Summary

생체 장내 줄기세포 기능을 연구하기 위한 쥐 결장 음와의 3차원 배양

Published: October 11, 2022
doi:

Summary

본 프로토콜은 claudin-7 녹아웃 모델에서 결장 줄기 세포의 활성 및 기능을 연구하기 위해 쥐 결장 오가노이드 시스템을 확립하는 것을 설명합니다.

Abstract

장 상피는 5-7 일마다 재생되며 음낭 부위의 바닥에 위치한 장 상피 줄기 세포 (IESC) 집단에 의해 제어됩니다. IESC에는 자체 재생되어 다양한 상피 세포 유형으로 분화하는 활성 줄기 세포와 손상시 예비 줄기 세포 역할을하는 정지 줄기 세포가 포함됩니다. 장 상피의 재생은 이러한 활성 IESC의 자체 재생 및 분화 능력에 의해 제어됩니다. 또한, 지하실 줄기 세포 집단의 균형과 줄기 세포 틈새의 유지는 장 재생에 필수적입니다. 오가노이드 배양은 줄기 세포의 생존과 기능을 조절하는 단백질, 신호 분자 및 환경 신호를 연구하는 데 중요하고 매력적인 접근 방식입니다. 이 모델은 동물 모델보다 저렴하고 시간이 덜 걸리며 조작이 가능합니다. 오가노이드는 또한 조직 미세 환경을 모방하여 생체 내 관련성을 제공합니다. 본 프로토콜은 결장 종루의 분리, 이러한 분리된 종와를 3차원 겔 매트릭스 시스템에 매립하고 자가조직화, 증식, 자가 재생 및 분화가 가능한 결장 오가노이드를 형성하기 위해 종와세포를 배양하는 방법을 설명합니다. 이 모델을 통해 claudin-7과 같은 특정 단백질을 녹아웃하고 신호 경로를 활성화 / 비활성화하는 등 환경을 조작하여 이러한 효과가 결장 줄기 세포의 기능에 어떻게 영향을 미치는지 연구 할 수 있습니다. 구체적으로, 결장 줄기세포 기능에서 밀착접합 단백질 claudin-7의 역할을 조사하였다. Claudin-7은 장 항상성과 장벽 기능 및 무결성을 유지하는 데 필수적입니다. 마우스에서 claudin-7의 녹아웃은 장 염증, 상피 증식, 체중 감소, 점막 궤양, 상피 세포 슬라우킹 및 선종을 나타내는 염증성 장 질환 유사 표현형을 유도합니다. 이전에는 claudin-7이 소장에서 장 상피 줄기 세포 기능에 필요한 것으로보고되었습니다. 이 프로토콜에서는 대장에서 claudin-7의 역할을 연구하기 위해 결장 오가노이드 배양 시스템이 구축됩니다.

Introduction

장 오가노이드 배양은 줄기 세포를 일차 조직의 장 음와에서 분리하고 겔 매트릭스 1,2로 도금하는 3차원(3D) 생체 외 시스템입니다. 이 줄기 세포는자가 재생,자가 조직 및 장기 기능이 가능합니다2. 오가노이드는 조직 미세 환경을 모방하고 세포 3,4보다 조작이 적지 만 2 차원 (2D) 시험관 내 세포 배양 모델보다 생체 내 모델과 더 유사합니다. 이 모델은 적절한 세포-세포 유착, 세포-매트릭스 상호 작용 및 균질 개체군의 부족과 같은 2D 모델에서 발생하는 장애물을 제거하고 높은 비용과긴 기간을 포함하여 동물 모델의 한계를 줄입니다5. 장내 오가노이드(결장 토굴 유래 줄기 세포에서 성장한 경우 콜로노이드라고도 함)는 본질적으로 생체 내에 존재하는 모든 세포 유형과 내강을 포함하는 상피를 포함하는 미니 기관입니다. 이 모델을 사용하면 시스템을 조작하여 줄기 세포 틈새, 장 생리학, 병태 생리학 및 장 형태 형성 3,5,6과 같은 장의 여러 측면을 연구 할 수 있습니다. 또한 약물 발견, 염증성 장 질환 (IBD) 및 대장 암과 같은 인간 장 질환 연구, 환자 별 개인화 된 치료 개발 및 조직 재생 4,7,8,9 연구를위한 훌륭한 모델을 제공합니다. 또한 오가노이드 시스템은 세포 통신, 약물 대사, 생존력, 증식 및 자극에 대한 반응을 연구하는 데에도 사용할수 있습니다7,8. 동물 모델은 장 병리학적 상태에 대한 잠재적인 치료제를 테스트하는 데 사용될 수 있지만 한 번에 여러 약물을 연구하는 것이 어려울 수 있으므로 매우 제한적입니다. 생체 내에는 더 많은 교란 변수가 있으며 관련 비용과 시간은 각각 높고 길다. 반면에, 오가노이드 배양 시스템은 더 짧은 기간에 한 번에 많은 치료제의 스크리닝을 허용하고, 또한 환자 유래 오가노이드 배양 4,8의 사용을 통해 개인화된 치료를 가능하게 한다. 결장 오가노이드가 조직 조직, 미세 환경 및 기능을 모방하는 능력은 또한 재생 및조직 복구를 연구하기 위한 훌륭한 모델입니다9. 우리 연구실은 소장 줄기 세포 기능에 대한 claudin-7의 효과를 연구하기 위해 소장 오가노이드 배양 시스템을 구축했습니다10. 이 연구에서는 조건부 claudin-7 녹아웃(cKO) 모델에서 줄기세포의 자가 갱신, 분화 및 증식 능력 또는 능력 부족을 연구하기 위해 대장 오가노이드 배양 시스템을 구축했습니다.

Claudin-7은 장에서 고도로 발현되고 TJ 기능 및 무결성11을 유지하는 데 필수적인 매우 중요한 단단한 접합 (TJ) 단백질입니다. cKO 마우스는 IBD 유사 표현형을 앓고 있으며 심각한 염증, 궤양, 상피 세포 슬라우링, 선종 및 증가된 사이토카인 수치11,12를 나타냅니다. 클로딘이 상피 장벽 기능에 필수적이라는 것은 널리 받아 들여지고 있지만, 클로딘의 새로운 역할이 등장하고 있습니다. 그들은 증식, 이동, 암 진행 및 줄기 세포 기능 10,12,13,14,15,16,17에 관여합니다. claudin-7이 줄기 세포 틈새와 결장 줄기 세포의 기능에 어떤 영향을 미치는지는 현재 알려져 있지 않습니다. 장이 약 5-7 일마다 빠르게 자체 재생되기 때문에 줄기 세포 틈새의 유지와 활성 줄기 세포의 적절한 기능이 중요합니다18. 여기에서는 결장 줄기 세포 틈새에 대한 claudin-7의 잠재적 인 조절 효과를 조사하기위한 시스템이 구축됩니다.

Protocol

모든 동물 실험 및 절차는 이스트 캐롤라이나 대학교 (ECU) 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았으며 실험실 동물 관리 및 사용에 관한 국립 보건원 및 ECU의 지침에 따라 수행되었습니다. 유도성, 장 특이적 클로딘-7 녹아웃 마우스를 C57BL6 클로딘-7-플록스 형질전환 마우스와 Villin-CreERT2 마우스19를 교배시킴으로써 생성하였다. 3개월령의 수컷 및 암컷 마우스를 본 연구에 ?…

Representative Results

결장 줄기 세포에 대한 claudin-7의 조절 효과를 조사하기 위해, 결장 음와를 상기 기재된 바와 같이 뮤린 결장 조직으로부터 분리하고 도 1A에 나타내었다. 지하실이 1차 조직에서 분리되면 96웰 플레이트의 3D 매트릭스에 도말하여 11일 동안 성장시켰습니다(그림 1). 정상적인 건강한 음와(Crypt)는 2일째에 내강을 닫고 스페로이드가 되며 결국 약 5일째에 다…

Discussion

오가노이드 배양은 줄기 세포 기능, 장 생리학, 약물 발견, 인간 장 질환, 조직 재생 및 복구 7,8,9,10,11,26을 연구하기 위한 훌륭한 모델입니다. 많은 장점이 있지만 설정하기가 어려울 수 있습니다. 프로토콜 전체의 모든 단계에서 주의를 기울여야 하…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 NIH DK103166의 자금 지원을 받았습니다.

Materials

0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator  United States Plastic Corp 78564 anesthesia chamber
0.5 M EDTA pH 8.0 Invitrogen AM9261
1.5 mL microcentrifuge tubes ThermoFisher 69715
15 mL conical centrifuge tubes Fisher Scientific 14-959-53A
1x Dulbecco’s Phosphate buffered saline Gibco 14190-144
2-methylbutane Sigma 277258
4% paraformaldehyde ThermoFisher J61899.AK
4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM) Sigma 579002
50 mL conical centrifuge tubes Fisher Scientific 14-432-22
70 µm nylon cell strainer Corning 352350
96 well culture plate Greiner Bio-One 655180
B-27 Supplement (50x) Gibco 12587-010
Bovine serum albumin Fisher Scientific BP1605-100
Claudin-7 anti-murine rabbit antibody Immuno-Biological Laboratories  18875
Cover glass (24 x 50-1.5) Fisher Scientific 12544E
Cryomolds vwr 25608-916
Cultrex RCF BME, Type 2 R&D Systems 3533-005-02 gel matrix
Cy3 anti-rabbit antibody Jackson Immunoresearch 111-165-003
Dewar Flask Thomas Scientific 1173F61
DMEM High Glucose with L-Glutamine ATCC 30-2002
EVOS FLoid Imaging System ThermoFisher 4477136
Fluoro-Gel II with DAPI Electron Microscopy Sciences 17985-50
GlutaMAX (100x) Gibco 35050-061
Glycine JT Baker 4059-02
HEPES (1 M) Buffer Solution Gibco 15630-080
Hoechst ThermoFisher 62249
In situ cell death detection kit, TMR Red Roche 12156792910
Isoflurane Pivetal 07-893-8440
L-WRN Media Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core N/A
Mouse surgical kit Kent Scientific Corporation INSMOUSEKIT
Murine EGF PeproTech 315-09-500UG
N2 Supplement (100x) Gibco 17502-048
Optimum cutting temperature (OCT) compound  Agar Scientific AGR1180
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Sequenza Rack vwr 10129-584
Sodium Citrate Fisher Scientific S-279
Sucrose Sigma S9378
Triton X-100 Sigma X100
Vacuum filter (0.22 µm; cellulose acetate) Corning 430769
Y-27632 dihydrochloride Tocris Bioscience 1254

References

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Cite This Article
Naser, A. N., Lu, Q., Chen, Y. Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo. J. Vis. Exp. (188), e64534, doi:10.3791/64534 (2022).

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