Summary
Phenol rødfrit / føtalt bovint serumfrit medium er en bedre mulighed end avanceret RPMI for at eliminere eksogene hormoner uden at ændre den normale funktion af konjunktivale bægerceller i undersøgelsen af kønsbaserede forskelle.
Abstract
Tørre øjne er en multifaktoriel sygdom, der påvirker okulær overfladesundhed, med en dybt højere forekomst hos kvinder. Forstyrrelse af den geldannende mucin, der udskilles af konjunktivale bægerceller (CGC'er) på den okulære overflade, bidrager til flere okulære overfladesygdomme. Eliminering af eksogene kønshormoner er afgørende for at opnå konsistente resultater under in vitro-undersøgelse af kønsbaserede forskelle i CGC'er. Dette papir beskriver en metode til at minimere tilstedeværelsen af eksogene hormoner i undersøgelsen af kønsbaserede forskelle i CGC'er, samtidig med at deres fysiologiske funktion opretholdes. CGC'er fra postmortem humane donorer af begge køn blev dyrket fra stykker af bindehinden i RPMI-medium med 10% føtalt bovint serum (FBS) (kaldet det komplette medium) indtil sammenløb. Næsten 48 timer før forsøgenes start blev CGC'er overført til RPMI-medium uden phenolrød eller FBS, men med 1% BSA (kaldet phenol-rødfrit medium). Den normale cellulære funktion blev undersøgt ved at måle stigningen i intracellulær [Ca 2+] ([Ca 2+]i) efter carbachol (Cch, 1 x 10-4 M) stimulering ved hjælp af fura 2/acetoxymethyl (AM) mikroskopi. Resultatet viser, at CGC'er opretholdt normal funktion i de phenol-rødfrie medier efter 48 timer. Der blev ikke observeret nogen signifikant forskel i [Ca2+]i-respons mellem phenolrødfrit RPMI-medium og komplet medium ved Cch-stimulering. Derfor anbefaler vi at bruge det phenolrøde frie RPMI-medium med 1% BSA til at eliminere eksogene hormoner uden at ændre CGC'ernes normale funktion i undersøgelsen af kønsbaserede forskelle.
Introduction
Kønsbaserede forskelle påvirker flere processer på den okulære overflade 1,2,3. Den kliniske manifestation af disse kønsbaserede forskelle er forskellen i forekomsten af mange okulære overfladesygdomme mellem mænd og kvinder, såsom tørre øjne og konjunktivitis 4,5,6. Beviser tyder på, at kønsbaserede forskelle stammer fra flere biologiske niveauer, herunder de forskellige profiler af gener på X- og Y-kromosomer7 og virkningerne af hormoner8. At studere det molekylære grundlag for kønsbaserede forskelle kan give en bedre forståelse af sygdom og i sidste ende forbedre personlig medicin.
Den okulære overflade omfatter den overliggende tårefilm, hornhinde og bindehinde. Kønsbaserede forskelle observeres i flere komponenter i den okulære overflade, herunder tårefilmen 9,10, hornhinden 11, lacrimalkirtlen 12,13 og meibomiske kirtler, der også udskiller tårer 12. Talrige mekanistiske undersøgelser har undersøgt virkningen af kønshormoner på hornhinden og dens tilknyttede komponenter14,15; Imidlertid er der lidt kendt om de kønsbaserede forskelle i bindehinden og dens bægerceller. Konjunktiva er en slimhinde, der dækker sclera og den indre overflade af øjenlåget. Bindehindens epitel består af ikke-keratiniserende, flerlags, stratificerede pladeceller16.
Blandt de stratificerede pladeceller i bindehinden er der bægerceller (CGC'er) ispedd epithelets apikale overflade. Disse bægerceller er kendetegnet ved det store antal sekretoriske granulater placeret ved den apikale pol17. CGC'er syntetiserer og udskiller den geldannende mucin MUC5AC for at fugte den okulære overflade og smøre den under blinkende17. Mucinsekretion reguleres tæt af den intracellulære [Ca 2+] ([Ca2+]i) og aktiveringen af den Ras-afhængige ekstracellulære signalregulerede kinase (ERK1/2)18. Manglende evne til at udskille mucin resulterer i tørhed af den okulære overflade og følgevirkninger af patologiske abnormiteter. På en betændt okulær overflade fører omfattende mucinsekretion stimuleret af inflammatoriske mediatorer imidlertid til en opfattelse af klæbrighed og kløe i øjet19. Disse tilstande med forstyrret mucinsekretion vil i sidste ende føre til forringelse af den okulære overflade.
Bægercellernes rolle som den vigtigste kilde til okulær mucin har længe været anerkendt20, men de kønsbaserede forskelle i mucinregulering i både fysiologiske og patologiske tilstande forbliver uopdagede. Et in vitro-system ville være nyttigt til at overvåge bægercellernes funktion uden hormonel virkning eller med et præcist kontrolleret niveau af kønshormoner. Selvom en konjunktival epitelcellelinje har udviklet21, er der ingen bægercellelinje med funktionel mucinsekretion tilgængelig. Derfor ændrede vi vores udviklede primære humane CGC-kultur for at etablere en metode til at analysere den kønsbaserede forskel in vitro16 og præsentere den som nedenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alt humant væv blev doneret til øjenbanken med forudgående informeret samtykke og tilladelse fra donoren til brug i videnskabelig forskning. Anvendelse af det humane konjunktivvæv blev gennemgået af Massachusetts Eye and Ear Human Studies Committee og besluttet at være undtaget og ikke opfylde definitionen af forskning med mennesker.
1. Primær menneskelig bægercellekultur
- Fra øjenbanken opnås humant konjunktivvæv16.
- Forbered dyrkningsmediet, RPMI-1640 dyrkningsmedium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM glutamin, 2 mM ikke-essentielle aminosyrer (NEAA), 2 mM natriumpyruvat, 100 μg / ml penicillin-streptomycin og 2 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethansulfonsyre (HEPES).
- Udfør primær cellekultur som beskrevet nedenfor.
- Hak vævet i 1 mm3 stykker med en steril skalpel og frø på kulturplader i en kulturhætte. Der sås fire stykker i hver brønd på en plade med 6 brønde i 1 ml komplet RPMI-medie. Selvom orienteringen af vævsstykket ikke påvirker cellevæksten, skal du sikre dig, at stykkerne klæber til kulturpladen for at sikre udvækst ved hjælp af skalpelbladet.
- Vævsstykkerne anbringes i inkubatoren, der indeholder 95 % luft og 5 % CO2 ved 37 °C. Opdater det samme dyrkningsmedium hver anden dag, indtil bægercellerne når 70% -80% sammenløb på cirka 14 dage. Fjern vævsproppen ca. 72 timer efter såning.
BEMÆRK: Humant konjunktivepitel indeholder hovedsageligt stratificerede pladeceller og bægerceller. RPMI er et selektivt medie til bægerceller. Sjældent i human CGC-kultur kan fibroblaster vokse omkring dag 7. Metoden til rensning af kulturen blev beskrevet i en tidligere publikation 22. - GC-kulturens renhed kontrolleres ved hjælp af immunofluorescensmikroskopi (IFM) rettet mod cytokeratin (CK)7 og Helix pomatia lectin-1 (HPA-1)22 efter IFM-standardmetoden beskrevet i19 Se repræsentative resultater.
2. Human konjunktival bægercellepassage og eksperimentel forberedelse
- Skyl cellerne med PBS (pH = 7,4) og løsn cellerne med trypsinisering ved hjælp af 0,05% trypsin i 1x EDTA. Overhold cellerne hvert minut under et mikroskop. Når cellerne løsner sig fra bunden, skal du deaktivere trypsin ved hjælp af komplette RPMI-medier.
- Centrifuger cellerne ved 150 × g i 5 minutter ved stuetemperatur. Opslæmp cellepellet igen i det komplette RPMI-dyrkningsmedium, og frø igen på glasbundede kulturskåle til [Ca2+]i-måling . Mediets samlede volumen er 300 μL pr. Skål. Hold mediet i midten af glasdelen af fadet.
- Eliminering af hormoner i kulturmedier: Kulturmediet kan indeholde kønshormoner, især FBS. Da phenolrødt indeholdt i RPMI-1640 har østrogen aktivitet 23,24, skal du udskifte RPMI-mediet med phenolrødfrit RPMI-medium og justere pH til 7,45 ved hjælp af pH-strimler efter tilberedning af det komplette medium. HEPES indeholdt i det komplette medium opretholder pH til et relativt lille område.
3. Fura-2/acetoxymethyl (AM)-assay til måling af [Ca2+]i
- Udfør Fura-2/AM-indlæsning som beskrevet nedenfor.
- Cellerne inkuberes i glasbundskåle i 1 time ved 37 °C, omgivende atmosfære og beskyttet mod lys med Krebs-Ringer bicarbonatbuffer (KRB; indeholdende 119 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1,0 mMCaCl2, 1,2 mMMgSO4 og 25 mM NaHCO3) med 0,5% HEPES (tabel 1) plus 0,5% BSA, 0,5 μM fura-2/AM, 8 μM plulonsyre F127 og 250 μM sulfinpyrazon.
- Juster pH-værdien til 7,45 ved hjælp af en pH-meter før brug. Efter påfyldning med fura-2/AM vaskes cellerne med KRB indeholdende 250 μM sulfinpyrazon umiddelbart før [Ca2+]i-målingen.
- Udfør [Ca2+]i-måling som beskrevet nedenfor.
- Placer skålene, der indeholder cellerne fyldt med fura-2 under mikroskopet, find et repræsentativt felt, der indeholder mellem 20 celler og 50 celler ved 200x forstørrelse, og brug frihåndsfunktionen til at tegne en kontur omkring hver celle for at indikere for softwaren, hvad der er og hvad der ikke er baggrundsfluorescens.
- Vent på, at softwaren automatisk trækker baggrundsfluorescens fra målingen, og klik på knappen Start eksperiment .
- Vent derefter mellem 8 s og 15 s for at etablere de basale calciumniveauer i cellerne, før du omhyggeligt pipetterer agonisten af interesse. Målingen fortsættes i mindst 120 sek. efter tilsætning af agonisten, eller indtil calciumniveauerne er vendt tilbage til baseline.
- Udfør dataanalyse som beskrevet nedenfor.
- Brug ændringen i top [Ca2+]i til at repræsentere stimuliens handlinger. Beregn det gennemsnitlige basale calciumniveau i hver celle fra de første 8-15 s målinger. Hvis dette tal er lig med eller over 500 nM, skal du fjerne cellen fra datasættet, da den gennemgår apoptose eller nekrose.
- Når basalniveauet for hver celle er beregnet, trækkes dette beløb fra det maksimale målte [Ca2+]i for den samme celle. Gennemsnittet af ændringen i peak [Ca2+]I for alle cellerne i en given skål.
- For at sikre konsistens registreres responserne for hver stimulus i to eksemplarer, og gennemsnitsværdien af ændringerne i peak [Ca2+]i opnået fra duplikaterne beregnes som et datapunkt fra den individuelle humane prøve. Sammenlign data fra forskellige grupper ved hjælp af en passende dataanalysemetode baseret på undersøgelsesdesignet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Menneskelige CGC'er i primærkultur vokser til 80% sammenløb på cirka 14 dage. Celletypen blev bekræftet ved immunofluorescensfarvning med antistoffer mod bægercellemarkørerne CK7 og HPA-125 (figur 1). Selvom fjernelse af FBS fra mediet kan eliminere kønshormonerne, kan manglen på FBS potentielt påvirke det cellulære respons. For at verificere hormoneliminationsmetoden blev en kolinerg agonist (carbachol, Cch 1 × 10-4 M) anvendt som stimulus til at efterligne den fysiologiske bægercellesekretion medieret af forskellige nerveender omkring bægercellerne26. Der blev ikke observeret nogen forskel i størrelsen af ændringen i calcium fra kontrolkomplets RPMI-medium, hvilket indikerer, at denne metode kan anvendes til at studere den kønsbaserede forskel i cellerespons.
Fura-2/AM-analysen beskrevet i protokolafsnittet blev udført på retter behandlet med komplet RPMI + 10% FBS-medium, avanceret RPMI-medium (RPMI leverede en proprietær koncentration af insulin) suppleret med 1% BSA og phenol rødfri RPMI med 1% BSA. Resultaterne er opnået fra fire personer. Der blev ikke fundet nogen signifikant forskel ved sammenligning af cellerne inkuberet i phenol rødfri RPMI med 1% BSA og komplet RPMI-medium. Imidlertid blev der observeret et signifikant øget [Ca2+]i-respons på Cch 1 × 10-4 M, når man sammenlignede den avancerede RPMI-mediumgruppe med den komplette RPMI-mediumgruppe (figur 2). Sammenfattende påvirker phenol rødfri RPMI med 1% BSA ikke bægercellernes cellulære respons, selv om det overgår det avancerede RPMI-medium i den nuværende forskningsindstilling.
Figur 1: Human conjunctival bægercelle primær kultur. Konjunktivalbægercellerne blev passeret på dæksedler efter 14 dage i kultur, og immunofluorescensfarvning ved hjælp af primært antistof mod CK7 (rød) og fluoresceinkonjugeret lektin HPA-1 (grøn) blev udført. (A) Billeder blev taget under en 200x forstørrelse, og (B) billeder blev taget under en 630x forstørrelse. CK7 præsenterer som et perinukleært fluorescerende signal (venstre panel); HPA-1 præsenterer et tegnsætningsmønster perinuklart (midterpanel). Positivt immunfluorescenssignal fra både CK7 og HPA-1 indikerer en bægercelle. Negativ kontrol er inkubation i fravær af det primære antistof (C). Skalastænger = 50 μm (A) og 8 μm (B). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Forskellige mediers virkninger på Cch-induceret [Ca2+]i-respons. Celler blev inkuberet med phenol rødfri RPMI med 1% BSA, RPMI medier med 10% FBS eller avanceret RPMI med 1% BSA for 48 timers inkubation før tilsætning af 1 × 10-4 M Cch. [Ca 2+]i blev målt ved Fura2-assay, og ændringen i peak [Ca2+]i blev beregnet og vist i grafen. Den sorte bjælke angiver komplet medium med phenolrød og 10% FBS. Den orange bjælke angiver avanceret medium med 1% BSA, og den grå bjælke angiver RPMI uden phenolrød og med 1% BSA. Data er gennemsnitlige ± SEM, n = 4. Envejs ANOVA med Dunnett-korrektion blev anvendt i flere gruppesammenligninger, p < 0,05 blev sat som statistisk signifikant. * angiver signifikant forskel mellem grupperne. Forkortelser: Cch = carbachol; [Ca2+] i = intracellulær Ca2+ koncentration. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Lager komponent | Beløb for 250 ml KRB | Endelig koncentration |
| Glukose | 0,25 g | 0,1% w/v |
| 1 M NaCl | 30 ml | 119 mM |
| 0,5 m NaHCO3 | 12,5 ml | 25 mM |
| 1 M 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethansulfonsyre (HEPES) | 2,5 ml | 10 mM |
| 1 m KCl | 1,2 ml | 4,8 mM |
| 1 M KH2PO4 | 300 μL | 1,2 mM |
| 1 MMgSO4 | 300 μL | 1,2 mM |
| 1 M CaCl2 | 250 μL | 1 mM |
Tabel 1: Materiale og formel for KRB. Forkortelse: w/v, vægt/volumen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Undersøgelse af kønsbaserede forskelle i okulært væv hjælper med at forstå sygdomsprocesserne, især tørre øjne og allergisk konjunktivitis, som uforholdsmæssigt påvirker et køn 4,5,6. Selvom dyremodeller kan bruges til disse undersøgelser, er data opnået direkte fra humant væv afgørende på grund af den højeste lighed med de humane celler in vivo. Det konjunktivvæv, der anvendes i den nuværende eksperimentelle indstilling, er fra afdøde donorer med en aldersgruppe på 70-85 år (postmenopausale), hvilket gør det lettere at kontrollere den hormonelle virkning ante mortem. Her præsenterede vi en omkostningseffektiv metode til at studere kønsbaserede forskelle i menneskelige CGC'er.
Det kritiske trin for at erhverve konsistente data er fjernelse af FBS og phenolrød i 48 timer før eksperimenter for at eliminere virkningerne af kønshormoner. Virkningerne af kønshormoner i celler kan kategoriseres i ikke-transkriptionelle og transkriptionelle virkninger. De ikke-transkriptionelle virkninger medieres hurtigt gennem G-proteiner på få sekunder til minutter, og den transkriptionelle effekt, hvor visse gener aktiveres, tager 30 minutter til flere timer27; halveringstiden for østrogeninduceret østrogenreceptor alfa (ERα) er 2-6 h28,29. Selvom omsætningshastighederne for andre typer kønshormoninducerede proteiner sjældent rapporteres, viser resultater fra de eksisterende undersøgelser, at kønshormoninducerede proteiner syntetiseres og nedbrydes inden for få timer. Derfor er 48 timer tilstrækkelig tid til at vaske den potentielle virkning af hormoner indeholdt i FBS, samtidig med at den normale cellulære funktion opretholdes. Ved hjælp af den nuværende metode rapporterede vi med succes kønsbaserede forskelle i ekspressionen af kønshormonreceptorer og cellulære funktioner i CGC'er30.
FBS er en væsentlig faktor for, at bægercellekulturer forbliver sunde og levedygtige. Udskiftning af den normale varmeinaktiverede FBS med trækulstrippet FBS er en anden mulig måde at eliminere kønshormoner i kultursystemet. Begrænsningen ved at bruge trækulstrippet FBS er omkostningerne og den komplekse sammensætning af FBS. Fuldstændig fjernelse af FBS eliminerer også den potentielle inkonsekvens fra de udefinerede mediekomponenter i FBS.
Det kritiske trin for [Ca2+]i-måling er at stabilisere pH og temperatur. På trods af HEPES-tilskuddet har vi bemærket et skift i pH i KRB-bufferen over tid, når det opbevares ved stuetemperatur. Således anbefales en justering af bufferens pH til et langt eksperiment, ca. hver 3. time. Den samme [Ca2+]i-metode gælder også for andre typer celler, såsom stratificerede pladeceller i bindehinden, vaskulære endotelceller, mikrogliaceller og neuroner for at studere virkningen af forskellige stimuli.
Binding af Fura-2 til frit calcium i cellen forårsager en ændring i dens maksimale absorptionsbølgelængde fra 380 nm (ubundet) til 340 nm (bundet). Emissionsbølgelængden forbliver dog på 510 nm, og disse emissioner fanges af kameraet som sort-hvide billeder. Forholdet mellem emissionsintensitet exciteret med 340 nm og 380 nm lys registreres. Udover at sammenligne 340/380-forholdet med en bevoksningskurve for at beregne en [Ca2+]i-koncentration , kan man også rapportere foldændringen af forholdet uden at skulle oprette en standardkurve, derfor uden en faktisk koncentration. Efterforskere kan vælge begge veje baseret på deres udstyrsopsætning og det eksperimentelle design.
Afslutningsvis kan dyrkede primære konjunktivale bægerceller bruges som model til at studere de kønsbaserede forskelle i okulære overfladesygdomme. Inkubation i 48 timer i phenolrødfrit RPMI-medium med 1% BSA før udførelse af eksperimenter er en konsistent og omkostningseffektiv metode til at eliminere de potentielle virkninger af hormoner i dyrkningsmedier og kan bruges som et basalmedium til at kontrollere hormonniveauer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Arbejdet er finansieret af National Eye Institute Grant EY019470 (D.A.D).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin with 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
| Advanced RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
| carbachol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
| Fetal Bovin Serum | R&D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
| Fura-2- acetoxymethyl ester | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
| Human conjunctival tissue | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
| inorganic salt for KRB buffer | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Any brand will work | |
| L-glutamine | Lonza Group (Basel, Switzerland) | 17-605F | |
| non-essential amino acids | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
| phenol red-free RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
| Pluronic acid F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
| scalpel | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | Any sterile surgical scalpel can work |
| sodium pyruvate | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
| sulfinpyrazone | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |
References
- Gao, Y., et al. Female-specific downregulation of tissue polymorphonuclear neutrophils drives impaired regulatory T cell and amplified effector T cell responses in autoimmune dry eye disease. Journal of Immunology. 195, 3086-3099 (2015).
- Wang, S. B., et al. Estrogen negatively regulates epithelial wound healing and protective lipid mediator circuits in the cornea. FASEB Journal. 26, 1506-1516 (2012).
- Sullivan, D. A., Block, L., Pena, J. D. Influence of androgens and pituitary hormones on the structural profile and secretory activity of the lacrimal gland. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 74, 421-435 (1996).
- Schaumberg, D. A., Dana, R., Buring, J. E., Sullivan, D. A. Prevalence of dry eye disease among US men: estimates from the Physicians' Health Studies. Archives of Ophthalmology. 127, 763-768 (2009).
- Tellefsen Nøland, S., et al. Sex and age differences in symptoms and signs of dry eye disease in a Norwegian cohort of patients. The Ocular Surface. 19, 68-73 (2021).
- Sullivan, D. A., et al. TFOS DEWS II Sex, gender, and hormones report. The Ocular Surface. 15, 284-333 (2017).
- Meester, I., et al. SeXY chromosomes and the immune system: reflections after a comparative study. Biology of Sex Differences. 11, 3 (2020).
- Yang, J. -H., et al. Hormone replacement therapy reverses the decrease in natural killer cytotoxicity but does not reverse the decreases in the T-cell subpopulation or interferon-gamma production in postmenopausal women. Fertility and Sterility. 74, 261-267 (2000).
- Orucoglu, F., Akman, M., Onal, S. Analysis of age, refractive error and gender related changes of the cornea and the anterior segment of the eye with Scheimpflug imaging. Contact Lens & Anterior Eye. 38, 345-350 (2015).
- Strobbe, E., Cellini, M., Barbaresi, U., Campos, E. C. Influence of age and gender on corneal biomechanical properties in a healthy Italian population. Cornea. 33, 968-972 (2014).
- Sullivan, D. A., Jensen, R. V., Suzuki, T., Richards, S. M. Do sex steroids exert sex-specific and/or opposite effects on gene expression in lacrimal and meibomian glands. Molecular Vision. 15, 1553-1572 (2009).
- Bukhari, A. A., Basheer, N. A., Joharjy, H. I. Age, gender, and interracial variability of normal lacrimal gland volume using MRI. Ophthalmic Plastic and Reconstructive Surgery. 30, 388-391 (2014).
- Sullivan, B. D., Evans, J. E., Dana, M. R., Sullivan, D. A. Influence of aging on the polar and neutral lipid profiles in human meibomian gland secretions. Archives of Ophthalmology. 124, 1286-1292 (2006).
- Ebeigbe, J. A., Ebeigbe, P. N. The influence of sex hormone levels on tear production in postmenopausal Nigerian women. African Journal of Medicine and Medical Sciences. 43, 205-211 (2014).
- Suzuki, T., et al. Estrogen's and progesterone's impact on gene expression in the mouse lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, 158-168 (2006).
- Shatos, M. A., et al. Isolation and characterization of cultured human conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 2477-2486 (2003).
- Huang, A. J., Tseng, S. C., Kenyon, K. R. Morphogenesis of rat conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 29, 969-975 (1988).
- Li, D., et al. Resolvin D1 and aspirin-triggered resolvin D1 regulate histamine-stimulated conjunctival goblet cell secretion. Mucosal Immunology. 6, 1119-1130 (2013).
- Dartt, D. A., Masli, S. Conjunctival epithelial and goblet cell function in chronic inflammation and ocular allergic inflammation. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 14, 464-470 (2014).
- Mantelli, F., Argüeso, P. Functions of ocular surface mucins in health and disease. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 8, 477-483 (2008).
- García-Posadas, L., et al. Characterization and functional performance of a commercial human conjunctival epithelial cell line. Experimental Eye Research. 223, 109220 (2022).
- Shatos, M. A., et al. Isolation, characterization, and propagation of rat conjunctival goblet cells in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42, 1455-1464 (2001).
- Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C.
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 2496-2500 (1986).
- García-Posadas, L., et al. Interaction of IFN-γ with cholinergic agonists to modulate rat and human goblet cell function. Mucosal Immunology. 9, 206-217 (2016).
- Li, D., Jiao, J., Shatos, M. A., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Effect of VIP on intracellular [Ca2 ], extracellular regulated kinase 1/2, and secretion in cultured rat conjunctival goblet cells. Investigative Opthalmology & Visual Science. 54, 2872-2884 (2013).
- Contrò, V., et al. Sex steroid hormone receptors, their ligands, and nuclear and non-nuclear pathways. AIMS Molecular Science. 2, 294-310 (2015).
- Valley, C. C., Solodin, N. M., Powers, G. L., Ellison, S. J., Alarid, E. T. Temporal variation in estrogen receptor-alpha protein turnover in the presence of estrogen. Journal of Molecular Endocrinology. 40, 23-34 (2008).
- Campen, C. A., Gorski, J. Anomalous behavior of protein synthesis inhibitors on the turnover of the estrogen receptor as measured by density labeling. Endocrinology. 119, 1454-1461 (1986).
- Yang, M., et al. Sex-based differences in conjunctival goblet cell responses to pro-inflammatory and pro-resolving mediators. Scientific Reports. 12, 16305 (2022).
