Summary
フェノールレッドフリー/ウシ胎児血清フリー培地は、性差の研究において結膜杯細胞の正常な機能を変えることなく外因性ホルモンを排除するための高度なRPMIよりも優れた選択肢です。
Abstract
ドライアイは、眼の表面の健康に影響を与える多因子性疾患であり、女性で非常に高い有病率があります。結膜杯細胞(CGC)によって眼表面に分泌されるゲル形成ムチンの破壊は、複数の眼表面疾患の一因となります。外因性性ホルモンの除去は、CGCの性差のin vitro研究中に一貫した結果を得るために不可欠です。この論文では、CGCの生理学的機能を維持しながら、CGCの性差の研究において外因性ホルモンの存在を最小限に抑える方法について説明します。死後ヒトの男女ドナー由来のCGCを、10%ウシ胎児血清(FBS)(完全培地と呼ぶ)を含むRPMI培地で結膜片からコンフルエントになるまで培養した。実験開始の約48時間前に、CGCをフェノールレッドまたはFBSを含まず、1%BSA(フェノールレッドフリー培地と呼ぶ)を含むRPMI培地に移しました。正常な細胞機能は、fura 2/アセトキシメチル(AM)顕微鏡を使用してカルバコール(Cch、1 x 10-4 M)刺激後の細胞内[Ca2+]([Ca2+]i)の増加を測定することによって研究されました。結果は、CGCがフェノールレッドフリー培地中で48時間後に正常な機能を維持したことを示しています。Cch刺激によるフェノール赤色含みRPMI培地と完全培地の間で[Ca2+]i応答に有意差は認められませんでした。したがって、性差の研究においてCGCの正常な機能を変えることなく外因性ホルモンを排除するために、1% BSAを含むフェノールレッドフリーRPMI培地を使用することをお勧めします。
Introduction
性差は眼表面の複数のプロセスに影響を及ぼします1,2,3。これらの性別に基づく違いの臨床症状は、ドライアイや結膜炎など、男性と女性の間の多くの眼表面疾患の有病率の違いです4,5,6。性差は、X染色体とY染色体上の遺伝子のプロファイルの違い7やホルモンの影響8など、複数の生物学的レベルから生じることを示唆する証拠がある。性差の分子基盤を研究することで、病気の理解が深まり、ひいては個別化医療の向上につながります。
眼球表面は、上にある涙液膜、角膜、および結膜で構成されています。性による違いは、涙液膜9,10、角膜11、涙腺12,13、涙腺12、涙腺12など、眼表面の複数の構成要素で観察される。多くのメカニズム研究により、角膜とその関連成分に対する性ホルモンの影響が調査されています14,15。しかし、結膜とその杯細胞の性差についてはほとんど知られていません。結膜は、強膜とまぶたの内面を覆う粘膜です。結膜の上皮は、角質化しない多層層の層状扁平上皮細胞で構成されています16。
結膜の層状扁平上皮細胞の中には、上皮の頂端表面に点在する杯細胞(CGC)があります。これらの杯細胞は、頂端極17に位置する多数の分泌顆粒によって特徴付けられる。CGCは、ゲル形成ムチンMUC5ACを合成して分泌し、眼表面に潤いを与え、まばたき中に滑らかにします17。ムチンの分泌は、細胞内[Ca 2+]([Ca 2+]i)とRas依存性細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK1/2)の活性化によって厳密に制御されている18。ムチンを分泌できないと、眼表面が乾燥し、病理学的異常が後遺症になります。しかし、炎症を起こした眼の表面では、炎症性メディエーターによって刺激された広範なムチン分泌により、目の粘着性やかゆみが知覚されます19。ムチン分泌が乱れるこれらの状態は、最終的に眼表面の悪化につながります。
眼のムチンの主要な供給源としての杯細胞の役割は長い間認識されてきましたが20、生理学的および病理学的状態の両方におけるムチン調節の性に基づく違いは未発見のままです。 in vitro システムは、ホルモンの影響なしに、または性ホルモンのレベルを正確に制御して杯細胞の機能を監視するのに役立ちます。結膜上皮細胞株が発達したにもかかわらず21、機能的なムチン分泌を持つ杯細胞株は存在しない。そこで、開発した初代ヒトCGC培養液を改変し、 in vitro16で性差を解析する方法を確立し、以下のように発表する。
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Protocol
すべてのヒト組織は、事前のインフォームドコンセントと科学研究で使用するためのドナーの承認を得て、アイバンクに寄付されました。ヒト結膜組織の使用は、マサチューセッツ州眼耳人間研究委員会によってレビューされ、免除され、ヒト被験者を対象とした研究の定義を満たしていないと判断されました。
1. 初代ヒト杯細胞培養
- アイバンクから、ヒト結膜組織16を得る。
- 10%ウシ胎児血清(FBS)、2 mMグルタミン、2 mM非必須アミノ酸(NEAA)、2 mMピルビン酸ナトリウム、100 μg/mLペニシリン-ストレプトマイシン、および2 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)を添加したRPMI-1640培地を調製します。
- 下記の方法で初代細胞培養を行います。
- 滅菌メスで組織を1mm3 個に細かく刻み、培養フード内の培養プレートに種をまきます。6ウェルプレートの各ウェルに4個を播種し、1 mLの完全RPMI培地に播種します。組織片の向きは細胞増殖に影響を与えませんが、メスの刃を使用して確実に成長できるように、断片が培養プレートに付着していることを確認してください。
- 組織片を95%の空気と5%のCO2 を含むインキュベーターに37°Cで入れます。 杯細胞が約14日で70%〜80%の濃度に達するまで、2日ごとに同じ培養培地をリフレッシュします。播種後約72時間でティッシュプラグを取り外します。
注:ヒト結膜上皮には、主に層状扁平上皮細胞と杯細胞が含まれています。RPMIは杯細胞の選択的培地です。まれにヒトCGC培養では、線維芽細胞が7日目頃に増殖することがあります。培養物を精製する方法は、以前の出版物 22に記載されている。 - サイトケラチン(CK)7およびHelix pomatia lectin-1(HPA-1)22 を標的とする免疫蛍光顕微鏡(IFM)を用いて、19に記載されている標準的なIFM法に従ってGC培養の純度を検証します。代表的な結果を参照してください。
2.ヒト結膜杯細胞の通過と実験の準備
- 細胞をPBS(pH = 7.4)で洗浄し、1x EDTAで0.05%トリプシンを使用してトリプシン処理で細胞を剥離します。顕微鏡で毎分細胞を観察します。細胞が底部から剥離したら、完全なRPMI培地を使用してトリプシンを不活性化します。
- 細胞を150× g で室温で5分間遠心分離します。細胞ペレットを完全なRPMI培地に再懸濁し、[Ca2+]i 測定用のガラス底培養皿に再播種します。培地の総容量は、皿当たり300μLである。メディアを皿のガラス部分の中央に置いてください。
- 培地中のホルモンの除去:培地には性ホルモン、特にFBSが含まれている可能性があります。RPMI-1640に含まれるフェノールレッドにエストロゲン活性23,24があるため、RPMI培地をフェノールレッドフリーRPMI培地と交換し、完全な培地を準備した後、pHストリップを使用してpHを7.45に調整します。完全な培地に含まれるHEPESは、pHを比較的低い範囲に維持します。
3. Fura-2/アセトキシメチル(AM)アッセイによる[Ca2+]i 測定
- Fura-2/AMの装填は、以下の手順で行います。
- ガラス底のディッシュ内で細胞を37°C、常温雰囲気で1時間インキュベートし、Krebs-Ringer重炭酸緩衝液(KRB;119 mM NaCl、4.8 mM KCl、1.0 mM CaCl 2、1.2 mM MgSO4、および25 mM NaHCO3を含む)と0.5% HEPES(表1)と0.5% BSA、0.5 μM fura-2/AMでインキュベートします。 8μMのプルロン酸F127、および250μMのスルフィンピラゾン。
- 使用前にpH計を使用してpHを7.45に調整してください。fura-2/AMをロードした後、[Ca 2+]i測定の直前に250 μMスルフィンピラゾンを含むKRBで細胞を洗浄します。
- [Ca2+]i 測定は下記のように行います。
- fura-2をロードした細胞を含むディッシュを顕微鏡下に置き、20倍の倍率で20〜50個の細胞を含む代表的なフィールドを見つけ、 フリーハンド 機能を使用して各細胞の周囲に輪郭を描き、何がバックグラウンド蛍光で何がバックグラウンド蛍光でないかをソフトウェアに示します。
- ソフトウェアが測定からバックグラウンド蛍光を自動的に差し引くのを待ってから、[ 実験の開始 ]ボタンをクリックします。
- 次に、8秒から15秒待って細胞内の基礎カルシウムレベルを確立してから、目的のアゴニストを慎重にピペッティングします。アゴニストを追加した後、またはカルシウムレベルがベースラインに戻るまで、少なくとも120秒間測定を続けます。.
- 以下で説明するようにデータ分析を実行します。
- ピーク [Ca2+]i の変化を使用して、刺激の作用を表します。測定の最初の8〜15秒から各セルの平均基礎カルシウムレベルを計算します。その数値が 500 nM 以上の場合は、アポトーシスまたは壊死を起こしているそのセルをデータセットから削除します。
- 各セルの基底レベルが計算されたら、同じセルで測定された最大値[Ca2+]i からその量を差し引きます。特定のディッシュ内のすべてのセルのピーク[Ca2+]I の変化を平均します。
- 一貫性を確保するために、各刺激の応答を二重に記録し、重複から得られたピーク[Ca 2+]i の変化の平均値を個々のヒトサンプルからの1つのデータポイントとして計算します。研究デザインに基づく適切なデータ分析方法を使用して、異なるグループのデータを比較します。
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Representative Results
初代培養中のヒトCGCは、約14日で80%のコンフルエントに増殖します。細胞型は、杯細胞マーカーCK7およびHPA-125 に対する抗体による免疫蛍光染色によって確認されました(図1)。培地からFBSを除去すると性ホルモンが除去されますが、FBSの欠乏は細胞応答に影響を与える可能性があります。ホルモン除去法を検証するために、コリン作動性アゴニスト(カルバコール、Cch 1 × 10-4 M)を刺激として使用して、杯細胞を取り巻く異なる神経終末によって媒介される生理学的杯細胞分泌を模倣した26。対照の完全RPMI培地からカルシウムの変化の大きさに差は観察されず、この方法は細胞応答の性差の研究に適用できることを示しています。
プロトコールの項に記載されているFura-2/AMアッセイは、完全なRPMI + 10%FBS培地、1%BSAを添加した高度なRPMI培地(RPMIは独自の濃度のインスリンを供給)、およびフェノールレッドフリーRPMIを1%BSAで処理した皿で実施しました。結果は4人の個人から得られます。フェノールレッドフリーRPMIでインキュベートした細胞を1%BSAおよび完全RPMI培地と比較した場合、有意差は認められませんでした。しかし、高度なRPMI培地群と完全なRPMI培地群を比較すると、10-4 M×Cch 1に対する[Ca2+]i応答の有意な増加が観察されました(図2)。要約すると、1% BSAを含むフェノール赤色フリーRPMIは、杯細胞の細胞応答に影響を与えず、現在の研究環境において高度なRPMI培地よりも優れています。
図1:ヒト結膜杯細胞の初代培養。 結膜杯細胞を14日間培養した後、カバーガラス上に継代し、CK7(赤)に対する一次抗体とフルオレセイン結合レクチンHPA-1(緑)を用いた免疫蛍光染色を行った。(A)画像は200倍の倍率で撮影し、(B)画像は630倍の倍率で撮影しました。CK7は核周囲蛍光シグナルとして現れます(左パネル)。HPA-1は、ペリヌリー(中央のパネル)に句読点のパターンを示します。CK7およびHPA-1の両方の陽性免疫蛍光シグナルは、杯細胞を示します。ネガティブコントロールは、一次抗体(C)の非存在下でのインキュベーションです。スケールバー = 50 μm (A) および 8 μm (B)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:Cch誘導性[Ca2+]i応答に対する異なる培地の影響。 細胞をフェノールレッドフリーRPMIと1%BSA、RPMI培地と10%FBS、または1%BSAと進行RPMIで48時間インキュベートした後、1×10-4 M Cchを添加してインキュベートしました。 [Ca 2+]iをFura2アッセイで測定し、ピーク[Ca2+]iの変化を計算してグラフに示しました。黒いバーは、フェノールレッドと10%FBSを含む完全な培地を示しています。オレンジ色のバーはBSAが1%の高度な培地を示し、灰色のバーはフェノールレッドを含まず、BSAが1%のRPMIを示します。データはSEM±平均値、n = 4です。多重群比較では、ダネット補正による一元配置分散分析を使用し、p < 0.05を統計的に有意なものとして設定しました。*はグループ間の有意差を示します。略語:Cch =カルバコール;[約2+]i = 細胞内Ca2+濃度。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| ストックコンポーネント | KRB250 mLの量 | 最終集中 |
| グルコース | 0.25グラム | 0.1%W/V |
| 1 mのNaCl | 30 mLの | 119ミリメートル |
| 0.5 M NaHCO3 | 12.5 mLの | 25ミリメートル |
| 1 M 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES) | 2.5 mLの | 10ミリメートル |
| 1 M KCl | 1.2 mLの | 4.8ミリメートル |
| 1 M KH2PO4 | 300 μL | 1.2ミリメートル |
| 1 M MgSO4 | 300 μL | 1.2ミリメートル |
| 1 M CaCl 2 (カルシウム2) | 250μL | 1ミリメートル |
表1:KRBの材料と式。 略語:w / v、重量/体積。
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Discussion
眼組織の性差を調査することは、片方の性に不釣り合いに影響を及ぼす疾患、特にドライアイやアレルギー性結膜炎のプロセスを理解するのに役立ちます4,5,6。これらの研究には動物モデルを使用できますが、in vivoのヒト細胞との類似性が最も高いため、ヒト組織から直接得られたデータが不可欠です。現在の実験環境で使用されている結膜組織は、70〜85歳(閉経後)の年齢範囲の死亡したドナーからのものであり、生前のホルモン効果を制御しやすくなっています。ここでは、ヒトCGCの性差を研究するための費用対効果の高い方法を提示しました。
一貫したデータを取得するための重要なステップは、性ホルモンの影響を排除するために、実験の前にFBSとフェノールレッドを48時間除去することです。細胞内の性ホルモンの作用は、非転写効果と転写効果に分類できます。非転写効果は、数秒から数分でGタンパク質を介して急速に媒介され、特定の遺伝子が活性化される転写効果は30分から数時間かかります27;エストロゲン誘導性エストロゲン受容体アルファ(ERα)の半減期は2〜6時間28,29です。他のタイプの性ホルモン誘発タンパク質の代謝回転率はめったに報告されていませんが、既存の研究の結果は、性ホルモン誘発タンパク質が数時間以内に合成および分解されることを示しています。したがって、48時間は、正常な細胞機能を維持しながら、FBSに含まれるホルモンの潜在的な効果を洗い流すのに十分な時間です。本手法を用いて、CGCにおける性ホルモン受容体の発現と細胞機能における性差の報告に成功した30。
FBSは、杯細胞培養が健康で生存可能な状態を維持するために不可欠な因子です。通常の熱不活化FBSを木炭除去FBSに置き換えることは、培養系内の性ホルモンを排除する別の可能な方法です。木炭剥離FBSの使用制限は、FBSのコストと複雑な組成です。FBSを完全に除去すると、FBSの未定義の培地コンポーネントによる潜在的な不整合も排除されます。
[Ca2+]i 測定の重要なステップは、pHと温度を安定させることです。HEPESサプリメントにもかかわらず、室温で保存すると、KRB緩衝液のpHが時間の経過とともに変化することに気付きました。したがって、緩衝液のpHの再調整は、約3時間ごとの長時間の実験に推奨されます。同じ[Ca2+]i 法は、結膜の層状扁平上皮細胞、血管内皮細胞、ミクログリア細胞、ニューロンなどの他の種類の細胞にも適用され、さまざまな刺激の作用を研究します。
Fura-2が細胞内の遊離カルシウムに結合すると、そのピーク吸収波長が380 nm(非結合)から340 nm(結合)に変化します。ただし、発光波長は510nmのままであり、これらの発光はカメラによって白黒画像としてキャプチャされます。340nmの光と380nmの光で励起された発光強度の比が記録されます。340/380比をスタンド曲線と比較して[Ca2+]i 濃度を計算する以外に、標準曲線を作成せずに、したがって実際の濃度なしで比の倍数変化を報告することもできます。研究者は、機器のセットアップと実験計画に基づいて、いずれかの方法を選択できます。
結論として、培養された初代結膜杯細胞は、眼表面疾患の性差を研究するためのモデルとして使用できます。実験を行う前に、1% BSAを含むフェノールレッドフリーRPMI培地中で48時間インキュベートすることは、培地中のホルモンの潜在的な影響を排除するための一貫した費用対効果の高い方法であり、ホルモンレベルを制御するための基礎培地として使用できます。
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Disclosures
著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、National Eye Institute Grant EY019470(D.A.D)から資金提供を受けています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin with 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
| Advanced RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
| carbachol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
| Fetal Bovin Serum | R&D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
| Fura-2- acetoxymethyl ester | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
| Human conjunctival tissue | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
| inorganic salt for KRB buffer | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Any brand will work | |
| L-glutamine | Lonza Group (Basel, Switzerland) | 17-605F | |
| non-essential amino acids | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
| phenol red-free RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
| Pluronic acid F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
| scalpel | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | Any sterile surgical scalpel can work |
| sodium pyruvate | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
| sulfinpyrazone | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |
References
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