Summary
Il terreno privo di fenolo rosso/siero fetale bovino è un'opzione migliore rispetto all'RPMI avanzato per eliminare gli ormoni esogeni senza alterare la normale funzione delle cellule caliciformi congiuntivali nello studio delle differenze basate sul sesso.
Abstract
L'occhio secco è una malattia multifattoriale che colpisce la salute della superficie oculare, con una prevalenza profondamente più elevata nelle donne. La rottura della mucina gelificante secreta dalle cellule caliciformi congiuntivali (CGC) sulla superficie oculare contribuisce a molteplici malattie della superficie oculare. L'eliminazione degli ormoni sessuali esogeni è essenziale per ottenere risultati coerenti durante lo studio in vitro delle differenze basate sul sesso nei CGC. Questo articolo descrive un metodo per ridurre al minimo la presenza di ormoni esogeni nello studio delle differenze basate sul sesso nei CGC mantenendo la loro funzione fisiologica. I CGC di donatori umani post-mortem di entrambi i sessi sono stati coltivati da pezzi della congiuntiva in terreno RPMI con il 10% di siero fetale bovino (FBS) (indicato come il terreno completo) fino alla confluenza. Circa 48 ore prima dell'inizio degli esperimenti, i CGC sono stati trasferiti in un terreno RPMI senza rosso fenolo o FBS ma con l'1% di BSA (indicato come mezzo privo di rosso fenolo). La normale funzione cellulare è stata studiata misurando l'aumento della stimolazione intracellulare [Ca2+] ([Ca2+]i) dopo stimolazione con carbacolo (Cch, 1 x 10-4 M) utilizzando la microscopia fura 2/acetossimetile (AM). Il risultato mostra che i CGC hanno mantenuto la normale funzione nei terreni privi di rosso fenolo dopo 48 ore. Non è stata osservata alcuna differenza significativa nella risposta [Ca2+]i tra il terreno RPMI privo di rosso fenolo e il terreno completo dopo stimolazione Cch. Pertanto, si consiglia di utilizzare il terreno RPMI privo di rosso fenolo con l'1% di BSA per eliminare gli ormoni esogeni senza alterare la normale funzione dei CGC nello studio delle differenze basate sul sesso.
Introduction
Le differenze basate sul sesso influenzano molteplici processi della superficie oculare 1,2,3. La manifestazione clinica di queste differenze basate sul sesso è la differenza nella prevalenza di molte malattie della superficie oculare tra uomini e donne, come l'occhio secco e la congiuntivite 4,5,6. L'evidenza suggerisce che le differenze basate sul sesso derivano da più livelli biologici, compresi i diversi profili dei geni sui cromosomi X e Y7 e gli effetti degli ormoni8. Studiare le basi molecolari delle differenze basate sul sesso può fornire una migliore comprensione della malattia e, infine, migliorare la medicina personalizzata.
La superficie oculare comprende il film lacrimale sovrastante, la cornea e la congiuntiva. Le differenze basate sul sesso sono osservate in più componenti della superficie oculare, tra cui il film lacrimale 9,10, la cornea 11, la ghiandola lacrimale 12,13 e le ghiandole di Meibomio che secernono anche lacrime 12. Numerosi studi meccanicistici hanno indagato l'effetto degli ormoni sessuali sulla cornea e sui suoi componenti associati14,15; Tuttavia, si sa poco sulle differenze basate sul sesso nella congiuntiva e nelle sue cellule caliciformi. La congiuntiva è una membrana mucosa che ricopre la sclera e la superficie interna della palpebra. L'epitelio della congiuntiva è costituito da cellule squamose stratificate, multistrato e non cheratinizzanti16.
Tra le cellule squamose stratificate della congiuntiva, ci sono cellule caliciformi (CGC) sparse sulla superficie apicale dell'epitelio. Queste cellule caliciformi sono caratterizzate dal gran numero di granuli secretori situati al polo apicale17. I CGC sintetizzano e secernono la mucina gelificante MUC5AC per idratare la superficie oculare e lubrificarla durante il battito delle palpebre17. La secrezione di mucina è strettamente regolata dalla [Ca 2+] intracellulare ([Ca2+]i) e dall'attivazione della chinasi regolata dal segnale extracellulare Ras-dipendente (ERK1/2)18. L'incapacità di secernere mucina provoca secchezza della superficie oculare e sequele di anomalie patologiche. Su una superficie oculare infiammata, tuttavia, un'estesa secrezione di mucina stimolata da mediatori dell'infiammazione porta a una percezione di viscosità e prurito dell'occhio19. Queste condizioni con una secrezione di mucina disturbata alla fine porteranno al deterioramento della superficie oculare.
Il ruolo delle cellule caliciformi come principale fonte di mucina oculare è stato a lungo riconosciuto20, tuttavia, le differenze basate sul sesso nella regolazione della mucina sia negli stati fisiologici che patologici rimangono sconosciute. Un sistema in vitro sarebbe utile per monitorare la funzione delle cellule caliciformi senza l'effetto ormonale o con un livello di ormoni sessuali controllato con precisione. Anche se una linea cellulare epiteliale congiuntivale ha sviluppato21, non esiste una linea cellulare a calici con secrezione funzionale di mucina. Pertanto, abbiamo modificato la nostra coltura CGC umana primaria sviluppata per stabilire un metodo per analizzare la differenza basata sul sesso in vitro16 e presentarla come di seguito.
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Protocol
Tutti i tessuti umani sono stati donati alla banca degli occhi con il previo consenso informato e l'autorizzazione del donatore per l'uso nella ricerca scientifica. L'uso del tessuto congiuntivale umano è stato esaminato dal Massachusetts Eye and Ear Human Studies Committee ed è risultato esente e non conforme alla definizione di ricerca con soggetti umani.
1. Colture primarie di cellule di calici umani
- Dalla banca degli occhi, ricavare il tessuto congiuntivale umano16.
- Preparare il terreno di coltura, il terreno di coltura RPMI-1640 integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 2 mM di glutammina, 2 mM di aminoacidi non essenziali (NEAA), 2 mM di piruvato di sodio, 100 μg/mL di penicillina-streptomicina e 2 mM di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico (HEPES).
- Eseguire la coltura cellulare primaria come descritto di seguito.
- Tritare il tessuto in3 pezzi di 1 mm con un bisturi sterile e seminare su piastre di coltura in un cappuccio di coltura. Seminare quattro pezzi in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti, in 1 mL di terreno RPMI completo. Sebbene l'orientamento del pezzo di tessuto non influisca sulla crescita cellulare, assicurarsi che i pezzi aderiscano alla piastra di coltura per garantire la crescita utilizzando la lama del bisturi.
- Introdurre i pezzi di tessuto nell'incubatrice contenente il 95% di aria e il 5% di CO2 a 37 °C. Rinfrescare lo stesso terreno di coltura ogni due giorni fino a quando le cellule caliciformi raggiungono il 70%-80% di confluenza in circa 14 giorni. Rimuovere il tappo di tessuto circa 72 ore dopo la semina.
NOTA: L'epitelio congiuntivale umano contiene principalmente cellule squamose stratificate e cellule caliciformi. L'RPMI è un terreno selettivo per le cellule caliciformi. Raramente nella coltura umana di CGC, i fibroblasti possono crescere intorno al giorno 7. Il metodo per purificare la coltura è stato descritto in una precedente pubblicazione 22. - Verificare la purezza della coltura GC utilizzando la microscopia a immunofluorescenza (IFM) mirata alla citocheratina (CK)7 e alla lectina-1 Helix pomatia (HPA-1)22 seguendo il metodo IFM standard descritto in19; Vedere i risultati rappresentativi.
2. Passaggio delle cellule caliciformi congiuntivali umane e preparazione sperimentale
- Sciacquare le cellule con PBS (pH = 7,4) e staccare le cellule con tripsinizzazione utilizzando tripsina allo 0,05% in 1x EDTA. Osserva le cellule ogni minuto al microscopio. Una volta che le cellule si staccano dal fondo, disattiva la tripsina utilizzando un terreno RPMI completo.
- Centrifugare le cellule a 150 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet cellulare nel terreno di coltura RPMI completo e riseminare su piastre di coltura con fondo di vetro per la misurazione [Ca2+]i . Il volume totale del terreno è di 300 μL per piatto. Tenere il supporto al centro della parte in vetro del piatto.
- Eliminazione degli ormoni nei terreni di coltura: il terreno di coltura può contenere ormoni sessuali, in particolare l'FBS. Poiché il rosso fenolo contenuto in RPMI-1640 ha attività estrogenica 23,24, sostituire il mezzo RPMI con un terreno RPMI privo di rosso fenolo e regolare il pH a 7,45 utilizzando strisce di pH dopo aver preparato il terreno completo. L'HEPES contenuto nel terreno completo mantiene il pH in un intervallo relativamente piccolo.
3. Saggio di fura-2/acetossimetile (AM) per la misurazione di [Ca2+]i
- Eseguire il caricamento di Fura-2/AM come descritto di seguito.
- Incubare le cellule in piastre con fondo di vetro per 1 ora a 37 °C, in atmosfera ambiente e al riparo dalla luce con tampone di bicarbonato Krebs-Ringer (KRB; contenente 119 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1,0 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO4 e 25 mM NaHCO3) con 0,5% HEPES (Tabella 1), più 0,5% BSA, 0,5 μM fura-2/AM, 8 μM di acido pluronico F127 e 250 μM di sulfinpirazone.
- Regolare il pH a 7,45 utilizzando un pHmetro prima dell'uso. Dopo il caricamento con fura-2/AM, lavare le celle con KRB contenente 250 μM sulfinpirazone immediatamente prima della misurazione [Ca2+]i .
- Eseguire la misurazione [Ca2+]i come descritto di seguito.
- Posizionare le piastre contenenti le cellule caricate con fura-2 sotto il microscopio, individuare un campo rappresentativo contenente tra 20 e 50 cellule con un ingrandimento di 200x e utilizzare la funzione Freehand per disegnare un contorno attorno a ciascuna cella per indicare al software cosa è e cosa non è fluorescenza di fondo.
- Attendi che il software sottragga automaticamente la fluorescenza di fondo dalla misurazione e fai clic sul pulsante Avvia esperimento .
- Quindi, attendere tra 8 e 15 secondi per stabilire i livelli basali di calcio nelle cellule prima di pipettare con cura l'agonista di interesse. Continuare a misurare per almeno 120 secondi dopo l'aggiunta dell'agonista o fino a quando i livelli di calcio non sono tornati al basale.
- Eseguire l'analisi dei dati come descritto di seguito.
- Usa la variazione del picco [Ca2+]i per rappresentare le azioni degli stimoli. Calcolare il livello basale medio di calcio in ogni cellula dai primi 8-15 secondi di misurazioni. Se tale numero è uguale o superiore a 500 nM, rimuovere la cella dal set di dati in quanto è in fase di apoptosi o necrosi.
- Una volta calcolato il livello basale di ciascuna cella, sottrarre tale quantità dal massimo misurato [Ca2+]i per la stessa cella. Calcola la media della variazione del picco [Ca2+]I per tutte le cellule in un dato piatto.
- Per garantire la coerenza, registrare le risposte di ogni stimolo in duplicato e calcolare il valore medio delle variazioni del picco [Ca2+]i ottenute dai duplicati come un punto dati dal singolo campione umano. Confrontare i dati provenienti da diversi gruppi utilizzando un metodo di analisi dei dati appropriato basato sul disegno dello studio.
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Representative Results
I CGC umani nella coltura primaria crescono fino all'80% di confluenza in circa 14 giorni. Il tipo di cellula è stato confermato mediante colorazione in immunofluorescenza con anticorpi contro i marcatori delle cellule caliciformi CK7 e HPA-125 (Figura 1). Anche se la rimozione di FBS dal mezzo può eliminare gli ormoni sessuali, la mancanza di FBS potrebbe potenzialmente influenzare la risposta cellulare. Per verificare il metodo di eliminazione ormonale, è stato utilizzato un agonista colinergico (carbachol, Cch 1 × 10-4 M) come stimolo per imitare la fisiologica secrezione delle cellule caliciformi mediata da diverse terminazioni nervose che circondano le cellule caliciformi26. Non è stata osservata alcuna differenza nell'entità della variazione del calcio rispetto al mezzo RPMI completo di controllo, indicando che questo metodo può essere applicato per studiare la differenza basata sul sesso nella risposta cellulare.
Il test Fura-2/AM descritto nella sezione del protocollo è stato eseguito su piatti trattati con RPMI completo + 10% di terreno FBS, terreno RPMI avanzato (RPMI ha fornito una concentrazione proprietaria di insulina) integrato con l'1% di BSA e RPMI privo di rosso fenolo con l'1% di BSA. I risultati sono ottenuti da quattro individui. Non è stata riscontrata alcuna differenza significativa quando si confrontano le cellule incubate in RPMI privo di rosso fenolo con BSA all'1% e terreno RPMI completo. Tuttavia, è stato osservato un aumento significativo della risposta [Ca2+]i a Cch 1 × 10-4 M confrontando il gruppo del mezzo RPMI avanzato con il gruppo completo del mezzo RPMI (Figura 2). In sintesi, l'RPMI privo di rosso fenolo con l'1% di BSA non influisce sulla risposta cellulare delle cellule caliciformi, superando persino il mezzo RPMI avanzato nell'attuale contesto di ricerca.
Figura 1: Coltura primaria di cellule caliciformi congiuntivali umane. Le cellule caliciformi congiuntivali sono state passate su vetrini coprioggetti dopo 14 giorni di coltura ed è stata eseguita la colorazione a immunofluorescenza utilizzando l'anticorpo primario contro CK7 (rosso) e la lectina HPA-1 coniugata con fluoresceina (verde). (A) Le immagini sono state scattate con un ingrandimento di 200x e (B) le immagini sono state scattate con un ingrandimento di 630x. CK7 si presenta come un segnale fluorescente perinucleare (pannello di sinistra); HPA-1 presenta un pattern di punteggiatura perinuclearly (pannello centrale). Il segnale di immunofluorescenza positivo sia di CK7 che di HPA-1 indica una cellula a calice. Il controllo negativo è l'incubazione in assenza dell'anticorpo primario (C). Barre di scala = 50 μm (A) e 8 μm (B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Effetti di diversi mezzi sulla risposta [Ca2+]i indotta da Cch. Le cellule sono state incubate con RPMI privo di rosso fenolo con l'1% di BSA, terreni RPMI con il 10% di FBS o RPMI avanzato con BSA all'1% per 48 ore di incubazione prima dell'aggiunta di 1 × 10-4 M Cch. [Ca 2+]i è stato misurato mediante test Fura2 e la variazione del picco [Ca2+]i è stata calcolata e mostrata nel grafico. La barra nera indica il mezzo completo con rosso fenolo e FBS al 10%. La barra arancione indica il mezzo avanzato con l'1% di BSA, mentre la barra grigia indica l'RPMI senza rosso fenolo e con l'1% di BSA. I dati sono medi ± SEM, n = 4. L'ANOVA unidirezionale con correzione di Dunnett è stata utilizzata in confronti di più gruppi, p < 0,05 è stato impostato come statisticamente significativo. * indica una differenza significativa tra i gruppi. Abbreviazioni: Cch = carbachol; [Ca2+] i = concentrazione intracellulare di Ca2+. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Componente grezzo | Quantità per 250 mL di KRB | Concentrazione finale |
| Glucosio | 0,25 grammi | 0,1% p/v |
| 1 M NaCl | 30 ml | 119 milioni di minuti |
| 0,5 milioni di NaHCO3 | 12,5 mL | 25 mM |
| Acido 1 M 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico (HEPES) | 2,5 mL | 10 milioni di metri |
| 1 M KCl | 1,2 mL | 4,8 milioni di minuti |
| 1 M KH2PO4 | 300 μL | 1,2 millimetri |
| 1 M MgSO4 | 300 μL | 1,2 millimetri |
| 1 M CaCl2 | 250 μL | 1 millimetro |
Tabella 1: Materiale e formula per KRB. Abbreviazione: w/v, peso/volume.
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Discussion
Studiare le differenze basate sul sesso nei tessuti oculari aiuta a comprendere i processi delle malattie, in particolare l'occhio secco e la congiuntivite allergica, che colpiscono in modo sproporzionato un sesso 4,5,6. Anche se i modelli animali possono essere utilizzati per questi studi, i dati ottenuti direttamente dal tessuto umano sono essenziali a causa della massima somiglianza con le cellule umane in vivo. I tessuti congiuntivali utilizzati nell'attuale contesto sperimentale provengono da donatori deceduti con un'età compresa tra 70 e 85 anni (postmenopausa), facilitando il controllo dell'effetto ormonale ante mortem. Qui, abbiamo presentato un metodo economico per studiare le differenze basate sul sesso nei CGC umani.
Il passaggio critico per l'acquisizione di dati coerenti è la rimozione di FBS e rosso fenolo per 48 ore prima degli esperimenti per eliminare gli effetti degli ormoni sessuali. Le azioni degli ormoni sessuali nelle cellule possono essere classificate in effetti non trascrizionali e trascrizionali. Gli effetti non trascrizionali sono rapidamente mediati attraverso le proteine G in pochi secondi o minuti e l'effetto trascrizionale in cui alcuni geni vengono attivati richiede da 30 minuti a diverse ore27; l'emivita del recettore alfa degli estrogeni indotto dagli estrogeni (ERα) è di 2-6 h28,29. Anche se i tassi di turnover di altri tipi di proteine indotte dagli ormoni sessuali sono raramente riportati, i risultati degli studi esistenti indicano che le proteine indotte dagli ormoni sessuali vengono sintetizzate e degradate in poche ore. Pertanto, 48 ore sono sufficienti per eliminare il potenziale effetto degli ormoni contenuti nell'FBS mantenendo la normale funzione cellulare. Utilizzando il metodo attuale, abbiamo riportato con successo le differenze basate sul sesso nell'espressione dei recettori degli ormoni sessuali e nelle funzioni cellulari nei CGC30.
L'FBS è un fattore essenziale affinché le colture cellulari caliciformi rimangano sane e vitali. Sostituire il normale FBS inattivato dal calore con FBS spogliato di carbone è un altro modo possibile per eliminare gli ormoni sessuali nel sistema di coltura. Il limite dell'utilizzo di FBS spogliato a carbone è il costo e la complessa composizione dell'FBS. La rimozione completa di FBS elimina anche la potenziale incoerenza dei componenti intermedi non definiti di FBS.
Il passaggio critico per la misurazione di [Ca2+]i è quello di stabilizzare il pH e la temperatura. Nonostante l'integratore HEPES, abbiamo notato uno spostamento del pH nel tampone KRB nel tempo se conservato a temperatura ambiente. Pertanto, si consiglia un riaggiustamento del pH del tampone per un lungo esperimento, circa ogni 3 ore. Lo stesso metodo [Ca2+]i si applica anche ad altri tipi di cellule come le cellule squamose stratificate della congiuntiva, le cellule dell'endotelio vascolare, le cellule microgliali e i neuroni per studiare l'azione di diversi stimoli.
Il legame di Fura-2 al calcio libero nella cellula provoca un cambiamento nella sua lunghezza d'onda di assorbimento di picco da 380 nm (non legato) a 340 nm (legato). Tuttavia, la lunghezza d'onda di emissione rimane a 510 nm e queste emissioni vengono catturate dalla fotocamera come immagini in bianco e nero. Viene registrato il rapporto tra l'intensità di emissione eccitata dalla luce a 340 nm e quella a 380 nm. Oltre a confrontare il rapporto 340/380 con una curva di stand per calcolare una concentrazione di [Ca2+]i , si può anche riportare la variazione di piega del rapporto senza dover creare una curva standard, quindi, senza una concentrazione effettiva. I ricercatori possono scegliere l'uno o l'altro modo in base alla configurazione dell'apparecchiatura e al disegno sperimentale.
In conclusione, le cellule caliciformi congiuntivali primarie in coltura possono essere utilizzate come modello per studiare le differenze basate sul sesso delle malattie della superficie oculare. L'incubazione per 48 ore in terreno RPMI privo di rosso fenolo con l'1% di BSA prima di eseguire qualsiasi esperimento è un metodo coerente ed economico per eliminare i potenziali effetti degli ormoni nei terreni di coltura e può essere utilizzato come terreno basale per controllare i livelli ormonali.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Acknowledgments
Il lavoro è finanziato dal National Eye Institute Grant EY019470 (D.A.D.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin with 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
| Advanced RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
| carbachol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
| Fetal Bovin Serum | R&D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
| Fura-2- acetoxymethyl ester | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
| Human conjunctival tissue | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
| inorganic salt for KRB buffer | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Any brand will work | |
| L-glutamine | Lonza Group (Basel, Switzerland) | 17-605F | |
| non-essential amino acids | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
| phenol red-free RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
| Pluronic acid F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
| scalpel | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | Any sterile surgical scalpel can work |
| sodium pyruvate | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
| sulfinpyrazone | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |
References
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