 | 12,5 ml | 25 mM |
| 1 M 4- (2-hydroksyetyl)-1- piperazineetansulfonsyre (HEPES) | 2,5 ml | 10 mM |
| 1 M KCl | 1,2 ml | 4,8 mM |
| 1 MKH 2PO4 | 300 μL | 1,2 mM |
| 1 M MgSO4 | 300 μL | 1,2 mM |
| 1 m CaCl2 | 250 μL | 1 mM |
Tabell 1: Materiale og formel for KRB. Forkortelse: w/v, vekt/volum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Undersøkelse av kjønnsbaserte forskjeller i okulært vev bidrar til å forstå sykdomsprosessene, spesielt tørre øyne og allergisk konjunktivitt, som uforholdsmessig påvirker ett kjønn 4,5,6. Selv om dyremodeller kan brukes til disse studiene, er data hentet direkte fra humant vev avgjørende på grunn av den høyeste likheten med humane celler in vivo. Konjunktivvevene som brukes i den nåværende eksperimentelle innstillingen, er fra avdøde givere med et aldersområde på 70-85 år (postmenopausal), noe som gjør det lettere å kontrollere den hormonelle effekten ante mortem. Her presenterte vi en kostnadseffektiv metode for å studere kjønnsbaserte forskjeller i humane CGC.
Det kritiske trinnet for å skaffe konsistente data er fjerning av FBS og fenolrødt i 48 timer før eksperimenter for å eliminere effekten av kjønnshormoner. Handlingene til kjønnshormoner i celler kan kategoriseres i ikke-transkripsjonelle og transkripsjonelle effekter. De ikke-transkripsjonelle effektene medieres raskt gjennom G-proteiner i løpet av få sekunder til minutter, og transkripsjonseffekten der visse gener blir aktivert tar 30 minutter til flere timer27; halveringstiden til østrogenindusert østrogenreseptor alfa (ERα) er 2-6 timer28,29. Selv om omsetningshastighetene til andre typer kjønnshormoninduserte proteiner sjelden rapporteres, indikerer resultater fra eksisterende studier at kjønnshormoninduserte proteiner syntetiseres og nedbrytes i løpet av timer. Derfor er 48 timer nok tid til å vaske ut den potensielle effekten av hormoner som finnes i FBS samtidig som normal cellulær funksjon opprettholdes. Ved hjelp av den nåværende metoden rapporterte vi vellykket kjønnsbaserte forskjeller i uttrykket av kjønnshormonreseptorer og cellulære funksjoner i CGC30.
FBS er en viktig faktor for at begercellekulturer skal forbli sunne og levedyktige. Å erstatte den normale varmeinaktiverte FBS med kullstrippet FBS er en annen mulig måte å eliminere kjønnshormoner i kultursystemet. Begrensningen av å bruke kullstrippet FBS er kostnaden og den komplekse sammensetningen av FBS. Fullstendig fjerning av FBS eliminerer også den potensielle inkonsekvensen fra de udefinerte mediumkomponentene i FBS.
Det kritiske trinnet for [Ca2+]i-måling er å stabilisere pH og temperatur. Til tross for HEPES-tilskuddet har vi lagt merke til et skifte av pH i KRB-bufferen over tid når den oppbevares ved romtemperatur. Dermed anbefales en justering av bufferens pH for et langt eksperiment, omtrent hver 3. Den samme [Ca2 +] i-metoden gjelder også for andre typer celler som stratifiserte plateepitelceller i bindehinden, vaskulære endotelceller, mikrogliaceller og nevroner for å studere virkningen av forskjellige stimuli.
Binding av Fura-2 til fritt kalsium i cellen forårsaker en endring i toppabsorpsjonsbølgelengden fra 380 nm (ubundet) til 340 nm (bundet). Emisjonsbølgelengden forblir imidlertid på 510 nm, og disse utslippene fanges av kameraet som svart-hvitt-bilder. Forholdet mellom utslippsintensitet opphisset av 340 nm og 380 nm lys registreres. I tillegg til å sammenligne 340/380-forholdet med en standkurve for å beregne en [Ca2+]i-konsentrasjon , kan man også rapportere foldeendringen av forholdet uten å måtte lage en standardkurve, derfor uten en faktisk konsentrasjon. Etterforskere kan velge begge veier basert på utstyrsoppsettet og det eksperimentelle designet.
Avslutningsvis kan dyrkede primære konjunktivale begerceller brukes som en modell for å studere kjønnsbaserte forskjeller i okulære overflatesykdommer. Inkubasjon i 48 timer i fenolfritt RPMI-medium med 1% BSA før du utfører eksperimenter, er en konsistent og kostnadseffektiv metode for å eliminere de potensielle effektene av hormoner i kulturmedier og kan brukes som et basalmedium for å kontrollere hormonnivåer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Arbeidet er finansiert av National Eye Institute Grant EY019470 (DAD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin with 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
| Advanced RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
| carbachol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
| Fetal Bovin Serum | R&D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
| Fura-2- acetoxymethyl ester | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
| Human conjunctival tissue | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
| inorganic salt for KRB buffer | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Any brand will work | |
| L-glutamine | Lonza Group (Basel, Switzerland) | 17-605F | |
| non-essential amino acids | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
| phenol red-free RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
| Pluronic acid F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
| scalpel | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | Any sterile surgical scalpel can work |
| sodium pyruvate | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
| sulfinpyrazone | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |
References
- Gao, Y., et al. Female-specific downregulation of tissue polymorphonuclear neutrophils drives impaired regulatory T cell and amplified effector T cell responses in autoimmune dry eye disease. Journal of Immunology. 195, 3086-3099 (2015).
- Wang, S. B., et al. Estrogen negatively regulates epithelial wound healing and protective lipid mediator circuits in the cornea. FASEB Journal. 26, 1506-1516 (2012).
- Sullivan, D. A., Block, L., Pena, J. D. Influence of androgens and pituitary hormones on the structural profile and secretory activity of the lacrimal gland. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 74, 421-435 (1996).
- Schaumberg, D. A., Dana, R., Buring, J. E., Sullivan, D. A. Prevalence of dry eye disease among US men: estimates from the Physicians' Health Studies. Archives of Ophthalmology. 127, 763-768 (2009).
- Tellefsen Nøland, S., et al. Sex and age differences in symptoms and signs of dry eye disease in a Norwegian cohort of patients. The Ocular Surface. 19, 68-73 (2021).
- Sullivan, D. A., et al. TFOS DEWS II Sex, gender, and hormones report. The Ocular Surface. 15, 284-333 (2017).
- Meester, I., et al. SeXY chromosomes and the immune system: reflections after a comparative study. Biology of Sex Differences. 11, 3 (2020).
- Yang, J. -H., et al. Hormone replacement therapy reverses the decrease in natural killer cytotoxicity but does not reverse the decreases in the T-cell subpopulation or interferon-gamma production in postmenopausal women. Fertility and Sterility. 74, 261-267 (2000).
- Orucoglu, F., Akman, M., Onal, S. Analysis of age, refractive error and gender related changes of the cornea and the anterior segment of the eye with Scheimpflug imaging. Contact Lens & Anterior Eye. 38, 345-350 (2015).
- Strobbe, E., Cellini, M., Barbaresi, U., Campos, E. C. Influence of age and gender on corneal biomechanical properties in a healthy Italian population. Cornea. 33, 968-972 (2014).
- Sullivan, D. A., Jensen, R. V., Suzuki, T., Richards, S. M. Do sex steroids exert sex-specific and/or opposite effects on gene expression in lacrimal and meibomian glands. Molecular Vision. 15, 1553-1572 (2009).
- Bukhari, A. A., Basheer, N. A., Joharjy, H. I. Age, gender, and interracial variability of normal lacrimal gland volume using MRI. Ophthalmic Plastic and Reconstructive Surgery. 30, 388-391 (2014).
- Sullivan, B. D., Evans, J. E., Dana, M. R., Sullivan, D. A. Influence of aging on the polar and neutral lipid profiles in human meibomian gland secretions. Archives of Ophthalmology. 124, 1286-1292 (2006).
- Ebeigbe, J. A., Ebeigbe, P. N. The influence of sex hormone levels on tear production in postmenopausal Nigerian women. African Journal of Medicine and Medical Sciences. 43, 205-211 (2014).
- Suzuki, T., et al. Estrogen's and progesterone's impact on gene expression in the mouse lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, 158-168 (2006).
- Shatos, M. A., et al. Isolation and characterization of cultured human conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 2477-2486 (2003).
- Huang, A. J., Tseng, S. C., Kenyon, K. R. Morphogenesis of rat conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 29, 969-975 (1988).
- Li, D., et al. Resolvin D1 and aspirin-triggered resolvin D1 regulate histamine-stimulated conjunctival goblet cell secretion. Mucosal Immunology. 6, 1119-1130 (2013).
- Dartt, D. A., Masli, S. Conjunctival epithelial and goblet cell function in chronic inflammation and ocular allergic inflammation. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 14, 464-470 (2014).
- Mantelli, F., Argüeso, P. Functions of ocular surface mucins in health and disease. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 8, 477-483 (2008).
- García-Posadas, L., et al. Characterization and functional performance of a commercial human conjunctival epithelial cell line. Experimental Eye Research. 223, 109220 (2022).
- Shatos, M. A., et al. Isolation, characterization, and propagation of rat conjunctival goblet cells in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42, 1455-1464 (2001).
- Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C.
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 2496-2500 (1986).
- García-Posadas, L., et al. Interaction of IFN-γ with cholinergic agonists to modulate rat and human goblet cell function. Mucosal Immunology. 9, 206-217 (2016).
- Li, D., Jiao, J., Shatos, M. A., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Effect of VIP on intracellular [Ca2 ], extracellular regulated kinase 1/2, and secretion in cultured rat conjunctival goblet cells. Investigative Opthalmology & Visual Science. 54, 2872-2884 (2013).
- Contrò, V., et al. Sex steroid hormone receptors, their ligands, and nuclear and non-nuclear pathways. AIMS Molecular Science. 2, 294-310 (2015).
- Valley, C. C., Solodin, N. M., Powers, G. L., Ellison, S. J., Alarid, E. T. Temporal variation in estrogen receptor-alpha protein turnover in the presence of estrogen. Journal of Molecular Endocrinology. 40, 23-34 (2008).
- Campen, C. A., Gorski, J. Anomalous behavior of protein synthesis inhibitors on the turnover of the estrogen receptor as measured by density labeling. Endocrinology. 119, 1454-1461 (1986).
- Yang, M., et al. Sex-based differences in conjunctival goblet cell responses to pro-inflammatory and pro-resolving mediators. Scientific Reports. 12, 16305 (2022).
