Summary
El presente protocolo describe la extracción de lumican de la membrana amniótica (AM) y sus condiciones de almacenamiento como extracto de AM (AME) a -20 °C, 4 °C y temperatura ambiente (RT) durante 6, 12, 20 y 32 días para cuantificar sus proteínas y la concentración de lumicano.
Abstract
Lumican es un pequeño proteoglicano rico en leucina en la membrana amniótica humana (AM) que promueve la epitelización corneal y la organización de las fibras de colágeno, manteniendo la transparencia corneal. En el presente trabajo, se propone un método de extracción de proteínas de AM para obtener lumican. Además, se evalúa la estabilidad de lumicano en el extracto AM (AME) almacenado a diferentes temperaturas y períodos de tiempo. 100 mg de AM fueron descongelados y desepitelizados mecánicamente. La AM desepitelizada se congeló y trituró hasta obtener un polvo fino, que se solubilizó con 2,5 mL de tampón salino con inhibidores de la proteasa y se centrifugó para la extracción de proteínas. El sobrenadante se recolectó y almacenó a -20 °C, 4 °C y temperatura ambiente (RT) durante 6, 12, 20 y 32 días. Posteriormente, lumican se cuantificó en cada AME. Esta técnica permite un protocolo accesible y adquirible para la extracción lumican de AM. La concentración de Lumican se vio afectada por el tiempo de almacenamiento y las condiciones de temperatura. Lumican en el AME de 12 días almacenado a -20 °C y 4 °C fue significativamente mayor que otros AME. Esta extracción lumica podría ser útil para desarrollar tratamientos y soluciones farmacéuticas. Se necesitan estudios adicionales para determinar los usos de AME lumican en el proceso de reepitelización y cicatrización de heridas.
Introduction
Uno de los tratamientos más utilizados para las afecciones corneales es el trasplante de membrana amniótica; Sin embargo, en los últimos años, han surgido nuevas propuestas para utilizar diversos componentes del tejido amniótico como tratamientos alternativos y adyuvantes. Entre los componentes más estudiados de AM se encuentran los obtenidos del extracto de AM (AME)1,2,3,4,5,6,7. AM contiene múltiples factores solubles como proteínas antiangiogénicas, interleucinas (IL), inhibidores tisulares de metaloproteinasas (TIMP), proteínas antiinflamatorias mediadas por TSG-6 que inhiben las trampas extracelulares de neutrófilos, factores de crecimiento: factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento transformante (TGF) (alfa y beta), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y lumican, que mantiene la transparencia corneal mediante la regulación de la fibrilogénesisde colágeno 1, 2,3,4,5,6,7,8,9.
Lumican es un pequeño proteoglicano rico en leucina (SLRP), uno de los principales componentes extracelulares de la colagenasa intersticial en la matriz del estroma corneal, responsable de organizar las fibras de colágeno y mantener la transparencia corneal 4,10,11. Los proteoglicanos son moléculas de la matriz extracelular (MEC), que son las principales en la realización de la señalización celular y el mantenimiento de la homeostasis intracelular12. Se ha informado que las proteínas ECM impulsan los procesos celulares de proliferación, diferenciación y migración durante la cicatrización de heridas11.
La evidencia indica la posible participación de lumican en el proceso de reepitelización corneal. Saika et al., en un estudio, demostraron que después de una lesión corneal, lumican podría detectarse en queratocitos corneales entre las primeras 8 h y hasta 3 días después de la lesión. Presentando la mayor concentración de lumicano en el segundo y tercer día, este proteoglicano es posteriormente indetectable en el séptimo día13. Estos datos sugieren la participación de lumican en la activación del proceso de reepitelización corneal. Por otro lado, en otro estudio, se informó que la ausencia de lumicano retrasa la reepitelización; Curiosamente, la adición de Lumican podría acelerar el proceso de reepitelización 4,11,13. Asimismo, un estudio reciente ha reportado que lumican puede modular las funciones inflamatorias de los fibroblastos del limbo corneal14, lo que sugiere un papel para lumican como modulador de la respuesta inflamatoria, antifibrótica y reepitelizante. Del mismo modo, lumican puede modular la respuesta corneal interactuando con moléculas de señalización como Fas-FasL. Además, la ausencia de lumican en un modelo de ratón Lum-/- knockout demostró que la falta de señalización lumican impide una reparación corneal adecuada15.
Principalmente, este método tiene como objetivo demostrar una forma factible y accesible de extraer lumican de AM. Con este ventajoso método de extracción lumicana, es posible obtener concentraciones similares de proteínas, disminuyendo el tiempo de procesamiento y haciéndolo más conveniente para los investigadores en comparación con los estudios previos16. Además, este AME lumican podría usarse como adyuvante para procesos de reparación y reepitelización corneal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional (Proyecto Nº CEI-2020/06/04). La AM se obtuvo del banco de amnios del Instituto de Oftalmología Conde de Valenciana (de sujetos humanos no identificados), preparado tal como lo describen Chávez-García et al.17.
1. Preparación del extracto de membrana amniótica
- Obtenga 100 mg de AM del banco de amnios.
NOTA: Según un informe anterior, 50 mg de AM secretan un total de 10 ng / ml de lumican14. Para obtener una mayor concentración de lumican, use 100 mg de AM, equivalente a un área total de 32 cm2. - Si la AM está congelada, descongélela a temperatura ambiente.
NOTA: Realice los siguientes procedimientos bajo una campana de flujo laminar clase II B. - Lave la AM en una placa de Petri con 10 ml de solución salina balanceada estéril (BSS, ver Tabla de materiales) durante 2 min.
- Vierta el BSS en un vaso de precipitados.
- Repita el paso 3 y confirme visualmente que el medio de glicerol no está presente en la placa de Petri BSS.
NOTA: Repita el paso 3. según sea necesario hasta que el medio de glicerol no esté presente en la placa de Petri BSS.
- Incubar la AM con 10 mL de dispasa II (1.7 UI/mL, ver Tabla de Materiales) a 37 °C, 5% deCO2 durante 30 min.
NOTA: La dispasa II es una proteasa neutra con actividad suave sobre las células epiteliales. Esta enzima separa eficazmente la epidermis intacta de la dermis y aísla las láminas epiteliales intactas18. - Después de la incubación de la dispasa, realice una desepitelización mecánica14 con un policía de goma (ver Tabla de materiales). Confirmar la desepitelización mediante visualización microscópica.
NOTA: El proceso de desepitelización se corrobora en un microscopio invertido utilizando objetivos 4x y 20x. Visualice el tejido para excluir la presencia de cualquier capa celular. - Lave la AM en una placa de Petri con 10 ml de BSS durante 2 min. Vierta el BSS en un vaso de precipitados.
- Coloque la AM desepitelizada (dAM) en un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Sumerja el dAM en nitrógeno líquido durante 40 min.
- Moler manualmente el dAM congelado durante 2-3 minutos en un mortero preenfriado a -85 °C hasta obtener un polvo fino.
- En el mortero, solubilizar el polvo de dAM con 2,5 ml de solución inhibidora de la proteasa (BSS con inhibidores de la proteasa).
NOTA: Cada tableta de inhibidor de la proteasa consiste en la siguiente mezcla de enzimas: extracto de páncreas (0.02 mg/ml), termolisina (metaloprrotasisa) (0.0005 mg/ml), quimotripsina (0.002 mg/ml), tripsina (0.02 mg/ml) y papaína (0.33 mg/ml) (ver Tabla de materiales). - Recoja la mezcla con una micropipeta y limpie las paredes de mortero con la ayuda de un cuchillo de bisturí. Coloque la mezcla en un tubo de 5 ml.
- Mezclar bien con el vórtice durante 30 s.
- Homogeneizar la mezcla de tejidos centrifugando a 34 x g durante 20 min a 4 °C e inmediatamente centrifugar a 3360 x g durante 20 min a 4 °C.
- El sobrenadante recogido es el AME (Figura 1). Almacene 0,7 ml de cada AME en diferentes tubos de microcentrífuga de 2 ml durante 6, 12, 20 y 33 días a las diferentes condiciones de temperatura de -20 °C, 4 °C y temperatura ambiente (RT).
Figura 1: Proceso de preparación de AME y medición de la concentración de lumican . Se incubaron 100 mg de AM con dispasa II a 37 °C durante 30 min y se desepitelizaron mecánicamente. La AM desepitelizada se lavó y se sumergió en nitrógeno líquido durante 40 min, y luego se trituró hasta obtener un polvo fino, que se solubilizó con 2,5 mL de tampón salino con inhibidores de proteasa y se centrifugó. El sobrenadante se recolectó y almacenó a -20 °C, 4 °C y RT durante 6, 12, 20 y 32 días hasta la cuantificación total de proteínas y lumicanos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. Cuantificación de proteínas AME
NOTA: La cuantificación de la proteína total en el AME debe llevarse a cabo inmediatamente después de la obtención. Cuantifique las proteínas usando el ensayo de proteína de Lowry y siga las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Se recomienda que todos los patrones y muestras se ensayen por triplicado.
- Pipetear 40 μL de cada muestra de AME en una microplaca de 96 pocillos.
- Preparar una curva estándar en la misma microplaca utilizando el estándar de albúmina sérica bovina (BSA) para una concentración final de BSA de 0-1,500 μg / ml (0, 1, 5, 25, 125, 250, 500, 750, 1,000 y 1,500 μg / ml).
- Pipetear 200 μL del reactivo de Lowry modificado a cada pocillo. Mezclar inmediatamente en una batidora de platos durante 30 s.
- Cubra la microplaca con papel de aluminio e incube a RT durante 10 min.
- Pipetear 20 μL de 1x reactivo de Folin-Ciocalteu a cada pocillo. Mezclar inmediatamente en una batidora de platos durante 30 s.
NOTA: Para preparar 1x reactivo de Folin-Ciocalteu, diluir 2x (2N) reactivo 1:1 con agua ultrapura. Preparar 1x reactivo de Folin-Ciocalteu el mismo día de uso, ya que el reactivo diluido es inestable. - Cubra la microplaca de la luz con papel de aluminio e incube a RT durante 30 min.
- Mida la absorbancia de muestras a 660 nm en un espectrómetro de placas ELISA (consulte la Tabla de materiales).
NOTA: El color se puede medir en longitudes de onda entre 650 nm y 750 nm. - Promedie el valor de absorbancia de 660 nm de las muestras en blanco estándar y réstelo de otros valores de 660 nm de muestras estándar y desconocidas.
- Mida la absorbancia con un espectrómetro de placas ELISA en un modo de punto final con baja agitación durante 10 s.
- Utilice la curva estándar para determinar la concentración de proteína de cada muestra desconocida.
- Para el cálculo de proteínas, determine la concentración a partir de un gráfico de regresión lineal utilizando los valores de absorbancia en el eje Y contra las concentraciones en mg/ml en el eje X de cada curva BSA estándar.
- Obtenga la ecuación de regresión lineal y el valor r para calcular la concentración de proteína.
NOTA: Los resultados se expresan como valores de concentración relativa normalizados de proteína total en relación con mg de AM (μg/ml de proteína/mg de tejido AM).
- Obtenga la ecuación de regresión lineal y el valor r para calcular la concentración de proteína.
3. Cuantificación de Lumican en AME
NOTA: La concentración de lumican debe medirse en el AME almacenado en diferentes condiciones de almacenamiento y períodos de tiempo. Cuantifique lumican usando ELISA sándwich y siga las instrucciones del fabricante. Se recomienda que todos los estándares y muestras se ensayen por duplicado.
- Diluir el anticuerpo de captura de lumicano humano (ver Tabla de materiales) a la concentración empleada en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
NOTA: El vial de anticuerpos de captura contiene 120 μg de anticuerpo. Después de la reconstitución con 0,5 ml de PBS, diluir el anticuerpo de captura en una solución de trabajo de 2 μg/ml.- Pipetear instantáneamente 100 μL por pocillo del anticuerpo de captura diluido a una microplaca de 96 pocillos. Encierre el plato e incube durante la noche en RT.
- Aspirar cada pocillo y lavarlo pipeteando con 300 μL de tampón de lavado: monolaurato de polioxietileno sorbitán al 0,05% 20 en PBS, pH 7,2-7,4 (ver Tabla de materiales) utilizando un pipetor multicanal. Repita tres veces.
NOTA: Después del último lavado, retire cualquier tampón de lavado restante everando el plato y golpeándolo suavemente contra toallas de papel. - Bloquee las placas agregando 300 μL de diluyente de reactivo: BSA al 1% en PBS, pH 7.2-7.4, 0.2 μm filtrados (ver Tabla de materiales) a cada pocillo. Incubar en RT durante 1 h.
- Repita el paso 2.
- Prepare una curva estándar en una microplaca de 96 pocillos utilizando diluciones seriadas dobles de 0-8,000 pg / ml para concentraciones finales de 125, 250, 500, 1,000, 2,000, 4,000 y 8,000 pg / ml. El kit ELISA lumican contiene un estándar lumican recombinante de 75 ng (consulte la Tabla de materiales).
- Agregue 100 μL de muestras y la curva estándar en la microplaca de 96 pocillos recubierta con anticuerpos de captura.
- Cubrir la microplaca e incubar durante 2 h a RT con baja agitación en un balancín compacto manteniendo la velocidad entre 2-3 rpm.
- Repita el paso 2.
- Agregue 100 μL del anticuerpo de detección biotinilada (consulte la Tabla de materiales) a cada pocillo. Cubrir de luz e incubar 2 h a RT con baja agitación en un balancín compacto manteniendo la velocidad entre 2-3 rpm.
NOTA: El vial de anticuerpos de detección biotinilada contiene 24 μg de anticuerpo. Después de la reconstitución con 1,0 ml de diluyente de reactivo, diluir el anticuerpo de detección biotinilado en una solución de trabajo de 400 ng/ml. - Repita el paso 2.
- Agregue 100 μL de la dilución de trabajo de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (HRP, consulte la Tabla de materiales) a cada pocillo. Cubra la microplaca de la luz e incube durante 20 minutos en RT.
NOTA: La estreptavidina-HRP reactiva se concentró 40 veces. La solución de trabajo 1x de estreptavidina-HRP se hizo con diluyente reactivo.
NOTA: Evite colocar la placa en luz directa. - Repita el paso 2.
- Finalmente, agregue 100 μL de solución de sustrato de tetrametilbencidina (TMB, consulte la Tabla de materiales) a cada pocillo.
NOTA: Prepare la solución TMB con un volumen igual de solución estabilizada de peróxido de hidrógeno al 30% proporcionada en el kit.
NOTA: Prepare la solución inmediatamente antes de usarla y manténgala a temperatura ambiente. - Incubar durante 30 minutos en RT en un lugar oscuro.
NOTA: Evite colocar la placa en luz directa. No aspire la solución TMB ya que no es necesario lavarla más. - Añadir 50 μL de solución de parada 1NH2SO4 para detener la reacción colorimétrica. Golpee suavemente el plato para asegurar una mezcla completa.
- Determine inmediatamente la absorbancia de cada pocillo utilizando un lector de microplacas ajustado a 450 nm en un espectrómetro de placas ELISA.
- Mida la absorbancia con un espectrómetro de placas ELISA en un modo de punto final con baja agitación durante 10 s.
- Promedie el valor de absorbancia de 450 nm de las muestras en blanco estándar y réstelo de otros valores de 450 nm de muestras estándar y desconocidas.
- Utilice la curva estándar para determinar la concentración lumica de cada muestra desconocida.
- Para el cálculo de la concentración lumicana, hacer un gráfico de regresión lineal utilizando los valores de absorbancia en el eje Y contra las concentraciones en pg/mL en el eje X de cada curva lumican estándar.
- Obtenga la ecuación de regresión lineal y el valor r para calcular la concentración lumicana.
NOTA: La concentración de lumican se normalizó con respecto al mg de tejido extraído. Los resultados se expresan como valores de concentración relativa normalizados de lumican a mg AM (ng/ml lumican/mg AM tejido).
- Obtenga la ecuación de regresión lineal y el valor r para calcular la concentración lumicana.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Los resultados se informan como el valor medio ± la desviación estándar (DE). Se realizaron pruebas t de Student y análisis de varianza (ANOVA). Los valores de p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. El análisis estadístico se realizó utilizando software estadístico (ver Tabla de materiales).
La cantidad total de proteína en el AME se vio afectada por el tiempo y las condiciones de almacenamiento. La concentración de proteína basal fue similar entre todos los AME; el rango de proteína total fue de 2,7 ± 0,3 μg/mL sin diferencia significativa entre las muestras evaluadas. Sin embargo, cuando las muestras se almacenaron durante 12, 20 y 32 días, se observó variabilidad en la concentración de proteínas con respecto a la concentración basal. Curiosamente, la concentración de proteínas aumentó en el AME a 4 °C y -20 °C con respecto a la RT en todo momento de almacenamiento.
Del mismo modo, cuando se comparó la concentración de proteína entre los tiempos de almacenamiento, cambió después de 12, 20 y 32 días. Se encontró una diferencia significativa (p < 0,05) en el AME de 32 y 20 días a 4 °C y -20 °C en comparación con la condición de RT (Figura 2), sugiriendo que la temperatura es importante para la conservación de proteínas en los diferentes AME obtenidos.
Figura 2: Concentración total de proteína en AME afectada por el tiempo y la temperatura de almacenamiento. La concentración de extracción de proteínas en AME se cuantificó antes y después de las condiciones de temperatura y tiempo de almacenamiento. El tiempo de almacenamiento evaluado fue de 6 días (triángulos negros), 12 días (triángulos rosas), 20 días (cuadrado púrpura) y 32 días (círculos marrones) en comparación con tres condiciones de temperatura diferentes (RT °C, 4 °C y -20 °C). La concentración de proteína basal fue similar entre todos los AME. Hubo una diferencia significativa en la concentración de proteína en el AME de 20 y 32 días con respecto a la concentración de proteína basal a diferentes condiciones de temperatura. En cada condición n = 3. Los datos se expresan como mediana de μg/ml de proteína ± SE *p < 0,05 (S1 32 días vs. S1 20, 12 y 6 días a 4 °C); (S1 32 días vs. S1 20, 12 y 6 días a -20 °C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La concentración de Lumican se vio afectada por el tiempo de almacenamiento y las condiciones de temperatura. Se encontró menos concentración de lumican en el AME almacenado durante 6, 20 y 32 días, en comparación con 12 días de almacenamiento. Significativamente, el AME de 12 días tuvo una mayor concentración de lumicano que 20 y 32 días de almacenamiento (p < 0,05).
Cuando se comparó la concentración de lumicano en el AME entre las temperaturas de almacenamiento, se encontró una mayor concentración de lumicano si se almacenó a -20 °C y 4 °C durante 12 días (Figura 3). Curiosamente, incluso una concentración más alta (p < 0.05) de lumican se encontró en los 12 días AME si se almacena a -20 ° C en comparación con 4 ° C.
Esto sugiere que la concentración de lumican se ve afectada por las condiciones de temperatura y el tiempo de almacenamiento, lo que sugiere que el tiempo de almacenamiento y la temperatura adecuados para lograr la concentración más alta de lumican es de 12 días a -20 ° C.
Figura 3: Concentración total de lumicano en AME afectada por el tiempo y la temperatura de almacenamiento. La concentración de Lumican se vio afectada por el tiempo de almacenamiento y las condiciones de temperatura. La concentración de lumican en AME se cuantificó antes y después de las condiciones de temperatura y tiempo de almacenamiento. El tiempo de almacenamiento evaluado fue de 6 días (triángulos negros), 12 días (triángulos rosas), 20 días (cuadrado púrpura) y 32 días (círculos marrones) en comparación con tres condiciones de temperatura diferentes (RT °C, 4 °C y -20 °C). Lumican en el AME de 12 días fue significativamente mayor en comparación con el AME de 32, 20 y 6 días, en condiciones de temperatura de -20 °C y 4 °C. *p < 0,05 (S1 12 días vs. S1 32, 20 y 6 días a 4 °C); p < 0,001 (S1 12 días vs. S1 32, 20 y 6 días a -20°C). La concentración más alta de lumicano en AME fue a los 12 días almacenada a -20 °C. ++p < 0,01 (S1 12 días 4 °C vs. S1 12 días -20 °C). No hubo diferencias significativas entre lumican en el AME de 32 y 20 días en comparación con las condiciones de temperatura de almacenamiento (n.s). En cada condición (n = 3), los datos se expresan como la mediana de ng/mL de proteína. Los datos se normalizaron con respecto a mg de tejido ± SE. (n.s.) no significación estadística. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En este estudio, se analizó la presencia de lumican en el AME y su correlación directa con su estabilidad bajo diferentes condiciones de almacenamiento. Curiosamente, cuando se cuantificó la concentración total de proteína en AME, la concentración de proteína aumentó después del almacenamiento. La evidencia sugiere tres mecanismos que podrían cambiar la concentración de proteínas en el almacenamiento congelado: la desnaturalización en frío, la concentración congelada de solutos y el despliegue parcial inducido por el hielo de la estructura de la proteína19. El proceso de congelación podría afectar la concentración de proteínas en las muestras de almacenamiento debido a la cristalización de la fase líquida en la muestra. Los resultados sugieren que esto podría haber ocurrido como un proceso de congelación de la concentración, afectado por el tiempo de almacenamiento en el congelador. Se observó una mayor concentración de proteínas en tiempos más largos de almacenamiento (32 y 20 días) y en las temperaturas más frías (4 °C y -20 °C). Sin embargo, el período con la mayor concentración de proteína no tuvo la mayor concentración de lumican; Esto sugiere que Lumican podría verse afectado por temperaturas congeladas y condiciones de tiempo.
Según los resultados, la concentración de lumicano fue mayor y más estable a los 12 días de almacenamiento a 4 °C y -20 °C. No obstante, se encontró una menor concentración de lumicano a los 6 días en comparación con 12 días. Algunos informes sugieren que la concentración de proteínas podría cambiar después de las condiciones de almacenamiento congelado20. Los resultados podrían ser causados por un mecanismo termodinámico llamado despliegue parcial inducido por hielo de la estructura de la proteína, que ocurre durante la congelación de muestras. La interacción de las proteínas con el agua en las soluciones acuosas reduce sus interacciones con otras moléculas. El proceso de cristalización del agua en condiciones de congelación permite que las proteínas y algunas regiones funcionales interactúen con otras moléculas19. Por lo anterior, después de 12 días de congelar lumican en una solución acuosa, podría ser capaz de interactuar con los anticuerpos presentes en el kit de cuantificación ELISA para dar como resultado una mayor concentración. Por otro lado, probablemente en el sexto día, el lumicano podría haber estado aislado en la solución acuosa.
En el avance de las innovaciones, el uso de AM es el tratamiento de vanguardia para la reepitelización corneal, independientemente de la etiología. Como se mencionó anteriormente, los beneficios de AM son vastos 21,22,23,24,25,26. Muchos autores han demostrado los beneficios de lumican en AME, por lo que es una alternativa asequible específicamente para los países en desarrollo 1,2,3,4,5,6,7,8,9. Actualmente, hay muchos beneficios de lumican en AME; Su uso como tratamiento favorece la reepitelización corneal y mejora el pronóstico de las úlceras corneales 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. El trasplante AM (AMT) se ha convertido en un tratamiento con grandes beneficios para mejorar diversos trastornos corneales24,25. Sin embargo, existen algunas afecciones crónicas del tejido corneal, como defectos epiteliales persistentes (PED) y deficiencias de células madre limbares (LESCD), que requieren tratamiento constante y mantenimiento de la presencia de factores biológicos que ayudan a la reparación corneal21,24. Actualmente, no existen tratamientos adyuvantes que permitan el mantenimiento a largo plazo de los factores liberados por AMT en la superficie corneal. Sin embargo, un reemplazo constante de la AMT no pudo ser recomendado para la seguridad del paciente26. Por esta razón, es necesario desarrollar alternativas que permitan que las funciones de AMT asistan y ayuden a mantener la presencia de factores liberados por AM en el tejido corneal como lumican por más tiempo, con la intención de favorecer el tratamiento de problemas persistentes de la córnea27.
Lumican es uno de los factores presentes en la AM con funciones antiinflamatorias y antifibróticas, que ha sido reportado para tener funciones en el proceso de reparación corneal 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . Es por eso que lumican sugiere ser un buen candidato para ayudar en el tratamiento de afecciones corneales; sin embargo, se requiere investigación adicional para determinar la eficacia de lumican en AME para lograr la reepitelización corneal.
Lumican es un proteoglicano que se ha demostrado que regula la secreción de compuestos de la matriz extracelular como colágeno; Además, está implicado en la activación de fibroblastos y la modulación de las células inflamatorias y el proceso de angiogénesis, teniendo un papel importante en la cicatrización de heridas. De acuerdo con los resultados, lumican se puede extraer del tejido AM. Las aplicaciones terapéuticas de lumican son numerosas; el uso de lumican en el AME permite una opción terapéutica alcanzable para los trastornos oculares 4,13. La principal ventaja de usar AME es que proporciona una fácil aplicación como tratamiento tópico para la superficie ocular, dada su composición acuosa. Asimismo, dentro de los componentes extraídos del tejido AM se pueden encontrar otras proteínas con características antiinflamatorias e inmunorreguladoras, lo que podría presentar un mayor beneficio en el tratamiento de problemas desepitelizantes en el ojo. Por ejemplo, otros factores antiinflamatorios como la TSG-6 presente en la AM y los componentes celulares han sido previamente reportados para tener propiedades inmunorreguladoras8. De este modo, una terapia combinada de lumicano y otros compuestos de la matriz extracelular y moléculas inmunomoduladoras presentes en el AME podría ser útil en el proceso de reepitelización y cicatrización de heridas.
Este método tiene como objetivo demostrar una técnica sencilla para la extracción de proteínas, útil para la obtención de proteínas y factores abundantes. Una de las consideraciones críticas para este método es el uso de inhibidores de la proteasa, ya que es fundamental para el éxito de la extracción de proteínas, ya que la AM es un tejido con cargas de compuestos enzimáticos para prevenir la degradación de proteínas27. La evidencia ha reportado que el uso de inhibidores proteicos junto con una solución acuosa aumenta la extracción de otros factores, como HGF, en el tejido AM26. La obtención de un polvo fino después de congelar y poner a tierra la AM es necesaria para la obtención óptima de AME, ya que este proceso es adecuado para la disrupción tisular y celular de estructuras necesarias para la extracción de compuestos citosólicos y otros compuestos nucleares28,29.
Algunas limitaciones de este método de extracción son que la cantidad AM utilizada no podría permitir una extracción a gran escala. Este protocolo permite la extracción de proteínas de una cantidad limitada de tejido; ya que no hay evidencia de que este método permita obtener una mayor cantidad de proteína de un área de tejido más grande. La solución de problemas a considerar en comparación con otros métodos de extracción es utilizar una concentración adecuada de inhibidor de la proteasa y el tiempo de incubación, ya que el exceso de enzimas podría afectar a las proteínas30 y reducir la eficacia de la técnica.
Parte de esta técnica fue modificada a partir de la reportada por Mahbod et al.16, que describe que repetir el proceso de centrifugación y extracción aumenta la extracción de proteínas. Contrariamente a Mahbod, los resultados no informaron la concentración de proteínas después de tres ciclos de centrifugación. Cuando se determinó la concentración total de proteína, disminuyó en un 80% en una segunda extracción y hasta un 97% en una tercera extracción. Realizar una sola extracción reduce el tiempo de procesamiento y no disminuye la cantidad de proteína total. Con lo anterior, el método de extracción reportado aquí requiere solo un paso de centrifugación con resultados favorables.
Esta técnica podría utilizarse para extraer otros factores y proteínas presentes en la AM y además, para obtener factores de otras fuentes como animales o vegetales. También podría tener una aplicación para la obtención de proteínas para llevar a cabo investigación básica o incluso el desarrollo de formulaciones y tratamientos.
Estos resultados sugieren que lumican puede extraerse de AM y almacenarse durante 12 días como AME en condiciones de temperatura de -20 °C y 4 °C. Es importante considerar su vida media para lograr los efectos terapéuticos del lumican como AME. Se necesitan estudios adicionales para determinar la función de AME lumican en las células epiteliales corneales y para determinar la dosis ideal de lumican para la reepitelización corneal.
En conclusión, los resultados sugieren que es posible obtener factores como lumican en el AME. Asimismo, las condiciones de temperatura y tiempo de almacenamiento influyen en la concentración de lumican presente en el AME.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
El estudio fue financiado por el Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica de la Universidad Nacional Autónoma de México (Subvención No. PAPIIT IN203821), y Secretaría de Educación, Ciencia, Tecnología e Innovación (Subvención No. SECTEI 250/2019).
Acknowledgments
Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 N H2SO4 stop solution | R&D Systems | DY994 | |
| 100 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 1000 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 15 mm Petri dish | Symlaboratorios | ||
| 18 G Needle (1.2 mm x 40 mm) | BD Becton Dickinson | 305211 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | Z606340 | |
| 20 mL plastic syringe | BD Becton Dickinson | 302562 | |
| 20 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 20-200 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 30119401 | |
| 96-well microplate | SARSTEDT | 821581 | |
| Aluminum foil | N/A | N/A | |
| Amniotic membrane | Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank | 100 mg | |
| Balanced salt solution | Bausch + Lomb | BSS-403802 | |
| Beaker | N/A | N/A | |
| BioRender | BioRender | figures design | |
| Compact Rocker | BioRad | 970822DD | Mod. 5202SD-BIO |
| complete, EDTA-free, Protease inhibitor cocktail tablets |
Roche | 11 873 580 001 | Protease Inhibitor |
| Daiggner vortex Genie 2 | A.Daigger & Co. , INC | 22220A | |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | |
| ELISA plate spectrometer | Thermo Labsystems | 35401106 | Multiscan |
| Freezer | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc | version 9 | statistical analysis and graphic program |
| Human lumican DuoSet ELISA kit | R&D Systems | DY2846-05 | includes human Lumican capture antibody |
| Incubator | Forma Scientific | 3326 S/N 36481-7002 | |
| Inverted light Microscope | Olympus | 6A13921 | to confirm de-epithelialization Mod.CK2 |
| Laminar flow hood | Forma Scientific | 14753-567 | Mod.1184 |
| Liquid nitrogen | N/A | N/A | |
| Mortar | N/A | N/A | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | ||
| Nitrogen Tank | Thermo Scientific | Mod. Biocan 20 | |
| Paper towels | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | R&D Systems | DY006 | |
| Pierce Modified Lowry Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23240 | |
| Plate sealers | R&D Systems | DY992 | |
| Reagent diluent | R&D Systems | DY995 | 1% BSA in PBS, pH 7.2-7.4, 0.2 μm filtered |
| Refrigerated centrifuge | centurion scientific Ltd | 15877 | Mod. K2015R |
| Rubber policeman cell scraper | NEST | 710001 | for mechanical de-epithelialization |
| Scalpel knife | Braun | BB521 | No. 10 or 21 |
| Streptavidin-HRP 40-fold concentrated | R&D Systems | part 893975 | |
| Substrate tetramethylbenzidine (TMB) solution | R&D Systems | DY999 | |
| Toothed tweezers | Invent Germany | 6b | inox |
| Ultrapure water | PISA | ||
| Wash buffer | R&D Systems | WA126 | 0.05% Tween 20 in PBS, pH 7.2-7.4 |
References
- Jirsova, K., Jones, G. Amniotic membrane in ophthalmology: properties, preparation, storage and indications for grafting-a review. Cell and Tissue Banking. 18 (2), 193-204 (2017).
- Witherel, C., Yu, T., Concannon, M., Dampier, W., Spiller, K. Immunomodulatory effects of human cryopreserved viable amniotic membrane in a pro-inflammatory environment in vitro. Cellular and Molecular Bioengineering. 10 (5), 451-462 (2017).
- Ruiz-Cañada, C., et al. Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating transforming growth factor-β signalling. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 808-820 (2017).
- Yeh, L., et al. Soluble lumican glycoprotein purified from human amniotic membrane promotes corneal epithelial wound healing. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46 (2), 479 (2005).
- Navas, A., et al. Anti-Inflammatory and anti-fibrotic effects of human amniotic membrane mesenchymal stem cells and their potential in corneal repair. Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 906-917 (2018).
- Magaña-Guerrero, F., Domínguez-López, A., Martínez-Aboytes, P., Buentello-Volante, B., Garfias, Y. Human amniotic membrane mesenchymal stem cells inhibit neutrophil extracellular traps through TSG-6. Scientific Reports. 7, 12426 (2017).
- Garfias, Y., Zaga-Clavellina, V., Vadillo-Ortega, F., Osorio, M., Jimenez-Martinez, M. Amniotic membrane is an immunosuppressor of peripheral blood mononuclear cells. Immunological Investigations. 40 (2), 183-196 (2010).
- Koob, T., et al. Biological properties of dehydrated human amnion/chorion composite graft: implications for chronic wound healing. International Wound Journal. 10 (5), 493-500 (2013).
- Miyagi, H., Thomasy, S., Russell, P., Murphy, C. The role of hepatocyte growth factor in corneal wound healing. Experimental Eye Research. 166, 49-55 (2018).
- Chen, S., Mienaltowski, M., Birk, D. Regulation of corneal stroma extracellular matrix assembly. Experimental Eye Research. 133, 69-80 (2015).
- Karamanou, K., Perrot, G., Maquart, F., Brézillon, S. Lumican as a multivalent effector in wound healing. Advanced Drug Delivery Reviews. 129, 344-351 (2018).
- Theocharis, A., et al. Cell-matrix interactions: focus on proteoglycan-proteinase interplay and pharmacological targeting in cancer. FEBS Journal. 281 (22), 5023-5042 (2014).
- Saika, S., et al. Role of lumican in the corneal epithelium during wound healing. Journal of Biological Chemistry. 275 (4), 2607-2612 (2000).
- Domínguez-López, A., et al. Amniotic membrane conditioned medium (AMCM) reduces inflammatory response on human limbal myofibroblast, and the potential role of lumican. Molecular Vision. 27, 370-383 (2021).
- Vij, N., Roberts, L., Joyce, S., Chakravarti, S. Lumican regulates corneal inflammatory responses by modulating Fas-Fas Ligand signaling. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46 (1), 88 (2005).
- Mahbod, M., et al. Amniotic membrane extract preparation: What is the best method. Journal of Ophthalmic and Vision Research. 9 (3), 314-319 (2014).
- Chávez-García, C., et al. Ophthalmic indications of amniotic membrane transplantation in Mexico: an eight years Amniotic Membrane Bank experience. Cell and Tissue Banking. 17 (2), 261-268 (2015).
- Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).
- Bhatnagar, B. S., Bogner, R. H., Pikal, M. J. Protein stability during freezing: separation of stresses and mechanisms of protein stabilization. Pharmaceutical Development and Technology. 12 (5), 505-523 (2007).
- McClain, A. K., McCarrel, T. M. The effect of four different freezing conditions and time in frozen storage on the concentration of commonly measured growth factors and enzymes in equine platelet-rich plasma over six months. BMC Veterinary Research. 15 (1), 292 (2019).
- Tamhane, A., et al. Evaluation of amniotic membrane transplantation as an adjunct to medical therapy as compared with medical therapy alone in acute ocular burns. Ophthalmology. 112 (11), 1963-1969 (2005).
- Shtein, R., et al. Autologous serum-based eye drops for treatment of ocular surface disease. Ophthalmology. 127 (1), 128-133 (2020).
- Shahriari, H., Tokhmehchi, F., Reza, M., Hashemi, N. Comparison of the effect of amniotic membrane suspension and autologous serum on alkaline corneal epithelial wound healing in the rabbit model. Cornea. 27 (10), 1148-1150 (2008).
- Schuerch, K., Baeriswyl, A., Frueh, B., Tappeiner, C. Efficacy of amniotic membrane transplantation for the treatment of corneal ulcers. Cornea. 39 (4), 479-483 (2019).
- Chen, H., et al. Amniotic membrane transplantation for persistent corneal ulcers and perforations in acute fungal keratitis. Cornea. 25 (5), 564-572 (2006).
- Guo, Q., et al. A comparison of the effectiveness between amniotic membrane homogenate and transplanted amniotic membrane in healing corneal damage in a rabbit model. Acta Ophthalmologica. 89 (4), 315-319 (2011).
- Sabater, A., Perez, V. Amniotic membrane use for management of corneal limbal stem cell deficiency. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 363-369 (2017).
- Ahmad, T., et al. Autolysis of bovine skin, its endogenous proteases, protease inhibitors and their effects on quality characteristics of extracted gelatin. Food Chemistry. 265, 1-8 (2018).
- Mullegama, S. V., et al. Nucleic acid extraction from human biological samples. Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).
- Skog, M., et al. The effect of enzymatic digestion on cultured epithelial autografts. Cell Transplantation. 28 (5), 638-644 (2019).
