Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल एक क्लॉडिन -7 नॉकआउट मॉडल में कोलोनिक स्टेम कोशिकाओं की गतिविधि और कामकाज का अध्ययन करने के लिए एक मुराइन कोलोनिक ऑर्गेनॉइड सिस्टम स्थापित करने का वर्णन करता है।
Abstract
आंतों का एपिथेलियम हर 5-7 दिनों में पुनर्जीवित होता है, और क्रिप्ट क्षेत्र के तल पर स्थित आंतों के उपकला स्टेम सेल (आईईएससी) आबादी द्वारा नियंत्रित होता है। आईईएससी में सक्रिय स्टेम सेल शामिल हैं, जो विभिन्न उपकला कोशिका प्रकारों में आत्म-नवीनीकरण और अंतर करते हैं, और क्विसेंट स्टेम सेल, जो चोट के मामले में आरक्षित स्टेम कोशिकाओं के रूप में काम करते हैं। आंतों के उपकला का पुनर्जनन इन सक्रिय आईईएससी की आत्म-नवीनीकरण और विभेदक क्षमताओं द्वारा नियंत्रित किया जाता है। इसके अलावा, क्रिप्ट स्टेम सेल आबादी का संतुलन और आंतों के उत्थान के लिए स्टेम सेल आला का रखरखाव आवश्यक है। ऑर्गेनॉइड संस्कृति प्रोटीन, सिग्नलिंग अणुओं और पर्यावरणीय संकेतों का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण और आकर्षक दृष्टिकोण है जो स्टेम सेल अस्तित्व और कार्यों को नियंत्रित करता है। यह मॉडल पशु मॉडल की तुलना में कम महंगा, कम समय लेने वाला और अधिक मैनिपुलेटेबल है। ऑर्गेनोइड्स ऊतक माइक्रोएन्वायरमेंट की नकल भी करते हैं, जो विवो प्रासंगिकता प्रदान करते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल कोलोनिक क्रिप्ट्स के अलगाव का वर्णन करता है, इन पृथक क्रिप्ट कोशिकाओं को तीन आयामी जेल मैट्रिक्स सिस्टम में एम्बेड करता है और स्व-संगठन, प्रसार, आत्म-नवीकरण और भेदभाव में सक्षम कोलोनिक ऑर्गेनोइड बनाने के लिए क्रिप्ट कोशिकाओं की खेती करता है। यह मॉडल किसी को पर्यावरण-दस्तक देने वाले विशिष्ट प्रोटीन जैसे क्लाउडिन -7, सिग्नलिंग मार्गों को सक्रिय / निष्क्रिय करने आदि में हेरफेर करने की अनुमति देता है - यह अध्ययन करने के लिए कि ये प्रभाव कोलोनिक स्टेम कोशिकाओं के कामकाज को कैसे प्रभावित करते हैं। विशेष रूप से, कोलोनिक स्टेम सेल फ़ंक्शन में तंग जंक्शन प्रोटीन क्लॉडिन -7 की भूमिका की जांच की गई थी। क्लॉडिन -7 आंतों के होमियोस्टैसिस और बाधा कार्य और अखंडता को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। चूहों में क्लॉडिन -7 का नॉकआउट आंतों की सूजन, उपकला हाइपरप्लासिया, वजन घटाने, म्यूकोसल अल्सरेशन, उपकला कोशिका सूजन और एडेनोमा का प्रदर्शन करने वाले सूजन आंत्र रोग जैसे फेनोटाइप को प्रेरित करता है। इससे पहले, यह बताया गया था कि छोटी आंत में आंतों के उपकला स्टेम सेल कार्यों के लिए क्लॉडिन -7 की आवश्यकता होती है। इस प्रोटोकॉल में, बड़ी आंत में क्लॉडिन -7 की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक कोलोनिक ऑर्गेनॉइड कल्चर सिस्टम स्थापित किया गया है।
Introduction
आंतों के ऑर्गेनॉइड कल्चर एक त्रि-आयामी (3 डी) एक्स विवो सिस्टम है जिसमें स्टेम कोशिकाओं को प्राथमिक ऊतक के आंतों के क्रिप्ट से अलग किया जाता है और जेल मैट्रिक्स 1,2 में चढ़ाया जाता है। ये स्टेम सेल आत्म-नवीकरण, आत्म-संगठन और अंग कार्यक्षमतामें सक्षम हैं। ऑर्गेनोइड्स ऊतक माइक्रोएन्वायरमेंट की नकल करते हैं और विट्रो सेल कल्चर मॉडल में दो-आयामी (2 डी) की तुलना में विवो मॉडल में अधिक समान होते हैं, हालांकि कोशिकाओं 3,4 की तुलना में कम मैनिपुलेटेबल होते हैं। यह मॉडल 2 डी मॉडल में आने वाली बाधाओं को समाप्त करता है, जैसे कि उचित सेल-सेल आसंजन, सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन और समरूप आबादी की कमी, और पशु मॉडल की सीमाओं को भी कम करता है, जिसमें उच्च लागत और समय की लंबी अवधिशामिल है। आंतों के ऑर्गेनोइड्स - जिन्हें कोलोनिक क्रिप्ट-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं से उगाए गए लोगों के लिए कोलोनोइड्स के रूप में भी जाना जाता है- अनिवार्य रूप से मिनी-अंग होते हैं जिनमें सभी सेल प्रकारों सहित एक उपकला होती है जो विवो में मौजूद होगी, साथ ही साथ एक लुमेन भी। यह मॉडल आंत के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए सिस्टम के हेरफेर की अनुमति देता है, जैसे कि स्टेम सेल आला, आंतों के शरीर विज्ञान, पैथोफिज़ियोलॉजी, और आंत मोर्फोजेनेसिस 3,5,6। यह दवा की खोज के लिए एक महान मॉडल भी प्रदान करता है, मानव आंतों के विकारों जैसे सूजन आंत्र रोग (आईबीडी) और कोलोरेक्टल कैंसर, रोगी-विशिष्ट व्यक्तिगत उपचार विकास और ऊतक पुनर्जनन 4,7,8,9 का अध्ययन करता है। इसके अलावा, ऑर्गेनॉइड सिस्टम का उपयोग सेलुलर संचार, दवा चयापचय, व्यवहार्यता, प्रसार औरउत्तेजनाओं की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है। जबकि पशु मॉडल का उपयोग आंतों की पैथोलॉजिकल स्थितियों के लिए संभावित चिकित्सीय का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है, वे काफी सीमित हैं, क्योंकि एक बार में कई दवाओं का अध्ययन करना एक चुनौती है। विवो में अधिक भ्रामक चर हैं, और संबंधित लागत और समय क्रमशः उच्च और लंबे हैं। दूसरी ओर, ऑर्गेनॉइड कल्चर सिस्टम कम समय अवधि में एक बार में कई चिकित्सीय की स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है और रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड कल्चर 4,8 के उपयोग के माध्यम से व्यक्तिगत उपचार की भी अनुमति देता है। ऊतक संगठन, माइक्रोएन्वायरमेंट और कार्यक्षमता की नकल करने के लिए कोलोनिक ऑर्गेनोइड्स की क्षमता भी उन्हें पुनर्जनन औरऊतक की मरम्मत का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल बनाती है। हमारी प्रयोगशाला ने छोटी आंत स्टेम सेल कार्यों 10 पर क्लॉडिन -7 के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक छोटी आंत ऑर्गेनॉइड कल्चर सिस्टम स्थापितकिया है। इस अध्ययन में, स्टेम कोशिकाओं की क्षमता, या क्षमता की कमी का अध्ययन करने के लिए एक बड़ी आंतों की ऑर्गेनॉइड संस्कृति प्रणाली स्थापित की गई है, जो सशर्त क्लॉडिन -7 नॉकआउट (सीकेओ) मॉडल में आत्म-नवीनीकरण, अंतर और प्रसार के लिए है।
क्लॉडिन -7 एक बहुत ही महत्वपूर्ण तंग जंक्शन (टीजे) प्रोटीन है जो आंत में अत्यधिक व्यक्त किया जाता है और टीजे फ़ंक्शन और अखंडताको बनाए रखने के लिए आवश्यक है। सीकेओ चूहे आईबीडी जैसे फेनोटाइप से पीड़ित हैं, जो गंभीर सूजन, अल्सरेशन, उपकला कोशिका स्लॉइंग, एडेनोमा और साइटोकिन स्तर11,12 में वृद्धि का प्रदर्शन करते हैं। हालांकि यह व्यापक रूप से स्वीकार किया जाता है कि क्लैडिन उपकला बाधा समारोह के लिए महत्वपूर्ण हैं, क्लॉडिन के लिए नई भूमिकाएं उभर रही हैं; वे प्रसार, प्रवासन, कैंसर की प्रगति और स्टेम सेल फ़ंक्शन 10,12,13,14,15,16,17 में शामिल हैं। वर्तमान में यह अज्ञात है कि क्लॉडिन -7 स्टेम सेल आला और कोलोनिक स्टेम कोशिकाओं के कार्य को कैसे प्रभावित करता है। चूंकि आंत लगभग हर 5-7 दिनों में तेजी से स्व-नवीनीकरण करती है, स्टेम सेल आला का रखरखाव और सक्रिय स्टेम कोशिकाओं का उचितकार्य महत्वपूर्ण है। यहां, कोलोनिक स्टेम सेल आला पर क्लॉडिन -7 के संभावित नियामक प्रभावों की जांच करने के लिए एक प्रणाली स्थापित की गई है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
सभी पशु प्रयोगों और प्रक्रियाओं को ईस्ट कैरोलिना यूनिवर्सिटी (ईसीयू) पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था और प्रयोगशाला पशु देखभाल और उपयोग पर राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान और ईसीयू के दिशानिर्देशों के अनुपालन में आयोजित किया गया था। इंड्यूसेबल, आंतों-विशिष्ट क्लॉडिन -7 नॉकआउट चूहों को विल्लिन-सीआरईआरटी 2 चूहों के साथ सी 57बीएल 6 क्लाउडिन -7-फ्लोक्स ट्रांसजेनिक चूहों को पार करके उत्पन्नकिया गया था। इस अध्ययन में 3 महीने की उम्र के नर और मादा चूहों का इस्तेमाल किया गया था।
1. अभिकर्मक / उपकरण तैयार करना
- अपने संबंधित प्रयोगों को शुरू करने से पहले निम्नलिखित अभिकर्मकों / उपकरणों को ठंडा करें: क्रिप्ट अलगाव के दौरान बृहदान्त्र ऊतक को धोने के लिए फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस); उपकला पृथक्करण मीडिया के साथ इनक्यूबेशन के लिए एक रॉकर / रोटेटर (4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में जगह)।
- जेल मैट्रिक्स ( सामग्री की तालिका देखें) को -20 डिग्री सेल्सियस से हटा दें और चढ़ाना से पहले बर्फ पर पिघलाएं।
- प्लेटिंग के लिए क्रिप्ट्स को घुमाने से पहले सेंट्रीफ्यूज को 4 डिग्री सेल्सियस तक प्री-कूल करें।
- ठंडा 0.1% सोडियम साइट्रेट बफर ( सामग्री की तालिका देखें) और सीटू सेल मृत्यु का पता लगाने से पहले बर्फ पर रखें।
- अपने संबंधित प्रयोगों को शुरू करने से पहले निम्नलिखित अभिकर्मकों को गर्म करें: चढ़ाना से पहले 24 घंटे के लिए एक 96-वेल कल्चर प्लेट; प्लेटेड क्रिप्ट्स में जोड़ने से पहले और प्रत्येक मीडिया परिवर्तन से पहले एल-डब्ल्यूआरएन मीडिया ( सामग्री की तालिका देखें)।
- धुंधला होने से पहले पानी के स्नान को 94 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
2. मुराइन कोलोनिक क्रिप्ट अलगाव
- नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए आवश्यक मीडिया तैयार करें।
नोट: मीडिया वॉल्यूम की गणना यहां दो चूहों के कोलोनिक ऊतक के लिए की जाती है।- उपकला पृथक्करण मीडिया तैयार करें: 1x PBS का 30 mL + 0.5 M EDTA का 400 μL + 10 mM Y-27632 डाइहाइड्रोक्लोराइड का 50 μL ( सामग्री की तालिका देखें)। उपयोग होने तक बर्फ पर रखें।
- क्रिप्ट पृथक्करण मीडिया तैयार करें: 1x PBS का 10 mL + 10 mM Y-27632 डाइहाइड्रोक्लोराइड का 10 μL। उपयोग होने तक बर्फ पर रखें।
- पूरक एल-डब्ल्यूआरएन मीडिया: एल-डब्ल्यूआरएन मीडिया का 50 एमएल + एल-ग्लूटामाइन के साथ डीएमईएम उच्च ग्लूकोज का 47.5 एमएल + एल-ग्लूटामाइन का 500 μL + पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन का 500 μL + बी -27 पूरक (50x) का 1,000 μL + 500 μL N2 पूरक (100x) + 50 μL HEPES (1 M) बफर समाधान (1 M) बफर समाधान का तालिका देखें)।
- पूर्ण (पूरक) एल-डब्ल्यूआरएन मीडिया और एलिकोट को 3 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए फ़िल्टर करें।
नोट: पिघला हुआ मीडिया 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है।
- क्रिप्ट अलगाव का प्रदर्शन करें।
- सामान्य संज्ञाहरण के लिए, कपास में 1 एमएल आइसोफ्लुरेन जोड़ें और इसे 0.09 घन फीट संज्ञाहरण कक्ष के भीतर प्लास्टिक कैसेट के अंदर रखें ( सामग्री की तालिका देखें)। माउस को संज्ञाहरण कक्ष में तब तक रखें जब तक कि सांस रुक न जाए (लगभग 3-5 मिनट) और फिर ग्रीवा अव्यवस्था20 करें।
- पेट को उजागर करने के लिए पीठ की त्वचा को पिन करते हुए, माउस की मध्य रेखा के नीचे लगभग 2 इंच का चीरा लगाएं। समीपस्थ पक्ष से सेकुम के ठीक नीचे और बाहर की तरफ से मलाशय के ऊपर काटकर बृहदान्त्र कोअलग करें।
- बल का उपयोग करके, बृहदान्त्र से जुड़े वसा ऊतक को हटा दें। बल के सपाट छोर का उपयोग करके धीरे से मल को बाहर धकेलें और ऊतक को अनुदैर्ध्य रूप से खोलें।
- ऊतक को ठंडे 1x PBS के साथ 10-15 बार धोएं ताकि धोने के बीच पीबीएस में ऊतक को "घुमाने" के लिए बल का उपयोग किया जा सके।
- साफ, तेज कैंची का उपयोग करके, ऊतक को छोटे टुकड़ों में काट लें, आकार में लगभग 3-5 मिमी।
- दूसरे माउस के लिए प्रक्रिया को दोहराएं और ऊतक के टुकड़ों को ठंडे उपकला पृथक्करण मीडिया (चरण 2.1.1) वाले 50 एमएल ट्यूब में मिलाएं।
- बृहदान्त्र ऊतक के टुकड़ों को उपकला पृथक्करण मीडिया में 90 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कोमल रॉकिंग के साथ इनक्यूबेट करें।
- ऊतक के टुकड़ों को ट्यूब के तल तक डूबने दें, फिर ऊतक को बाधित किए बिना उपकला पृथक्करण मीडिया को सावधानीपूर्वक त्याग दें। ठंडे 1x PBS के साथ ऊतक को 10-15 बार धोते समय इस प्रक्रिया को दोहराएं। अंतिम धोने के दौरान जितना संभव हो उतना पीबीएस छोड़ दें।
- बृहदान्त्र ऊतक के टुकड़ों वाले 50 एमएल ट्यूब में क्रिप्ट पृथक्करण मीडिया (चरण 2.1.2) जोड़ें और हाथ से 5-10 मिनट तक लगातार हिलाएं।
नोट: मीडिया को अलग-थलग क्रिप्ट्स से बादल बन जाना चाहिए। - सेल कल्चर हुड के तहत, ऊतक और मीडिया को 70 μm नायलॉन सेल स्ट्रेनर ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ एक ताजा 50 एमएल ट्यूब में फ़िल्टर करें।
- कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और क्रिप्ट युक्त गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
नोट: उपकरण के आधार पर, कोई भी सेंट्रीफ्यूजिंग के लिए तनावपूर्ण मीडिया को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित कर सकता है। - गोली को ~ 3-4 एमएल ठंडे 1x PBS में पुन: निलंबित करें।
- माइक्रोस्कोप स्लाइड पर एक पंक्ति में पृथक क्रिप्ट्स का पिपेट 10 μL। माइक्रोस्कोप के तहत, प्रति 10 μL क्रिप्ट एकाग्रता का अनुमान लगाने के लिए पूर्ण, लंबे क्रिप्ट की संख्या की गणना करें।
- 96-वेल प्लेट में 10 क्रिप्ट्स/μL प्लेट करने के लिए क्रिप्ट्स की उचित मात्रा की गणना करें।
3. क्रिप्ट प्लेटिंग
- सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पृथक क्रिप्ट्स की एक उपयुक्त मात्रा।
- पेलेट क्रिप्ट को बाधित किए बिना 1,000 μL पिपेट का उपयोग करके सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक हटा दें।
- हवा के बुलबुले को पेश करने से बचने के लिए पेलेट क्रिप्ट और पिपेट में 100 μL जेल मैट्रिक्स (नौ कुओं के लिए पर्याप्त) सावधानीपूर्वक जोड़ें।
नोट: जेल मैट्रिक्स और क्रिप्ट्स को मिश्रण करने के तरीके के विस्तृत विवरण के लिए चर्चा अनुभाग देखें। आमतौर पर, नौ कुओं के लिए 100 μL पर्याप्त है। - जेल मैट्रिक्स को आंशिक रूप से जमने दें (~ 1-2 मिनट)।
- जेल मैट्रिक्स की प्लेट 10 μL को गुंबद के आकार के निर्माण के लिए पूर्व-गर्म 96-वेल कल्चर प्लेट के प्रत्येक कुएं में क्रिप्ट के साथ मिलाया जाता है।
नोट: गुंबद को कुएं के केंद्र में रखें। सावधान रहें कि जेल मैट्रिक्स को कुएं के किनारों तक फैलने न दें। ठोसकरण और चढ़ाना पर विस्तृत विवरण के लिए चर्चा अनुभाग देखें। - जेल मैट्रिक्स को 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में10-20 मिनट के लिए पूरी तरह से सेट होने दें।
- एल-डब्ल्यूआरएन मीडिया का अंतिम कामकाजी समाधान तैयार करें।
- स्ट्रेप्टोमाइसिन को एल-डब्ल्यूआरएन मीडिया के 10 एमएल एलिकोट में जोड़ें (चरण 2.1.3 देखें) (4 डिग्री सेल्सियस पर 2 सप्ताह के लिए स्थिर)।
- स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ एल-डब्ल्यूआरएन मीडिया के 900 μL में पूरक जोड़ें: 1 mg/ mL EGF का 0.9 μL + 10 mM Y-27632 डाइहाइड्रोक्लोराइड का 0.9 μL।
नोट: वॉल्यूम नौ कुओं पर आधारित हैं। वाई -27632 डाइहाइड्रोक्लोराइड केवल दिन 0 (चढ़ाना के समय) पर जोड़ा जाता है।
- प्रत्येक कुएं में 100 μL मीडिया जोड़ें। गुम्बद को बाधित न करने का ध्यान रखें।
- 24 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
4. संस्कृति में क्लॉडिन -7 नॉकआउट बनाना
- चढ़ाना के बाद 24 घंटे के लिए क्रिप्ट्स को संस्कृति में सामान्य रूप से बढ़ने दें।
- 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में, 1 mmol/L 4-hydroxytamoxifen (4OH-Tamoxifen) का 2.7 μL L-WRN मीडिया (3 μmol/L की अंतिम सांद्रता) + 0.9 μL 1 mg/mL EGF जोड़ें।
नोट: 4ओएच-टैमोक्सीफेन का स्टॉक समाधान पाउडर 4ओएच-टैमोक्सीफेन ( सामग्री की तालिका देखें) को 1 एक्स पीबीएस के साथ 1 mmol / L की एकाग्रता में मिलाकर तैयार किया जाता है। - वैक्यूम सक्शन के माध्यम से कुओं से पुराने मीडिया को हटा दें।
- प्रत्येक कुएं में 4ओएच-टैमोक्सीफेन युक्त मीडिया के 100 μL जोड़ें और उन्हें क्लाउडिन -7 cKO / 4OH-TAM के रूप में लेबल करें।
नोट: डीएमएसओ को नियंत्रण कुओं में जोड़ा जाना चाहिए। ताजा 4ओएच-टैमोक्सीफेन युक्त मीडिया को हर 2 दिनों में जोड़ा जाना चाहिए। - अगले मीडिया परिवर्तन (~ 2-3 दिन) तक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
5. कोलोनिक ऑर्गेनॉइड रखरखाव
नोट: मीडिया को हर 2-3 दिनों में बदलना होगा। संस्कृति 12 दिनों तक।
- एल-डब्ल्यूआरएन मीडिया का एक नया अंतिम कार्य समाधान तैयार करें: एल-डब्ल्यूआरएन मीडिया का 900 μL + 1 mg / mL EGF का 0.9 μL।
- वैक्यूम सक्शन के माध्यम से कुओं से पुराने मीडिया को हटा दें। कुओं में ताजा मीडिया जोड़ें।
नोट: गुंबद को बाधित न करने के लिए सावधान रहें। - अगले मीडिया परिवर्तन तक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
नोट: प्रयोग के लिए वांछित अवधि के लिए संस्कृतियों को बनाए रखा और पारित किया जा सकता है। वर्तमान अध्ययन के लिए संस्कृतियों को आम तौर पर 9-12 दिनों के बीच बनाए रखा गया था, लेकिन कोई भी 15 या 20 दिनों के लिए आगे जारी रखना चाह सकता है।
6. कोलोनिक ऑर्गेनोइड्स की कटाई और एम्बेडिंग
- वैक्यूम सक्शन के माध्यम से कुओं से पुराने मीडिया को हटा दें।
- कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ ऑर्गेनोइड्स को ठीक करें।
नोट: पीएफए एक विषाक्त सामग्री है। इस अभिकर्मक का उपयोग करते समय सावधानी बरतें। - वैक्यूम सक्शन के माध्यम से कुओं से 4% पीएफए निकालें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए 30% सुक्रोज जोड़ें।
- एक प्लास्टिक मोल्ड को लेबल करें और इसे इष्टतम काटने के तापमान (ओसीटी) यौगिक के साथ 90% तक भरें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- वैक्यूम सक्शन के माध्यम से कुओं से 30% सुक्रोज निकालें। प्रत्येक कुएं में 1x PBS का 10 μL जोड़ें।
- पिपेट टिप के साथ, धीरे से कुएं के निचले हिस्से को खरोंचें ताकि ऑर्गेनोइड युक्त गुंबद को अलग किया जा सके।
- पिपेट के साथ, अलग किए गए ऑर्गेनोइड्स वाले पीबीएस को हटा दें और तरल को ओसीटी युक्त मोल्ड में लोड करें।
नोट: ओसीटी यौगिक में बुलबुले पेश करने से बचें। - इस प्रक्रिया को तब तक जारी रखें जब तक कि सभी कुओं से सभी ऑर्गेनोइड्स को हटा न दिया जाए।
- स्टेनलेस-स्टील देवर फ्लास्क में, सूखी बर्फ के छर्रों और 2-मेथिलबुटेन (सूखी बर्फ के छर्रों को कवर करने के लिए पर्याप्त) जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- फ्लैश फ्रीज के लिए 2-मेथिलबुटेन के ऊपर ऑर्गेनॉइड युक्त ओसीटी ब्लॉक को लगातार पकड़ें।
- ऑर्गेनॉइड युक्त ओसीटी ब्लॉक को -80 डिग्री सेल्सियस पर तब तक स्टोर करें जब तक कि सेक्शन के लिए तैयार न हो (1 वर्ष तक संग्रहीत किया जा सकता है)।
7. इम्यूनोफ्लोरेसेंस
- -20 डिग्री सेल्सियस पर क्रायोस्टेट ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके 5 μm मोटाई पर ऑर्गेनॉइड युक्त OCT ब्लॉक को खंडित करें।
- प्रत्येक अनुभाग के लिए, माइक्रोस्कोप के नीचे जांच करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि एक ऑर्गेनॉइड कैप्चर किया गया था। जब सेक्शनिंग पूरी हो जाती है, तो स्लाइड्स को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि दाग के लिए तैयार न हो (6 महीने तक संग्रहीत किया जा सकता है)।
- स्लाइड्स को 10 mM सोडियम साइट्रेट बफर में 94 °C पर 10 मिनट के लिए गर्म करें।
नोट: बफर को विआयनीकृत पानी में सोडियम साइट्रेट को भंग करके बनाया जाता है। हाइड्रोक्लोरिक एसिड के साथ पीएच को 6 में समायोजित करें। - स्लाइड्स को बेंचटॉप पर 20 मिनट के लिए ठंडा होने दें। 5 मिनट के लिए आसुत जल से धो लें।
- स्लाइड्स को 0.2% ट्राइटन एक्स -100 के साथ एक धुंधला रैक ( सामग्री की तालिका देखें) में इकट्ठा करें और 15 मिनट के लिए 100 एमएम ग्लाइसिन के साथ इनक्यूबेट करें।
- 5 मिनट के लिए 1x PBS के साथ तीन बार धोएं। कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए 5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के साथ ब्लॉक करें।
- क्लॉडिन -7 एंटी-मुराइन खरगोश प्राथमिक एंटीबॉडी22 (1% बीएसए में पतला) के साथ रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 10 मिनट के लिए 1x PBS के साथ तीन बार धोएं।
- कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए Cy3 एंटी-खरगोश द्वितीयक एंटीबॉडी23 (1% बीएसए में पतला) के साथ इनक्यूबेट करें। 10 मिनट के लिए 1x PBS के साथ तीन बार धोएं।
- DAPI के साथ एक उपयुक्त माउंटिंग माध्यम ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ स्लाइड्स को माउंट करें और एक कवरस्लिप जोड़ें।
8. कोशिका मृत्यु का पता लगाना
- कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ कुओं के अंदर ऑर्गेनोइड्स को ठीक करें। 5 मिनट के लिए 1x PBS से धो लें।
- 2 मिनट के लिए ठंडे 0.1% सोडियम साइट्रेट बफर में 0.1% ट्राइटन एक्स -100 के साथ बर्फ पर कल्चर प्लेट को इनक्यूबेट करें। 5 मिनट के लिए 1x PBS के साथ दो बार धोएं।
- टीएमआर रेड का उपयोग करके ट्यूनल प्रतिक्रिया 24,25 तैयार करें, एक सीटूसेल डेथ डिटेक्शन किट (सामग्री की तालिका देखें)। प्रत्येक अच्छी तरह से ट्यूनल प्रतिक्रिया अभिकर्मकों के 50 μL जोड़ें।
- अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए आर्द्र वातावरण में इनक्यूबेट करें।
नोट: शेष सभी चरणों को अंधेरे में पूरा किया जाना चाहिए। - 5 मिनट के लिए 1x PBS के साथ तीन बार धोएं। 3 मिनट के लिए 1: 2,500 होचस्ट (1x PBS में पतला, सामग्री की तालिका देखें) के साथ इनक्यूबेट करें।
- 5 मिनट के लिए 1x PBS के साथ तीन बार धोएं। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर छवियों की कल्पना करने के लिए TRITC फ़िल्टर का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
बृहदान्त्र स्टेम कोशिकाओं पर क्लॉडिन -7 के नियामक प्रभावों की जांच करने के लिए, कोलोनिक क्रिप्ट्स को मुराइन बृहदान्त्र ऊतक से अलग किया गया था जैसा कि ऊपर वर्णित है और चित्रा 1 ए में दिखाया गया है। एक बार जब क्रिप्ट्स को प्राथमिक ऊतक से अलग कर दिया गया, तो उन्हें 11 दिनों तक बढ़ने के लिए 96-वेल प्लेट में 3 डी मैट्रिक्स में चढ़ाया गया (चित्रा 1)। सामान्य स्वस्थ क्रिप्ट्स लुमेन को बंद कर देंगे और दिन 2 तक स्फेरॉइड बन जाएंगे और अंततः लगभग 5 दिन (चित्रा 1 बी) में विभिन्न उपकला कोशिका प्रकारों का निर्माण शुरू कर देंगे। कोलोनोइड्स को 11 वें दिन तक बढ़ने की अनुमति दी गई थी, जहां उन्हें आगे के प्रयोगों के लिए काटा गया था (चित्रा 1 बी)। संस्कृति में क्लॉडिन -7 को नॉकआउट करने के लिए, क्रिप्ट्स को 24 घंटे के लिए सामान्य रूप से बढ़ने की अनुमति दी गई थी। 24 घंटे के बाद, क्रिप्ट्स को 3 μmol / L 4OH-Tamoxifen (TAM) के साथ इलाज किया गया और 10 अतिरिक्त दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया। ताजा 4ओएच-टीएएम युक्त संस्कृति माध्यम को हर 2 दिनों में बदल दिया गया था। डीएमएसओ को नियंत्रण कुओं में एक वाहन के रूप में इस्तेमाल किया गया था। क्लॉडिन -7 की कमी वाले क्रिप्ट्स (क्लॉडिन -7 केओ) उचित स्फेरॉइड बनाने में विफल रहे और 4ओएच-टीएएम उपचार के 1 दिन के बाद तेजी से मरना शुरू कर दिया (चित्रा 1 बी)।
चित्रा 2 ए सामान्य क्रिप्ट्स से कोलोनोइड्स के सफल विकास पर प्रकाश डालता है जिसमें क्लॉडिन -7 (नियंत्रण) होता है क्योंकि वे संस्कृति के 9 दिनों में प्रगति करते हैं। इन क्रिप्ट्स ने दिन 2 तक स्फेरॉइड बनाना शुरू कर दिया, 5 वें दिन से उभरना शुरू कर दिया, और 9 वें दिन कटाई तक बढ़ते और उभरते रहे (चित्रा 2 ए)। इसके विपरीत, क्लॉडिन -7 (क्लॉडिन -7 केओ) की कमी वाले क्रिप्ट बहुत जल्दी बिगड़ गए (चित्रा 2 बी)। 4ओएच-टीएएम के साथ उपचार के लगभग 2-3 दिन बाद, क्लॉडिन -7 केओ क्रिप्ट्स ने स्वस्थ दिखने वाले स्फेरॉइड का गठन नहीं किया था और केवल कोशिकाओं के गोलाकार झुरमुट के रूप में दिखाई दिया था (चित्रा 2 बी)। जंगली प्रकार के चूहों से अलग किए गए क्रिप्ट्स को 4ओएच-टीएएम के साथ इलाज किया गया था ताकि यह पुष्टि की जा सके कि टैमोक्सीफेन उपचार के कारण कोई विषाक्त प्रभाव नहीं है; ये क्रिप्ट्स जीवित रहने और सामान्य रूप से बढ़ने में सक्षम थे। क्लॉडिन -7 विलोपन और क्लॉडिन -7 केओ कोलोनोइड्स की उत्तरजीविता की स्थिति की जांच करने के लिए, एक इम्यूनोस्टेनिंग विधि और एक सीटू सेल डेथ डिटेक्शन किट का उपयोग किया गया था (चित्रा 3)। कटे हुए नियंत्रण और सीकेओ ऑर्गेनोइड्स में क्लॉडिन -7 के लिए इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग ने संस्कृति में क्लॉडिन -7 के सफल नॉकआउट की पुष्टि की (चित्रा 3 ए)। दिन 9 नियंत्रण कोलोनोइड्स ने बहुत कम एपोप्टोटिक संकेत का प्रदर्शन किया (चित्रा 3 बी); हालांकि, क्लॉडिन -7 केओ कोलोनोइड्स ने उच्च एपोप्टोसिस प्रदर्शित किया (चित्रा 3 बी)। क्लॉडिन -7 के बिना, स्टेम कोशिकाएं जीवित नहीं रह सकती थीं, आत्म-नवीनीकरण नहीं कर सकती थीं, या कोलोनोइड्स बनाने के लिए अंतर नहीं कर सकती थीं।
चित्र 1: क्रिप्ट अलगाव और कोलोनॉइड विकास को दर्शाने वाला योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (ए) क्रिप्ट अलगाव प्रक्रिया का ग्राफिकल चित्रण, 3 डी मैट्रिक्स में चढ़ाना, और फसल तक वृद्धि। (बी) नियंत्रण में प्रयोगों और कोलोनोइड विकास की समयरेखा और क्लॉडिन -7 केओ-व्युत्पन्न क्रिप्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2: क्लॉडिन -7 की कमी वाले कोलोनोइड्स जीवित रहने और बढ़ने में असमर्थ हैं। (ए) दिन 3 और दिन 9 पर नियंत्रण / डीएमएसओ ऑर्गेनोइड्स की प्रतिनिधि छवियां। (बी) दिन 3 और दिन 9, एन = 10 पर 4ओएच-टीएएम / सीकेओ ऑर्गेनोइड्स की प्रतिनिधि छवियां। स्केल पट्टियाँ = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्र 3: क्लॉडिन -7 की कमी वाले कोलोनोइड्स तेजी से एपोप्टोसिस से गुजरते हैं। (ए) क्लॉडिन -7 दिन 9 नियंत्रण / डीएमएसओ और क्लाउडिन -7 सीकेओ / 4ओएच-टीएएम ऑर्गेनोइड्स, एन = 3 में धुंधला होना। स्केल सलाखों = 250 μm. (B) दिन 9 नियंत्रण में एपोप्टोटिक धुंधलापन और क्लॉडिन -7 cKO/ 4OH-TAM कोलोनोइड्स, n = 3। स्केल पट्टियाँ = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ऑर्गेनॉइड कल्चर स्टेम सेल फ़ंक्शन, आंतों के शरीर विज्ञान, दवा की खोज, मानव आंतों के रोगों और ऊतक पुनर्जनन और मरम्मत 7,8,9,10,11,26 का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है। जबकि इसके कई फायदे हैं, इसे स्थापित करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। प्रोटोकॉल के दौरान सभी चरणों में देखभाल की जानी चाहिए, लेकिन सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि चढ़ाना चरण के दौरान। अलग-थलग क्रिप्ट्स को जेल मैट्रिक्स के साथ मिलाते समय, सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद बनने वाले क्रिप्ट पेलेट को तोड़ने के लिए पूरी तरह से ऊपर और नीचे करना सुनिश्चित करें और क्रिप्ट्स को पूरे मैट्रिक्स में समान रूप से वितरित करें। समवर्ती रूप से, पाइपिंग करते समय मैट्रिक्स में हवा के बुलबुले पेश करने से बचें। ऐसा करने के लिए, पिपेटिंग को धीरे-धीरे किया जाना चाहिए, जिसमें पिपेट टिप 1.5 एमएल ट्यूब के तल की ओर है।
इसके अतिरिक्त, जेल मैट्रिक्स को इस प्रक्रिया में पूरी तरह से ठोस नहीं होना चाहिए। समय से पहले जमने से रोकने के लिए, सावधानीपूर्वक पाइपिंग द्वारा मिलाएं, फिर ट्यूब को बर्फ पर रखें, और इस प्रक्रिया को दोहराएं। एक बार पृथक क्रिप्ट और जेल मैट्रिक्स पर्याप्त रूप से मिश्रित हो जाने के बाद, जेल मैट्रिक्स को आंशिक रूप से ठोस होने दें। इस प्रक्रिया में 1-5 मिनट लग सकते हैं, जो उपयोग किए गए जेल मैट्रिक्स के प्रकार / ब्रांड पर निर्भर करता है। यह एक जेल के समान होना चाहिए जो ट्यूब को डुबोने पर थोड़ा हिलेगा, लेकिन इतना चिकना नहीं होना चाहिए कि यह उल्टा होने पर बाहर निकल जाए। इस बिंदु पर, कोई प्रत्येक कुएं के केंद्र में 10 μL चढ़ाना शुरू कर सकता है। जेल मैट्रिक्स को एक 3 डी गुंबद बनाना चाहिए और कुएं के किनारों को नहीं छूना चाहिए। यदि जेल मैट्रिक्स फैलता है और कुएं की दीवार से टकराता है, तो यह पर्याप्त ठोस नहीं होता है; तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि यह गुंबद बनाने के लिए पर्याप्त रूप से ठोस नहीं हो जाता, क्योंकि गुंबद नहीं बनने पर क्रिप्ट जीवित नहीं रहेंगे और बढ़ेंगे। एक बार चढ़ाना ठीक से पूरा हो जाने के बाद, और क्रिप्ट्स को पर्याप्त रूप से पूरक किया जाता है, जैसा कि ऊपर बताया गया है, ऑर्गेनोइड्स को बिना किसी समस्या के बढ़ने की उम्मीद है।
यह प्रोटोकॉल कोलोनिक स्टेम सेल अस्तित्व पर इसके प्रभावों का निरीक्षण करने के लिए क्लॉडिन -7 के साथ या उसके बिना एक बृहदान्त्र ऑर्गेनॉइड प्रणाली स्थापित करता है। जबकि कोलन ऑर्गेनॉइड संस्कृति एक अभिनव और लाभप्रद प्रणाली है, मॉडल में अभी भी सीमाएं हैं। अध्ययन के प्रकार के आधार पर, आंतों के ऑर्गेनोइड्स में प्रतिरक्षा कोशिकाओं और माइक्रोबायोटा की कमी एक फायदा या नुकसान हो सकताहै। वर्तमान अध्ययन के लिए, प्रतिरक्षा घटक के बिना स्टेम सेल कार्यों पर क्लॉडिन -7 की नियामक भूमिका की जांच करना फायदेमंद है। यह निष्कर्ष निकाला गया कि एक निश्चित प्रभाव विशेष रूप से क्लाउडिन -7 के कारण होता है, बजाय अन्य संभावित चर जैसे कि प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया जो विवो पशु मॉडल में मौजूद होगी। इसके विपरीत, यह कारक अन्य प्रकार के अध्ययनों के लिए एक सीमा हो सकती है। कोलन ऑर्गेनॉइड संस्कृति स्थापित करना पारंपरिक 2 डी सेल लाइनों की तुलना में अधिक महंगा और समय गहन हो सकता है। हालांकि, वे विवो प्रासंगिकता प्रदान करने वाले ऊतकों के सेलुलर माइक्रोएन्वायरमेंट की नकल कर सकते हैं, 2 डी सेल संस्कृति की तुलना में ऊतक के बहुत अधिक प्रतिनिधि हैं, और अभी भी पशु मॉडल 4,7 की तुलना में कम महंगे हैं। आंतों के ऑर्गेनॉइड संस्कृति के विशाल अनुप्रयोग और विशाल क्षमता को देखते हुए, यह प्रणाली दुनिया भर में प्रयोगशाला अनुसंधान में आदर्श मॉडल बनने की संभावना है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
इस अध्ययन को एनआईएच डीके 103166 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator | United States Plastic Corp | 78564 | anesthesia chamber |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | AM9261 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 1x Dulbecco’s Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
| 2-methylbutane | Sigma | 277258 | |
| 4% paraformaldehyde | ThermoFisher | J61899.AK | |
| 4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM) | Sigma | 579002 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 70 µm nylon cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96 well culture plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | |
| Claudin-7 anti-murine rabbit antibody | Immuno-Biological Laboratories | 18875 | |
| Cover glass (24 x 50-1.5) | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryomolds | vwr | 25608-916 | |
| Cultrex RCF BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | gel matrix |
| Cy3 anti-rabbit antibody | Jackson Immunoresearch | 111-165-003 | |
| Dewar Flask | Thomas Scientific | 1173F61 | |
| DMEM High Glucose with L-Glutamine | ATCC | 30-2002 | |
| EVOS FLoid Imaging System | ThermoFisher | 4477136 | |
| Fluoro-Gel II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 17985-50 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Glycine | JT Baker | 4059-02 | |
| HEPES (1 M) Buffer Solution | Gibco | 15630-080 | |
| Hoechst | ThermoFisher | 62249 | |
| In situ cell death detection kit, TMR Red | Roche | 12156792910 | |
| Isoflurane | Pivetal | 07-893-8440 | |
| L-WRN Media | Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core | N/A | |
| Mouse surgical kit | Kent Scientific Corporation | INSMOUSEKIT | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-500UG | |
| N2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Sequenza Rack | vwr | 10129-584 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S-279 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Vacuum filter (0.22 µm; cellulose acetate) | Corning | 430769 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 |
References
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Wallach, T. E., Bayrer, J. R. Intestinal organoids: new frontiers in the study of intestinal disease and physiology. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 180-185 (2017).
- Shankaran, A., Prasad, K., Chaudhari, S., Brand, A., Satyamoorthy, K. Advances in development and application of human organoids. 3 Biotech. 11 (6), 257 (2021).
- Angus, H., Butt, A., Schultz, M., Kemp, R. Intestinal organoids as a tool for inflammatory bowel disease research. Frontiers in Medicine. 6, 334 (2020).
- Fan, Y., Davidson, L. A., Chapkin, R. S. Murine colonic organoid culture system and down stream assay applications. Methods in Molecular Biology. 1576, 171-181 (2019).
- Gupta, N., et al. Microfluidics-based 3D cell culture models: Utility in novel drug discovery and delivery research. Bioengineering and Translational Medicine. 1 (1), 63-81 (2016).
- Yoo, J., Donowitz, M. Intesitnal enteroids/organoids: A novel platform for drug discovery in inflammatory bowel diseases. World Journal of Gastroenterology. 25 (30), 4125-4147 (2019).
- Qu, M., et al. Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration. Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).
- Xing, T., et al. Tight junction protein claudin-7 is essential for intestinal epithelial stem cell self-renewal and differentiation. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 641-659 (2020).
- Ding, L., et al. Inflammation and disruption of the mucosal architecture in claudin-7-deficient mice. Gastroenterology. 142 (2), 305-315 (2012).
- Lu, Z., Ding, L., Lu, Q., Chen, Y. H. Claudins in intestines: distribution and functional significance in health and diseases. Tissue Barriers. 1 (3), 24978 (2013).
- Ding, L., Lu, Z., Lu, Q., Chen, Y. H. The claudin family of proteins in human malignancy: a clinical perspective. Cancer Management and Research. 5, 367-375 (2013).
- Bhat, A. A., et al. Claudin-7 expression induces mesenchymal to epithelial transformation (MET) to inhibit colon tumorigenesis. Oncogene. 34 (35), 4570-4580 (2015).
- Lu, Z., et al. A non-tight junction function of claudin-7-interaction with integrin signaling in suppressing lung cancer cell proliferation and detachement. Molecular Cancer. 14, 120 (2015).
- Wang, K., Xu, C., Li, W., Ding, L. Emerging clinical significance of claudin-7 in colorectal cancer: a review. Cancer Management and Research. 10, 3741-3752 (2018).
- Wang, K., et al. Claudin-7 downregulation induces metastasis and invasion in colorectal cancer via the promotion of epithelial-mesenchymal transition. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (3), 797-804 (2019).
- Wang, F., et al. Isolation and characterization of intestinal stem cells based on surface marker combinations and colony-formation assay. Gastroenterology. 145 (2), 383 (2013).
- Li, W., et al. Severe intestinal inflammation in the small intestine of mice induced by controllable deletion of claudin-7. Digestive Diseases and Sciences. 63 (5), 1200-1209 (2018).
- Donovan, J., Brown, P. Euthanasia. Current Protocols in Immunology. 73 (1), (2006).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. Journal of Visual Experiments. (80), e50611 (2013).
- Sugimoto, K., et al. Cell adhesion signals regulate the nuclear receptor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (49), 24600-24609 (2019).
- Mansour, H., et al. Connexin 30 expression and frewuency of connexin heterogeneity in astrocyte gap junction plaques increase with age in the rat retina. PLoS One. 8 (3), 57038 (2013).
- Miranda, M., et al. Antioxidants rescue photoreceptors in rd1 mice: relationship with thiol metabolism. Free Radical Biology and Medicine. 48 (2), 216-222 (2010).
- Wang, L., et al. Mesenchymal stromal cells ameliorate oxidative stress-induced islet endothelium apoptosis and functional impairment via Wnt4-β-catenin signaling. Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 188 (2017).
- Almeqdadi, M., Mana, M., Roper, J., Yilmaz, O. Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).
