Summary
페놀 레드-프리/태아 무혈청 배지는 성별에 따른 차이 연구에서 결막 잔 세포의 정상적인 기능을 변경하지 않고 외인성 호르몬을 제거하기 위해 고급 RPMI보다 더 나은 옵션입니다.
Abstract
안구건조증은 안구 표면 건강에 영향을 미치는 여러 요인으로 인한 질환으로, 여성의 유병률이 매우 높습니다. 결막 잔 세포(CGC)가 안구 표면으로 분비하는 겔 형성 점액의 파괴는 여러 안구 표면 질환의 원인이 됩니다. 외인성 성 호르몬의 제거는 CGC의 성별 차이에 대한 시험관 내 연구 중에 일관된 결과를 얻는 데 필수적입니다. 이 논문은 생리적 기능을 유지하면서 CGC의 성별 차이 연구에서 외인성 호르몬의 존재를 최소화하는 방법을 설명합니다. 남녀 모두의 사후 인간 기증자로부터 얻은 CGC는 10% 소 태아 혈청(FBS)(완전 배지라고 함)이 있는 RPMI 배지의 결막 조각에서 합류할 때까지 배양되었습니다. 실험이 시작되기 거의 48시간 전에 CGC를 페놀 레드 또는 FBS가 없지만 1% BSA(페놀-레드-프리 배지라고 함)가 있는 RPMI 배지로 옮겼습니다. 정상적인 세포 기능은 fura 2/acetoxymethyl(AM) 현미경을 사용하여 카르바콜(Cch, 1 x 10-4 M) 자극 후 세포 내 [Ca 2+]([Ca2+]i)의 증가를 측정하여 연구되었습니다. 결과는 CGC가 48시간 후에도 페놀-적색-프리 배지에서 정상적인 기능을 유지했음을 보여줍니다. Cch 자극 시 페놀 적색이 없는 RPMI 배지와 완전 배지 간에 [Ca2+]i 반응의 유의한 차이는 관찰되지 않았습니다. 따라서 성별 차이 연구에서 CGC의 정상적인 기능을 변경하지 않고 외인성 호르몬을 제거하기 위해 1% BSA가 함유된 페놀-레드 프리 RPMI 배지를 사용하는 것이 좋습니다.
Introduction
성별에 따른 차이는 안구 표면의 여러 과정에 영향을 미친다 1,2,3. 이러한 성별에 따른 차이의 임상적 양상은 안구건조증 및 결막염과 같은 남성과 여성의 많은 안구 표면 질환의 유병률 차이입니다 4,5,6. 증거에 따르면 성별에 따른 차이는 X 염색체와 Y 염색체7의 유전자 프로필의 상이한 프로필과 호르몬8의 영향을 포함한 여러 생물학적 수준에서 발생한다. 성별에 따른 차이의 분자적 기초를 연구하면 질병에 대한 더 나은 이해를 제공할 수 있으며, 궁극적으로 맞춤형 의학을 개선할 수 있습니다.
안구 표면은 위에 놓인 눈물막, 각막 및 결막으로 구성됩니다. 눈물막(tear film)9,10, 각막(cornea)11, 눈물샘(larimal gland)12,13, 눈물샘(meibomian gland)12을 포함한 안구 표면의 여러 구성 요소에서 성별에 따른 차이가 관찰된다. 수많은 기계론적 연구에서 각막 및 관련 구성 요소에 대한 성 호르몬의 영향을 조사했습니다14,15; 그러나 결막과 결막 세포의 성별에 따른 차이에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 결막은 공막과 눈꺼풀 안쪽 표면을 덮고 있는 점막입니다. 결막의 상피는 각질화되지 않고 다층으로 된 층화된 편평 세포로 구성되어 있다16.
결막의 층화된 편평 세포 중에는 상피의 정점 표면에 산재된 잔 세포(CGC)가 있습니다. 이들 잔 세포는 정점 극(17)에 위치한 많은 수의 분비 과립을 특징으로 한다. CGC는 겔 형성 뮤신 MUC5AC를 합성 및 분비하여 안구 표면에 수분을 공급하고 눈 깜빡임 동안 윤활합니다17. 뮤신 분비는 세포 내 [Ca 2+] ([Ca2+]i)와 Ras 의존성 세포 외 신호 조절 키나아제 (ERK1/2)의 활성화에 의해 엄격하게 조절됩니다 18. 점액을 분비하지 못하면 안구 표면이 건조해지고 병리학적 이상이 후유증이 생깁니다. 그러나 염증이 있는 안구 표면에서는 염증 매개체에 의해 자극된 광범위한 점액 분비로 인해 눈의 끈적임과 가려움증이 유발된다19. 점액 분비가 방해를 받는 이러한 상태는 결국 안구 표면의 악화로 이어집니다.
안구 점액의 주요 공급원으로서 잔 세포의 역할은 오랫동안 인식되어 왔지만20 생리학적 및 병리학적 상태 모두에서 점액 조절의 성별 차이는 발견되지 않은 상태로 남아 있습니다. 체외 시스템은 호르몬 영향 없이 또는 정밀하게 조절된 수준의 성 호르몬으로 잔 세포의 기능을 모니터링하는 데 유용할 것입니다. 결막 상피 세포주가 발달했음에도 불구하고21 기능성 점액 분비를 가진 잔 세포주는 없습니다. 따라서 개발된 1차 인간 CGC 배양을 수정하여 in vitro16에서 성별에 따른 차이를 분석하는 방법을 확립하고 아래와 같이 제시하였다.
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Protocol
모든 인체 조직은 과학 연구에 사용하기 위해 기증자의 사전 동의와 승인을 받아 안구 은행에 기증되었습니다. 인간 결막 조직의 사용은 매사추세츠 눈과 귀 인간 연구 위원회(Massachusetts Eye and Ear Human Studies Committee)에서 검토했으며 면제 대상이며 인간 피험자를 대상으로 한 연구의 정의에 부합하지 않는 것으로 결정되었습니다.
1. 1차 인간 잔 세포 배양
- 안구 은행에서 인체 결막 조직16을 얻습니다.
- 10% 소 태아 혈청(FBS), 2mM 글루타민, 2mM 비필수 아미노산(NEAA), 2mM 피루브산 나트륨, 100μg/mL 페니실린-스트렙토마이신 및 2mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진술폰산(HEPES)이 보충된 배양 배지인 RPMI-1640 배양 배지를 준비합니다.
- 아래 설명된 대로 1차 세포 배양을 수행합니다.
- 멸균 메스로 조직을 1mm3 조각으로 다지고 배양 후드의 배양 플레이트에 씨를 뿌립니다. 6웰 플레이트의 각 웰에 4개를 1mL의 완전한 RPMI 배지에 파종합니다. 조직 조각의 방향은 세포 성장에 영향을 미치지 않지만 메스 블레이드를 사용하여 세포가 성장할 수 있도록 조각이 배양 플레이트에 부착되도록 합니다.
- 37 ° C에서 95 % 공기와 5 % CO2 가 들어있는 인큐베이터에 조직 조각을 넣습니다. 약 14일 내에 잔 세포가 70%-80% 밀도에 도달할 때까지 동일한 배양 배지를 이틀마다 새로 고칩니다. 씨를 뿌린 후 약 72시간 후에 티슈 플러그를 제거합니다.
참고: 인간 결막 상피는 주로 층화된 편평 세포와 잔 세포를 포함합니다. RPMI는 잔 세포에 대한 선택적 매체입니다. 드물게 인간 CGC 배양에서 섬유아세포는 7일째 즈음에 자랄 수 있습니다. 배양물을 정화하는 방법은 이전 간행물 22에 기술되어 있다. - 19에 설명된 표준 IFM 방법에 따라 사이토케라틴(CK)7 및 나선 포마티아 렉틴-1(HPA-1)22을 표적으로 하는 면역형광 현미경(IFM)을 사용하여 GC 배양의 순도를 확인합니다. 대표 결과를 참조하십시오.
2. 인간 결막 잔 세포 통로 및 실험 준비
- PBS(pH = 7.4)로 세포를 헹구고 1x EDTA에서 0.05% 트립신을 사용하여 트립신화로 세포를 분리합니다. 현미경으로 매분 세포를 관찰하십시오. 셀이 바닥에서 분리되면 완전한 RPMI 배지를 사용하여 트립신을 비활성화합니다.
- 실온에서 150× g 에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 세포 펠릿을 전체 RPMI 배양 배지에 재현탁시키고 [Ca2+]i 측정을 위해 유리 바닥 배양 접시에 다시 파종합니다. 배지의 총 부피는 접시당 300μL입니다. 미디어를 접시의 유리 부분 중앙에 두십시오.
- 배양 배지에서 호르몬 제거: 배양 배지에는 성 호르몬, 특히 FBS가 포함될 수 있습니다. RPMI-1640에 함유된 페놀 레드는 에스트로겐 활성 23,24를 가지므로 RPMI 배지를 페놀 레드가 없는 RPMI 배지로 교체하고 완전한 배지를 준비한 후 pH 스트립을 사용하여 pH를 7.45로 조정합니다. 전체 배지에 포함된 HEPES는 pH를 비교적 작은 범위로 유지합니다.
3. [Ca2+]i 측정을 위한 Fura-2/acetoxymethyl(AM) 분석
- 아래 설명에 따라 Fura-2/AM 로딩을 수행합니다.
- 37°C, 주변 대기에서 1시간 동안 유리 바닥 접시에 세포를 배양하고 Krebs-Ringer 중탄산염 완충액(KRB, 119mM NaCl, 4.8mM KCl, 1.0mM CaCl2, 1.2mM MgSO4 및 25mM NaHCO3 함유)과 0.5% HEPES(표 1) 및 0.5% BSA, 0.5μM fura-2/AM, 8 μM 플루론산 F127 및 250 μM 설핀피라존.
- 사용하기 전에 pH 측정기를 사용하여 pH를 7.45로 조정하십시오. fura-2/AM으로 로딩 한 후 [Ca2 +] i 측정 직전에 250 μM 술핀피라존을 함유 한 KRB로 세포를 세척하십시오.
- 아래 설명에 따라 [Ca2+]i 측정을 수행합니다.
- fura-2가 로드된 세포가 들어 있는 접시를 현미경 아래에 놓고 20x 배율로 20개에서 50개 사이의 세포가 포함된 대표 필드를 찾은 다음 Freehand 기능을 사용하여 각 세포 주위에 윤곽선을 그려 배경 형광과 배경 형광이 아닌 것을 소프트웨어에 표시합니다.
- 소프트웨어가 측정에서 배경 형광을 자동으로 뺄 때까지 기다렸다가 실험 시작 버튼을 클릭합니다.
- 그런 다음 8초에서 15초 사이에 기다렸다가 세포의 기초 칼슘 수치를 확인한 후 관심 작용제를 조심스럽게 피펫팅합니다. 작용제를 추가한 후 또는 칼슘 수치가 기준선으로 돌아올 때까지 최소 120초 동안 계속 측정하십시오.
- 아래 설명에 따라 데이터 분석을 수행합니다.
- 피크 [Ca2+]i 의 변화를 사용하여 자극의 작용을 나타냅니다. 측정의 처음 8-15초에서 각 셀의 평균 기초 칼슘 수준을 계산합니다. 해당 숫자가 500nM 이상이면 세포 사멸 또는 괴사가 진행 중이므로 데이터 세트에서 해당 셀을 제거합니다.
- 각 셀의 기초 수준이 계산되면 동일한 셀에 대해 측정된 최대 [Ca2+]i 에서 해당 양을 뺍니다. 주어진 접시의 모든 세포에 대한 피크 [Ca2+]I 의 변화를 평균화합니다.
- 일관성을 보장하기 위해 각 자극의 반응을 중복으로 기록하고 복제본에서 얻은 피크 [Ca2+]i 변화의 평균값을 개별 인간 샘플의 하나의 데이터 포인트로 계산합니다. 연구 설계에 따라 적절한 데이터 분석 방법을 사용하여 여러 그룹의 데이터를 비교합니다.
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Representative Results
1차 배양에서 인간 CGC는 약 14일 만에 80%의 밀도로 성장합니다. 세포 유형은 잔 세포 마커 CK7 및 HPA-125 에 대한 항체로 면역형광 염색을 통해 확인되었습니다(그림 1). 배지에서 FBS를 제거하면 성 호르몬을 제거할 수 있지만, FBS가 부족하면 세포 반응에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있습니다. 호르몬 제거 방법을 검증하기 위해, 콜린성 작용제(carbachol, Cch 1 × 10-4 M)를 자극제로서 잔 세포를 둘러싼 상이한 신경 말단에 의해 매개되는 생리적 잔 세포 분비를 모방하는 자극으로 사용하였다(26). 대조군 완전 RPMI 배지에서 칼슘 변화의 크기에 차이가 관찰되지 않았으며, 이는 이 방법이 세포 반응의 성별 기반 차이를 연구하는 데 적용될 수 있음을 나타냅니다.
프로토콜 섹션에 설명된 Fura-2/AM 분석은 완전 RPMI + 10% FBS 배지, 1% BSA가 보충된 고급 RPMI 배지(RPMI는 독점적인 농도의 인슐린 공급) 및 1% BSA가 포함된 페놀 레드 프리 RPMI로 처리된 접시에서 수행되었습니다. 결과는 4명의 개인으로부터 얻어졌습니다. 페놀 레드-프리 RPMI에서 배양된 세포를 1% BSA 및 완전한 RPMI 배지와 비교했을 때 유의미한 차이는 발견되지 않았습니다. 그러나 고급 RPMI 배지 그룹과 전체 RPMI 배지 그룹을 비교할 때 Cch 1 × 10-4 M에 대한 [Ca2+]i 반응이 유의하게 증가된 것으로 관찰되었습니다(그림 2). 요약하면, BSA가 1% 함유된 페놀 레드 프리 RPMI는 잔 세포의 세포 반응에 영향을 미치지 않으며, 현재 연구 환경에서 고급 RPMI 배지를 능가합니다.
그림 1: 인간 결막 잔 세포 1차 배양. 결막 잔 세포를 배양 14일 후 커버슬립에 통과시키고, CK7(빨간색)에 대한 1차 항체 및 플루오레세인 접합 렉틴 HPA-1(녹색)을 이용한 면역형광 염색을 수행하였다. (A) 이미지는 200x 배율로 촬영되었고 (B) 이미지는 630x 배율로 촬영되었습니다. CK7은 핵 주위 형광 신호로 표시됩니다(왼쪽 패널). HPA-1은 구두점 패턴을 나타냅니다 (중간 패널). CK7 및 HPA-1의 양성 면역 형광 신호는 잔 세포를 나타냅니다. 음성 대조군은 1차 항체(C)가 없는 상태에서 배양하는 것입니다. 스케일 바 = 50μm(A) 및 8μm(B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: Cch 유도 [Ca2+]i 반응에 대한 다양한 매체의 효과. 세포는 1 × 10-4 M Cch를 첨가하기 전에 48시간 배양 동안 1% BSA가 있는 페놀 레드-프리 RPMI, 1% FBS가 있는 RPMI 배지 또는 1% BSA가 있는 고급 RPMI로 배양하였다. [Ca 2+]i는 Fura2 분석에 의해 측정되었고, 피크 [Ca2+]i의 변화를 계산하여 그래프에 나타내었다. 검은색 막대는 페놀 레드와 10% FBS가 포함된 완전한 매체를 나타냅니다. 주황색 막대는 BSA가 1%인 고급 배지를 나타내고 회색 막대는 페놀 레드가 없고 BSA가 1%인 RPMI를 나타냅니다. 데이터는 평균± SEM, n = 4입니다. Dunnett 보정을 사용한 일원 분산 분석은 다중 그룹 비교에서 사용되었으며, p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 설정되었습니다. *는 그룹 간의 유의미한 차이를 나타냅니다. 약어: Cch = carbachol; [캘리포니아2+] i = 세포 내 Ca2+ 농도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 스톡 컴포넌트 | KRB 250mL 분량 | 최종 집중 |
| 포도당 | 0.25 지 | 0.1% 승/v |
| 1개 M NaCl | 30mL | 119 밀리미터 |
| 0.5 M NaHCO3 재질 보기 | 12.5 mL | 25 밀리미터 |
| 1 M4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES) | 2.5 mL | 10 mM |
| 1 M KCl | 1.2 mL | 4.8 밀리미터 |
| 1 M KH2PO4 | 300 μL | 1.2 밀리미터 |
| 1 M MgSO4 | 300 μL | 1.2 밀리미터 |
| 1 M CaCl2 | 250 μL | 1 mM |
표 1: KRB의 재료 및 공식. 약어: w/v, 무게/부피.
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Discussion
안구 조직의 성별에 따른 차이를 조사하는 것은 질병, 특히 안구건조증과 알레르기성 결막염의 진행 과정을 이해하는 데 도움이 되며, 이는 한쪽 성별에 불균형적으로 영향을 미친다 4,5,6. 이러한 연구에는 동물 모델을 사용할 수 있지만 생체 내 인간 세포와의 유사성이 가장 높기 때문에 인간 조직에서 직접 얻은 데이터가 필수적입니다. 현재 실험 환경에서 사용되는 결막 조직은 70-85세(폐경 후)의 연령 범위에서 사망한 기증자의 것이어서 사망 전 호르몬 효과를 더 쉽게 제어할 수 있습니다. 여기에서 우리는 인간 CGC의 성별 기반 차이를 연구하는 비용 효율적인 방법을 제시했습니다.
일관된 데이터를 얻기 위한 중요한 단계는 성호르몬의 영향을 제거하기 위한 실험 전에 48시간 동안 FBS와 페놀 레드를 제거하는 것입니다. 세포에서 성호르몬의 작용은 비전사 효과와 전사 효과로 분류할 수 있습니다. 비전사 효과는 G-단백질을 통해 몇 초에서 몇 분 안에 빠르게 매개되며, 특정 유전자가 활성화되는 전사 효과는 30분에서 몇 시간이 걸린다27; 에스트로겐 유도 에스트로겐 수용체 알파 (ERα)의 반감기는 2-6 h28,29입니다. 다른 유형의 성호르몬 유도 단백질의 회전율은 거의 보고되지 않지만, 기존 연구 결과에 따르면 성호르몬 유도 단백질은 몇 시간 내에 합성되고 분해됩니다. 그러므로, 48 h는 정상적인 세포질 기능을 유지하면서 FBS에서 포함된 호르몬의 잠재적인 효력을 씻어내기에 충분한 시간입니다. 현재 방법을 사용하여 CGC30에서 성 호르몬 수용체 및 세포 기능의 발현에 대한 성별 차이를 성공적으로 보고했습니다.
FBS는 잔 세포 배양이 건강하고 생존 가능한 상태를 유지하는 데 필수적인 요소입니다. 정상적인 열 비활성화 FBS를 숯이 벗겨진 FBS로 대체하는 것은 배양 시스템에서 성 호르몬을 제거하는 또 다른 가능한 방법입니다. 숯 벗겨진 FBS 사용의 한계는 FBS의 비용과 복잡한 구성입니다. FBS를 완전히 제거하면 FBS의 정의되지 않은 매체 구성 요소에서 발생할 수 있는 불일치도 제거됩니다.
[Ca2+]i 측정의 중요한 단계는 pH와 온도를 안정화하는 것입니다. HEPES 보충제에도 불구하고 실온에서 보관할 때 시간이 지남에 따라 KRB 완충액의 pH 변화가 관찰되었습니다. 따라서 약 3시간마다 긴 실험을 위해 완충액의 pH를 재조정하는 것이 좋습니다. 동일한 [Ca2+]i 방법은 결막의 층화 편평 세포, 혈관 내피 세포, 소교세포 및 뉴런과 같은 다른 유형의 세포에도 적용되어 다양한 자극의 작용을 연구합니다.
Fura-2가 세포의 유리 칼슘에 결합하면 최대 흡수 파장이 380nm(결합되지 않음)에서 340nm(결합됨)로 변화합니다. 그러나 방출 파장은 510nm로 유지되며 이러한 방출은 카메라에 흑백 이미지로 캡처됩니다. 340nm와 380nm 빛에 의해 여기되는 방출 강도의 비율이 기록됩니다. [Ca2+]i 농도를 계산하기 위해 340/380 비율을 스탠드 곡선과 비교하는 것 외에도 표준 곡선을 생성하지 않고도 비율의 접힘 변화를 보고할 수 있으므로 실제 농도 없이도 보고할 수 있습니다. 연구자는 장비 설정과 실험 설계에 따라 두 가지 방법 중 하나를 선택할 수 있습니다.
결론적으로, 배양된 원발성 결막 잔 세포는 안구 표면 질환의 성별에 따른 차이를 연구하기 위한 모델로 사용될 수 있습니다. 실험을 수행하기 전에 1% BSA가 함유된 페놀 적색이 없는 RPMI 배지에서 48시간 동안 배양하는 것은 배양 배지에서 호르몬의 잠재적 영향을 제거하는 일관되고 비용 효율적인 방법이며 호르몬 수치를 조절하기 위한 기초 배지로 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 미국 국립안과연구소(National Eye Institute) 보조금 EY019470(D.A.D)의 지원을 받습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin with 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
| Advanced RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
| carbachol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
| Fetal Bovin Serum | R&D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
| Fura-2- acetoxymethyl ester | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
| Human conjunctival tissue | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
| inorganic salt for KRB buffer | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Any brand will work | |
| L-glutamine | Lonza Group (Basel, Switzerland) | 17-605F | |
| non-essential amino acids | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
| phenol red-free RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
| Pluronic acid F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
| scalpel | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | Any sterile surgical scalpel can work |
| sodium pyruvate | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
| sulfinpyrazone | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |
References
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