El presente protocolo describe el establecimiento de un sistema organoide colónico murino para estudiar la actividad y el funcionamiento de las células madre colónicas en un modelo knockout de claudina-7.
El epitelio intestinal se regenera cada 5-7 días, y es controlado por la población de células madre epiteliales intestinales (IESC) ubicada en la parte inferior de la región de la cripta. Las IESC incluyen células madre activas, que se autorrenuevan y se diferencian en varios tipos de células epiteliales, y células madre quiescentes, que sirven como células madre de reserva en caso de lesión. La regeneración del epitelio intestinal está controlada por las capacidades autorrenovadoras y diferenciadoras de estos IESC activos. Además, el equilibrio de la población de células madre de la cripta y el mantenimiento del nicho de células madre son esenciales para la regeneración intestinal. El cultivo de organoides es un enfoque importante y atractivo para estudiar proteínas, moléculas de señalización y señales ambientales que regulan la supervivencia y las funciones de las células madre. Este modelo es menos costoso, consume menos tiempo y es más manipulable que los modelos animales. Los organoides también imitan el microambiente tisular, proporcionando relevancia in vivo . El presente protocolo describe el aislamiento de criptas colónicas, incrustando estas células de cripta aisladas en un sistema de matriz de gel tridimensional y cultivando células de cripta para formar organoides colónicos capaces de autoorganización, proliferación, autorrenovación y diferenciación. Este modelo permite manipular el entorno, eliminando proteínas específicas como la claudina-7, activando / desactivando las vías de señalización, etc., para estudiar cómo estos efectos influyen en el funcionamiento de las células madre del colon. Específicamente, se examinó el papel de la proteína de unión estrecha claudina-7 en la función de las células madre del colon. Claudina-7 es vital para mantener la homeostasis intestinal y la función e integridad de barrera. La eliminación de claudina-7 en ratones induce un fenotipo similar a la enfermedad inflamatoria intestinal que exhibe inflamación intestinal, hiperplasia epitelial, pérdida de peso, ulceraciones de la mucosa, desprendimiento de células epiteliales y adenomas. Anteriormente, se informó que la claudina-7 es necesaria para las funciones de las células madre epiteliales intestinales en el intestino delgado. En este protocolo, se establece un sistema de cultivo de organoides colónicos para estudiar el papel de la claudina-7 en el intestino grueso.
El cultivo de organoides intestinales es un sistema tridimensional (3D) ex vivo en el que las células madre se aíslan de las criptas intestinales del tejido primario y se colocan en una matriz de gel 1,2. Estas células madre son capaces de autorrenovación, autoorganización y funcionalidad de órganos2. Los organoides imitan el microambiente tisular y son más similares a los modelos in vivo que a los modelos de cultivo celular in vitro bidimensionales (2D), aunque menos manipulables que las células 3,4. Este modelo elimina los obstáculos encontrados en los modelos 2D, como la falta de adherencias adecuadas célula-célula, interacciones célula-matriz y poblaciones homogéneas, y también reduce las limitaciones de los modelos animales, incluidos los altos costos y los largos períodos de tiempo5. Los organoides intestinales, también conocidos como colonoides para aquellos cultivados a partir de células madre derivadas de criptas colónicas, son esencialmente miniórganos que contienen un epitelio que incluye todos los tipos de células que estarían presentes in vivo, así como un lumen. Este modelo permite la manipulación del sistema para estudiar muchos aspectos del intestino, como el nicho de células madre, la fisiología intestinal, la fisiopatología y la morfogénesis intestinal 3,5,6. También proporciona un gran modelo para el descubrimiento de fármacos, estudiando trastornos intestinales humanos como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y el cáncer colorrectal, el desarrollo de tratamientos personalizados específicos para el paciente y el estudio de la regeneración de tejidos 4,7,8,9. Además, el sistema organoide también puede ser utilizado para estudiar la comunicación celular, el metabolismo de los fármacos, la viabilidad, la proliferación y la respuesta a estímulos 7,8. Si bien los modelos animales pueden usarse para probar terapias potenciales para afecciones patológicas intestinales, son bastante limitados, ya que estudiar múltiples medicamentos a la vez plantea un desafío. Hay más variables de confusión in vivo, y el costo y el tiempo asociados son altos y largos, respectivamente. Por otro lado, el sistema de cultivo de organoides permite el cribado de muchas terapias a la vez en un período de tiempo más corto y también permite el tratamiento personalizado mediante el uso del cultivo de organoides derivado del paciente 4,8. La capacidad de los organoides colónicos para imitar la organización tisular, el microambiente y la funcionalidad también los convierte en un excelente modelo para estudiar la regeneración y la reparación de tejidos9. Nuestro laboratorio ha establecido un sistema de cultivo de organoides del intestino delgado para estudiar el efecto de la claudina-7 en las funciones de las células madre del intestino delgado10. En este estudio, se establece un sistema de cultivo de organoides del intestino grande para estudiar la capacidad o falta de capacidad de las células madre para autorrenovarse, diferenciarse y proliferar en un modelo de knockout condicional de claudina-7 (cKO).
La claudina-7 es una proteína de unión estrecha (TJ) muy importante que se expresa altamente en el intestino y es esencial para mantener la función e integridad de TJ11. Los ratones cKO sufren de un fenotipo similar a la EII, exhibiendo inflamación severa, ulceraciones, desprendimiento de células epiteliales, adenomas y aumento de los niveles de citoquinas11,12. Si bien es ampliamente aceptado que las claudinas son vitales para la función de barrera epitelial, están surgiendo nuevos roles para las claudinas; Están involucrados en la proliferación, migración, progresión del cáncer y función de las células madre 10,12,13,14,15,16,17. Actualmente se desconoce cómo la claudina-7 afecta el nicho de células madre y la función de las células madre del colon. Como el intestino se renueva rápidamente aproximadamente cada 5-7 días, el mantenimiento del nicho de células madre y el funcionamiento adecuado de las células madre activas es vital18. Aquí, se establece un sistema para examinar los posibles efectos reguladores de la claudina-7 en el nicho de células madre del colon.
El cultivo de organoides es un excelente modelo para estudiar la función de las células madre, la fisiología intestinal, el descubrimiento de fármacos, las enfermedades intestinales humanas y la regeneración y reparación de tejidos 7,8,9,10,11,26. Si bien tiene muchas ventajas, puede ser difícil de establecer. Se debe …
The authors have nothing to disclose.
Este estudio fue financiado por NIH DK103166.
0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator | United States Plastic Corp | 78564 | anesthesia chamber |
0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | AM9261 | |
1.5 mL microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
15 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
1x Dulbecco’s Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
2-methylbutane | Sigma | 277258 | |
4% paraformaldehyde | ThermoFisher | J61899.AK | |
4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM) | Sigma | 579002 | |
50 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
70 µm nylon cell strainer | Corning | 352350 | |
96 well culture plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
B-27 Supplement (50x) | Gibco | 12587-010 | |
Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | |
Claudin-7 anti-murine rabbit antibody | Immuno-Biological Laboratories | 18875 | |
Cover glass (24 x 50-1.5) | Fisher Scientific | 12544E | |
Cryomolds | vwr | 25608-916 | |
Cultrex RCF BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | gel matrix |
Cy3 anti-rabbit antibody | Jackson Immunoresearch | 111-165-003 | |
Dewar Flask | Thomas Scientific | 1173F61 | |
DMEM High Glucose with L-Glutamine | ATCC | 30-2002 | |
EVOS FLoid Imaging System | ThermoFisher | 4477136 | |
Fluoro-Gel II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 17985-50 | |
GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
Glycine | JT Baker | 4059-02 | |
HEPES (1 M) Buffer Solution | Gibco | 15630-080 | |
Hoechst | ThermoFisher | 62249 | |
In situ cell death detection kit, TMR Red | Roche | 12156792910 | |
Isoflurane | Pivetal | 07-893-8440 | |
L-WRN Media | Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core | N/A | |
Mouse surgical kit | Kent Scientific Corporation | INSMOUSEKIT | |
Murine EGF | PeproTech | 315-09-500UG | |
N2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
Optimum cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Sequenza Rack | vwr | 10129-584 | |
Sodium Citrate | Fisher Scientific | S-279 | |
Sucrose | Sigma | S9378 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | |
Vacuum filter (0.22 µm; cellulose acetate) | Corning | 430769 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 |