Summary
מדיום ללא פנול ללא אדום / סרום בקר עוברי הוא אפשרות טובה יותר מאשר RPMI מתקדם לחסל הורמונים אקסוגניים מבלי לשנות את התפקוד הרגיל של תאי גביע הלחמית במחקר של הבדלים מבוססי מין.
Abstract
עין יבשה היא מחלה רב-גורמית המשפיעה על בריאות פני העין, עם שכיחות גבוהה יותר באופן משמעותי אצל נשים. הפרעה של מוצין יוצר ג'ל המופרש על ידי תאי גביע הלחמית (CGCs) על פני השטח של העין תורמת למחלות מרובות של פני השטח של העין. חיסול הורמוני המין האקסוגניים חיוני להשגת תוצאות עקביות במהלך מחקר חוץ גופי של הבדלים מבוססי מין ב- CGCs. מאמר זה מתאר שיטה למזער את נוכחותם של הורמונים אקסוגניים בחקר הבדלים מבוססי מין ב- CGCs תוך שמירה על תפקודם הפיזיולוגי. CGCs מתורמים אנושיים לאחר המוות משני המינים תורבתו מחתיכות של הלחמית בתווך RPMI עם 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) (המכונה המדיום השלם) עד למפגש. כמעט 48 שעות לפני תחילת הניסויים, CGCs הועברו למדיום RPMI ללא פנול אדום או FBS אך עם 1% BSA (המכונה מדיום נטול פנול-אדום). התפקוד התאי התקין נחקר על ידי מדידת העלייה בגירוי תוך-תאי [Ca 2+] ([Ca2+]i) לאחר גירוי קרבצ'ול (Cch, 1 x 10-4 M) באמצעות מיקרוסקופ fura 2/acetoxymethyl (AM). התוצאה מראה כי CGCs שמרו על תפקוד תקין במדיה נטולת פנול-אדום לאחר 48 שעות. לא נצפה הבדל משמעותי בתגובת [Ca2+]i בין מדיום סל"ד ללא פנול אדום לבין מדיום שלם בגירוי Cch. לכן, אנו ממליצים להשתמש בתווך RPMI ללא פנול-אדום עם 1% BSA כדי לחסל הורמונים אקסוגניים מבלי לשנות את התפקוד הרגיל של CGCs במחקר של הבדלים מבוססי מין.
Introduction
הבדלים מבוססי מין משפיעים על תהליכים מרובים של משטח העין 1,2,3. הביטוי הקליני של הבדלים מבוססי מין אלה הוא ההבדל בשכיחות של מחלות רבות על פני העין בין גברים לנשים, כגון עין יבשה ודלקת הלחמית 4,5,6. ראיות מצביעות על כך שהבדלים מבוססי מין נובעים מרמות ביולוגיות מרובות, כולל פרופילים שונים של גנים על כרומוזומי X ו- Y7 וההשפעות של הורמונים8. חקר הבסיס המולקולרי של הבדלים מבוססי מין יכול לספק הבנה טובה יותר של מחלות, ובסופו של דבר, לשפר את הרפואה המותאמת אישית.
משטח העין כולל את סרט הדמעות שמעליו, הקרנית והלחמית. הבדלים מבוססי מין נצפים במספר מרכיבים של משטח העין, כולל סרט הדמעות 9,10, קרנית 11, בלוטת הדמעות 12,13, ובלוטות מייבומיאן שגם מפרישות דמעות 12. מחקרים מכניסטיים רבים חקרו את ההשפעה של הורמוני מין על הקרנית ומרכיביה הקשורים14,15; עם זאת, מעט ידוע על ההבדלים מבוססי המין בלחמית ובתאי הגביע שלה. הלחמית היא קרום רירי המכסה את לובן העין ואת פני השטח הפנימיים של העפעף. אפיתל הלחמית מורכב מתאי קשקש לא קרקטיניים, רב-שכבתיים, מרובדים16.
בין תאי הקשקש המרובדים של הלחמית, ישנם תאי גביע (CGCs) המשולבים על פני השטח האפיקליים של האפיתל. תאי גביע אלה מאופיינים במספר רב של גרגרי הפרשה הממוקמים בקוטב האפי17. CGCs מסנתזים ומפרישים את המוצין MUC5AC יוצר הג'ל כדי להעניק לחות למשטח העין ולשמן אותו במהלך מצמוץ17. הפרשת מוצין מווסתת היטב על ידי התוך-תאי [Ca 2+] ([Ca2+]i) וההפעלה של קינאז מווסת אות חוץ-תאי תלוי Ras (ERK1/2)18. חוסר יכולת להפריש מוצין גורם ליובש של פני השטח של העין ו sequelae של הפרעות פתולוגיות. על משטח עיני מודלק, לעומת זאת, הפרשת מוצין נרחבת המגורה על ידי מתווכי דלקת מובילה לתפיסה של דביקות וגירוד של העין19. תנאים אלה עם הפרשת מוצין מופרעת יובילו בסופו של דבר להידרדרות פני העין.
תפקידם של תאי גביע כמקור העיקרי של מוצין עיני מוכר זה מכבר20, עם זאת, ההבדלים מבוססי המין בוויסות המוצין הן במצב פיזיולוגי והן במצב פתולוגי עדיין לא התגלו. מערכת במבחנה תהיה שימושית כדי לפקח על תפקודם של תאי גביע ללא ההשפעה ההורמונלית או עם רמה מבוקרת במדויק של הורמוני מין. למרות שקו תאי אפיתל לחמית התפתח21, אין קו תאי גביע עם הפרשת מוצין פונקציונלית זמינה. לכן, שינינו את תרבות ה-CGC האנושית הראשונית שפיתחנו כדי לבסס שיטה לניתוח ההבדל מבוסס המין במבחנה16, ולהציג אותו להלן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הרקמה האנושית נתרמה לבנק העיניים בהסכמה מדעת מראש ובאישור התורם לשימוש במחקר מדעי. השימוש ברקמת הלחמית האנושית נבדק על ידי הוועדה ללימודי אנוש של העיניים והאוזן של מסצ'וסטס ונקבע כי הוא פטור ואינו עונה על ההגדרה של מחקר עם נבדקים אנושיים.
1. תרבית תאי גביע אנושית ראשונית
- מבנק העיניים, להשיג רקמת הלחמית האנושית16.
- הכינו את מדיום התרבית, מדיום תרבית RPMI-1640 בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 2 מ"מ גלוטמין, 2 מ"מ חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), 2 מ"מ נתרן פירובט, 100 מיקרוגרם / מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין, ו 2 מ"מ 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1- חומצה פיפרזיניאתנסולפונית (HEPES).
- לבצע תרבית תאים ראשונית כמתואר להלן.
- טוחנים את הרקמה ל-1 מ"מ3 חתיכות עם אזמל סטרילי וזרעים על צלחות תרבית במכסה תרבית. זרעו ארבע חתיכות בכל באר של צלחת 6 בארות, ב 1 מ"ל של מדיה RPMI שלם. למרות שהכיוון של פיסת הרקמה אינו משפיע על צמיחת התאים, ודא שהחלקים נצמדים לצלחת התרבית כדי להבטיח צמיחה באמצעות להב האזמל.
- הכניסו את חלקי הרקמה לאינקובטור המכיל 95% אוויר ו-5% CO2 בטמפרטורה של 37°C. רעננו את אותו מדיום תרבית כל יומיים עד שתאי הגביע יגיעו למפגש של 70%-80% תוך כ-14 יום. הסר את תקע הרקמה כ 72 שעות לאחר הזריעה.
הערה: אפיתל הלחמית האנושי מכיל בעיקר תאי קשקש מרובדים ותאי גביע. RPMI הוא מדיה סלקטיבית לתאי גביע. לעתים רחוקות בתרבית CGC אנושית, פיברובלסטים עשויים לגדול סביב היום השביעי. השיטה לטיהור התרבות תוארה בפרסום קודם 22. - לאמת את טוהר תרבית GC באמצעות מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי (IFM) המכוון לציטוקרטין (CK)7 והליקס פומטיה לקטין-1 (HPA-1)22 בהתאם לשיטת IFM הסטנדרטית המתוארתב-19; ראה תוצאות מייצגות.
2. מעבר תאי גביע לחמית אנושיים והכנה ניסיונית
- שטפו את התאים עם PBS (pH = 7.4) ונתקו את התאים עם טריפסיניזציה באמצעות 0.05% טריפסין ב-1x EDTA. התבוננו בתאים כל דקה תחת מיקרוסקופ. ברגע שהתאים מתנתקים מהתחתית, נטרלו את פעולת הטריפסין באמצעות מדיית סל"ד מלאה.
- צנטריפוגה את התאים ב 150 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השהה מחדש את כדורית התא בתווך תרבית RPMI המלא וזרע מחדש על צלחות תרבית בעלות תחתית זכוכית למדידת [Ca2+]i . הנפח הכולל של המדיום הוא 300 μL לכל מנה. שמרו את המדיה במרכז חלק הזכוכית של המנה.
- חיסול הורמונים במדיה תרבותית: מדיום התרבית עשוי להכיל הורמוני מין, במיוחד FBS. מכיוון שהפנול האדום הכלול ב-RPMI-1640 הוא בעל פעילות אסטרוגנית 23,24, החלף את מדיום ה-RPMI בתווך RPMI נטול פנול אדום וכוונן את ה-pH ל-7.45 באמצעות רצועות pH לאחר הכנת המדיום המלא. HEPES הכלול בתווך המלא שומר על ה- pH לטווח קטן יחסית.
3. בדיקת Fura-2/אצטוקסימתיל (AM) למדידת [Ca2+]i
- בצע טעינת Fura-2/AM כמתואר להלן.
- דגור על התאים בצלחות זכוכית תחתונות למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37°C, אווירת הסביבה, ומוגן מפני אור עם חיץ ביקרבונט ביקרבונט Krebs-Ringer (KRB; מכיל 119 mM NaCl, 4.8 mM KCl, 1.0 mM CaCl 2, 1.2 mM MgSO4 ו-25 mM NaHCO3) עם 0.5% HEPES (טבלה 1), בתוספת 0.5% BSA, 0.5 מיקרומטר fura-2/AM, 8 מיקרומטר חומצה פלורונית F127, ו 250 מיקרומטר sulfinpyrazone.
- יש לכוונן את רמת החומציות ל-7.45 באמצעות מד חומציות לפני השימוש. לאחר טעינה עם fura-2/AM, שטפו את התאים עם KRB המכיל 250 מיקרומטר sulfinpyrazone מיד לפני [Ca2+]i מדידה.
- בצע מדידת [Ca2+]i כמתואר להלן.
- הניחו את הכלים המכילים את התאים העמוסים בפורה-2 מתחת למיקרוסקופ, אתרו שדה מייצג המכיל בין 20 תאים ל-50 תאים בהגדלה של פי 200, והשתמשו בפונקציה Freehand כדי לשרטט קו מתאר סביב כל תא כדי לציין לתוכנה מה פלואורסצנטי רקע ומה לא.
- המתן עד שהתוכנה תחסר באופן אוטומטי פלואורסצנטיות רקע מהמדידה ולחץ על הלחצן התחל ניסוי .
- לאחר מכן, המתן בין 8 s ל 15 s כדי לקבוע את רמות הסידן הבסיסי בתאים לפני pipeting בזהירות אגוניסט של עניין. המשך למדוד לפחות 120 שניות לאחר הוספת האגוניסט או עד שרמות הסידן יחזרו לקו הבסיס.
- בצע ניתוח נתונים כמתואר להלן.
- השתמש בשינוי בשיא [Ca2+]i כדי לייצג את פעולות הגירויים. חשב את רמת הסידן הבסיסית הממוצעת בכל תא מתוך 8-15 שניות הראשונות של המדידות. אם מספר זה שווה ל- 500 ננומטר או גבוה ממנו, הסר תא זה מערך הנתונים מכיוון שהוא עובר אפופטוזיס או נמק.
- לאחר חישוב הרמה הבסיסית של כל תא, הפחת סכום זה מהמקסימום שנמדד [Ca2+]i עבור אותו תא. ממוצע השינוי בשיא [Ca2+]I עבור כל התאים במנה נתונה.
- כדי להבטיח עקביות, רשום את התגובות של כל גירוי בכפילות, וחשב את הערך הממוצע של השינויים בשיא [Ca2+]i המתקבל מהכפילויות כנקודת נתונים אחת מהמדגם האנושי הבודד. השווה את הנתונים מקבוצות שונות באמצעות שיטת ניתוח נתונים מתאימה המבוססת על עיצוב המחקר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CGCs אנושיים בתרבית ראשונית גדלים למפגש של 80% תוך כ-14 יום. סוג התא אושר על-ידי צביעה אימונופלואורסצנטית עם נוגדנים לסמני תאי הגביע CK7 ו-HPA-125 (איור 1). למרות הסרת FBS מן המדיום יכול לחסל את הורמוני המין, חוסר FBS עלול להשפיע על התגובה התאית. כדי לאמת את שיטת סילוק ההורמונים, אגוניסט כולינרגי (carbachol, Cch 1 × 10-4 M) שימש כגירוי כדי לחקות את הפרשת תאי הגביע הפיזיולוגית בתיווך קצות עצבים שונים המקיפים את תאי הגביע26. לא נצפה הבדל בגודל השינוי בסידן ממדיום הסל"ד המלא של הבקרה, מה שמצביע על כך שניתן ליישם שיטה זו כדי לחקור את ההבדל מבוסס המין בתגובת התא.
בדיקת Fura-2/AM המתוארת בסעיף הפרוטוקול בוצעה על צלחות שטופלו בסל"ד מלא + 10% FBS בינוני, מדיום RPMI מתקדם (RPMI סיפק ריכוז קנייני של אינסולין) בתוספת 1% BSA, וסל"ד אדום פנול עם 1% BSA. התוצאות מתקבלות מארבעה אנשים. לא נמצא הבדל משמעותי כאשר משווים את התאים המודגרים בסל"ד אדום פנול עם 1% BSA ומדיום RPMI מלא. עם זאת, תגובת [Ca2+]i מוגברת באופן משמעותי ל-Cch 1 ×-10-4 M נצפתה כאשר השוו את הקבוצה הבינונית של הסל"ד המתקדם לקבוצה הבינונית השלמה של הסל"ד (איור 2). לסיכום, סל"ד אדום ללא פנול עם 1% BSA אינו משפיע על התגובה התאית של תאי הגביע, אפילו עולה בביצועיו על מדיום הסל"ד המתקדם במסגרת המחקר הנוכחי.
איור 1: תרבית ראשונית של תאי גביע לחמית אנושיים. תאי גביע הלחמית הועברו לכיסויים לאחר 14 יום בתרבית, ובוצע צביעה אימונופלואורסצנטית באמצעות נוגדן ראשוני נגד CK7 (אדום), ולקטין מצומד פלואורסצאין HPA-1 (ירוק). (A) התמונות צולמו תחת הגדלה של פי 200, ו-(B) התמונות צולמו תחת הגדלה של פי 630. CK7 מציג כאות פלואורסצנטי פרי-גרעיני (פאנל שמאלי); HPA-1 מציג תבנית פיסוק perinuclearly (לוח אמצעי). אות אימונופלואורסצנטי חיובי הן של CK7 והן של HPA-1 מצביע על תא גביע. שליטה שלילית היא דגירה בהיעדר הנוגדן הראשוני (C). מוטות קנה מידה = 50 מיקרומטר (A) ו- 8 מיקרומטר (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: השפעות של מדיות שונות על תגובת Cch [Ca2+]i. התאים הודגרו עם סל"ד אדום פנול עם 1% BSA, מדיית RPMI עם 10% FBS, או RPMI מתקדם עם 1% BSA במשך 48 שעות דגירה לפני תוספת של 1 × 10-4 M Cch. [Ca 2+]i נמדד על ידי בדיקת Fura2 והשינוי בשיא [Ca2+]i חושב והוצג בגרף. הסרגל השחור מציין מדיום מלא עם אדום פנול ו-10% FBS. הסרגל הכתום מציין מדיום מתקדם עם 1% BSA, והפס האפור מציין RPMI ללא אדום פנול ועם 1% BSA. הנתונים ממוצעים ± SEM, n = 4. ANOVA חד-כיווני עם תיקון דנט שימש במספר השוואות קבוצתיות, p < 0.05 נקבע כמובהק סטטיסטית. * מצביע על הבדל משמעותי בין הקבוצות. קיצורים: Cch = carbachol; [כא2+] i = ריכוז Ca2+ תוך תאי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| רכיב מלאי | כמות עבור 250 מ"ל של KRB | ריכוז סופי |
| גלוקוז | 0.25 גרם | 0.1% עם V |
| 1 מטר NaCl | 30 מ"ל | 119 מ"מ |
| 0.5 מטר NaHCO3 | 12.5 מ"ל | 25 מ"מ |
| 1 M 4-(2-hydroxyethyl)-1- חומצה piperazineethanesulfonic (HEPES) | 2.5 מ"ל | 10 מ"מ |
| 1 מטר KCl | 1.2 מ"ל | 4.8 מ"מ |
| 1 מ ח2PO4 | 300 μL | 1.2 מ"מ |
| 1 מטר מגסו4 | 300 μL | 1.2 מ"מ |
| 1 מטר CaCl2 | 250 מיקרוליטר | 1 מ"מ |
טבלה 1: חומר ונוסחה עבור KRB. קיצור: w/v, משקל/נפח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
חקירת ההבדלים מבוססי המין ברקמות העין מסייעת להבין את תהליכי המחלות, במיוחד עין יבשה ודלקת לחמית אלרגית, המשפיעות באופן לא פרופורציונלי על מין אחד 4,5,6. למרות שניתן להשתמש במודלים של בעלי חיים עבור מחקרים אלה, נתונים המתקבלים ישירות מרקמה אנושית חיוניים בשל הדמיון הגבוה ביותר לתאים האנושיים in vivo. רקמות הלחמית המשמשות במסגרת הניסוי הנוכחית הן מתורמים שנפטרו בטווח הגילאים של 70-85 שנים (לאחר גיל המעבר), מה שמקל על השליטה בהשפעה ההורמונלית אנטה מורטם. כאן, הצגנו שיטה חסכונית לחקר הבדלים מבוססי מין ב- CGCs אנושיים.
השלב הקריטי להשגת נתונים עקביים הוא הסרת FBS ופנול אדום למשך 48 שעות לפני ניסויים לחיסול ההשפעות של הורמוני מין. ניתן לסווג את הפעולות של הורמוני המין בתאים להשפעות שאינן שעתוק ושעתוק . ההשפעות הלא-שעתוק מתווכות במהירות באמצעות חלבוני G תוך מספר שניות עד דקות, ואפקט השעתוק שבו גנים מסוימים מופעלים אורך 30 דקות עד מספר שעות27; זמן מחצית החיים של קולטן אסטרוגן המושרה על ידי אסטרוגן אלפא (ERα) הוא 2-6 שעות28,29. למרות ששיעורי התחלופה של סוגים אחרים של חלבונים המושרים על ידי הורמוני מין מדווחים לעתים רחוקות, תוצאות המחקרים הקיימים מצביעות על כך שחלבונים המושרים על ידי הורמוני מין מסונתזים ומתפרקים תוך שעות. לכן, 48 שעות הוא מספיק זמן כדי לשטוף את ההשפעה הפוטנציאלית של הורמונים הכלולים FBS תוך שמירה על תפקוד תאי תקין. באמצעות השיטה הנוכחית דיווחנו בהצלחה על הבדלים מבוססי מין בביטוי קולטני הורמוני מין ותפקודים תאיים ב-CGCs30.
FBS הוא גורם חיוני עבור תרביות תאי גביע להישאר בריא ובר קיימא. החלפת FBS רגיל מומת בחום עם FBS מופשט פחם היא דרך אפשרית נוספת לחסל הורמוני מין במערכת התרבית. המגבלה של שימוש בפחם מופשט FBS היא העלות ואת ההרכב המורכב של FBS. הסרה מוחלטת של FBS מבטלת גם את חוסר העקביות הפוטנציאלי מהרכיבים הבינוניים הבלתי מוגדרים של FBS.
השלב הקריטי למדידת [Ca2+]i הוא לייצב את ה- pH והטמפרטורה. למרות תוסף HEPES, שמנו לב לשינוי של pH במאגר KRB לאורך זמן כאשר מאוחסן בטמפרטורת החדר. לכן, התאמה מחדש של ה- pH של המאגר מומלצת לניסוי ארוך, בערך כל 3 שעות. אותה שיטת [Ca2+]i חלה גם על סוגים אחרים של תאים כגון תאי קשקש מרובדים של הלחמית, תאי אנדותל וסקולריים, תאי מיקרוגליאה ונוירונים כדי לחקור את פעולתם של גירויים שונים.
קשירה של Fura-2 לסידן חופשי בתא גורמת לשינוי באורך הגל של שיא הבליעה שלו מ-380 ננומטר (לא קשור) ל-340 ננומטר (קשור). עם זאת, אורך גל הפליטה נשאר על 510 ננומטר ופליטות אלה נלכדות על ידי המצלמה כתמונות בשחור-לבן. היחס בין עוצמת הפליטה המעוררת באור 340 ננומטר ואור 380 ננומטר נרשם. מלבד השוואת יחס 340/380 לעקומת עמידה כדי לחשב ריכוז [Ca2+]i , ניתן גם לדווח על שינוי הקיפול של היחס מבלי ליצור עקומה סטנדרטית, ולכן ללא ריכוז בפועל. החוקרים יכולים לבחור בכל דרך בהתבסס על מערך הציוד שלהם ותכנון הניסוי.
לסיכום, תאי גביע לחמית ראשוניים בתרבית יכולים לשמש כמודל לחקר ההבדלים מבוססי המין של מחלות פני השטח של העין. דגירה במשך 48 שעות בתווך RPMI ללא פנול אדום עם 1% BSA לפני ביצוע ניסויים כלשהם היא שיטה עקבית וחסכונית לחיסול ההשפעות האפשריות של הורמונים במדיה תרבית וניתן להשתמש בה כמדיום בסיסי לשליטה ברמות ההורמונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
העבודה ממומנת על ידי EY019470 המענקים של המכון הלאומי לעיניים (D.A.D).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin with 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
| Advanced RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
| carbachol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
| Fetal Bovin Serum | R&D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
| Fura-2- acetoxymethyl ester | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
| Human conjunctival tissue | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
| inorganic salt for KRB buffer | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Any brand will work | |
| L-glutamine | Lonza Group (Basel, Switzerland) | 17-605F | |
| non-essential amino acids | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
| phenol red-free RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
| Pluronic acid F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
| scalpel | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | Any sterile surgical scalpel can work |
| sodium pyruvate | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
| sulfinpyrazone | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |
References
- Gao, Y., et al. Female-specific downregulation of tissue polymorphonuclear neutrophils drives impaired regulatory T cell and amplified effector T cell responses in autoimmune dry eye disease. Journal of Immunology. 195, 3086-3099 (2015).
- Wang, S. B., et al. Estrogen negatively regulates epithelial wound healing and protective lipid mediator circuits in the cornea. FASEB Journal. 26, 1506-1516 (2012).
- Sullivan, D. A., Block, L., Pena, J. D. Influence of androgens and pituitary hormones on the structural profile and secretory activity of the lacrimal gland. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 74, 421-435 (1996).
- Schaumberg, D. A., Dana, R., Buring, J. E., Sullivan, D. A. Prevalence of dry eye disease among US men: estimates from the Physicians' Health Studies. Archives of Ophthalmology. 127, 763-768 (2009).
- Tellefsen Nøland, S., et al. Sex and age differences in symptoms and signs of dry eye disease in a Norwegian cohort of patients. The Ocular Surface. 19, 68-73 (2021).
- Sullivan, D. A., et al. TFOS DEWS II Sex, gender, and hormones report. The Ocular Surface. 15, 284-333 (2017).
- Meester, I., et al. SeXY chromosomes and the immune system: reflections after a comparative study. Biology of Sex Differences. 11, 3 (2020).
- Yang, J. -H., et al. Hormone replacement therapy reverses the decrease in natural killer cytotoxicity but does not reverse the decreases in the T-cell subpopulation or interferon-gamma production in postmenopausal women. Fertility and Sterility. 74, 261-267 (2000).
- Orucoglu, F., Akman, M., Onal, S. Analysis of age, refractive error and gender related changes of the cornea and the anterior segment of the eye with Scheimpflug imaging. Contact Lens & Anterior Eye. 38, 345-350 (2015).
- Strobbe, E., Cellini, M., Barbaresi, U., Campos, E. C. Influence of age and gender on corneal biomechanical properties in a healthy Italian population. Cornea. 33, 968-972 (2014).
- Sullivan, D. A., Jensen, R. V., Suzuki, T., Richards, S. M. Do sex steroids exert sex-specific and/or opposite effects on gene expression in lacrimal and meibomian glands. Molecular Vision. 15, 1553-1572 (2009).
- Bukhari, A. A., Basheer, N. A., Joharjy, H. I. Age, gender, and interracial variability of normal lacrimal gland volume using MRI. Ophthalmic Plastic and Reconstructive Surgery. 30, 388-391 (2014).
- Sullivan, B. D., Evans, J. E., Dana, M. R., Sullivan, D. A. Influence of aging on the polar and neutral lipid profiles in human meibomian gland secretions. Archives of Ophthalmology. 124, 1286-1292 (2006).
- Ebeigbe, J. A., Ebeigbe, P. N. The influence of sex hormone levels on tear production in postmenopausal Nigerian women. African Journal of Medicine and Medical Sciences. 43, 205-211 (2014).
- Suzuki, T., et al. Estrogen's and progesterone's impact on gene expression in the mouse lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, 158-168 (2006).
- Shatos, M. A., et al. Isolation and characterization of cultured human conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 2477-2486 (2003).
- Huang, A. J., Tseng, S. C., Kenyon, K. R. Morphogenesis of rat conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 29, 969-975 (1988).
- Li, D., et al. Resolvin D1 and aspirin-triggered resolvin D1 regulate histamine-stimulated conjunctival goblet cell secretion. Mucosal Immunology. 6, 1119-1130 (2013).
- Dartt, D. A., Masli, S. Conjunctival epithelial and goblet cell function in chronic inflammation and ocular allergic inflammation. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 14, 464-470 (2014).
- Mantelli, F., Argüeso, P. Functions of ocular surface mucins in health and disease. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 8, 477-483 (2008).
- García-Posadas, L., et al. Characterization and functional performance of a commercial human conjunctival epithelial cell line. Experimental Eye Research. 223, 109220 (2022).
- Shatos, M. A., et al. Isolation, characterization, and propagation of rat conjunctival goblet cells in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42, 1455-1464 (2001).
- Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C.
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 2496-2500 (1986).
- García-Posadas, L., et al. Interaction of IFN-γ with cholinergic agonists to modulate rat and human goblet cell function. Mucosal Immunology. 9, 206-217 (2016).
- Li, D., Jiao, J., Shatos, M. A., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Effect of VIP on intracellular [Ca2 ], extracellular regulated kinase 1/2, and secretion in cultured rat conjunctival goblet cells. Investigative Opthalmology & Visual Science. 54, 2872-2884 (2013).
- Contrò, V., et al. Sex steroid hormone receptors, their ligands, and nuclear and non-nuclear pathways. AIMS Molecular Science. 2, 294-310 (2015).
- Valley, C. C., Solodin, N. M., Powers, G. L., Ellison, S. J., Alarid, E. T. Temporal variation in estrogen receptor-alpha protein turnover in the presence of estrogen. Journal of Molecular Endocrinology. 40, 23-34 (2008).
- Campen, C. A., Gorski, J. Anomalous behavior of protein synthesis inhibitors on the turnover of the estrogen receptor as measured by density labeling. Endocrinology. 119, 1454-1461 (1986).
- Yang, M., et al. Sex-based differences in conjunctival goblet cell responses to pro-inflammatory and pro-resolving mediators. Scientific Reports. 12, 16305 (2022).
