Summary
Het huidige protocol beschrijft het opzetten van een murine colon organoïde systeem om de activiteit en werking van colonstamcellen te bestuderen in een claudin-7 knock-out model.
Abstract
Het darmepitheel regenereert elke 5-7 dagen en wordt gecontroleerd door de intestinale epitheliale stamcelpopulatie (IESC) op de bodem van het cryptegebied. IESCs omvatten actieve stamcellen, die zichzelf vernieuwen en differentiëren in verschillende epitheelceltypen, en rustige stamcellen, die dienen als reservestamcellen in geval van letsel. Regeneratie van het darmepitheel wordt gecontroleerd door de zelfvernieuwende en onderscheidende mogelijkheden van deze actieve IESCs. Bovendien zijn de balans van de crypte stamcelpopulatie en het behoud van de stamcelniche essentieel voor darmregeneratie. Organoïde cultuur is een belangrijke en aantrekkelijke benadering voor het bestuderen van eiwitten, signaalmoleculen en omgevingssignalen die de overleving en functies van stamcellen reguleren. Dit model is goedkoper, minder tijdrovend en beter beheersbaar dan diermodellen. Organoïden bootsen ook de micro-omgeving van het weefsel na en bieden in vivo relevantie. Het huidige protocol beschrijft de isolatie van coloncrypten, het inbedden van deze geïsoleerde cryptecellen in een driedimensionaal gelmatrixsysteem en het kweken van cryptecellen om colonorganoïden te vormen die in staat zijn tot zelforganisatie, proliferatie, zelfvernieuwing en differentiatie. Dit model stelt iemand in staat om de omgeving te manipuleren - het uitschakelen van specifieke eiwitten zoals claudine-7, activerende / deactiverende signaalroutes, enz. - om te bestuderen hoe deze effecten de werking van colonstamcellen beïnvloeden. Specifiek werd de rol van tight junction eiwit claudin-7 in de darmstamcelfunctie onderzocht. Claudin-7 is van vitaal belang voor het behoud van intestinale homeostase en barrièrefunctie en integriteit. Knock-out van claudine-7 bij muizen induceert een inflammatoir darmziekte-achtig fenotype dat darmontsteking, epitheliale hyperplasie, gewichtsverlies, mucosale ulceraties, epitheelcelschimmel en adenomen vertoont. Eerder werd gemeld dat claudine-7 nodig is voor intestinale epitheelstamcelfuncties in de dunne darm. In dit protocol wordt een colon-organoïde kweeksysteem opgezet om de rol van claudine-7 in de dikke darm te bestuderen.
Introduction
Intestinale organoïde cultuur is een driedimensionaal (3D) ex vivo systeem waarbij stamcellen worden geïsoleerd uit de darmcrypten van primair weefsel en verguld in een gelmatrix 1,2. Deze stamcellen zijn in staat tot zelfvernieuwing, zelforganisatie en orgaanfunctionaliteit2. Organoïden bootsen de micro-omgeving van het weefsel na en lijken meer op in vivo modellen dan tweedimensionale (2D) in vitro celkweekmodellen, hoewel minder manipulateerbaar dan cellen 3,4. Dit model elimineert obstakels die worden aangetroffen in 2D-modellen, zoals een gebrek aan goede cel-celverklevingen, cel-matrixinteracties en homogene populaties, en vermindert ook de beperkingen van diermodellen, waaronder hoge kosten en lange perioden van tijd5. Intestinale organoïden - ook wel colonoïden genoemd voor die gekweekt uit van coloncrypten afgeleide stamcellen - zijn in wezen mini-organen die een epitheel bevatten met alle celtypen die in vivo aanwezig zouden zijn, evenals een lumen. Dit model maakt manipulatie van het systeem mogelijk om vele aspecten van de darm te bestuderen, zoals de stamcelniche, darmfysiologie, pathofysiologie en darmmorfogenese 3,5,6. Het biedt ook een geweldig model voor het ontdekken van geneesmiddelen, het bestuderen van menselijke darmaandoeningen zoals inflammatoire darmaandoeningen (IBD) en colorectale kanker, patiëntspecifieke gepersonaliseerde behandelingsontwikkeling en het bestuderen van weefselregeneratie 4,7,8,9. Daarnaast kan het organoïde systeem ook worden gebruikt om cellulaire communicatie, medicijnmetabolisme, levensvatbaarheid, proliferatie en reactie op stimuli te bestuderen 7,8. Hoewel diermodellen kunnen worden gebruikt om potentiële therapieën voor intestinale pathologische aandoeningen te testen, zijn ze vrij beperkt, omdat het bestuderen van meerdere geneesmiddelen tegelijk een uitdaging vormt. Er zijn meer verstorende variabelen in vivo, en de bijbehorende kosten en tijd zijn respectievelijk hoog en lang. Aan de andere kant maakt het organoïde kweeksysteem de screening van veel therapeutica tegelijk in een kortere periode mogelijk en maakt het ook een gepersonaliseerde behandeling mogelijk door het gebruik van van de patiënt afgeleide organoïde cultuur 4,8. Het vermogen van colonorganoïden om weefselorganisatie, micro-omgeving en functionaliteit na te bootsen, maakt ze ook een uitstekend model voor het bestuderen van regeneratie en weefselherstel9. Ons lab heeft een organoïde kweeksysteem voor de dunne darm opgezet om het effect van claudine-7 op de stamcelfuncties van de dunne darm te bestuderen10. In deze studie wordt een groot intestinaal organoïde kweeksysteem opgezet om het vermogen of gebrek aan vermogen van stamcellen te bestuderen om zichzelf te vernieuwen, te differentiëren en te vermenigvuldigen in een voorwaardelijk claudine-7 knock-out (cKO) -model.
Claudin-7 is een zeer belangrijk tight junction (TJ) eiwit dat sterk tot expressie komt in de darm en essentieel is voor het behoud van de TJ-functie en integriteit11. cKO-muizen lijden aan een IBD-achtig fenotype, vertonen ernstige ontstekingen, ulceraties, epitheelcelschilfers, adenomen en verhoogde cytokinespiegels11,12. Hoewel het algemeen aanvaard is dat claudins van vitaal belang zijn voor de epitheliale barrièrefunctie, ontstaan er nieuwe rollen voor claudins; ze zijn betrokken bij proliferatie, migratie, kankerprogressie en stamcelfunctie 10,12,13,14,15,16,17. Het is momenteel onbekend hoe claudine-7 de stamcelniche en -functie van colonstamcellen beïnvloedt. Omdat de darm zichzelf ongeveer elke 5-7 dagen snel vernieuwt, is het behoud van de stamcelniche en de goede werking van de actieve stamcellen van vitaal belang18. Hier wordt een systeem opgezet om de potentiële regulerende effecten van claudine-7 op de colonstamcelniche te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven en -procedures zijn goedgekeurd door de East Carolina University (ECU) Animal Care and Use Committee (IACUC) en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health en ECU voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Induceerbare, darmspecifieke claudine-7 knock-out muizen werden gegenereerd door C57BL6 claudine-7-flox transgene muizen te kruisen met Villin-CreERT2 muizen19. Mannelijke en vrouwelijke muizen van 3 maanden oud werden gebruikt in deze studie.
1. Bereiding van reagens/apparatuur
- Koel de volgende reagentia/apparatuur voordat u met de bijbehorende experimenten begint: fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) voor het wassen van colonweefsel tijdens cryptische isolatie; een rocker/rotator (plaats in een koelkast van 4 °C) voor incubatie met epitheliale dissociatiemedia.
- Verwijder de gelmatrix (zie materiaaltabel) van -20 °C en ontdooi op ijs voor het plateren.
- Koel de centrifuge voor tot 4 °C voordat de crypten worden afgeknald voor beplating.
- Koel 0,1% natriumcitraatbuffer af (zie Materiaaltabel) en bewaar op ijs voordat de celdood wordt gedetecteerd.
- Verwarm de volgende reagentia voordat u met hun bijbehorende experimenten begint: een 96-well kweekplaat gedurende 24 uur voordat u ze platt; L-WRN-media (zie Materiaaltabel) voordat ze worden toegevoegd aan vergulde crypten en voordat elke media verandert.
- Verwarm het waterbad tot 94 °C voordat u het beitst.
2. Murine colon crypt isolatie
- Bereid de benodigde media voor volgens de onderstaande stappen.
OPMERKING: De mediavolumes worden hier berekend voor het darmweefsel van twee muizen.- Bereid epitheliale dissociatiemedia: 30 ml 1x PBS + 400 μL van 0,5 M EDTA + 50 μL van 10 mM Y-27632 dihydrochloride (zie materiaaltabel). Blijf op ijs tot gebruik.
- Bereid crypt dissociatiemedia voor: 10 ml 1x PBS + 10 μL 10 mM Y-27632 dihydrochloride. Blijf op ijs tot gebruik.
- Supplement L-WRN media: 50 ml L-WRN media + 47,5 ml DMEM hoge glucose met L-glutamine + 500 μl L-glutamine + 500 μl penniciline/streptomycine + 1.000 μL B-27 supplement (50x) + 500 μL N2-supplement (100x) + 50 μL HEPES (1 M) bufferoplossing (zie Materiaaltabel).
- Filtreer de volledige (aangevulde) L-WRN media en aliquot voor opslag bij -20 °C gedurende maximaal 3 maanden.
OPMERKING: Ontdooide media zijn stabiel bij 4 °C gedurende maximaal 2 weken.
- Voer de cryptisolatie uit.
- Voeg voor algemene anesthesie 1 ml isofluraan toe aan katoen en plaats het in een plastic cassette in een anesthesiekamer van 0,09 kubieke voet (zie Materiaaltabel). Plaats de muis in de anesthesiekamer totdat de ademhaling stopt (ongeveer 3-5 min) en voer vervolgens cervicale dislocatie20 uit.
- Maak een incisie van ongeveer 2 in de middellijn van de muis en pin de achterhuid vast om de buik bloot te leggen. Isoleer de dikke darm door net onder de blindedarm van de proximale kant en boven het rectum van de distale kant21 te snijden.
- Verwijder met behulp van een tang het vetweefsel dat aan de dikke darm is bevestigd. Duw de ontlasting voorzichtig naar buiten met behulp van het platte uiteinde van de tang en snijd het weefsel in de lengterichting open.
- Was het weefsel 10-15 keer met koude 1x PBS met behulp van een tang om het weefsel rond te "wervelen" in PBS tussen wasbeurten.
- Snijd met een schone, scherpe schaar het weefsel in kleine stukjes, ongeveer 3-5 mm groot.
- Herhaal het proces voor de tweede muis en combineer de stukjes weefsel in een buis van 50 ml met koude epitheliale dissociatiemedia (stap 2.1.1).
- Incubeer de stukjes darmweefsel in epitheliale dissociatiemedia gedurende 90 minuten bij 4 °C met zacht schommelen.
- Laat de weefselfragmenten naar de bodem van de buis zakken en gooi vervolgens voorzichtig de epitheliale dissociatiemedia weg zonder het weefsel te verstoren. Herhaal dit proces bij het wassen van de tissue 10-15 keer met koude 1x PBS. Gooi zoveel mogelijk PBS weg tijdens de laatste wasbeurt.
- Voeg crypt dissociatiemedia (stap 2.1.2) toe aan de buis van 50 ml met stukjes darmweefsel en schud continu gedurende 5-10 minuten met de hand.
OPMERKING: De media moeten troebel worden van de gedissocieerde crypten. - Filter onder de celkweekkap het weefsel en de media met een nylon celzeef van 70 μm (zie Materiaaltabel) in een verse buis van 50 ml.
- Centrifugeer bij 200 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg zonder de cryptehoudende pellet te verstoren.
OPMERKING: Afhankelijk van de apparatuur kan men de gespannen media overbrengen naar een buis van 15 ml voor centrifuging. - Resuspendeer de pellet in ~ 3-4 ml koude 1x PBS.
- Pipetteer 10 μL van de geïsoleerde crypten in een lijn op een microscoopglaasje. Tel onder de microscoop het aantal volle, lange crypten om de crypteconcentratie per 10 μL te schatten.
- Bereken het juiste volume crypten om af te draaien om 10 crypten / μL in een 96-well plaat te plaatsen.
3. Crypt plating
- Centrifugeer een geschikt volume geïsoleerde crypten in een microcentrifugebuis van 1,5 ml bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Verwijder het supernatant voorzichtig met een pipet van 1.000 μL zonder de gepelletiseerde crypten te verstoren.
- Voeg 100 μL gelmatrix (genoeg voor negen putten) toe aan de gepelletiseerde crypten en pipetteer voorzichtig om te voorkomen dat luchtbellen worden geïntroduceerd.
OPMERKING: Zie het gedeelte Discussie voor een gedetailleerde beschrijving van het mengen van de gelmatrix en crypten. Doorgaans is 100 μL voldoende voor negen putten. - Laat de gelmatrix gedeeltelijk stollen (~1-2 min).
- Plaat 10 μL van de gelmatrix gemengd met de crypten in elk putje van een voorverwarmde 96-well kweekplaat om een koepelvorm te vormen.
OPMERKING: Plaats de koepel in het midden van de put. Zorg ervoor dat de gelmatrix zich niet naar de zijkanten van de put verspreidt. Zie de sectie Discussie voor een gedetailleerde beschrijving van stolling en beplating. - Laat de gelmatrix gedurende 10-20 minuten volledig worden ingesteld in een incubator bij 37 °C met 5% CO2.
- Bereid de uiteindelijke werkoplossing van L-WRN media voor.
- Voeg 100 μL pennicilin/streptomycine toe aan een aliquot van 10 ml L-WRN media (zie stap 2.1.3) (stabiel gedurende 2 weken bij 4 °C).
- Voeg supplementen toe aan 900 μL L-WRN-media met penniciline/streptomycine: 0,9 μL van 1 mg/ml EGF + 0,9 μL van 10 mM Y-27632 dihydrochloride.
OPMERKING: De volumes zijn gebaseerd op negen putten. Y-27632 dihydrochloride wordt pas toegevoegd op dag 0 (op het moment van plating).
- Voeg 100 μL media toe aan elk putje. Pas op dat je de koepel niet verstoort.
- Incubeer bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 24 uur.
4. Claudin-7 knock-out creëren in cultuur
- Laat de crypten na het beplateren 24 uur normaal in cultuur groeien.
- Voeg in een microcentrifugebuis van 1,5 ml 2,7 μL 1 mmol/L 4-hydroxytamoxifen (4OH-Tamoxifen) toe aan 900 μL L-WRN-media (eindconcentratie van 3 μmol/L) + 0,9 μL van 1 mg/ml EGF.
OPMERKING: De stamoplossing van 4OH-Tamoxifen wordt bereid door poedervormige 4OH-Tamoxifen (zie Materiaaltabel) te mengen met 1x PBS tot een concentratie van 1 mmol/L. - Verwijder oude media uit de putten via vacuümafzuiging.
- Voeg 100 μL 4OH-Tamoxifen-bevattende media toe aan elk putje en label ze als claudine-7 cKO/4OH-TAM.
OPMERKING: DMSO moet worden toegevoegd aan de controleputten. Verse 4OH-Tamoxifen-bevattende media moeten om de 2 dagen worden toegevoegd. - Incubeer bij 37 °C tot de volgende mediaverandering (~2-3 dagen).
5. Onderhoud van colonorganoïden
OPMERKING: Media moeten elke 2-3 dagen worden vervangen. Cultuur tot 12 dagen.
- Bereid een verse eindoplossing van L-WRN-media: 900 μL L-WRN-media + 0,9 μL van 1 mg/ml EGF.
- Verwijder oude media uit de putten via vacuümafzuiging. Voeg verse media toe aan de putten.
OPMERKING: Pas op dat u de koepel niet verstoort. - Incubeer bij 37 °C tot de volgende mediawissel.
OPMERKING: Culturen kunnen worden onderhouden en doorgegeven voor de duur die voor het experiment gewenst is. De culturen voor de huidige studie werden meestal tussen de 9-12 dagen gehandhaafd, maar men kan verder willen gaan, gedurende 15 of 20 dagen.
6. Oogsten en inbedden van colonorganoïden
- Verwijder oude media uit de putten via vacuümafzuiging.
- Bevestig de organoïden met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
OPMERKING: PFA is een giftig materiaal. Neem voorzorgsmaatregelen bij het gebruik van dit reagens. - Verwijder 4% PFA uit de putjes via vacuümafzuiging en voeg 30% sucrose toe gedurende 24 uur bij 4 °C.
- Label een plastic mal en vul deze tot 90% met een optimale snijtemperatuur (OCT) (zie Materiaaltabel).
- Verwijder 30% sucrose uit de putjes via vacuümafzuiging. Voeg 10 μL 1x PBS toe aan elk putje.
- Krab met een pipetpunt voorzichtig aan de onderkant van de put om de koepel met organoïden te dissociëren.
- Verwijder met een pipet de PBS met de gedissocieerde organoïden en laad de vloeistof in de mal die OCT bevat.
OPMERKING: Vermijd het introduceren van bubbels in de OCT-verbinding. - Ga door met dit proces totdat alle organoïden uit alle putten zijn verwijderd.
- Voeg in een roestvrijstalen Dewar-kolf droogijskorrels en 2-methylbutaan toe (voldoende om de droogijspellets te bedekken) (zie Materiaaltabel).
- Houd het organoïde-bevattende OCT-blok gestaag boven 2-methylbutaan om te bevriezen.
- Bewaar het organoïde-bevattende OCT-blok bij -80 °C totdat het klaar is om te worden doorgesneden (kan maximaal 1 jaar worden bewaard).
7. Immunofluorescentie
- Sectie van het organoïde-bevattende OCT-blok op een dikte van 5 μm met behulp van een cryostaat (zie Materiaaltabel) bij -20 °C.
- Controleer voor elke sectie onder de microscoop of er een organoïde is gevangen. Wanneer de sectie is voltooid, bewaart u de dia's bij -80 °C totdat ze klaar zijn om te vlekken (kan tot 6 maanden worden bewaard).
- Verwarm de glaasjes in 10 mM natriumcitraatbuffer gedurende 10 min bij 94 °C.
OPMERKING: De buffer wordt gemaakt door natriumcitraat op te lossen in gedeïoniseerd water. Stel de pH in op 6 met zoutzuur. - Laat de glijbanen 20 minuten afkoelen op de benchtop. Spoel af met gedestilleerd water gedurende 5 min.
- Monteer de dia's in een beitsrek (zie Materiaaltabel) met 0,2% Triton X-100 en incubeer met 100 mM glycine gedurende 15 min.
- Spoel drie keer met 1x PBS gedurende 5 minuten elk. Blok met 5% runderserumalbumine (BSA) gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
- Incubeer met claudine-7 anti-murine konijn primair antilichaam22 (verdund in 1% BSA) 's nachts bij 4 °C. Spoel drie keer met 1x PBS gedurende 10 minuten elk.
- Incubeer met Cy3 anti-konijn secundair antilichaam23 (verdund in 1% BSA) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Spoel drie keer met 1x PBS gedurende 10 minuten elk.
- Monteer de dia's met een geschikt montagemedium (zie Materiaaltabel) met DAPI en voeg een coverslip toe.
8. Celdooddetectie
- Bevestig de organoïden in de putten met 4% paraformaldehyde gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Spoel met 1x PBS gedurende 5 min.
- Incubeer de kweekplaat op ijs met 0,1% Triton X-100 in koude 0,1% natriumcitraatbuffer gedurende 2 min. Spoel twee keer met 1x PBS gedurende 5 minuten elk.
- Bereid TUNEL-reactie24,25 voor met TMR Red, een in situceldooddetectiekit (zie Materiaaltabel). Voeg 50 μL reactiereagentia toe aan elk putje.
- Incubeer in een bevochtigde atmosfeer gedurende 1 uur bij 37 °C in het donker.
OPMERKING: Alle resterende stappen moeten in het donker worden voltooid. - Spoel drie keer met 1x PBS gedurende 5 minuten elk. Incubeer met 1:2.500 Hoechst (verdund in 1x PBS, zie Materiaaltabel) gedurende 3 min.
- Spoel drie keer met 1x PBS gedurende 5 minuten elk. Gebruik het TRITC-filter om beelden op een fluorescerende microscoop te visualiseren (zie Tabel met materialen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de regulerende effecten van claudine-7 op darmstamcellen te onderzoeken, werden coloncrypten geïsoleerd uit muizenzwamweefsel zoals hierboven beschreven en weergegeven in figuur 1A. Nadat de crypten waren geïsoleerd van het primaire weefsel, werden ze in een 3D-matrix in een 96-well plaat geplaatst om gedurende 11 dagen te groeien (figuur 1). Normale gezonde crypten zullen het lumen sluiten en op dag 2 sferoïden worden en uiteindelijk beginnen te ontluiken en de verschillende epitheelceltypen te vormen op ongeveer dag 5 (figuur 1B). Colonoïden mochten groeien tot dag 11, waar ze vervolgens werden geoogst voor verdere experimenten (figuur 1B). Om claudin-7 in cultuur uit te schakelen, mochten de crypten 24 uur normaal groeien. Na 24 uur werden de crypten behandeld met 3 μmol/L 4OH-Tamoxifen (TAM) en gedurende 10 extra dagen gekweekt. Het kweekmedium met verse 4OH-TAM werd om de 2 dagen vervangen. DMSO werd gebruikt als een voertuig in controleputten. Claudin-7 deficiënte crypten (claudin-7 KO) slaagden er niet in om de juiste sferoïden te vormen en begonnen snel te sterven na 1 dag 4OH-TAM-behandeling (figuur 1B).
Figuur 2A benadrukt de succesvolle groei van colonoïden uit normale crypten die claudine-7 (controle) bevatten naarmate ze vorderen gedurende de 9 dagen van cultuur. Deze crypten begonnen op dag 2 sferoïden te vormen, begonnen te ontluiken op dag 5 en bleven groeien en ontluiken totdat ze op dag 9 werden geoogst (figuur 2A). Daarentegen verslechterden crypten zonder claudin-7 (claudin-7 KO) zeer snel (figuur 2B). Ongeveer 2-3 dagen na behandeling met 4OH-TAM hadden claudine-7 KO-crypten geen gezond uitziende sferoïden gevormd en verschenen ze alleen als cirkelvormige klonten cellen (figuur 2B). Crypten geïsoleerd van wild-type muizen werden behandeld met 4OH-TAM om te bevestigen dat er geen toxisch effect is als gevolg van tamoxifenbehandeling; deze crypten waren in staat om te overleven en normaal te groeien. Om claudine-7 deletie en de overlevingsconditie van claudine-7 KO colonoïden te onderzoeken, werden een immunostaining methode en een in situ celdood detectie kit gebruikt (Figuur 3). Immunofluorescente kleuring voor claudine-7 in geoogste controle en cKO organoïden bevestigde succesvolle knock-out van claudine-7 in cultuur (figuur 3A). Dag 9 controle colonoïden vertoonden zeer weinig apoptotisch signaal (figuur 3B); claudine-7 KO colonoïden vertoonden echter een hoge apoptose (figuur 3B). Zonder claudine-7 konden de stamcellen niet overleven, zichzelf vernieuwen of differentiëren om colonoïden te vormen.
Figuur 1: Schematische weergave van cryptisolatie en kolonoïdegroei. (A) Grafische weergave van het cryptisolatieproces, plating in de 3D-matrix en groei tot de oogst. (B) Tijdlijn van experimenten en kolonoïdegroei in controle- en claudine-7 KO-afgeleide crypten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Claudin-7 deficiënte colonoïden zijn niet in staat om te overleven en te groeien. (A) Representatieve beelden van controle/DMSO organoïden op dag 3 en dag 9. (B) Representatieve beelden van 4OH-TAM/cKO organoïden op dag 3 en dag 9, n = 10. Schaalbalken = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Claudin-7 deficiënte colonoïden ondergaan snel apoptose. (A) Claudin-7 kleuring in dag 9 controle/DMSO en claudine-7 cKO/4OH-TAM organoïden, n = 3. Schaalstaven = 250 μm. (B) Apoptotische kleuring in dag 9 controle en claudine-7 cKO/4OH-TAM colonoïden, n = 3. Schaalbalken = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Organoïde cultuur is een uitstekend model voor het bestuderen van stamcelfunctie, darmfysiologie, medicijnontdekking, menselijke darmziekten en weefselregeneratie en -reparatie 7,8,9,10,11,26. Hoewel het veel voordelen heeft, kan het een uitdaging zijn om vast te stellen. Voorzichtigheid is geboden in alle stappen in het protocol, maar vooral tijdens de beplatingsfase. Wanneer u de geïsoleerde crypten mengt met een gelmatrix, moet u ervoor zorgen dat u grondig op en neer pipet om de cryptekorrel die na centrifugatie is gevormd, te breken en de crypten gelijkmatig over de matrix te verdelen. Vermijd tegelijkertijd het introduceren van luchtbellen in de matrix tijdens het pipetteren. Om dit te doen, moet het pipetteren langzaam worden gedaan, met de pipetpunt naar de onderkant van de buis van 1,5 ml.
Bovendien mag de gelmatrix tijdens dit proces niet volledig worden gestold. Om voortijdige stolling te voorkomen, mengt u door zorgvuldig pipetteren, plaatst u de buis vervolgens op ijs en herhaalt u dit proces. Zodra de geïsoleerde crypten en gelmatrix voldoende gemengd zijn, laat de gelmatrix gedeeltelijk stollen. Dit proces kan 1-5 minuten duren, afhankelijk van het type / merk gelmatrix dat wordt gebruikt. Het moet lijken op een gel die iets zal bewegen als de buis wordt gekanteld, maar mag niet te vloeibaar zijn dat het zou uitlekken als het omgekeerd zou worden. Op dit punt kan men beginnen met het platen van 10 μL in het midden van elke put. De gelmatrix moet een 3D-koepel vormen en mag de zijkanten van de put niet raken. Als de gelmatrix zich verspreidt en de wand van de put raakt, is deze niet voldoende gestold; wacht tot het voldoende gestold is om een koepel te vormen, omdat de crypten niet zullen overleven en groeien als de koepel niet wordt gevormd. Zodra de beplating goed is voltooid en crypten voldoende zijn aangevuld, zoals hierboven uitgelegd, wordt verwacht dat de organoïden zonder problemen zullen groeien.
Dit protocol stelt een colonorganoïde systeem in met of zonder claudine-7 om de effecten ervan op de overleving van colonstamcellen te observeren. Hoewel colon organoïde cultuur een innovatief en voordelig systeem is, heeft het model nog steeds beperkingen. Afhankelijk van het type onderzoek kan het ontbreken van immuuncellen en de microbiota in darmorganoïden een voor- of nadeel zijn26. Voor deze studie is het voordelig om de regulerende rol van claudine-7 op stamcelfuncties te onderzoeken zonder de immuuncomponent. Er werd geconcludeerd dat een bepaald effect specifiek te wijten is aan claudine-7, in plaats van andere potentiële variabelen zoals de immuunrespons die aanwezig zou zijn in in vivo diermodellen. Omgekeerd kan deze factor een beperking zijn voor andere soorten studies. Het vaststellen van colon organoïde cultuur kan ook duurder en tijdsintensiever zijn dan traditionele 2D-cellijnen. Ze kunnen echter de cellulaire micro-omgeving van weefsels nabootsen die in vivo relevant zijn, zijn veel representatiever voor weefsel dan 2D-celkweek en zijn nog steeds minder duur dan diermodellen 4,7. Gezien de enorme toepassing en het enorme potentieel van intestinale organoïde cultuur, zal dit systeem waarschijnlijk het ideale model worden in laboratoriumonderzoek wereldwijd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Deze studie werd gefinancierd door NIH DK103166.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator | United States Plastic Corp | 78564 | anesthesia chamber |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | AM9261 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 1x Dulbecco’s Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
| 2-methylbutane | Sigma | 277258 | |
| 4% paraformaldehyde | ThermoFisher | J61899.AK | |
| 4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM) | Sigma | 579002 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 70 µm nylon cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96 well culture plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | |
| Claudin-7 anti-murine rabbit antibody | Immuno-Biological Laboratories | 18875 | |
| Cover glass (24 x 50-1.5) | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryomolds | vwr | 25608-916 | |
| Cultrex RCF BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | gel matrix |
| Cy3 anti-rabbit antibody | Jackson Immunoresearch | 111-165-003 | |
| Dewar Flask | Thomas Scientific | 1173F61 | |
| DMEM High Glucose with L-Glutamine | ATCC | 30-2002 | |
| EVOS FLoid Imaging System | ThermoFisher | 4477136 | |
| Fluoro-Gel II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 17985-50 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Glycine | JT Baker | 4059-02 | |
| HEPES (1 M) Buffer Solution | Gibco | 15630-080 | |
| Hoechst | ThermoFisher | 62249 | |
| In situ cell death detection kit, TMR Red | Roche | 12156792910 | |
| Isoflurane | Pivetal | 07-893-8440 | |
| L-WRN Media | Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core | N/A | |
| Mouse surgical kit | Kent Scientific Corporation | INSMOUSEKIT | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-500UG | |
| N2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Sequenza Rack | vwr | 10129-584 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S-279 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Vacuum filter (0.22 µm; cellulose acetate) | Corning | 430769 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 |
References
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Wallach, T. E., Bayrer, J. R. Intestinal organoids: new frontiers in the study of intestinal disease and physiology. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 180-185 (2017).
- Shankaran, A., Prasad, K., Chaudhari, S., Brand, A., Satyamoorthy, K. Advances in development and application of human organoids. 3 Biotech. 11 (6), 257 (2021).
- Angus, H., Butt, A., Schultz, M., Kemp, R. Intestinal organoids as a tool for inflammatory bowel disease research. Frontiers in Medicine. 6, 334 (2020).
- Fan, Y., Davidson, L. A., Chapkin, R. S. Murine colonic organoid culture system and down stream assay applications. Methods in Molecular Biology. 1576, 171-181 (2019).
- Gupta, N., et al. Microfluidics-based 3D cell culture models: Utility in novel drug discovery and delivery research. Bioengineering and Translational Medicine. 1 (1), 63-81 (2016).
- Yoo, J., Donowitz, M. Intesitnal enteroids/organoids: A novel platform for drug discovery in inflammatory bowel diseases. World Journal of Gastroenterology. 25 (30), 4125-4147 (2019).
- Qu, M., et al. Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration. Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).
- Xing, T., et al. Tight junction protein claudin-7 is essential for intestinal epithelial stem cell self-renewal and differentiation. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 641-659 (2020).
- Ding, L., et al. Inflammation and disruption of the mucosal architecture in claudin-7-deficient mice. Gastroenterology. 142 (2), 305-315 (2012).
- Lu, Z., Ding, L., Lu, Q., Chen, Y. H. Claudins in intestines: distribution and functional significance in health and diseases. Tissue Barriers. 1 (3), 24978 (2013).
- Ding, L., Lu, Z., Lu, Q., Chen, Y. H. The claudin family of proteins in human malignancy: a clinical perspective. Cancer Management and Research. 5, 367-375 (2013).
- Bhat, A. A., et al. Claudin-7 expression induces mesenchymal to epithelial transformation (MET) to inhibit colon tumorigenesis. Oncogene. 34 (35), 4570-4580 (2015).
- Lu, Z., et al. A non-tight junction function of claudin-7-interaction with integrin signaling in suppressing lung cancer cell proliferation and detachement. Molecular Cancer. 14, 120 (2015).
- Wang, K., Xu, C., Li, W., Ding, L. Emerging clinical significance of claudin-7 in colorectal cancer: a review. Cancer Management and Research. 10, 3741-3752 (2018).
- Wang, K., et al. Claudin-7 downregulation induces metastasis and invasion in colorectal cancer via the promotion of epithelial-mesenchymal transition. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (3), 797-804 (2019).
- Wang, F., et al. Isolation and characterization of intestinal stem cells based on surface marker combinations and colony-formation assay. Gastroenterology. 145 (2), 383 (2013).
- Li, W., et al. Severe intestinal inflammation in the small intestine of mice induced by controllable deletion of claudin-7. Digestive Diseases and Sciences. 63 (5), 1200-1209 (2018).
- Donovan, J., Brown, P. Euthanasia. Current Protocols in Immunology. 73 (1), (2006).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. Journal of Visual Experiments. (80), e50611 (2013).
- Sugimoto, K., et al. Cell adhesion signals regulate the nuclear receptor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (49), 24600-24609 (2019).
- Mansour, H., et al. Connexin 30 expression and frewuency of connexin heterogeneity in astrocyte gap junction plaques increase with age in the rat retina. PLoS One. 8 (3), 57038 (2013).
- Miranda, M., et al. Antioxidants rescue photoreceptors in rd1 mice: relationship with thiol metabolism. Free Radical Biology and Medicine. 48 (2), 216-222 (2010).
- Wang, L., et al. Mesenchymal stromal cells ameliorate oxidative stress-induced islet endothelium apoptosis and functional impairment via Wnt4-β-catenin signaling. Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 188 (2017).
- Almeqdadi, M., Mana, M., Roper, J., Yilmaz, O. Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).
