ثقافة ثلاثية الأبعاد لخبايا القولون الفئران لدراسة وظيفة الخلايا الجذعية المعوية خارج الجسم الحي
Summary
يصف البروتوكول الحالي إنشاء نظام عضوي قولوني للفئران لدراسة نشاط وعمل الخلايا الجذعية القولونية في نموذج خروج المغلوب claudin-7.
Abstract
تتجدد ظهارة الأمعاء كل 5-7 أيام ، ويتم التحكم فيها بواسطة مجموعة الخلايا الجذعية الظهارية المعوية (IESC) الموجودة في الجزء السفلي من منطقة القبو. تشمل IESCs الخلايا الجذعية النشطة ، التي تتجدد ذاتيا وتتمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا الظهارية ، والخلايا الجذعية الهادئة ، والتي تعمل كخلايا جذعية احتياطية في حالة الإصابة. يتم التحكم في تجديد ظهارة الأمعاء من خلال قدرات التجديد الذاتي والتمايز لهذه IESCs النشطة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن توازن عدد الخلايا الجذعية القبو والحفاظ على مكانة الخلايا الجذعية ضروريان لتجديد الأمعاء. تعد الثقافة العضوية طريقة مهمة وجذابة لدراسة البروتينات وجزيئات الإشارات والإشارات البيئية التي تنظم بقاء الخلايا الجذعية ووظائفها. هذا النموذج أقل تكلفة وأقل استهلاكا للوقت وأكثر قابلية للتلاعب من النماذج الحيوانية. تحاكي الكائنات العضوية أيضا البيئة المكروية للأنسجة ، مما يوفر أهمية في الجسم الحي . يصف البروتوكول الحالي عزل خبايا القولون ، ودمج خلايا القبو المعزولة هذه في نظام مصفوفة هلام ثلاثي الأبعاد وزراعة خلايا القبو لتشكيل عضويات قولونية قادرة على التنظيم الذاتي والانتشار والتجديد الذاتي والتمايز. يسمح هذا النموذج للمرء بمعالجة البيئة – ضرب بروتينات معينة مثل claudin-7 ، وتنشيط / إلغاء تنشيط مسارات الإشارات ، وما إلى ذلك – لدراسة كيفية تأثير هذه التأثيرات على عمل الخلايا الجذعية القولونية. على وجه التحديد ، تم فحص دور بروتين الوصلة الضيقة claudin-7 في وظيفة الخلايا الجذعية القولونية. Claudin-7 أمر حيوي للحفاظ على التوازن المعوي ووظيفة الحاجز وسلامته. يؤدي خروج المغلوب من claudin-7 في الفئران إلى نمط ظاهري يشبه مرض التهاب الأمعاء يظهر التهابا معويا ، وتضخم ظهاري ، وفقدان الوزن ، وتقرحات الغشاء المخاطي ، وتقشير الخلايا الظهارية ، والأورام الغدية. في السابق ، أفيد أن claudin-7 مطلوب لوظائف الخلايا الجذعية الظهارية المعوية في الأمعاء الدقيقة. في هذا البروتوكول ، يتم إنشاء نظام زراعة عضوي القولون لدراسة دور claudin-7 في الأمعاء الغليظة.
Introduction
الثقافة العضوية المعوية هي نظام ثلاثي الأبعاد (3D) خارج الجسم الحي يتم فيه عزل الخلايا الجذعية من الخبايا المعوية للأنسجة الأولية ومطلية في مصفوفة هلام 1,2. هذه الخلايا الجذعية قادرة على التجديد الذاتي والتنظيم الذاتي ووظائف الأعضاء2. تحاكي الكائنات العضوية البيئة المكروية للأنسجة وهي أكثر تشابها مع النماذج في الجسم الحي من نماذج زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد (2D) في المختبر ، على الرغم من أنها أقل قابلية للتلاعب من الخلايا 3,4. يزيل هذا النموذج العقبات التي تواجهها نماذج 2D ، مثل عدم وجود التصاقات مناسبة للخلايا الخلوية ، وتفاعلات مصفوفة الخلية ، والمجموعات المتجانسة ، ويقلل أيضا من قيود النماذج الحيوانية ، بما في ذلك التكاليف المرتفعة والفترات الزمنية الطويلة5. الكائنات العضوية المعوية – يشار إليها أيضا باسم القولون لتلك التي تزرع من الخلايا الجذعية المشتقة من سرداب القولون – هي في الأساس أعضاء صغيرة تحتوي على ظهارة بما في ذلك جميع أنواع الخلايا التي ستكون موجودة في الجسم الحي ، بالإضافة إلى التجويف. يسمح هذا النموذج بمعالجة النظام لدراسة العديد من جوانب الأمعاء ، مثل مكانة الخلايا الجذعية ، وعلم وظائف الأعضاء المعوية ، والفيزيولوجيا المرضية ، وتشكل الأمعاء3،5،6. كما يوفر نموذجا رائعا لاكتشاف الأدوية ، ودراسة الاضطرابات المعوية البشرية مثل مرض التهاب الأمعاء (IBD) وسرطان القولون والمستقيم ، وتطوير العلاج الشخصي الخاص بالمريض ، ودراسة تجديد الأنسجة4،7،8،9. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا استخدام النظام العضوي لدراسة الاتصالات الخلوية ، واستقلاب الدواء ، والجدوى ، والانتشار ، والاستجابة للمنبهات 7,8. في حين يمكن استخدام النماذج الحيوانية لاختبار العلاجات المحتملة للحالات المرضية المعوية ، إلا أنها محدودة للغاية ، حيث تشكل دراسة أدوية متعددة في وقت واحد تحديا. هناك المزيد من المتغيرات المربكة في الجسم الحي ، والتكلفة والوقت المرتبطان مرتفعان وطويلان ، على التوالي. من ناحية أخرى ، يسمح نظام الزراعة العضوية بفحص العديد من العلاجات في وقت واحد في فترة زمنية أقصر ويسمح أيضا بالعلاج الشخصي من خلال استخدام الثقافة العضوية المشتقة من المريض 4,8. كما أن قدرة الكائنات العضوية القولونية على تقليد تنظيم الأنسجة والبيئة المكروية والوظائف تجعلها أيضا نموذجا ممتازا لدراسة التجديد وإصلاح الأنسجة9. أنشأ مختبرنا نظام زراعة عضوي للأمعاء الدقيقة لدراسة تأثير claudin-7 على وظائف الخلايا الجذعية للأمعاء الدقيقة10. في هذه الدراسة ، تم إنشاء نظام زراعة عضوي معوي كبير لدراسة قدرة الخلايا الجذعية ، أو عدم قدرتها ، على التجديد الذاتي والتمايز والتكاثر في نموذج خروج المغلوب claudin-7 الشرطي (cKO).
Claudin-7 هو بروتين مهم جدا للوصلة الضيقة (TJ) يتم التعبير عنه بشكل كبير في الأمعاء وهو ضروري للحفاظ على وظيفة TJ وسلامته11. تعاني فئران cKO من نمط ظاهري يشبه IBD ، حيث تظهر التهابا شديدا ، وتقرحات ، وتقشير الخلايا الظهارية ، والأورام الغدية ، وزيادة مستويات السيتوكين11,12. في حين أنه من المقبول على نطاق واسع أن claudins حيوية لوظيفة الحاجز الظهاري ، فإن أدوارا جديدة للكلاودين آخذة في الظهور. يشاركون في الانتشار والهجرة وتطور السرطان ووظيفة الخلايا الجذعية 10،12،13،14،15،16،17. من غير المعروف حاليا كيف يؤثر claudin-7 على مكانة الخلايا الجذعية ووظيفة الخلايا الجذعية القولونية. نظرا لأن الأمعاء تتجدد ذاتيا بسرعة كل 5-7 أيام تقريبا ، فإن الحفاظ على مكانة الخلايا الجذعية والأداء السليم للخلايا الجذعية النشطة أمر حيوي18. هنا ، يتم إنشاء نظام لدراسة الآثار التنظيمية المحتملة ل claudin-7 على مكانة الخلايا الجذعية القولونية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعد الزراعة العضوية نموذجا ممتازا لدراسة وظيفة الخلايا الجذعية ، وعلم وظائف الأعضاء المعوية ، واكتشاف الأدوية ، والأمراض المعوية البشرية ، وتجديد الأنسجةوإصلاحها 7،8،9،10،11،26. في ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذه الدراسة من قبل NIH DK103166.
Materials
| 0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator | United States Plastic Corp | 78564 | anesthesia chamber |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | AM9261 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 1x Dulbecco’s Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
| 2-methylbutane | Sigma | 277258 | |
| 4% paraformaldehyde | ThermoFisher | J61899.AK | |
| 4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM) | Sigma | 579002 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 70 µm nylon cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96 well culture plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | |
| Claudin-7 anti-murine rabbit antibody | Immuno-Biological Laboratories | 18875 | |
| Cover glass (24 x 50-1.5) | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryomolds | vwr | 25608-916 | |
| Cultrex RCF BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | gel matrix |
| Cy3 anti-rabbit antibody | Jackson Immunoresearch | 111-165-003 | |
| Dewar Flask | Thomas Scientific | 1173F61 | |
| DMEM High Glucose with L-Glutamine | ATCC | 30-2002 | |
| EVOS FLoid Imaging System | ThermoFisher | 4477136 | |
| Fluoro-Gel II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 17985-50 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Glycine | JT Baker | 4059-02 | |
| HEPES (1 M) Buffer Solution | Gibco | 15630-080 | |
| Hoechst | ThermoFisher | 62249 | |
| In situ cell death detection kit, TMR Red | Roche | 12156792910 | |
| Isoflurane | Pivetal | 07-893-8440 | |
| L-WRN Media | Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core | N/A | |
| Mouse surgical kit | Kent Scientific Corporation | INSMOUSEKIT | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-500UG | |
| N2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Sequenza Rack | vwr | 10129-584 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S-279 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Vacuum filter (0.22 µm; cellulose acetate) | Corning | 430769 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 |
References
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Wallach, T. E., Bayrer, J. R. Intestinal organoids: new frontiers in the study of intestinal disease and physiology. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 180-185 (2017).
- Shankaran, A., Prasad, K., Chaudhari, S., Brand, A., Satyamoorthy, K. Advances in development and application of human organoids. 3 Biotech. 11 (6), 257 (2021).
- Angus, H., Butt, A., Schultz, M., Kemp, R. Intestinal organoids as a tool for inflammatory bowel disease research. Frontiers in Medicine. 6, 334 (2020).
- Fan, Y., Davidson, L. A., Chapkin, R. S. Murine colonic organoid culture system and down stream assay applications. Methods in Molecular Biology. 1576, 171-181 (2019).
- Gupta, N., et al. Microfluidics-based 3D cell culture models: Utility in novel drug discovery and delivery research. Bioengineering and Translational Medicine. 1 (1), 63-81 (2016).
- Yoo, J., Donowitz, M. Intesitnal enteroids/organoids: A novel platform for drug discovery in inflammatory bowel diseases. World Journal of Gastroenterology. 25 (30), 4125-4147 (2019).
- Qu, M., et al. Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration. Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).
- Xing, T., et al. Tight junction protein claudin-7 is essential for intestinal epithelial stem cell self-renewal and differentiation. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 641-659 (2020).
- Ding, L., et al. Inflammation and disruption of the mucosal architecture in claudin-7-deficient mice. Gastroenterology. 142 (2), 305-315 (2012).
- Lu, Z., Ding, L., Lu, Q., Chen, Y. H. Claudins in intestines: distribution and functional significance in health and diseases. Tissue Barriers. 1 (3), 24978 (2013).
- Ding, L., Lu, Z., Lu, Q., Chen, Y. H. The claudin family of proteins in human malignancy: a clinical perspective. Cancer Management and Research. 5, 367-375 (2013).
- Bhat, A. A., et al. Claudin-7 expression induces mesenchymal to epithelial transformation (MET) to inhibit colon tumorigenesis. Oncogene. 34 (35), 4570-4580 (2015).
- Lu, Z., et al. A non-tight junction function of claudin-7-interaction with integrin signaling in suppressing lung cancer cell proliferation and detachement. Molecular Cancer. 14, 120 (2015).
- Wang, K., Xu, C., Li, W., Ding, L. Emerging clinical significance of claudin-7 in colorectal cancer: a review. Cancer Management and Research. 10, 3741-3752 (2018).
- Wang, K., et al. Claudin-7 downregulation induces metastasis and invasion in colorectal cancer via the promotion of epithelial-mesenchymal transition. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (3), 797-804 (2019).
- Wang, F., et al. Isolation and characterization of intestinal stem cells based on surface marker combinations and colony-formation assay. Gastroenterology. 145 (2), 383 (2013).
- Li, W., et al. Severe intestinal inflammation in the small intestine of mice induced by controllable deletion of claudin-7. Digestive Diseases and Sciences. 63 (5), 1200-1209 (2018).
- Donovan, J., Brown, P. Euthanasia. Current Protocols in Immunology. 73 (1), (2006).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. Journal of Visual Experiments. (80), e50611 (2013).
- Sugimoto, K., et al. Cell adhesion signals regulate the nuclear receptor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (49), 24600-24609 (2019).
- Mansour, H., et al. Connexin 30 expression and frewuency of connexin heterogeneity in astrocyte gap junction plaques increase with age in the rat retina. PLoS One. 8 (3), 57038 (2013).
- Miranda, M., et al. Antioxidants rescue photoreceptors in rd1 mice: relationship with thiol metabolism. Free Radical Biology and Medicine. 48 (2), 216-222 (2010).
- Wang, L., et al. Mesenchymal stromal cells ameliorate oxidative stress-induced islet endothelium apoptosis and functional impairment via Wnt4-β-catenin signaling. Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 188 (2017).
- Almeqdadi, M., Mana, M., Roper, J., Yilmaz, O. Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).
