Summary
Den nuværende protokol beskriver ekstraktionen af lumikan fra fosterhinden (AM) og deres opbevaringsbetingelser som AM-ekstrakt (AME) ved -20 °C, 4 °C og stuetemperatur (RT) i 6, 12, 20 og 32 dage for at kvantificere dets proteiner og lumikankoncentration.
Abstract
Lumican er en lille leucinrig proteoglycan i den humane fosterhinde (AM), der fremmer hornhindeepitelisering og organisering af kollagenfibre, der opretholder hornhindegennemsigtighed. I det foreliggende arbejde foreslås en metode til proteinekstraktion fra AM til opnåelse af lumikan. Derudover evalueres stabiliteten af lumican i AM-ekstraktet (AME), der opbevares ved forskellige temperaturer og tidsperioder. 100 mg AM blev optøet og mekanisk af-epiteliseret. Den afepiteliserede AM blev frosset og knust, indtil der blev opnået et fint pulver, som blev opløst med 2,5 ml saltvandsbuffer med proteasehæmmere og centrifugeret til proteinekstraktion. Supernatanten blev opsamlet og opbevaret ved -20 °C, 4 °C og stuetemperatur (RT) i 6, 12, 20 og 32 dage. Derefter blev lumican kvantificeret i hver AME. Denne teknik tillader en tilgængelig og indløselig protokol til lumicanekstraktion fra AM. Lumicankoncentrationen blev påvirket af opbevaringstid og temperaturforhold. Lumican i AME på 12 dage opbevaret ved -20 °C og 4 °C var signifikant højere end andet AME. Denne lumican ekstraktion kan være nyttig til udvikling af behandlinger og farmaceutiske løsninger. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at bestemme anvendelserne af AME lumican i re-epitelisering og sårheling proces.
Introduction
En af de mest anvendte behandlinger for hornhindekærlighed er fosterhindetransplantation; I de senere år er der imidlertid kommet nye forslag til anvendelse af forskellige komponenter i fostervand som alternative og adjuverende behandlinger. Blandt de mest undersøgte komponenter af AM er dem, der er opnået fra AM-ekstraktet (AME)1,2,3,4,5,6,7. AM indeholder flere opløselige faktorer såsom antiangiogene proteiner, interleukiner (IL), vævsinhibitorer af metalloproteinaser (TIMP'er), antiinflammatoriske proteiner medieret af TSG-6, der hæmmer neutrofile ekstracellulære fælder, vækstfaktorer: epidermal vækstfaktor (EGF), transformerende vækstfaktor (TGF) (alfa og beta), keratinocytvækstfaktor (KGF), hepatocytvækstfaktor (HGF) og lumican, som opretholder hornhindegennemsigtighed ved at regulere kollagenfibrillogenese1, 2,3,4,5,6,7,8,9.
Lumican er en lille leucinrig proteoglycan (SLRP), en af de vigtigste ekstracellulære komponenter i interstitiel collagenase i hornhindestromamatrixen, der er ansvarlig for at organisere kollagenfibre og opretholde hornhindegennemsigtighed 4,10,11. Proteoglycaner er molekyler i den ekstracellulære matrix (ECM), som er de vigtigste i udførelsen af cellesignalering og opretholdelse af intracellulær homeostase12. ECM-proteiner er blevet rapporteret at drive de cellulære processer med proliferation, differentiering og migration under sårheling11.
Beviser indikerer den mulige deltagelse af lumican i processen med hornhinde re-epitelisering. Saika et al. viste i en undersøgelse, at lumican efter en hornhindeskade kunne påvises i hornhindekratocytter mellem de første 8 timer og op til 3 dage efter skade. Denne proteoglycan præsenterer den højeste koncentration af lumican på den anden og tredje dag og kan efterfølgende ikke detekteres på den syvende dag13. Disse data tyder på lumicans deltagelse i aktiveringen af hornhinde-re-epiteliseringsprocessen. På den anden side blev det i en anden undersøgelse rapporteret, at fraværet af lumican forsinker re-epitelisering; Interessant nok kan tilføjelse af lumican fremskynde re-epiteliseringsprocessen 4,11,13. Ligeledes har en nylig undersøgelse rapporteret, at lumican kan modulere de inflammatoriske funktioner af hornhinde limbus fibroblaster14, hvilket tyder på en rolle for lumican som en modulator af det inflammatoriske, antifibrotiske og re-epiteliserende respons. På samme måde kan lumican modulere hornhinderesponset ved at interagere med signalmolekyler såsom Fas-FasL. Fraværet af lumican i en knockout Lum-/- musemodel viste også, at manglen på lumicansignalering forhindrer tilstrækkelig hornhindereparation15.
Primært har denne metode til formål at demonstrere en gennemførlig og tilgængelig måde at udtrække lumican fra AM. Med denne fordelagtige metode til lumicanekstraktion er det muligt at opnå lignende koncentrationer af proteiner, hvilket reducerer behandlingstiden og gør det mere bekvemt for efterforskere sammenlignet med de tidligere undersøgelser16. Desuden kan denne AME lumican bruges som en adjuvans til hornhindereparations- og re-epiteliseringsprocesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøgsprocedurer blev godkendt af Institutional Review Board (projekt nr. CEI-2020/06/04). AM blev opnået fra Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana amnionbank (fra afidentificerede mennesker), som er udarbejdet som beskrevet af Chávez-García et al.17.
1. Fremstilling af fosterhindeekstrakt
- Få 100 mg AM fra amnionbanken.
BEMÆRK: Ifølge en tidligere rapport udskiller 50 mg AM i alt 10 ng / ml lumican14. For at opnå en højere koncentration af lumican skal du bruge 100 mg AM, svarende til et samlet areal på 32 cm2. - Hvis AM er frosset, optø det ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Udfør følgende procedurer under en laminær flowhætte klasse II B. - Vask AM i en petriskål med 10 ml steril afbalanceret saltopløsning (BSS, se Materialetabel) i 2 min.
- Hæld BSS i et bægerglas.
- Gentag trin 3 og bekræft visuelt, at glycerolmedium ikke er til stede i petriskål BSS.
BEMÆRK: Gentag trin 3. efter behov, indtil glycerolmedium ikke er til stede i petriskål BSS.
- Am inkuberes med 10 ml dispase II (1,7 IE/ml, se materialetabel) ved 37 °C, 5 % CO2 i 30 min.
BEMÆRK: Dispase II er en neutral protease med blid aktivitet over epitelceller. Dette enzym adskiller effektivt den intakte epidermis fra dermis og isolerer intakte epitelplader18. - Efter dispase inkubation udføres en mekanisk de-epitelisering14 med en gummipolitimand (se Materialetabel). Bekræft de-epitelisering ved mikroskopi visualisering.
BEMÆRK: Processen med de-epitelisering bekræftes i et omvendt mikroskop ved hjælp af 4x og 20x mål. Visualiser vævet for at udelukke tilstedeværelsen af ethvert cellulært lag. - Vask AM i en petriskål med 10 ml BSS i 2 min. Hæld BSS i et bægerglas.
- Placer den af-epiteliserede AM (dAM) i et 2 ml mikrocentrifugerør. Nedsænk dAM i flydende nitrogen i 40 min.
- Mal den frosne dAM manuelt i 2-3 minutter i en forkølet mørtel ved -85 °C, indtil der opnås et fint pulver.
- I mørtel opløses dAM-pulveret med 2,5 ml proteasehæmmeropløsning (BSS med proteasehæmmere).
BEMÆRK: Hver tablet proteasehæmmer består af følgende blanding af enzymer: bugspytkirtelekstrakt (0,02 mg / ml), termolysin (metalloprotease) (0,0005 mg / ml), chymotrypsin (0,002 mg / ml), trypsin (0,02 mg / ml) og papain (0,33 mg / ml) (se materialetabel). - Saml blandingen med en mikropipette, og rengør mørtelvæggene ved hjælp af en skalpelkniv. Anbring blandingen i et 5 ml rør.
- Bland godt med hvirvelen i 30 s.
- Vævsblandingen homogeniseres ved centrifugering ved 34 x g i 20 minutter ved 4 °C og centrifugeres straks ved 3360 x g i 20 minutter ved 4 °C.
- Den indsamlede supernatant er AME (figur 1). Opbevar 0,7 ml af hver AME i forskellige 2 ml mikrocentrifugerør i 6, 12, 20 og 33 dage ved de forskellige temperaturforhold på -20 °C, 4 °C og stuetemperatur (RT).
Figur 1: Proces for AME-præparation og måling af lumicankoncentration . 100 mg AM blev inkuberet med dispase II ved 37 °C i 30 minutter og mekanisk afepiteliseret. Den afepithelialiserede AM blev vasket og nedsænket i flydende nitrogen i 40 minutter og derefter knust, indtil der blev opnået et fint pulver, som blev opløst med 2,5 ml saltvandsbuffer med proteasehæmmere og centrifugeret. Supernatanten blev opsamlet og opbevaret ved -20 °C, 4 °C og RT i 6, 12, 20 og 32 dage indtil total protein- og lumikankvantificering. Klik her for at se en større version af denne figur.
2. Kvantificering af AME-protein
BEMÆRK: Kvantificeringen af det samlede protein i AME skal udføres umiddelbart efter obtention. Kvantificer proteiner ved hjælp af Lowry-proteinassay, og følg producentens anvisninger (se Materialetabel). Det anbefales, at alle standarder og prøver analyseres i tre eksemplarer.
- Der pipetteres 40 μL af hver AME-prøve til en mikroplade med 96 brønde.
- Der forberedes en standardkurve i den samme mikroplade ved hjælp af BSA-standarden (bovin serumalbumin) for en endelig BSA-koncentration på 0-1.500 μg/ml (0, 1, 5, 25, 125, 250, 500, 750, 1.000 og 1.500 μg/ml).
- Pipetter 200 μL af det modificerede Lowry-reagens til hver brønd. Bland det straks på en pladeblander i 30 s.
- Dæk mikropladen med aluminiumsfolie og inkuber den ved RT i 10 min.
- Pipette 20 μL 1x Folin-Ciocalteu reagens til hver brønd. Bland det straks på en pladeblander i 30 s.
BEMÆRK: For at forberede 1x Folin-Ciocalteu reagens, fortyndes 2x (2N) reagens 1: 1 med ultrarent vand. Der fremstilles 1x Folin-Ciocalteu reagens samme brugsdag, som det fortyndede reagens er ustabilt. - Dæk mikropladen fra lys med aluminiumsfolie og inkuber den ved RT i 30 min.
- Absorbansen af prøver måles ved 660 nm i et ELISA-pladespektrometer (se Materialetabel).
BEMÆRK: Farve kan måles ved bølgelængder mellem 650 nm og 750 nm. - Absorbansværdien på 660 nm for standardprøverne i blindprøver beregnes i gennemsnit, og den trækkes fra andre 660 nm-værdier for standardprøver og ukendte prøver.
- Absorbansen måles med et ELISA-pladespektrometer i slutpunktstilstand med lav omrystning i 10 s.
- Brug standardkurven til at bestemme proteinkoncentrationen for hver ukendt prøve.
- Til beregning af protein bestemmes koncentrationen ud fra en lineal regressionsgraf ved hjælp af absorbansværdierne på Y-aksen mod koncentrationerne i mg/ml på X-aksen for hver standard BSA-kurve.
- Opnå ligningen af lineær regression og r-værdi for at beregne proteinkoncentrationen.
BEMÆRK: Resultaterne udtrykkes som normaliserede relative koncentrationsværdier for total protein i forhold til mg AM (μg / ml protein / mg AM-væv).
- Opnå ligningen af lineær regression og r-værdi for at beregne proteinkoncentrationen.
3. Kvantificering af Lumican i AME
BEMÆRK: Koncentrationen af lumican skal måles i AME opbevaret under forskellige opbevaringsforhold og tidsperioder. Kvantificer lumican ved hjælp af sandwich ELISA og følg producentens anvisninger. Det anbefales, at alle standarder og prøver analyseres i to eksemplarer.
- Fortynd det humane lumikanindfangningsantistof (se Materialetabel) til den anvendte koncentration i fosfatbufferet saltvand (PBS).
BEMÆRK: Hætteglasset med indfangningsantistof indeholder 120 μg antistof. Efter rekonstitution med 0,5 ml PBS fortyndes indfangningsantistoffet ved en arbejdsopløsning på 2 μg/ml.- Der pipetteres øjeblikkeligt 100 μL pr. brønd af det fortyndede indfangningsantistof til en mikroplade med 96 brønde. Vedlæg pladen og inkuber den natten over på RT.
- Aspirer hvert brønd og vask det ved pipettering med 300 μL vaskebuffer: 0,05% polyoxyethylensorbitanmonolaurat 20 i PBS, pH 7,2-7,4 (se materialetabel) ved hjælp af en flerkanals pipettor. Gentag tre gange.
BEMÆRK: Efter den sidste vask skal du fjerne den resterende vaskebuffer ved at løsne pladen og forsigtigt banke den mod køkkenrulle. - Blokplader ved tilsætning af 300 μL reagensfortyndingsmiddel: 1% BSA i PBS, pH 7,2-7,4, 0,2 μm filtreret (se materialetabel) til hver brønd. Inkuberes ved RT i 1 time.
- Gentag trin 2.
- Forbered en standardkurve i en 96-brønds mikroplade ved hjælp af to gange serielle fortyndinger fra 0-8.000 pg / ml til endelige koncentrationer på 125, 250, 500, 1.000, 2.000, 4.000 og 8.000 pg / ml. ELISA lumican kit indeholder en rekombinant lumican standard på 75 ng (se Tabel over materialer).
- Tilsæt 100 μL prøver og standardkurven i den indfangningsantistofbelagte 96-brønds mikroplade.
- Dæk mikropladen og inkuber i 2 timer ved RT med lav omrøring i en kompakt vippe, der opretholder hastigheden mellem 2-3 o / min.
- Gentag trin 2.
- Der tilsættes 100 μL biotinyleret detektionsantistof (se Materialetabel) til hvert hul. Dæk fra lys og inkuber 2 timer ved RT med lav omrøring i en kompakt vippe, der opretholder hastigheden mellem 2-3 o / min.
BEMÆRK: Det biotinylerede detektionsantistofhætteglas indeholder 24 μg antistof. Efter rekonstitution med 1,0 ml reagensfortyndingsmiddel fortyndes det biotinylerede detektionsantistof ved en arbejdsopløsning på 400 ng/ml. - Gentag trin 2.
- Der tilsættes 100 μL af arbejdsfortyndingen af streptavidin-peberrodsperoxidase (HRP, se Materialetabel) til hver brønd. Dæk mikropladen for lys og inkuber i 20 minutter ved RT.
BEMÆRK: Den reaktive streptavidin-HRP var 40 gange koncentreret. Arbejdsløsningen 1x streptavidin- HRP blev lavet med reagensfortyndingsmiddel.
BEMÆRK: Undgå at placere pladen i direkte lys. - Gentag trin 2.
- Endelig tilsættes 100 μL substrattetramethylbenzidin (TMB, se Materialetabel) opløsning til hver brønd.
BEMÆRK: Forbered TMB-opløsning med et lige volumen stabiliseret hydrogenperoxid 30% opløsning leveret i sættet.
BEMÆRK: Forbered opløsningen umiddelbart før brug, og hold den ved stuetemperatur. - Inkuberes i 30 minutter ved RT på et mørkt sted.
BEMÆRK: Undgå at placere pladen i direkte lys. Aspirer ikke TMB-opløsningen, da der ikke er behov for yderligere vask. - Tilsæt 50 μL 1N H2SO4 stopopløsning for at stoppe den kolorimetriske reaktion. Bank forsigtigt på pladen for at sikre grundig blanding.
- Bestem straks absorbansen af hver brønd ved hjælp af en mikropladelæser indstillet til 450 nm i et ELISA-pladespektrometer.
- Absorbansen måles med et ELISA-pladespektrometer i slutpunktstilstand med lav omrystning i 10 s.
- Absorbansværdien på 450 nm for standardprøverne i blindprøven beregnes som et gennemsnit, og den trækkes fra andre 450 nm-værdier for standardprøver og ukendte prøver.
- Brug standardkurven til at bestemme lumikankoncentrationen af hver ukendt prøve.
- Til beregning af lumicankoncentration skal du lave en linjeregressionsgraf ved hjælp af absorbansværdierne på Y-aksen mod koncentrationerne i pg / ml på X-aksen for hver standard lumicankurve.
- Opnå ligningen af lineær regression og r-værdi for at beregne lumikankoncentrationen.
BEMÆRK: Koncentrationen af lumican blev normaliseret med hensyn til mg væv ekstraheret. Resultaterne udtrykkes som normaliserede relative koncentrationsværdier for lumican til mg AM (ng / ml lumican / mg AM-væv).
- Opnå ligningen af lineær regression og r-værdi for at beregne lumikankoncentrationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaterne rapporteres som middelværdien ± standardafvigelsen (SD). Studerendes t-tests og analyse af varians (ANOVA) blev udført. P-værdier < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikante. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af statistiksoftware (se Materialetabel).
Den samlede proteinmængde i AME blev påvirket af tid og opbevaringsforhold. Basalproteinkoncentrationen var ens blandt alle AME; intervallet for total protein var 2,7 ± 0,3 μg/ml uden en signifikant forskel mellem de evaluerede prøver. Når prøverne blev opbevaret i 12, 20 og 32 dage, blev der imidlertid observeret variation i proteinkoncentrationen med hensyn til basalkoncentration. Interessant nok steg proteinkoncentrationen i AME ved 4 °C og -20 °C i forhold til RT på alle opbevaringstidspunkter.
Tilsvarende, når proteinkoncentrationen blev sammenlignet mellem opbevaringstider, ændrede den sig efter 12, 20 og 32 dage. En signifikant forskel (p < 0,05) blev fundet i AME på 32 og 20 dage ved 4 °C og -20 °C sammenlignet med RT-tilstanden (figur 2), hvilket tyder på, at temperaturen er vigtig for proteinbevarelsen i de forskellige opnåede AME.
Figur 2: Samlet proteinkoncentration i AME påvirket af tid og opbevaringstemperatur. Koncentrationen af proteinekstraktion på AME blev kvantificeret før og efter temperatur og tid opbevaringsforhold. Den evaluerede opbevaringstid var 6 dage (sorte trekanter), 12 dage (lyserøde trekanter), 20 dage (lilla firkant) og 32 dage (brune cirkler) sammenlignet med tre forskellige temperaturforhold (RT °C, 4 °C og -20 °C). Basal proteinkoncentration var ens blandt alle AME. Der var en signifikant forskel i proteinkoncentrationen i AME på 20 og 32 dage med hensyn til basalproteinkoncentration ved forskellige temperaturforhold. I hver betingelse n = 3. Data udtrykkes som medianen af μg/ml protein ± SE *p < 0,05 (S1 32 dage vs. S1 20, 12 og 6 dage ved 4 °C); (S1 32 dage vs. S1 20, 12 og 6 dage ved -20 °C). Klik her for at se en større version af denne figur.
Lumicankoncentrationen blev påvirket af opbevaringstid og temperaturforhold. Der blev fundet færre koncentrationer af lumican i AME opbevaret i 6, 20 og 32 dage sammenlignet med 12 dages opbevaring. Det er signifikant, at AME på 12 dage havde en højere koncentration af lumican end 20 og 32 dages opbevaring (s < 0,05).
Når lumikankoncentrationen i AME blev sammenlignet mellem opbevaringstemperaturer, blev der fundet en højere koncentration af lumikan, hvis den blev opbevaret ved -20 °C og 4 °C i 12 dage (figur 3). Interessant nok blev der fundet en højere (p < 0,05) koncentration af lumican i 12 dages AME, hvis den blev opbevaret ved -20 °C sammenlignet med 4 °C.
Dette tyder på, at koncentrationen af lumikan påvirkes af temperaturforhold og opbevaringstid, hvilket tyder på, at den passende opbevaringstid og temperatur for at opnå den højeste koncentration af lumikan er 12 dage ved -20 °C.
Figur 3: Samlet lumicankoncentration i AME påvirket af tid og opbevaringstemperatur. Lumicankoncentrationen blev påvirket af opbevaringstid og temperaturforhold. Koncentrationen af lumican i AME blev kvantificeret før og efter temperatur og tid opbevaringsforhold. Den evaluerede opbevaringstid var 6 dage (sorte trekanter), 12 dage (lyserøde trekanter), 20 dage (lilla firkant) og 32 dage (brune cirkler) sammenlignet med tre forskellige temperaturforhold (RT °C, 4 °C og -20 °C). Lumican i AME på 12 dage var signifikant højere sammenlignet med AME på 32, 20 og 6 dage ved temperaturforhold på -20 °C og 4 °C. *p < 0,05 (S1 12 dage vs. S1 32, 20 og 6 dage ved 4 °C); p < 0,001 (S1 12 dage vs. S1 32, 20 og 6 dage ved -20 °C). Den højeste koncentration af lumikan i AME var ved 12 dage opbevaret ved -20 °C. ++p < 0,01 (S1 12 dage 4 °C vs. S1 12 dage -20 °C). Der var ingen signifikant forskel mellem lumican i AME på 32 og 20 dage sammenlignet med opbevaringstemperaturforhold (n.s). I hver tilstand (n = 3) udtrykkes data som medianen af ng / ml protein. Data blev normaliseret med hensyn til mg væv ± SE. (n.s.) ikke statistisk signifikans. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse blev tilstedeværelsen af lumican analyseret i AME og dens direkte sammenhæng med dens stabilitet under forskellige opbevaringsforhold. Interessant nok, da den samlede proteinkoncentration i AME blev kvantificeret, steg proteinkoncentrationen efter opbevaring. Beviser tyder på tre mekanismer, der kan ændre proteinkoncentrationen i frossen opbevaring: kold denaturering, den frosne koncentration af opløste stoffer og isinduceret delvis udfoldelse af proteinstruktur19. Fryseprocessen kan påvirke proteinkoncentrationen på opbevaringsprøver på grund af krystallisationen af væskefasen i prøven. Resultaterne tyder på, at dette kunne være sket som en proces med frysning af koncentrationen, påvirket af opbevaringstiden i fryseren. En højere koncentration af proteiner blev observeret ved længere opbevaringstider (32 og 20 dage) og ved de koldeste temperaturer (4 °C og -20 °C). Perioden med den højeste koncentration af protein havde imidlertid ikke den højeste koncentration af lumikan; Dette tyder på, at lumican kan blive påvirket af frosne temperaturer og tidsforhold.
Ifølge resultaterne var lumikankoncentrationen højere og mere stabil ved 12 dages opbevaring ved 4 °C og -20 °C. Ikke desto mindre blev der fundet en mindre koncentration af lumican efter 6 dage sammenlignet med 12 dage. Nogle rapporter tyder på, at proteinkoncentrationen kan ændre sig efter frosne opbevaringsforhold20. Resultaterne kan være forårsaget af en termodynamisk mekanisme ved navn isinduceret delvis udfoldelse af proteinstruktur, hvilket sker under frysning af prøver. Samspillet mellem proteiner og vand i de vandige opløsninger reducerer deres interaktioner med andre molekyler. Krystalliseringsprocessen af vand under frosne forhold tillader proteiner og nogle funktionelle regioner at interagere med andre molekyler19. Efter 12 dages frysning af lumican i en vandig opløsning kan det efter 12 dages frysning kunne interagere med antistofferne i ELISA-kvantificeringssættet for at resultere i en højere koncentration. På den anden side, sandsynligvis på den sjette dag, kunne lumikanen have været afsondret i den vandige opløsning.
Ved fremme af innovationer er brugen af AM den nyeste behandling for hornhinde-epitelisering uanset ætiologi. Som nævnt er fordelene ved AM enorme 21,22,23,24,25,26. Mange forfattere har demonstreret fordelene ved lumican i AME, hvilket gør det til et overkommeligt alternativ specielt til udviklingslande 1,2,3,4,5,6,7,8,9. I øjeblikket er der mange fordele ved lumikan i AME; Dens anvendelse som behandling favoriserer hornhinde-re-epitelisering og forbedrer prognosen for hornhindesår 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. AM-transplantation (AMT) er blevet en behandling med store fordele for at forbedre forskellige hornhindelidelser24,25. Der er dog nogle kroniske følelser af hornhindevævet, såsom vedvarende epiteldefekter (PED) og limbal stamcellemangel (LESCD), der kræver konstant behandling og vedligeholdelse af tilstedeværelsen af biologiske faktorer, der hjælper hornhindereparation21,24. I øjeblikket er der ingen adjuverende behandlinger, der tillader langsigtet vedligeholdelse af de faktorer, der frigives af AMT på hornhindeoverfladen. En konstant udskiftning af AMT kunne dog ikke anbefales af hensyn til patientsikkerheden26. Af denne grund er det nødvendigt at udvikle alternativer, der gør det muligt for AMT's funktioner at hjælpe og hjælper med at opretholde tilstedeværelsen af faktorer frigivet af AM i hornhindevævet, såsom lumican i længere tid, med det formål at favorisere behandlingen af vedvarende problemer i hornhinden27.
Lumican er en af de faktorer, der er til stede i AM med antiinflammatoriske og antifibrotiske funktioner, som er rapporteret at have funktioner i hornhindereparationsprocessen 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . Derfor foreslår lumican at være en god kandidat til at hjælpe med at behandle hornhindefølelser; yderligere forskning er dog nødvendig for at bestemme effektiviteten af lumican i AME for at opnå hornhinde-re-epitelisering.
Lumican er en proteoglycan, der har vist sig at regulere udskillelsen af ekstracellulære matrixforbindelser som kollagen; Det er også involveret i fibroblastaktivering og modulering af inflammatoriske celler og angiogeneseprocessen, der har en vigtig rolle i sårheling. Ifølge resultaterne kan lumican ekstraheres fra AM-væv. Terapeutiske anvendelser af lumikan er talrige; brugen af lumican i AME tillader en opnåelig terapeutisk mulighed for okulære lidelser 4,13. Den primære fordel ved at bruge AME er, at det giver en nem anvendelse som en topisk behandling af den okulære overflade i betragtning af dens vandige sammensætning. Ligeledes kan andre proteiner med antiinflammatoriske og immunregulerende egenskaber findes i komponenterne ekstraheret fra AM-vævet, hvilket kan udgøre en større fordel ved behandling af de-epiteliseringsproblemer i øjet. For eksempel er andre antiinflammatoriske faktorer såsom TSG-6 til stede i AM og cellulære komponenter tidligere blevet rapporteret at have immunregulerende egenskaber8. Herved kan en kombineret behandling af lumican og andre ekstracellulære matrixforbindelser og immunmodulerende molekyler, der er til stede i AME, være nyttig i re-epiteliserings- og sårhelingsprocessen.
Denne metode sigter mod at demonstrere en ligetil teknik til proteinekstraktion, der er nyttig til opnåelse af rigelige proteiner og faktorer. En af de kritiske overvejelser for denne metode er brugen af proteasehæmmere, da det er grundlæggende for vellykket proteinekstraktion, da AM er et væv med masser af enzymatiske forbindelser for at forhindre proteinnedbrydning27. Beviser har rapporteret, at anvendelse af proteinhæmmere sammen med en vandig opløsning øger ekstraktionen af andre faktorer, såsom HGF, i AM-væv26. Opnåelse af et fint pulver efter frysning og jordforbindelse af AM er nødvendig for optimal obtention af AME, da denne proces er egnet til vævs- og cellulær forstyrrelse af strukturer, der er nødvendige til ekstraktion af cytosoliske og andre nukleare forbindelser28,29.
Et par begrænsninger ved denne ekstraktionsmetode er, at den anvendte AM-mængde ikke kunne tillade en ekstraktion i stor skala. Denne protokol tillader proteinekstraktion fra en begrænset mængde væv; Da der ikke er noget bevis for, at denne metode tillader opnåelse af en større mængde protein fra et større vævsområde. Fejlfinding, der skal overvejes i sammenligning med andre ekstraktionsmetoder, er at anvende en passende koncentration af proteasehæmmer og inkubationstid, da de overskydende enzymer kan påvirke proteiner30 og reducere teknikkens effektivitet.
En del af denne teknik blev modificeret fra den, der blev rapporteret af Mahbod et al.16, som beskriver, at gentagelse af centrifugerings- og ekstraktionsprocessen øger proteinekstraktionen. I modsætning til Mahbod rapporterede resultaterne ikke proteinkoncentration efter tre centrifugeringscyklusser. Når den samlede proteinkoncentration blev bestemt, faldt den med 80% i en anden ekstraktion og op til 97% i en tredje ekstraktion. Udførelse af kun en ekstraktion reducerer behandlingstiden og reducerer ikke mængden af total protein. Med det foregående kræver ekstraktionsmetoden, der er rapporteret her, kun et centrifugeringstrin med gunstige resultater.
Denne teknik kan bruges til at ekstrahere andre faktorer og proteiner, der er til stede i AM og yderligere for at opnå faktorer fra andre kilder såsom dyr eller grøntsager. Det kunne også have en ansøgning om at opnå proteiner til at udføre grundforskning eller endda udvikling af formuleringer og behandlinger.
Disse resultater tyder på, at lumican kan ekstraheres fra AM og opbevares i 12 dage som AME under både -20 °C og 4 °C temperaturforhold. Det er vigtigt at overveje dets halveringstid for at opnå de terapeutiske virkninger af lumican som AME. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at bestemme rollen som AME lumican i hornhindeepitelceller og for at bestemme den ideelle dosis lumican til hornhinde-re-epitelisering.
Afslutningsvis tyder resultaterne på, at det er muligt at opnå faktorer som lumican i AME. Ligeledes påvirker temperatur- og opbevaringstidsforhold koncentrationen af lumican til stede i AME.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Undersøgelsen blev finansieret af støtteprogrammet for forsknings- og teknologiske innovationsprojekter fra Universidad Nacional Autonoma de Mexico (tilskudsnr. PAPIIT IN203821) og Ministeriet for Uddannelse, Videnskab, Teknologi og Innovation (Grant No. SECTEI 250/2019).
Acknowledgments
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 N H2SO4 stop solution | R&D Systems | DY994 | |
| 100 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 1000 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 15 mm Petri dish | Symlaboratorios | ||
| 18 G Needle (1.2 mm x 40 mm) | BD Becton Dickinson | 305211 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | Z606340 | |
| 20 mL plastic syringe | BD Becton Dickinson | 302562 | |
| 20 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 20-200 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 30119401 | |
| 96-well microplate | SARSTEDT | 821581 | |
| Aluminum foil | N/A | N/A | |
| Amniotic membrane | Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank | 100 mg | |
| Balanced salt solution | Bausch + Lomb | BSS-403802 | |
| Beaker | N/A | N/A | |
| BioRender | BioRender | figures design | |
| Compact Rocker | BioRad | 970822DD | Mod. 5202SD-BIO |
| complete, EDTA-free, Protease inhibitor cocktail tablets |
Roche | 11 873 580 001 | Protease Inhibitor |
| Daiggner vortex Genie 2 | A.Daigger & Co. , INC | 22220A | |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | |
| ELISA plate spectrometer | Thermo Labsystems | 35401106 | Multiscan |
| Freezer | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc | version 9 | statistical analysis and graphic program |
| Human lumican DuoSet ELISA kit | R&D Systems | DY2846-05 | includes human Lumican capture antibody |
| Incubator | Forma Scientific | 3326 S/N 36481-7002 | |
| Inverted light Microscope | Olympus | 6A13921 | to confirm de-epithelialization Mod.CK2 |
| Laminar flow hood | Forma Scientific | 14753-567 | Mod.1184 |
| Liquid nitrogen | N/A | N/A | |
| Mortar | N/A | N/A | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | ||
| Nitrogen Tank | Thermo Scientific | Mod. Biocan 20 | |
| Paper towels | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | R&D Systems | DY006 | |
| Pierce Modified Lowry Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23240 | |
| Plate sealers | R&D Systems | DY992 | |
| Reagent diluent | R&D Systems | DY995 | 1% BSA in PBS, pH 7.2-7.4, 0.2 μm filtered |
| Refrigerated centrifuge | centurion scientific Ltd | 15877 | Mod. K2015R |
| Rubber policeman cell scraper | NEST | 710001 | for mechanical de-epithelialization |
| Scalpel knife | Braun | BB521 | No. 10 or 21 |
| Streptavidin-HRP 40-fold concentrated | R&D Systems | part 893975 | |
| Substrate tetramethylbenzidine (TMB) solution | R&D Systems | DY999 | |
| Toothed tweezers | Invent Germany | 6b | inox |
| Ultrapure water | PISA | ||
| Wash buffer | R&D Systems | WA126 | 0.05% Tween 20 in PBS, pH 7.2-7.4 |
References
- Jirsova, K., Jones, G. Amniotic membrane in ophthalmology: properties, preparation, storage and indications for grafting-a review. Cell and Tissue Banking. 18 (2), 193-204 (2017).
- Witherel, C., Yu, T., Concannon, M., Dampier, W., Spiller, K. Immunomodulatory effects of human cryopreserved viable amniotic membrane in a pro-inflammatory environment in vitro. Cellular and Molecular Bioengineering. 10 (5), 451-462 (2017).
- Ruiz-Cañada, C., et al. Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating transforming growth factor-β signalling. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 808-820 (2017).
- Yeh, L., et al. Soluble lumican glycoprotein purified from human amniotic membrane promotes corneal epithelial wound healing. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46 (2), 479 (2005).
- Navas, A., et al. Anti-Inflammatory and anti-fibrotic effects of human amniotic membrane mesenchymal stem cells and their potential in corneal repair. Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 906-917 (2018).
- Magaña-Guerrero, F., Domínguez-López, A., Martínez-Aboytes, P., Buentello-Volante, B., Garfias, Y. Human amniotic membrane mesenchymal stem cells inhibit neutrophil extracellular traps through TSG-6. Scientific Reports. 7, 12426 (2017).
- Garfias, Y., Zaga-Clavellina, V., Vadillo-Ortega, F., Osorio, M., Jimenez-Martinez, M. Amniotic membrane is an immunosuppressor of peripheral blood mononuclear cells. Immunological Investigations. 40 (2), 183-196 (2010).
- Koob, T., et al. Biological properties of dehydrated human amnion/chorion composite graft: implications for chronic wound healing. International Wound Journal. 10 (5), 493-500 (2013).
- Miyagi, H., Thomasy, S., Russell, P., Murphy, C. The role of hepatocyte growth factor in corneal wound healing. Experimental Eye Research. 166, 49-55 (2018).
- Chen, S., Mienaltowski, M., Birk, D. Regulation of corneal stroma extracellular matrix assembly. Experimental Eye Research. 133, 69-80 (2015).
- Karamanou, K., Perrot, G., Maquart, F., Brézillon, S. Lumican as a multivalent effector in wound healing. Advanced Drug Delivery Reviews. 129, 344-351 (2018).
- Theocharis, A., et al. Cell-matrix interactions: focus on proteoglycan-proteinase interplay and pharmacological targeting in cancer. FEBS Journal. 281 (22), 5023-5042 (2014).
- Saika, S., et al. Role of lumican in the corneal epithelium during wound healing. Journal of Biological Chemistry. 275 (4), 2607-2612 (2000).
- Domínguez-López, A., et al. Amniotic membrane conditioned medium (AMCM) reduces inflammatory response on human limbal myofibroblast, and the potential role of lumican. Molecular Vision. 27, 370-383 (2021).
- Vij, N., Roberts, L., Joyce, S., Chakravarti, S. Lumican regulates corneal inflammatory responses by modulating Fas-Fas Ligand signaling. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46 (1), 88 (2005).
- Mahbod, M., et al. Amniotic membrane extract preparation: What is the best method. Journal of Ophthalmic and Vision Research. 9 (3), 314-319 (2014).
- Chávez-García, C., et al. Ophthalmic indications of amniotic membrane transplantation in Mexico: an eight years Amniotic Membrane Bank experience. Cell and Tissue Banking. 17 (2), 261-268 (2015).
- Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).
- Bhatnagar, B. S., Bogner, R. H., Pikal, M. J. Protein stability during freezing: separation of stresses and mechanisms of protein stabilization. Pharmaceutical Development and Technology. 12 (5), 505-523 (2007).
- McClain, A. K., McCarrel, T. M. The effect of four different freezing conditions and time in frozen storage on the concentration of commonly measured growth factors and enzymes in equine platelet-rich plasma over six months. BMC Veterinary Research. 15 (1), 292 (2019).
- Tamhane, A., et al. Evaluation of amniotic membrane transplantation as an adjunct to medical therapy as compared with medical therapy alone in acute ocular burns. Ophthalmology. 112 (11), 1963-1969 (2005).
- Shtein, R., et al. Autologous serum-based eye drops for treatment of ocular surface disease. Ophthalmology. 127 (1), 128-133 (2020).
- Shahriari, H., Tokhmehchi, F., Reza, M., Hashemi, N. Comparison of the effect of amniotic membrane suspension and autologous serum on alkaline corneal epithelial wound healing in the rabbit model. Cornea. 27 (10), 1148-1150 (2008).
- Schuerch, K., Baeriswyl, A., Frueh, B., Tappeiner, C. Efficacy of amniotic membrane transplantation for the treatment of corneal ulcers. Cornea. 39 (4), 479-483 (2019).
- Chen, H., et al. Amniotic membrane transplantation for persistent corneal ulcers and perforations in acute fungal keratitis. Cornea. 25 (5), 564-572 (2006).
- Guo, Q., et al. A comparison of the effectiveness between amniotic membrane homogenate and transplanted amniotic membrane in healing corneal damage in a rabbit model. Acta Ophthalmologica. 89 (4), 315-319 (2011).
- Sabater, A., Perez, V. Amniotic membrane use for management of corneal limbal stem cell deficiency. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 363-369 (2017).
- Ahmad, T., et al. Autolysis of bovine skin, its endogenous proteases, protease inhibitors and their effects on quality characteristics of extracted gelatin. Food Chemistry. 265, 1-8 (2018).
- Mullegama, S. V., et al. Nucleic acid extraction from human biological samples. Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).
- Skog, M., et al. The effect of enzymatic digestion on cultured epithelial autografts. Cell Transplantation. 28 (5), 638-644 (2019).
