Summary
Phenolrotfreies/fetales Rinderserum-freies Medium ist eine bessere Option als fortschrittliches RPMI, um exogene Hormone zu eliminieren, ohne die normale Funktion der Bindehautbecherzellen bei der Untersuchung von geschlechtsspezifischen Unterschieden zu verändern.
Abstract
Trockenes Auge ist eine multifaktorielle Erkrankung, die die Gesundheit der Augenoberfläche beeinträchtigt, mit einer deutlich höheren Prävalenz bei Frauen. Die Störung des gelbildenden Mucins, das von Bindehautbecherzellen (CGCs) auf die Augenoberfläche abgesondert wird, trägt zu mehreren Erkrankungen der Augenoberfläche bei. Die Eliminierung exogener Sexualhormone ist unerlässlich, um konsistente Ergebnisse bei der In-vitro-Untersuchung von geschlechtsspezifischen Unterschieden in CGCs zu erhalten. Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur Minimierung des Vorhandenseins exogener Hormone bei der Untersuchung geschlechtsspezifischer Unterschiede in CGCs bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung ihrer physiologischen Funktion. CGCs von postmortalen menschlichen Spendern beiderlei Geschlechts wurden aus Stücken der Bindehaut in RPMI-Medium mit 10% fötalem Kälberserum (FBS) (als vollständiges Medium bezeichnet) bis zur Konfluenz kultiviert. Knapp 48 Stunden vor Beginn der Versuche wurden CGCs in RPMI-Medium ohne Phenolrot oder FBS, aber mit 1% BSA (als phenolrotfreies Medium bezeichnet) überführt. Die normale zelluläre Funktion wurde untersucht, indem der Anstieg des intrazellulären [Ca 2+] ([Ca2+]i) nach Carbachol-Stimulation (Cch, 1 x 10-4 M) mittels Fura-2/Acetoxymethyl (AM)-Mikroskopie gemessen wurde. Das Ergebnis zeigt, dass CGCs nach 48 h ihre normale Funktion in den phenolrotfreien Medien aufrechterhielten. Es wurde kein signifikanter Unterschied in der [Ca2+]i-Reaktion zwischen phenolrotfreiem RPMI-Medium und vollständigem Medium nach Cch-Stimulation beobachtet. Daher empfehlen wir die Verwendung des phenolrotfreien RPMI-Mediums mit 1% BSA, um exogene Hormone zu eliminieren, ohne die normale Funktion von CGCs bei der Untersuchung von geschlechtsspezifischen Unterschieden zu verändern.
Introduction
Geschlechtsspezifische Unterschiede betreffen mehrere Prozesse der Augenoberfläche 1,2,3. Die klinische Manifestation dieser geschlechtsspezifischen Unterschiede ist der Unterschied in der Prävalenz vieler Augenoberflächenerkrankungen zwischen Männern und Frauen, wie z. B. trockenes Auge und Bindehautentzündung 4,5,6. Es gibt Hinweise darauf, dass geschlechtsspezifische Unterschiede auf mehreren biologischen Ebenen entstehen, einschließlich der unterschiedlichen Profile von Genen auf X- und Y-Chromosomen7 und der Wirkung von Hormonen8. Die Untersuchung der molekularen Grundlagen geschlechtsspezifischer Unterschiede kann zu einem besseren Verständnis von Krankheiten beitragen und letztendlich die personalisierte Medizin verbessern.
Die Augenoberfläche besteht aus dem darüber liegenden Tränenfilm, der Hornhaut und der Bindehaut. Geschlechtsspezifische Unterschiede werden in mehreren Komponenten der Augenoberfläche beobachtet, darunter der Tränenfilm 9,10, die Hornhaut 11, die Tränendrüse 12,13 und Meibom-Drüsen, die ebenfalls Tränen absondern, 12. Zahlreiche mechanistische Studien haben die Wirkung von Sexualhormonen auf die Hornhaut und ihre assoziierten Bestandteile untersucht14,15; Über die geschlechtsspezifischen Unterschiede in der Bindehaut und ihren Becherzellen ist jedoch wenig bekannt. Die Bindehaut ist eine Schleimhaut, die die Sklera und die Innenfläche des Augenlids bedeckt. Das Epithel der Bindehaut besteht aus nicht-keratinisierenden, mehrschichtigen, geschichteten Plattenepithelzellen16.
Unter den geschichteten Plattenepithelzellen der Bindehaut befinden sich Becherzellen (CGCs), die an der apikalen Oberfläche des Epithels eingestreut sind. Diese Becherzellen zeichnen sich durch die große Anzahl von sekretorischen Granula aus, die sich am apikalen Pol17 befinden. CGCs synthetisieren und sezernieren das gelbildende Mucin MUC5AC, um die Augenoberfläche zu befeuchten und sie während des Blinzelns zu schmieren17. Die Mucinsekretion wird durch das intrazelluläre [Ca2+] ([Ca2+]i) und die Aktivierung der Ras-abhängigen extrazellulären signalregulierten Kinase (ERK1/2)18 stark reguliert. Die Unfähigkeit, Muzin abzusondern, führt zu Trockenheit der Augenoberfläche und zu pathologischen Anomalien. Auf einer entzündeten Augenoberfläche führt jedoch eine durch Entzündungsmediatoren angeregte übermäßige Muzinsekretion zu einer Wahrnehmung von Klebrigkeit und Juckreiz des Auges19. Diese Zustände mit gestörter Muzinsekretion führen schließlich zu einer Verschlechterung der Augenoberfläche.
Die Rolle von Becherzellen als Hauptquelle für Augenschleim ist seit langem bekannt20, jedoch sind die geschlechtsspezifischen Unterschiede in der Muzinregulation sowohl in physiologischen als auch in pathologischen Zuständen noch unentdeckt. Ein In-vitro-System wäre nützlich, um die Funktion von Becherzellen ohne hormonelle Wirkung oder mit einem genau kontrollierten Spiegel von Sexualhormonen zu überwachen. Obwohl sich eine Bindehautepithelzelllinie entwickelt hat21, steht keine Becherzelllinie mit funktioneller Muzinsekretion zur Verfügung. Daher modifizierten wir unsere entwickelte primäre humane CGC-Kultur, um eine Methode zur Analyse des geschlechtsspezifischen Unterschieds in vitrozu etablieren 16 und stellen sie wie folgt dar.
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Protocol
Sämtliches menschliches Gewebe wurde mit vorheriger informierter Zustimmung und Genehmigung des Spenders für die Verwendung in der wissenschaftlichen Forschung an die Augenbank gespendet. Die Verwendung des menschlichen Bindehautgewebes wurde vom Massachusetts Eye and Ear Human Studies Committee überprüft und als ausgenommen eingestuft und nicht der Definition von Forschung mit menschlichen Probanden entsprechend.
1. Primäre menschliche Kelchzellkultur
- Aus der Augenbank wird menschliches Bindehautgewebeentnommen 16.
- Bereiten Sie das Nährmedium, RPMI-1640 Nährmedium, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum (FBS), 2 mM Glutamin, 2 mM nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), 2 mM Natriumpyruvat, 100 μg/ml Penicillin-Streptomycin und 2 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) vor.
- Führen Sie die primäre Zellkultur wie unten beschrieben durch.
- Zerkleinern Sie das Gewebe mit einem sterilen Skalpell in 1 mm3 Stücke und säen Sie es auf Kulturplatten in einer Kulturhaube. Säen Sie vier Stücke in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte in 1 ml vollständiges RPMI-Medium. Obwohl die Ausrichtung des Gewebestücks keinen Einfluss auf das Zellwachstum hat, stellen Sie sicher, dass die Stücke an der Kulturplatte haften, um das Wachstum mit der Skalpellklinge zu gewährleisten.
- Legen Sie die Gewebestücke in den Inkubator, der 95 % Luft und 5 % CO2 bei 37 °C enthält. Aktualisieren Sie das gleiche Nährmedium jeden zweiten Tag, bis die Becherzellen in etwa 14 Tagen eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreichen. Entfernen Sie den Gewebepfropfen ca. 72 h nach der Aussaat.
HINWEIS: Das menschliche Bindehautepithel enthält hauptsächlich geschichtete Plattenepithelzellen und Becherzellen. RPMI ist ein selektives Medium für Becherzellen. Selten in menschlicher CGC-Kultur können Fibroblasten um den 7. Tag herum wachsen. Das Verfahren zur Reinigung der Kultur wurde in einer früheren Veröffentlichung 22 beschrieben. - Überprüfung der Reinheit der GC-Kultur mittels Immunfluoreszenzmikroskopie (IFM), die auf Zytokeratin (CK)7 und Helix-Pomatia-Lektin-1 (HPA-1)22 abzielt, gemäß der in19 beschriebenen Standard-IFM-Methode; Siehe repräsentative Ergebnisse.
2. Humane Bindehautkelchzellpassage und experimentelle Vorbereitung
- Spülen Sie die Zellen mit PBS (pH = 7,4) und lösen Sie die Zellen mit Trypsinisierung unter Verwendung von 0,05% Trypsin in 1x EDTA. Beobachten Sie die Zellen jede Minute unter dem Mikroskop. Sobald sich die Zellen vom Boden lösen, deaktivieren Sie das Trypsin mit vollständigem RPMI-Medium.
- Die Zellen werden bei 150 × g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Resuspendieren Sie das Zellpellet im vollständigen RPMI-Nährmedium und säen Sie es zur [Ca2+]i-Messung erneut auf Kulturschalen mit Glasboden. Das Gesamtvolumen des Mediums beträgt 300 μL pro Schale. Bewahren Sie das Medium in der Mitte des Glasteils der Schale auf.
- Ausscheidung von Hormonen in Nährmedien: Das Nährmedium kann Sexualhormone enthalten, insbesondere das FBS. Da das in RPMI-1640 enthaltene Phenolrot die östrogene Aktivität 23,24 aufweist, ersetzen Sie das RPMI-Medium durch phenolrotfreies RPMI-Medium und stellen Sie den pH-Wert mit pH-Streifen auf 7,45 ein, nachdem Sie das vollständige Medium hergestellt haben. Das im gesamten Medium enthaltene HEPES hält den pH-Wert in einem relativ kleinen Bereich.
3. Fura-2/Acetoxymethyl (AM)-Assay für die Messung von [Ca2+]i
- Führen Sie das Laden von Fura-2/AM wie unten beschrieben durch.
- Inkubieren Sie die Zellen in Glasbodenschalen für 1 h bei 37 °C Umgebungsatmosphäre und lichtgeschützt mit Krebs-Ringer-Bicarbonatpuffer (KRB; enthält 119 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1,0 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4 und 25 mM NaHCO3) mit 0,5 % HEPES (Tabelle 1) plus 0,5 % BSA, 0,5 μM fura-2/AM, 8 μM Pluronsäure F127 und 250 μM Sulfinpyrazon.
- Stellen Sie den pH-Wert vor Gebrauch mit einem pH-Messgerät auf 7,45 ein. Nach dem Beladen mit fura-2/AM werden die Zellen unmittelbar vor der [Ca2+]i-Messung mit KRB gewaschen, das 250 μM Sulfinpyrazon enthält.
- Führen Sie die [Ca2+]i-Messung wie unten beschrieben durch.
- Legen Sie die Schalen mit den mit Fura-2 beladenen Zellen unter das Mikroskop, lokalisieren Sie ein repräsentatives Feld, das zwischen 20 und 50 Zellen bei 200-facher Vergrößerung enthält, und verwenden Sie die Freihandfunktion , um einen Umriss um jede Zelle zu zeichnen, um der Software anzuzeigen, was Hintergrundfluoreszenz ist und was nicht.
- Warten Sie, bis die Software automatisch die Hintergrundfluoreszenz von der Messung abzieht, und klicken Sie auf die Schaltfläche Experiment starten .
- Warten Sie dann zwischen 8 und 15 Sekunden, um den basalen Kalziumspiegel in den Zellen zu bestimmen, bevor Sie vorsichtig in den interessierenden Agonisten pipettieren. Fahren Sie mit der Messung für mindestens 120 Sekunden nach Zugabe des Agonisten fort oder bis der Kalziumspiegel wieder auf den Ausgangswert zurückgekehrt ist.
- Führen Sie die Datenanalyse wie unten beschrieben durch.
- Verwenden Sie die Änderung des Peaks [Ca2+]i , um die Aktionen der Stimuli darzustellen. Berechnen Sie den mittleren basalen Kalziumspiegel in jeder Zelle aus den ersten 8-15 s der Messungen. Wenn diese Zahl gleich oder größer als 500 nM ist, entfernen Sie diese Zelle aus dem Datensatz, da sie Apoptose oder Nekrose durchläuft.
- Sobald der Basalwert jeder Zelle berechnet wurde, subtrahieren Sie diesen Betrag von dem für dieselbe Zelle gemessenen Maximum [Ca2+]i . Mittelwert der Änderung des Peaks [Ca2+]I für alle Zellen in einer bestimmten Schale.
- Um die Konsistenz zu gewährleisten, zeichnen Sie die Reaktionen jedes Stimulus in doppelter Ausführung auf und berechnen Sie den Durchschnittswert der Änderungen des Spitzenwerts [Ca2+]i , der aus den Duplikaten als ein Datenpunkt aus der einzelnen menschlichen Probe erhalten wurde. Vergleichen Sie die Daten aus verschiedenen Gruppen mit einer geeigneten Datenanalysemethode, die auf dem Studiendesign basiert.
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Representative Results
Humane CGCs in Primärkultur wachsen in etwa 14 Tagen auf 80% Konfluenz. Der Zelltyp wurde durch Immunfluoreszenzfärbung mit Antikörpern gegen die Becherzellmarker CK7 und HPA-125 bestätigt (Abbildung 1). Auch wenn die Entfernung von FBS aus dem Medium die Sexualhormone eliminieren kann, könnte das Fehlen von FBS möglicherweise die zelluläre Reaktion beeinflussen. Um die Hormoneliminierungsmethode zu verifizieren, wurde ein cholinerger Agonist (Carbachol, Cch 1 × 10-4 M) als Stimulus verwendet, um die physiologische Becherzellsekretion nachzuahmen, die durch verschiedene Nervenenden vermittelt wird, die die Becherzellen umgeben26. Es wurde kein Unterschied in der Größenordnung der Veränderung des Kalziums aus dem vollständigen RPMI-Kontrollmedium beobachtet, was darauf hindeutet, dass diese Methode angewendet werden kann, um den geschlechtsspezifischen Unterschied in der Zellantwort zu untersuchen.
Der im Protokollabschnitt beschriebene Fura-2/AM-Assay wurde an Schalen durchgeführt, die mit vollständigem RPMI + 10 % FBS-Medium, fortschrittlichem RPMI-Medium (RPMI lieferte eine proprietäre Konzentration von Insulin), ergänzt mit 1 % BSA, und phenolrotfreiem RPMI mit 1 % BSA behandelt wurden. Die Ergebnisse stammen von vier Personen. Beim Vergleich der Zellen, die in phenolrotfreiem RPMI mit 1% BSA und vollständigem RPMI-Medium inkubiert wurden, wurde kein signifikanter Unterschied gefunden. Beim Vergleich der fortgeschrittenen RPMI-Mediumgruppe mit der vollständigen RPMI-Mediumgruppe wurde jedoch eine signifikant erhöhte [Ca2+]i-Reaktion auf Cch 1 × 10-4 M beobachtet (Abbildung 2). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass phenolrotfreies RPMI mit 1 % BSA die zelluläre Reaktion von Becherzellen nicht beeinflusst und das fortschrittliche RPMI-Medium in der aktuellen Forschungsumgebung sogar übertrifft.
Abbildung 1: Humane Bindehautbecher-Primärkultur. Die Bindehautbecherzellen wurden nach 14 Tagen in Kultur auf Deckgläser übertragen und eine Immunfluoreszenzfärbung mit primären Antikörpern gegen CK7 (rot) und Fluorescein-konjugiertem Lektin HPA-1 (grün) durchgeführt. (A) Die Bilder wurden unter einer 200-fachen Vergrößerung und (B) unter einer 630-fachen Vergrößerung aufgenommen. CK7 präsentiert sich als perinukleäres fluoreszierendes Signal (linkes Bild); HPA-1 zeigt ein punktuelles Muster perinueindeutig (mittleres Bild). Ein positives Immunfluoreszenzsignal von CK7 und HPA-1 deutet auf eine Becherzelle hin. Die Negativkontrolle ist die Inkubation in Abwesenheit des Primärantikörpers (C). Maßstabsbalken = 50 μm (A) und 8 μm (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Auswirkungen verschiedener Medien auf die Cch-induzierte [Ca2+]i-Antwort. Die Zellen wurden mit phenolrotfreiem RPMI mit 1 % BSA, RPMI-Medien mit 10 % FBS oder fortgeschrittenem RPMI mit 1 % BSA für eine 48-stündige Inkubation vor der Zugabe von 1 × 10-4 M Cch inkubiert. [Ca 2+]i wurde mit dem Fura2-Assay gemessen und die Änderung des Peaks [Ca2+]i wurde berechnet und in der Grafik dargestellt. Der schwarze Balken zeigt ein vollständiges Medium mit Phenolrot und 10 % FBS an. Der orangefarbene Balken zeigt fortgeschrittenes Medium mit 1 % BSA an, und der graue Balken zeigt RPMI ohne Phenolrot und mit 1 % BSA an. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM, n = 4. Die einseitige ANOVA mit Dunnett-Korrektur wurde in mehreren Gruppenvergleichen verwendet, p < 0,05 wurde als statistisch signifikant festgelegt. * zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen an. Abkürzungen: Cch = Carbachol; [Ca2+] i = intrazelluläreCa2+-Konzentration. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Lagerkomponente | Menge für 250 ml KRB | Endkonzentration |
| Traubenzucker | 0,25 g | 0,1 % w/v |
| 1 M NaCl | 30 ml | 119 mM |
| 0,5 M NaHCO3 | 12,5 ml | 25 mM |
| 1 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) | 2,5 ml | 10 mM |
| 1 M KCl | 1,2 ml | 4,8 mM |
| 1 M KH2PO4 | 300 μl | 1,2 mM |
| 1 M MgSO4 | 300 μl | 1,2 mM |
| 1 M CaCl2 | 250 μl | 1 mM |
Tabelle 1: Material und Formel für KRB. Abkürzung: w/v, weight/volume.
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Discussion
Die Untersuchung der geschlechtsspezifischen Unterschiede im Augengewebe hilft, die Prozesse von Krankheiten zu verstehen, insbesondere des trockenen Auges und der allergischen Bindehautentzündung, von denen ein Geschlecht überproportional betroffen ist 4,5,6. Auch wenn für diese Studien Tiermodelle verwendet werden können, sind Daten, die direkt aus menschlichem Gewebe gewonnen werden, aufgrund der höchsten Ähnlichkeit mit den menschlichen Zellen in vivo unerlässlich. Die Bindehautgewebe, die in der aktuellen Versuchsanordnung verwendet werden, stammen von verstorbenen Spendern mit einer Altersspanne von 70-85 Jahren (postmenopausal), was es einfacher macht, die hormonelle Wirkung ante mortem zu kontrollieren. In dieser Arbeit haben wir eine kosteneffiziente Methode vorgestellt, um geschlechtsspezifische Unterschiede in menschlichen CGCs zu untersuchen.
Der entscheidende Schritt für die Gewinnung konsistenter Daten ist die Entfernung von FBS und Phenolrot für 48 Stunden vor Experimenten zur Eliminierung der Auswirkungen von Sexualhormonen. Die Wirkung von Sexualhormonen in Zellen kann in nicht-transkriptionelle und transkriptionelle Effekte unterteilt werden. Die nicht-transkriptionellen Effekte werden schnell durch G-Proteine in wenigen Sekunden bis Minuten vermittelt, und der transkriptionelle Effekt, bei dem bestimmte Gene aktiviert werden, dauert 30 Minuten bis mehrere Stunden27; Die Halbwertszeit des östrogeninduzierten Östrogenrezeptors alpha (ERα) beträgt2-6 h 28,29. Auch wenn die Umsatzraten anderer Arten von Sexualhormon-induzierten Proteinen selten berichtet werden, deuten die Ergebnisse der vorliegenden Studien darauf hin, dass Sexualhormon-induzierte Proteine innerhalb von Stunden synthetisiert und abgebaut werden. Daher sind 48 Stunden genug Zeit, um die potenzielle Wirkung der im FBS enthaltenen Hormone auszuwaschen und gleichzeitig die normale Zellfunktion aufrechtzuerhalten. Mit der aktuellen Methode konnten wir erfolgreich geschlechtsspezifische Unterschiede in der Expression von Sexualhormonrezeptoren und zellulären Funktionen in CGCs30 berichten.
FBS ist ein wesentlicher Faktor dafür, dass Becherzellkulturen gesund und lebensfähig bleiben. Das Ersetzen des normalen, hitzeinaktivierten FBS durch das mit Holzkohle abgestreifte FBS ist eine weitere Möglichkeit, Sexualhormone im Kultursystem zu eliminieren. Die Einschränkung bei der Verwendung von FBS mit Holzkohle sind die Kosten und die komplexe Zusammensetzung des FBS. Durch das vollständige Entfernen von FBS wird auch die potenzielle Inkonsistenz durch die undefinierten Medienkomponenten von FBS eliminiert.
Der entscheidende Schritt für die [Ca2+]i-Messung ist die Stabilisierung des pH-Werts und der Temperatur. Trotz des HEPES-Präparats haben wir eine Verschiebung des pH-Werts im KRB-Puffer im Laufe der Zeit festgestellt, wenn er bei Raumtemperatur gelagert wird. Daher wird eine Nachjustierung des pH-Werts des Puffers für ein langes Experiment, etwa alle 3 h, empfohlen. Die gleiche [Ca2+]i-Methode gilt auch für andere Zelltypen, wie z. B. geschichtete Plattenepithelzellen der Bindehaut, vaskuläre Endothelzellen, Mikrogliazellen und Neuronen, um die Wirkung verschiedener Reize zu untersuchen.
Die Bindung von Fura-2 an freies Kalzium in der Zelle bewirkt eine Änderung der maximalen Absorptionswellenlänge von 380 nm (ungebunden) auf 340 nm (gebunden). Die Emissionswellenlänge bleibt jedoch bei 510 nm und diese Emissionen werden von der Kamera als Schwarz-Weiß-Bilder erfasst. Das Verhältnis der durch 340 nm angeregten Emissionsintensität und 380 nm Licht wird aufgezeichnet. Neben dem Vergleich des 340/380-Verhältnisses mit einer Standkurve zur Berechnung einer [Ca2+]i-Konzentration kann man auch die Faltungsänderung des Verhältnisses angeben, ohne eine Standardkurve erstellen zu müssen, also ohne eine tatsächliche Konzentration. Die Forscher können sich je nach Geräteaufbau und Versuchsaufbau für einen der beiden Wege entscheiden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass kultivierte primäre Bindehautbecherzellen als Modell verwendet werden können, um die geschlechtsspezifischen Unterschiede von Erkrankungen der Augenoberfläche zu untersuchen. Die Inkubation für 48 Stunden in phenolrotfreiem RPMI-Medium mit 1 % BSA vor der Durchführung von Experimenten ist eine konsistente und kosteneffiziente Methode, um die potenziellen Auswirkungen von Hormonen in Nährmedien zu eliminieren, und kann als Basalmedium zur Kontrolle des Hormonspiegels verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Arbeit wird vom National Eye Institute Grant EY019470 (D.A.D.) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin with 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
| Advanced RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
| carbachol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
| Fetal Bovin Serum | R&D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
| Fura-2- acetoxymethyl ester | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
| Human conjunctival tissue | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
| inorganic salt for KRB buffer | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Any brand will work | |
| L-glutamine | Lonza Group (Basel, Switzerland) | 17-605F | |
| non-essential amino acids | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
| phenol red-free RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
| Pluronic acid F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
| scalpel | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | Any sterile surgical scalpel can work |
| sodium pyruvate | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
| sulfinpyrazone | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |
References
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