Summary
本协议描述了建立鼠结肠类器官系统以研究claudin-7敲除模型中结肠干细胞的活性和功能。
Abstract
肠上皮每5-7天再生一次，并由位于隐窝区域底部的肠上皮干细胞（IESC）群控制。IESC包括活性干细胞，其自我更新并分化为各种上皮细胞类型，以及静止干细胞，在受伤的情况下作为储备干细胞。肠上皮的再生由这些活性IESC的自我更新和分化能力控制。此外，隐窝干细胞群的平衡和干细胞生态位的维持对于肠道再生至关重要。类器官培养是研究调节干细胞存活和功能的蛋白质、信号分子和环境线索的一种重要且有吸引力的方法。该模型比动物模型更便宜，耗时更少，并且更易于操作。类器官还模仿组织微环境，提供 体内 相关性。本协议描述了结肠隐窝的分离，将这些分离的隐窝细胞嵌入到三维凝胶基质系统中并培养隐窝细胞以形成能够自组织，增殖，自我更新和分化的结肠类器官。该模型允许人们操纵环境 - 敲除特定的蛋白质，如claudin-7，激活/停用信号通路等 - 研究这些效应如何影响结肠干细胞的功能。具体而言，研究了紧密连接蛋白claudin-7在结肠干细胞功能中的作用。Claudin-7对于维持肠道稳态和屏障功能和完整性至关重要。在小鼠中敲除claudin-7诱导炎症性肠病样表型，表现出肠道炎症，上皮增生，体重减轻，粘膜溃疡，上皮细胞脱落和腺瘤。此前，据报道，claudin-7是小肠肠上皮干细胞功能所必需的。在该协议中，建立了结肠类器官培养系统以研究claudin-7在大肠中的作用。
Introduction
肠道类器官培养是一种三维（3D）离体系统，其中干细胞从原代组织的肠隐窝中分离并接种到凝胶基质中1，2。这些干细胞能够自我更新，自我组织和器官功能2。类器官模拟组织微环境，与二维（2D）体外细胞培养模型更类似于体内模型，尽管可操作性不如细胞3，4。该模型消除了2D模型中遇到的障碍，例如缺乏适当的细胞-细胞粘附，细胞-基质相互作用和同质群体，并且还减少了动物模型的局限性，包括高成本和长时间5。肠道类器官 - 也称为结肠类器官，用于从结肠隐窝来源的干细胞生长的类结肠 - 本质上是包含上皮的微型器官，包括体内存在的所有细胞类型以及腔。该模型允许操纵系统来研究肠道的许多方面，例如干细胞生态位、肠道生理学、病理生理学和肠道形态发生3，5，6。它还为药物发现、研究炎症性肠病 （IBD） 和结直肠癌等人类肠道疾病、患者特异性个性化治疗开发以及研究组织再生4，7，8，9 提供了一个很好的模型。此外，类器官系统还可用于研究细胞通讯、药物代谢、活力、增殖和对刺激的反应7，8。虽然动物模型可用于测试肠道病理状况的潜在治疗方法，但它们非常有限，因为同时研究多种药物是一项挑战。体内混杂变量较多，相关成本和时间分别高而长。另一方面，类器官培养系统允许在较短的时间内一次筛选多种治疗方法，并且还允许通过使用患者来源的类器官培养物进行个性化治疗4，8。结肠类器官模仿组织组织、微环境和功能的能力也使它们成为研究再生和组织修复的优秀模型9。本实验室建立了小肠类器官培养系统，研究claudin-7对小肠干细胞功能的影响10。在这项研究中，建立了一个大型肠道类器官培养系统来研究干细胞在条件claudin-7敲除（cKO）模型中自我更新，分化和增殖的能力或缺乏能力。
Claudin-7是一种非常重要的紧密连接（TJ）蛋白，在肠道中高度表达，对于维持TJ功能和完整性至关重要11。cKO小鼠患有IBD样表型，表现出严重的炎症，溃疡，上皮细胞脱落，腺瘤和细胞因子水平升高11，12。虽然人们普遍认为克劳迪斯对上皮屏障功能至关重要，但克劳迪斯的新角色正在出现;它们参与增殖、迁移、癌症进展和干细胞功能10，12，13，14，15，16，17。目前尚不清楚claudin-7如何影响结肠干细胞的干细胞生态位和功能。由于肠道大约每5-7天快速自我更新一次，因此维持干细胞生态位和活性干细胞的正常功能至关重要18。在这里，建立了一个系统来检查claudin-7对结肠干细胞生态位的潜在调节作用。
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Protocol
所有动物实验和程序均由东卡罗来纳大学（ECU）动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并按照美国国立卫生研究院和ECU关于实验动物护理和使用指南进行。通过将C57BL6claudin-7-flox转基因小鼠与Villin-CreERT2小鼠杂交产生诱导的肠特异性claudin-7基因敲除小鼠19。本研究使用3个月大的雄性和雌性小鼠。
1. 试剂/设备准备
- 在开始相关实验之前冷却以下试剂/设备：磷酸盐缓冲盐水（PBS），用于在隐窝分离期间清洗结肠组织;摇臂/旋转器（置于4°C冰箱中）用于与上皮解离培养基孵育。
- 从-20°C中取出凝胶基质（参见 材料表），并在电镀前在冰上解冻。
- 将离心机预冷至4°C，然后再旋转地下室进行电镀。
- 冷却0.1%柠檬酸钠缓冲液（见 材料表），并在 原位 细胞死亡检测之前保持在冰上。
- 在开始相关实验之前加热以下试剂：96孔培养板在接种前24小时;L-WRN培养基（见 材料表）在添加到电镀地穴之前和每个介质更换之前。
- 染色前将水浴加热至94°C。
2.鼠结肠隐窝隔离
- 按照以下步骤准备必要的介质。
注意：此处计算两只小鼠结肠组织的培养基体积。- 制备上皮解离培养基：30 mL 1x PBS + 400 μL 0.5 M EDTA + 50 μL 10 mM Y-27632 二盐酸盐（参见 材料表）。在冰上保持使用。
- 制备隐窝解离培养基：10 mL 1x PBS + 10 μL 10 mM Y-27632 二盐酸盐。在冰上保持使用。
- 补充 L-WRN 培养基：50 mL L-WRN 培养基 + 47.5 mL DMEM 高葡萄糖与 L-谷氨酰胺 + 500 μL L-谷氨酰胺 + 500 μL 青霉素/链霉素 + 1，000 μL B-27 添加剂 （50x） + 500 μL N2 添加剂 （100x） + 50 μL HEPES （1 M） 缓冲溶液（参见 材料表）。
- 过滤完整的（补充的）L-WRN培养基和等分试样，以便在-20°C下储存长达3个月。
注意：解冻的培养基在4°C下稳定长达2周。
- 执行地穴隔离。
- 对于全身麻醉，在棉花中加入1mL异氟醚，并将其放入0.09立方英尺麻醉室内的塑料盒内（见 材料表）。将鼠标置于麻醉室中，直到呼吸停止（约3-5分钟），然后进行颈椎脱位20。
- 沿着鼠标的中线做一个大约 2 的切口，固定背部皮肤以露出腹部。通过从近端切开盲肠下方和从远端切开直肠上方来分离结肠21。
- 使用镊子去除附着在结肠上的脂肪组织。利用镊子的平端轻轻地将粪便推出，并纵向切开组织。
- 使用镊子用冷的 1x PBS 清洗纸巾 10-15 次，在两次洗涤之间在 PBS 中“旋转”纸巾。
- 使用干净、锋利的剪刀，将组织切成小块，大小约为 3-5 毫米。
- 对第二只小鼠重复该过程，并将组织碎片合并到含有冷上皮解离培养基的50 mL管中（步骤2.1.1）。
- 将结肠组织碎片在上皮解离培养基中在4°C下轻轻摇动孵育90分钟。
- 让组织碎片沉入管底部，然后小心地丢弃上皮解离介质而不破坏组织。用冷的1x PBS洗涤纸巾10-15次时重复此过程。在最后一次洗涤期间尽可能多地丢弃PBS。
- 将隐窝解离培养基（步骤2.1.2）加入含有结肠组织碎片的50mL管中，并用手连续摇动5-10分钟。
注：介质必须从分离的地穴中变得浑浊。 - 在细胞培养罩下，用70μm尼龙细胞过滤器（参见 材料表）将组织和培养基过滤到新鲜的50 mL管中。
- 在室温下以200× g 离心10分钟，弃去上清液而不干扰含有隐窝的沉淀。
注意：根据设备的不同，可以将过滤的培养基转移到 15 mL 管中进行离心。 - 将沉淀重悬于~3-4mL冷的1x PBS中。
- 在显微镜载玻片上将 10 μL 分离的隐窝移液成一条线。在显微镜下，计算完整、长的隐窝数量，以估计每 10 μL 的隐窝浓度。
- 计算要旋转的适当体积的隐窝，以便在 96 孔板中接种 10 个隐窝/μL。
3. 隐窝电镀
- 在1.5mL微量离心管中以200× g 在4°C下离心适当体积的分离隐窝5分钟。
- 使用 1，000 μL 移液器小心地去除上清液，而不会破坏沉淀的隐窝。
- 向沉淀的隐窝中加入 100 μL 凝胶基质（足够 9 个孔），并小心移液以避免引入气泡。
注意：有关如何混合凝胶基质和隐窝的详细说明，请参阅讨论部分。通常，100 μL 足以容纳 9 个孔。 - 让凝胶基质部分凝固（~1-2分钟）。
- 板 10 μL 凝胶基质与预热的 96 孔培养板的每个孔中的隐窝混合以形成圆顶形状。
注意：将圆顶放在井的中心。小心不要让凝胶基质扩散到孔的两侧。有关凝固和电镀的详细说明，请参阅讨论部分。 - 让凝胶基质在37°C的培养箱中用5%CO2完全凝固10-20分钟。
- 准备L-WRN介质的最终工作溶液。
- 将 100 μL 喷尼西林/链霉素加入 10 mL 等分试样的 L-WRN 培养基中（参见步骤 2.1.3）（在 4 °C 下稳定 2 周）。
- 将补充剂添加到 900 μL 含有青霉素/链霉素的 L-WRN 培养基中：0.9 μL 1 mg/mL EGF + 0.9 μL 10 mM Y-27632 二盐酸盐。
注：体积基于九口井。Y-27632二盐酸盐仅在第0天（电镀时）添加。
- 向每个孔中加入 100 μL 培养基。小心不要破坏圆顶。
- 在37°C下用5%CO2 孵育24小时。
4. 在培养中创造克劳丁-7敲除
- 让地穴在培养物中正常生长24小时后。
- 在 1.5 mL 微量离心管中，将 2.7 μL 1 mmol/L 4-羟基他莫昔芬（4OH-他莫昔芬）加入 900 μL L-WRN 培养基（终浓度为 3 μmol/L）+ 0.9 μL 1 mg/mL EGF。
注意：4OH-他莫昔芬的储备溶液是通过将粉末状的4OH-他莫昔芬（见 材料表）与1x PBS混合至浓度为1mmol/L来制备的。 - 通过真空抽吸 从 孔中取出旧介质。
- 向每个孔中加入 100 μL 含 4OH-他莫昔芬的培养基，并将其标记为 claudin-7 cKO/4OH-TAM。
注意：需要将DMSO添加到对照孔中。必须每 2 天添加新鲜的含 4OH-他莫昔芬的培养基。 - 在37°C孵育直至下一次培养基更换（~2-3天）。
5. 结肠类器官维护
注：介质必须每 2-3 天更换一次。培养长达12天。
- 准备 L-WRN 培养基的新鲜最终工作溶液：900 μL L-WRN 培养基 + 0.9 μL 1 mg/mL EGF。
- 通过真空抽吸 从 孔中取出旧介质。向孔中加入新鲜培养基。
注意：注意不要破坏圆顶。 - 在37°C下孵育，直到下一次培养基更换。
注意：培养物可以在实验所需的持续时间内保持和传代。本研究的培养物通常维持9-12天，但可能希望继续15或20天。
6. 收获和包埋结肠类器官
- 通过真空抽吸 从 孔中取出旧介质。
- 在室温下用4%多聚甲醛（PFA）固定类器官1小时。
注意：PFA是一种有毒物质。使用本试剂时要注意注意事项。 - 通过真空抽吸 从 孔中除去4%PFA，并在4°C下加入30%蔗糖24小时。
- 标记塑料模具，并用最佳切割温度（OCT）化合物将其填充至90%（见 材料表）。
- 通过真空抽吸 从 孔中除去30%的蔗糖。向每个孔中加入 10 μL 的 1x PBS。
- 用移液器吸头轻轻刮擦孔底部以解离含有类器官的圆顶。
- 用移液管取出含有解离类器官的PBS，然后将液体装入含有OCT的模具中。
注意：避免将气泡引入OCT化合物。 - 继续此过程，直到从所有孔中去除所有类器官。
- 在不锈钢杜瓦瓶中，加入干冰颗粒和2-甲基丁烷（足以覆盖干冰颗粒）（见 材料表）。
- 将含有类器官的OCT块稳定地保持在2-甲基丁烷以上以快速冷冻。
- 将含有类器官的OCT块储存在-80°C，直到准备切片（可储存长达1年）。
7. 免疫荧光
- 在-20°C下使用低温恒温器（参见 材料表）以5μm厚度切片含有类器官的OCT块。
- 对于每个切片，在显微镜下检查以确保捕获类器官。切片完成后，将载玻片储存在-80°C直至准备染色（可保存长达6个月）。
- 在94°C下在10mM柠檬酸钠缓冲液中加热载玻片10分钟。
注意：缓冲液是通过将柠檬酸钠溶解在去离子水中制成的。用盐酸将pH值调节至6。 - 让载玻片在工作台上冷却 20 分钟。用蒸馏水冲洗5分钟。
- 用0.2%Triton X-100将载玻片组装在染色架（参见 材料表）中，并与100mM甘氨酸孵育15分钟。
- 用 1x PBS 冲洗 3 次，每次冲洗 5 分钟。在室温下用5%牛血清白蛋白（BSA）封闭45分钟。
- 与claudin-7抗鼠兔一抗22 （在1%BSA中稀释）在4°C孵育过夜。 用 1x PBS 冲洗 3 次，每次 10 分钟。
- 在室温下与Cy3抗兔二抗23 （在1%BSA中稀释）孵育1小时。用 1x PBS 冲洗 3 次，每次 10 分钟。
- 使用DAPI使用适当的安装介质（参见 材料表）安装载玻片，并添加盖玻片。
8. 细胞死亡检测
- 在室温下用4%多聚甲醛固定孔内的类器官1小时。用 1x PBS 冲洗 5 分钟。
- 将培养板在冰上与0.1%Triton X-100在冷的0.1%柠檬酸钠缓冲液中孵育2分钟。用 1x PBS 冲洗两次，每次冲洗 5 分钟。
- 使用原位细胞死亡检测试剂盒TMR Red制备TUNEL反应24，25（参见材料表）。向每个孔中加入 50 μL TUNEL 反应试剂。
- 在黑暗中在37°C的潮湿气氛中孵育1小时。
注意：所有剩余步骤必须在黑暗中完成。 - 用 1x PBS 冲洗 3 次，每次冲洗 5 分钟。用1：2，500 Hoechst（在1x PBS中稀释，参见 材料表）孵育3分钟。
- 用 1x PBS 冲洗 3 次，每次冲洗 5 分钟。利用TRITC滤光片在荧光显微镜上可视化图像（见 材料表）。
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Representative Results
为了检查claudin-7对结肠干细胞的调节作用，如上所述从鼠结肠组织中分离结肠隐窝，如图 1A所示。从原代组织中分离出隐窝后，将它们接种在96孔板中的3D基质中以生长11天（图1）。正常健康的隐窝将在第2天关闭管腔并变成球状体，并最终在大约第5天开始出芽并形成各种上皮细胞类型（图1B）。允许结肠类生长到第11天，然后收获它们以进行进一步实验（图1B）。为了敲除培养物中的claudin-7，允许隐窝正常生长24小时。24小时后，用3μmol/ L 4OH-他莫昔芬（TAM）处理隐窝并再培养10天。含有新鲜4OH-TAM的培养基每2天更换一次。DMSO被用作控制井中的载体。Claudin-7缺陷隐窝（claudin-7 KO）未能形成适当的球状体，并在4OH-TAM治疗1天后开始迅速死亡（图1B）。
图2A 突出显示了含有claudin-7（对照）的正常隐窝结肠样蛋白在培养的9天内的成功生长。这些隐窝在第2天开始形成球状体，在第5天开始萌芽，并继续生长和萌芽，直到第9天收获（图2A）。相比之下，缺乏claudin-7（claudin-7 KO）的隐窝恶化得非常快（图2B）。用4OH-TAM处理后约2-3天，claudin-7 KO隐窝没有形成看起来健康的球状体，仅表现为圆形细胞团块（图2B）。用4OH-TAM处理从野生型小鼠中分离的隐窝，以确认他莫昔芬处理没有毒性作用;这些地穴能够正常生存和生长。为了检查claudin-7缺失和claudin-7 KO结肠样的存活条件，使用了免疫染色方法和 原位 细胞死亡检测试剂盒（图3）。收获对照和cKO类器官中claudin-7的免疫荧光染色证实在培养物中成功敲除claudin-7（图3A）。第9天对照结肠表现出很少的凋亡信号（图3B）;然而，claudin-7 KO结肠样显示出高凋亡（图3B）。没有claudin-7，干细胞就无法存活，自我更新或分化形成结肠。
图 1：显示隐窝分离和结肠样生长的示意图。 （A）隐窝分离过程的图形描述，在3D基质中铺板，以及收获前的生长。（B）对照组和claudin-7 KO衍生的隐窝中的实验和结肠生长时间表。请点击此处查看此图的大图。
图 2：Claudin-7 缺陷结肠无法存活和生长 。 （A）第3天和第9天对照/ DMSO类器官的代表性图像。（B）第3天和第9天4OH-TAM/cKO类器官的代表性图像，n = 10。比例尺 = 200 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：Claudin-7 缺陷结肠类化合物迅速发生细胞凋亡。 （A） 第 9 天对照/DMSO 中的 Claudin-7 染色和 claudin-7 cKO/4OH-TAM 类器官，n = 3。比例尺= 250μm。 （B）第9天对照和claudin-7 cKO/4OH-TAM结肠样的凋亡染色，n = 3。比例尺 = 200 μm。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
类器官培养是研究干细胞功能、肠道生理学、药物发现、人类肠道疾病以及组织再生和修复的优秀模型7，8，9，10，11，26。虽然它有很多优点，但建立起来可能具有挑战性。在整个协议的所有步骤中都必须小心，但最重要的是在电镀阶段。将分离的隐窝与凝胶基质混合时，确保上下彻底移液以分解离心后形成的隐窝颗粒，并将隐窝均匀分布在整个基质中。同时，避免在移液时将气泡引入基质中。为此，移液器必须缓慢进行移液，移液器吸头朝向 1.5 mL 管的底部。
此外，在整个过程中，凝胶基质不得完全固化。为防止过早凝固，请小心移液混合，然后将试管放在冰上，并重复此过程。一旦分离的隐窝和凝胶基质充分混合，让凝胶基质部分凝固。此过程可能需要1-5分钟，具体取决于所用凝胶基质的类型/品牌。它必须类似于凝胶，如果管子倾斜会稍微移动，但不应该太流，如果倒置会溢出。此时，可以开始将 10 μL 电镀到每个孔的中心。凝胶基质必须形成3D圆顶，不应接触孔的侧面。如果凝胶基质扩散并撞击孔壁，则其凝固不够;等到它充分凝固形成圆顶，因为如果不形成圆顶，地穴将无法生存和生长。如上所述，一旦电镀正确完成，并且隐窝得到充分补充，类器官有望毫无问题地生长。
该协议建立了具有或不具有claudin-7的结肠类器官系统，以观察其对结肠干细胞存活的影响。虽然结肠类器官培养是一种创新和有利的系统，但该模型仍然存在局限性。根据研究类型，肠道类器官中缺乏免疫细胞和微生物群可能是优点或缺点26。对于本研究，研究claudin-7在没有免疫成分的情况下对干细胞功能的调节作用是有利的。得出的结论是，某种影响是专门归因于claudin-7，而不是其他潜在的变量，例如 体内 动物模型中存在的免疫反应。相反，这个因素可能是其他类型的研究的限制。建立结肠类器官培养也可能比传统的2D细胞系更昂贵和更耗时。然而，它们可以模拟组织的细胞微环境，提供 体内 相关性，比2D细胞培养更能代表组织，并且仍然比动物模型4，7便宜。鉴于肠道类器官培养的广泛应用和巨大潜力，该系统很可能成为全球实验室研究的理想模型。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
这项研究由NIH DK103166资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator | United States Plastic Corp | 78564 | anesthesia chamber |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | AM9261 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 1x Dulbecco’s Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
| 2-methylbutane | Sigma | 277258 | |
| 4% paraformaldehyde | ThermoFisher | J61899.AK | |
| 4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM) | Sigma | 579002 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 70 µm nylon cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96 well culture plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | |
| Claudin-7 anti-murine rabbit antibody | Immuno-Biological Laboratories | 18875 | |
| Cover glass (24 x 50-1.5) | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryomolds | vwr | 25608-916 | |
| Cultrex RCF BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | gel matrix |
| Cy3 anti-rabbit antibody | Jackson Immunoresearch | 111-165-003 | |
| Dewar Flask | Thomas Scientific | 1173F61 | |
| DMEM High Glucose with L-Glutamine | ATCC | 30-2002 | |
| EVOS FLoid Imaging System | ThermoFisher | 4477136 | |
| Fluoro-Gel II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 17985-50 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Glycine | JT Baker | 4059-02 | |
| HEPES (1 M) Buffer Solution | Gibco | 15630-080 | |
| Hoechst | ThermoFisher | 62249 | |
| In situ cell death detection kit, TMR Red | Roche | 12156792910 | |
| Isoflurane | Pivetal | 07-893-8440 | |
| L-WRN Media | Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core | N/A | |
| Mouse surgical kit | Kent Scientific Corporation | INSMOUSEKIT | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-500UG | |
| N2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Sequenza Rack | vwr | 10129-584 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S-279 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Vacuum filter (0.22 µm; cellulose acetate) | Corning | 430769 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 |
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