생체 외 장내 줄기세포 기능을 연구하기 위한 쥐 결장 음와의 3차원 배양
Summary
본 프로토콜은 claudin-7 녹아웃 모델에서 결장 줄기 세포의 활성 및 기능을 연구하기 위해 쥐 결장 오가노이드 시스템을 확립하는 것을 설명합니다.
Abstract
장 상피는 5-7 일마다 재생되며 음낭 부위의 바닥에 위치한 장 상피 줄기 세포 (IESC) 집단에 의해 제어됩니다. IESC에는 자체 재생되어 다양한 상피 세포 유형으로 분화하는 활성 줄기 세포와 손상시 예비 줄기 세포 역할을하는 정지 줄기 세포가 포함됩니다. 장 상피의 재생은 이러한 활성 IESC의 자체 재생 및 분화 능력에 의해 제어됩니다. 또한, 지하실 줄기 세포 집단의 균형과 줄기 세포 틈새의 유지는 장 재생에 필수적입니다. 오가노이드 배양은 줄기 세포의 생존과 기능을 조절하는 단백질, 신호 분자 및 환경 신호를 연구하는 데 중요하고 매력적인 접근 방식입니다. 이 모델은 동물 모델보다 저렴하고 시간이 덜 걸리며 조작이 가능합니다. 오가노이드는 또한 조직 미세 환경을 모방하여 생체 내 관련성을 제공합니다. 본 프로토콜은 결장 종루의 분리, 이러한 분리된 종와를 3차원 겔 매트릭스 시스템에 매립하고 자가조직화, 증식, 자가 재생 및 분화가 가능한 결장 오가노이드를 형성하기 위해 종와세포를 배양하는 방법을 설명합니다. 이 모델을 통해 claudin-7과 같은 특정 단백질을 녹아웃하고 신호 경로를 활성화 / 비활성화하는 등 환경을 조작하여 이러한 효과가 결장 줄기 세포의 기능에 어떻게 영향을 미치는지 연구 할 수 있습니다. 구체적으로, 결장 줄기세포 기능에서 밀착접합 단백질 claudin-7의 역할을 조사하였다. Claudin-7은 장 항상성과 장벽 기능 및 무결성을 유지하는 데 필수적입니다. 마우스에서 claudin-7의 녹아웃은 장 염증, 상피 증식, 체중 감소, 점막 궤양, 상피 세포 슬라우킹 및 선종을 나타내는 염증성 장 질환 유사 표현형을 유도합니다. 이전에는 claudin-7이 소장에서 장 상피 줄기 세포 기능에 필요한 것으로보고되었습니다. 이 프로토콜에서는 대장에서 claudin-7의 역할을 연구하기 위해 결장 오가노이드 배양 시스템이 구축됩니다.
Introduction
장 오가노이드 배양은 줄기 세포를 일차 조직의 장 음와에서 분리하고 겔 매트릭스 1,2로 도금하는 3차원(3D) 생체 외 시스템입니다. 이 줄기 세포는자가 재생,자가 조직 및 장기 기능이 가능합니다2. 오가노이드는 조직 미세 환경을 모방하고 세포 3,4보다 조작이 적지 만 2 차원 (2D) 시험관 내 세포 배양 모델보다 생체 내 모델과 더 유사합니다. 이 모델은 적절한 세포-세포 유착, 세포-매트릭스 상호 작용 및 균질 개체군의 부족과 같은 2D 모델에서 발생하는 장애물을 제거하고 높은 비용과긴 기간을 포함하여 동물 모델의 한계를 줄입니다5. 장내 오가노이드(결장 토굴 유래 줄기 세포에서 성장한 경우 콜로노이드라고도 함)는 본질적으로 생체 내에 존재하는 모든 세포 유형과 내강을 포함하는 상피를 포함하는 미니 기관입니다. 이 모델을 사용하면 시스템을 조작하여 줄기 세포 틈새, 장 생리학, 병태 생리학 및 장 형태 형성 3,5,6과 같은 장의 여러 측면을 연구 할 수 있습니다. 또한 약물 발견, 염증성 장 질환 (IBD) 및 대장 암과 같은 인간 장 질환 연구, 환자 별 개인화 된 치료 개발 및 조직 재생 4,7,8,9 연구를위한 훌륭한 모델을 제공합니다. 또한 오가노이드 시스템은 세포 통신, 약물 대사, 생존력, 증식 및 자극에 대한 반응을 연구하는 데에도 사용할수 있습니다7,8. 동물 모델은 장 병리학적 상태에 대한 잠재적인 치료제를 테스트하는 데 사용될 수 있지만 한 번에 여러 약물을 연구하는 것이 어려울 수 있으므로 매우 제한적입니다. 생체 내에는 더 많은 교란 변수가 있으며 관련 비용과 시간은 각각 높고 길다. 반면에, 오가노이드 배양 시스템은 더 짧은 기간에 한 번에 많은 치료제의 스크리닝을 허용하고, 또한 환자 유래 오가노이드 배양 4,8의 사용을 통해 개인화된 치료를 가능하게 한다. 결장 오가노이드가 조직 조직, 미세 환경 및 기능을 모방하는 능력은 또한 재생 및조직 복구를 연구하기 위한 훌륭한 모델입니다9. 우리 연구실은 소장 줄기 세포 기능에 대한 claudin-7의 효과를 연구하기 위해 소장 오가노이드 배양 시스템을 구축했습니다10. 이 연구에서는 조건부 claudin-7 녹아웃(cKO) 모델에서 줄기세포의 자가 갱신, 분화 및 증식 능력 또는 능력 부족을 연구하기 위해 대장 오가노이드 배양 시스템을 구축했습니다.
Claudin-7은 장에서 고도로 발현되고 TJ 기능 및 무결성11을 유지하는 데 필수적인 매우 중요한 단단한 접합 (TJ) 단백질입니다. cKO 마우스는 IBD 유사 표현형을 앓고 있으며 심각한 염증, 궤양, 상피 세포 슬라우링, 선종 및 증가된 사이토카인 수치11,12를 나타냅니다. 클로딘이 상피 장벽 기능에 필수적이라는 것은 널리 받아 들여지고 있지만, 클로딘의 새로운 역할이 등장하고 있습니다. 그들은 증식, 이동, 암 진행 및 줄기 세포 기능 10,12,13,14,15,16,17에 관여합니다. claudin-7이 줄기 세포 틈새와 결장 줄기 세포의 기능에 어떤 영향을 미치는지는 현재 알려져 있지 않습니다. 장이 약 5-7 일마다 빠르게 자체 재생되기 때문에 줄기 세포 틈새의 유지와 활성 줄기 세포의 적절한 기능이 중요합니다18. 여기에서는 결장 줄기 세포 틈새에 대한 claudin-7의 잠재적 인 조절 효과를 조사하기위한 시스템이 구축됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
오가노이드 배양은 줄기 세포 기능, 장 생리학, 약물 발견, 인간 장 질환, 조직 재생 및 복구 7,8,9,10,11,26을 연구하기 위한 훌륭한 모델입니다. 많은 장점이 있지만 설정하기가 어려울 수 있습니다. 프로토콜 전체의 모든 단계에서 주의를 기울여야 하…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 NIH DK103166의 자금 지원을 받았습니다.
Materials
| 0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator | United States Plastic Corp | 78564 | anesthesia chamber |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | AM9261 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 1x Dulbecco’s Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
| 2-methylbutane | Sigma | 277258 | |
| 4% paraformaldehyde | ThermoFisher | J61899.AK | |
| 4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM) | Sigma | 579002 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 70 µm nylon cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96 well culture plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | |
| Claudin-7 anti-murine rabbit antibody | Immuno-Biological Laboratories | 18875 | |
| Cover glass (24 x 50-1.5) | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryomolds | vwr | 25608-916 | |
| Cultrex RCF BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | gel matrix |
| Cy3 anti-rabbit antibody | Jackson Immunoresearch | 111-165-003 | |
| Dewar Flask | Thomas Scientific | 1173F61 | |
| DMEM High Glucose with L-Glutamine | ATCC | 30-2002 | |
| EVOS FLoid Imaging System | ThermoFisher | 4477136 | |
| Fluoro-Gel II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 17985-50 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Glycine | JT Baker | 4059-02 | |
| HEPES (1 M) Buffer Solution | Gibco | 15630-080 | |
| Hoechst | ThermoFisher | 62249 | |
| In situ cell death detection kit, TMR Red | Roche | 12156792910 | |
| Isoflurane | Pivetal | 07-893-8440 | |
| L-WRN Media | Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core | N/A | |
| Mouse surgical kit | Kent Scientific Corporation | INSMOUSEKIT | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-500UG | |
| N2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Sequenza Rack | vwr | 10129-584 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S-279 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Vacuum filter (0.22 µm; cellulose acetate) | Corning | 430769 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 |
References
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Wallach, T. E., Bayrer, J. R. Intestinal organoids: new frontiers in the study of intestinal disease and physiology. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 180-185 (2017).
- Shankaran, A., Prasad, K., Chaudhari, S., Brand, A., Satyamoorthy, K. Advances in development and application of human organoids. 3 Biotech. 11 (6), 257 (2021).
- Angus, H., Butt, A., Schultz, M., Kemp, R. Intestinal organoids as a tool for inflammatory bowel disease research. Frontiers in Medicine. 6, 334 (2020).
- Fan, Y., Davidson, L. A., Chapkin, R. S. Murine colonic organoid culture system and down stream assay applications. Methods in Molecular Biology. 1576, 171-181 (2019).
- Gupta, N., et al. Microfluidics-based 3D cell culture models: Utility in novel drug discovery and delivery research. Bioengineering and Translational Medicine. 1 (1), 63-81 (2016).
- Yoo, J., Donowitz, M. Intesitnal enteroids/organoids: A novel platform for drug discovery in inflammatory bowel diseases. World Journal of Gastroenterology. 25 (30), 4125-4147 (2019).
- Qu, M., et al. Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration. Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).
- Xing, T., et al. Tight junction protein claudin-7 is essential for intestinal epithelial stem cell self-renewal and differentiation. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 641-659 (2020).
- Ding, L., et al. Inflammation and disruption of the mucosal architecture in claudin-7-deficient mice. Gastroenterology. 142 (2), 305-315 (2012).
- Lu, Z., Ding, L., Lu, Q., Chen, Y. H. Claudins in intestines: distribution and functional significance in health and diseases. Tissue Barriers. 1 (3), 24978 (2013).
- Ding, L., Lu, Z., Lu, Q., Chen, Y. H. The claudin family of proteins in human malignancy: a clinical perspective. Cancer Management and Research. 5, 367-375 (2013).
- Bhat, A. A., et al. Claudin-7 expression induces mesenchymal to epithelial transformation (MET) to inhibit colon tumorigenesis. Oncogene. 34 (35), 4570-4580 (2015).
- Lu, Z., et al. A non-tight junction function of claudin-7-interaction with integrin signaling in suppressing lung cancer cell proliferation and detachement. Molecular Cancer. 14, 120 (2015).
- Wang, K., Xu, C., Li, W., Ding, L. Emerging clinical significance of claudin-7 in colorectal cancer: a review. Cancer Management and Research. 10, 3741-3752 (2018).
- Wang, K., et al. Claudin-7 downregulation induces metastasis and invasion in colorectal cancer via the promotion of epithelial-mesenchymal transition. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (3), 797-804 (2019).
- Wang, F., et al. Isolation and characterization of intestinal stem cells based on surface marker combinations and colony-formation assay. Gastroenterology. 145 (2), 383 (2013).
- Li, W., et al. Severe intestinal inflammation in the small intestine of mice induced by controllable deletion of claudin-7. Digestive Diseases and Sciences. 63 (5), 1200-1209 (2018).
- Donovan, J., Brown, P. Euthanasia. Current Protocols in Immunology. 73 (1), (2006).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. Journal of Visual Experiments. (80), e50611 (2013).
- Sugimoto, K., et al. Cell adhesion signals regulate the nuclear receptor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (49), 24600-24609 (2019).
- Mansour, H., et al. Connexin 30 expression and frewuency of connexin heterogeneity in astrocyte gap junction plaques increase with age in the rat retina. PLoS One. 8 (3), 57038 (2013).
- Miranda, M., et al. Antioxidants rescue photoreceptors in rd1 mice: relationship with thiol metabolism. Free Radical Biology and Medicine. 48 (2), 216-222 (2010).
- Wang, L., et al. Mesenchymal stromal cells ameliorate oxidative stress-induced islet endothelium apoptosis and functional impairment via Wnt4-β-catenin signaling. Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 188 (2017).
- Almeqdadi, M., Mana, M., Roper, J., Yilmaz, O. Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).
