Summary
Detta protokoll beskriver upprättandet av ett murint kolonorganoidsystem för att studera aktiviteten och funktionen hos kolonstamceller i en claudin-7 knockout-modell.
Abstract
Tarmepitelet regenererar var 5-7: e dag och styrs av tarmepitelstamcellspopulationen (IESC) som ligger längst ner i kryptregionen. IESC inkluderar aktiva stamceller, som självförnyar och differentieras till olika epitelcelltyper, och vilande stamceller, som fungerar som reservstamceller vid skada. Regenerering av tarmepitelet styrs av de självförnyande och differentierande egenskaperna hos dessa aktiva IESC: er. Dessutom är balansen mellan kryptstamcellspopulationen och underhållet av stamcellsnischen avgörande för tarmregenerering. Organoidodling är ett viktigt och attraktivt tillvägagångssätt för att studera proteiner, signalmolekyler och miljösignaler som reglerar stamcellsöverlevnad och funktioner. Denna modell är billigare, mindre tidskrävande och mer manipuleringsbar än djurmodeller. Organoider efterliknar också vävnadsmikromiljön, vilket ger in vivo-relevans . Det nuvarande protokollet beskriver isoleringen av kolonkrypter, bäddar in dessa isolerade kryptceller i ett tredimensionellt gelmatrissystem och odlar kryptceller för att bilda kolonorganoider som kan självorganisera, proliferation, självförnyelse och differentiering. Denna modell gör det möjligt för en att manipulera miljö-slå ut specifika proteiner som claudin-7, aktivera/inaktivera signalvägar etc.-för att studera hur dessa effekter påverkar funktionen hos kolonstamceller. Specifikt undersöktes rollen av tight junction protein claudin-7 i kolonstamcellsfunktionen. Claudin-7 är avgörande för att upprätthålla tarmhomeostas och barriärfunktion och integritet. Knockout av claudin-7 hos möss inducerar en inflammatorisk tarmsjukdomsliknande fenotyp som uppvisar tarminflammation, epitelial hyperplasi, viktminskning, slemhinnesår, epitelcellsloughing och adenom. Tidigare rapporterades att claudin-7 krävs för tarmepitelstamcellsfunktioner i tunntarmen. I detta protokoll upprättas ett kolonorganoidodlingssystem för att studera rollen av claudin-7 i tjocktarmen.
Introduction
Tarmorganoidodling är ett tredimensionellt (3D) ex vivo-system där stamceller isoleras från tarmkrypterna i primärvävnaden och pläteras till en gelmatris 1,2. Dessa stamceller kan självförnya, självorganisera och organfunktionalitet2. Organoider efterliknar vävnadsmikromiljön och liknar mer in vivo-modeller än tvådimensionella (2D) in vitro-cellodlingsmodeller, även om de är mindre manipuleringsbara än cellerna 3,4. Denna modell eliminerar hinder som uppstår i 2D-modeller, såsom brist på korrekta cell-celladhesioner, cellmatrisinteraktioner och homogena populationer, och minskar också begränsningarna för djurmodeller, inklusive höga kostnader och långa tidsperioder5. Tarmorganoider - även kallade kolonoider för de som odlas från kolonkrypt-härledda stamceller - är i huvudsak miniorgan som innehåller ett epitel inklusive alla celltyper som skulle vara närvarande in vivo, liksom en lumen. Denna modell möjliggör manipulation av systemet för att studera många aspekter av tarmen, såsom stamcellsnischen, tarmfysiologi, patofysiologi och tarmmorfogenes 3,5,6. Det ger också en bra modell för läkemedelsupptäckt, studerar mänskliga tarmsjukdomar som inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) och kolorektal cancer, patientspecifik personlig behandlingsutveckling och studerar vävnadsregenerering 4,7,8,9. Dessutom kan organoidsystemet också användas för att studera cellulär kommunikation, läkemedelsmetabolism, livskraft, proliferation och svar på stimuli 7,8. Medan djurmodeller kan användas för att testa potentiella terapier för tarmpatologiska tillstånd, är de ganska begränsade, eftersom det är en utmaning att studera flera läkemedel samtidigt. Det finns fler förvirrande variabler in vivo, och tillhörande kostnad och tid är höga respektive långa. Å andra sidan möjliggör organoidodlingssystemet screening av många terapier samtidigt under en kortare tidsperiod och möjliggör också personlig behandling genom användning av patient-härledd organoidkultur 4,8. Förmågan hos kolonorganoider att efterlikna vävnadsorganisation, mikromiljö och funktionalitet gör dem också till en utmärkt modell för att studera regenerering och vävnadsreparation9. Vårt laboratorium har etablerat ett tunntarmsorganoidodlingssystem för att studera effekten av claudin-7 på tunntarmens stamcellsfunktioner10. I denna studie etableras ett magorganoidodlingssystem för att studera stamcellers förmåga, eller brist på förmåga, att självförnya, differentiera och sprida sig i en villkorlig claudin-7 knockout (cKO) -modell.
Claudin-7 är ett mycket viktigt protein med tät korsning (TJ) som uttrycks starkt i tarmen och är viktigt för att upprätthålla TJ-funktion och integritet11. cKO-möss lider av en IBD-liknande fenotyp och uppvisar allvarlig inflammation, sårbildning, epitelcellsloughing, adenom och ökade cytokinnivåer11,12. Även om det är allmänt accepterat att claudins är avgörande för epitelbarriärfunktion, växer nya roller för claudins fram; De är involverade i spridning, migration, cancerprogression och stamcellsfunktion 10,12,13,14,15,16,17. Det är för närvarande okänt hur claudin-7 påverkar stamcellsnischen och funktionen hos kolonstamceller. Eftersom tarmen snabbt förnyas ungefär var 5-7: e dag är det viktigt att upprätthålla stamcellsnischen och att de aktiva stamcellerna fungerar korrekt18. Här etableras ett system för att undersöka de potentiella regulatoriska effekterna av claudin-7 på kolonstamcellsnischen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök och procedurer godkändes av East Carolina University (ECU) Animal Care and Use Committee (IACUC) och genomfördes i enlighet med riktlinjer från National Institutes of Health och ECU om laboratoriedjurvård och användning. Inducerbara, tarmspecifika claudin-7 knockout-möss genererades genom att korsa C57BL6 claudin-7-flox transgena möss med Villin-CreERT2 möss19. Manliga och kvinnliga möss i åldern 3 månader användes i denna studie.
1. Beredning av reagens/utrustning
- Kyl följande reagenser/utrustning innan de börjar med tillhörande experiment: fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för tvättning av kolonvävnad under kryptisolering; en vippa/rotator (placerad i kylskåp på 4 °C) för inkubation med epiteldissociationsmedier.
- Ta bort gelmatrisen (se materialtabell) från -20 °C och tina på is före plätering.
- Förkyl centrifugen till 4 °C innan du snurrar ner krypter för plätering.
- Kyl 0,1% natriumcitratbuffert (se materialtabell) och håll på is före detektering av celldöd på plats .
- Värm följande reagenser innan de börjar sina associerade experiment: en odlingsplatta med 96 brunnar i 24 timmar före plätering; L-WRN-media (se Materialförteckning) innan du lägger till pläterade krypter och före varje mediebyte.
- Värm vattenbadet till 94 °C före färgning.
2. Murin kolon kryptisolering
- Förbered nödvändiga medier genom att följa stegen nedan.
OBS: Medievolymerna beräknas här för kolonvävnaden hos två möss.- Förbered epiteldissociationsmedia: 30 ml 1x PBS + 400 μL 0,5 M EDTA + 50 μL 10 mM Y-27632 dihydroklorid (se materialtabell). Håll på is tills det används.
- Förbered kryptdissociationsmedia: 10 ml 1x PBS + 10 μL 10 mM Y-27632 dihydroklorid. Håll på is tills det används.
- Tillägg L-WRN-media: 50 ml L-WRN-media + 47,5 ml DMEM-hög glukos med L-glutamin + 500 μL L-glutamin + 500 μL pennicilin / streptomycin + 1,000 μL B-27-tillskott (50x) + 500 μL N2-tillskott (100x) + 50 μL HEPES (1 M) buffertlösning (se materialtabell).
- Filtrera hela (kompletterade) L-WRN-mediet och alikvoten för förvaring vid -20 °C i upp till 3 månader.
OBS: Upptinade medier är stabila vid 4 °C i upp till 2 veckor.
- Utför kryptisoleringen.
- För generell anestesi, tillsätt 1 ml isofluran till bomull och placera den i en plastkassett i en 0,09 kubikfot anestesikammare (se materialtabell). Placera musen i anestesikammaren tills andningen stannar (cirka 3-5 min) och utför sedan cervikal dislokation20.
- Gör ett snitt på cirka 2 längs musens mittlinje och fäst bakhuden för att exponera buken. Isolera tjocktarmen genom att skära strax under cecum från den proximala sidan och ovanför ändtarmen från den distala sidan21.
- Använd pincett, ta bort fettvävnaden som är fäst vid tjocktarmen. Tryck försiktigt ut avföring med hjälp av den plana änden av pincetten och skär vävnaden öppen i längdriktningen.
- Tvätta vävnaden 10-15 gånger med kall 1x PBS med pincett för att "virvla" vävnaden runt i PBS mellan tvättarna.
- Skär vävnaden i små bitar, cirka 3-5 mm i storlek, med en ren, skarp sax.
- Upprepa processen för den andra musen och kombinera vävnadsbitarna i ett 50 ml rör som innehåller kallt epiteldissociationsmedium (steg 2.1.1).
- Inkubera kolonvävnadsbitarna i epiteldissociationsmedier i 90 minuter vid 4 °C med försiktig gungning.
- Låt vävnadsfragmenten sjunka till botten av röret och kassera sedan försiktigt epiteldissociationsmediet utan att störa vävnaden. Upprepa denna process när du tvättar vävnaden 10-15 gånger med kall 1x PBS. Kassera så mycket PBS som möjligt under den slutliga tvätten.
- Tillsätt kryptdissociationsmedia (steg 2.1.2) till 50 ml röret som innehåller kolonvävnadsbitar och skaka kontinuerligt i 5-10 minuter för hand.
OBS: Media måste bli grumligt från de dissocierade krypterna. - Under cellodlingshuven filtrerar du vävnaden och mediet med en 70 μm nyloncellsil (se materialtabell) i ett nytt 50 ml rör.
- Centrifugera vid 200 x g i 10 minuter vid rumstemperatur och kassera supernatanten utan att störa den kryptinnehållande pelleten.
OBS: Beroende på utrustning kan man överföra det ansträngda mediet till ett 15 ml rör för centrifugering. - Återsuspendera pelleten i ~ 3-4 ml kall 1x PBS.
- Pipettera 10 μL av de isolerade krypterna i en linje på ett mikroskopglas. Under mikroskopet räknar du antalet fulla, långa krypter för att uppskatta kryptkoncentrationen per 10 μL.
- Beräkna lämplig volym krypter att snurra ner för att platta 10 krypter / μL i en 96-brunnsplatta.
3. Kryptplätering
- Centrifugera en lämplig volym isolerade krypter i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör vid 200 x g i 5 minuter vid 4 °C.
- Ta försiktigt bort supernatanten med en 1 000 μl pipett utan att störa de pelleterade krypterna.
- Tillsätt 100 μL gelmatris (tillräckligt för nio brunnar) till de pelleterade krypterna och pipettera försiktigt för att undvika att införa luftbubblor.
OBS: Se diskussionsavsnittet för en detaljerad beskrivning av hur man blandar gelmatrisen och krypterna. Vanligtvis är 100 μL tillräckligt för nio brunnar. - Låt gelmatrisen stelna delvis (~1-2 min).
- Platta 10 μL av gelmatrisen blandad med krypterna i varje brunn i en förvärmd 96-brunns odlingsplatta för att bilda en kupolform.
OBS: Placera kupolen i mitten av brunnen. Var försiktig så att du inte låter gelmatrisen sprida sig till brunnens sidor. Se diskussionsavsnittet för en detaljerad beskrivning av stelning och plätering. - Låt gelmatrisen vara helt inställd i 10-20 min i en inkubator vid 37 °C med 5%CO2.
- Förbered den slutliga arbetslösningen för L-WRN-media.
- Tillsätt 100 μl pennicilin/streptomycin till en alikvot på 10 ml L-WRN-medier (se steg 2.1.3) (stabilt i 2 veckor vid 4 °C).
- Tillsätt kosttillskott till 900 μL L-WRN-media med pennicilin/streptomycin: 0,9 μl 1 mg/ml EGF + 0,9 μL 10 mM Y-27632 dihydroklorid.
OBS: Volymerna är baserade på nio brunnar. Y-27632 dihydroklorid tillsätts endast på dag 0 (vid pläteringstillfället).
- Tillsätt 100 μL media till varje brunn. Var försiktig så att du inte stör kupolen.
- Inkubera vid 37 °C med 5 %CO2 i 24 timmar.
4. Skapa claudin-7 knockout i kulturen
- Låt krypterna växa normalt i odling i 24 timmar efter plätering.
- I ett 1,5 ml mikrocentrifugrör, tillsätt 2,7 μL 1 mmol / L 4-hydroxitamoxifen (4OH-Tamoxifen) till 900 μL L-WRN-media (slutlig koncentration av 3 μmol / L) + 0,9 μL av 1 mg / ml EGF.
OBS: Stamlösningen av 4OH-Tamoxifen framställs genom att blanda pulveriserat 4OH-Tamoxifen (se materialtabell) med 1x PBS till en koncentration av 1 mmol / L. - Ta bort gamla medier från brunnarna via vakuumsugning.
- Tillsätt 100 μL 4OH-Tamoxifen-innehållande media till varje brunn och märk dem som claudin-7 cKO/4OH-TAM.
DMSO måste läggas till i kontrollbrunnarna. Färskt 4OH-Tamoxifen-innehållande medium måste tillsättas var 2: e dag. - Inkubera vid 37 °C tills nästa mediebyte (~2-3 dagar).
5. Colonic organoid underhåll
OBS: Media måste ändras var 2-3: e dag. Kultur upp till 12 dagar.
- Förbered en ny slutlig arbetslösning av L-WRN-media: 900 μL L-WRN-media + 0,9 μL 1 mg / ml EGF.
- Ta bort gamla medier från brunnarna via vakuumsugning. Lägg till färska medier i brunnarna.
OBS: Var försiktig så att du inte stör kupolen. - Inkubera vid 37 °C tills nästa mediebyte.
OBS: Kulturer kan bibehållas och passeras under den tid som önskas för experimentet. Kulturerna för den aktuella studien bibehölls vanligtvis i mellan 9-12 dagar, men man kanske vill fortsätta vidare, i 15 eller 20 dagar.
6. Skörd och inbäddning av kolonorganiska oider
- Ta bort gamla medier från brunnarna via vakuumsugning.
- Fixera organoiderna med 4% paraformaldehyd (PFA) i 1 h vid rumstemperatur.
PFA är ett giftigt material. Vidta försiktighetsåtgärder när du använder detta reagens. - Ta bort 4% PFA från brunnarna via vakuumsugning och tillsätt 30% sackaros i 24 timmar vid 4 °C.
- Märk en plastform och fyll den till 90% med optimal skärtemperatur (OCT) förening (se materialtabell).
- Ta bort 30% sackaros från brunnarna via vakuumsugning. Tillsätt 10 μL 1x PBS till varje brunn.
- Med en pipettspets, skrapa försiktigt botten av brunnen för att dissociera kupolen som innehåller organoider.
- Ta bort PBS som innehåller de dissocierade organoiderna med en pipett och ladda vätskan i formen som innehåller OCT.
OBS: Undvik att införa bubblor i OCT-föreningen. - Fortsätt denna process tills alla organoider har tagits bort från alla brunnar.
- I en Dewar-kolv i rostfritt stål, tillsätt torrispellets och 2-metylbutan (tillräckligt för att täcka torrispellets) (se materialförteckning).
- Håll stadigt det organoidinnehållande OCT-blocket över 2-metylbutan för att blixtfrysa.
- Förvara det organoidhaltiga OCT-blocket vid -80 °C tills det är klart att dela (kan förvaras i upp till 1 år).
7. Immunofluorescens
- Dela det organoidinnehållande OCT-blocket med en tjocklek på 5 μm med hjälp av en kryostat (se materialförteckning) vid -20 °C.
- För varje avsnitt, kontrollera under mikroskopet för att säkerställa att en organoid fångades. När sektioneringen är klar, förvara bilderna vid -80 °C tills de är klara att färgas (kan förvaras i upp till 6 månader).
- Värm objektglasen i 10 mM natriumcitratbuffert i 10 minuter vid 94 °C.
OBS: Bufferten görs genom att lösa natriumcitrat i avjoniserat vatten. Justera pH till 6 med saltsyra. - Låt rutschkanorna svalna på bänkskivan i 20 min. Skölj med destillerat vatten i 5 min.
- Montera bilderna i ett färgningsställ (se materialtabell) med 0,2% Triton X-100 och inkubera med 100 mM glycin i 15 min.
- Skölj tre gånger med 1x PBS i 5 min vardera. Blockera med 5% bovint serumalbumin (BSA) i 45 min vid rumstemperatur.
- Inkubera med klaudin-7 anti-murin kanin primär antikropp22 (utspädd i 1% BSA) över natten vid 4 °C. Skölj tre gånger med 1x PBS i 10 min vardera.
- Inkubera med Cy3 anti-kanin sekundär antikropp23 (utspädd i 1% BSA) i 1 h vid rumstemperatur. Skölj tre gånger med 1x PBS i 10 min vardera.
- Montera bilderna med ett lämpligt monteringsmedium (se Materialförteckning) med DAPI och lägg till en täckglas.
8. Upptäckt av celldöd
- Fixa organoiderna inuti brunnarna med 4% paraformaldehyd i 1 h vid rumstemperatur. Skölj med 1x PBS i 5 min.
- Inkubera odlingsplattan på is med 0,1% Triton X-100 i kall 0,1% natriumcitratbuffert i 2 min. Skölj två gånger med 1x PBS i 5 min vardera.
- Förbered TUNEL-reaktion24,25 med TMR Red, ett in situ-celldödsdetekteringssats(se materialförteckning). Tillsätt 50 μl TUNEL-reaktionsreagens till varje brunn.
- Inkubera i en fuktad atmosfär i 1 timme vid 37 °C i mörker.
OBS: Alla återstående steg måste slutföras i mörkret. - Skölj tre gånger med 1x PBS i 5 min vardera. Inkubera med 1:2 500 Hoechst (utspädd i 1x PBS, se Materialtabell) i 3 min.
- Skölj tre gånger med 1x PBS i 5 min vardera. Använd TRITC-filtret för att visualisera bilder på ett fluorescerande mikroskop (se Materialförteckning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att undersöka de regulatoriska effekterna av claudin-7 på kolonstamceller isolerades kolonkrypter från murin kolonvävnad enligt beskrivningen ovan och visas i figur 1A. När krypterna isolerades från primärvävnaden pläterades de i en 3D-matris i en 96-brunnsplatta för att växa i 11 dagar (figur 1). Normala friska krypter stänger lumen och blir sfäroider vid dag 2 och börjar så småningom spira och bilda de olika epitelcelltyperna ungefär dag 5 (Figur 1B). Kolonioider fick växa fram till dag 11, där de sedan skördades för ytterligare experiment (figur 1B). För att slå ut claudin-7 i kulturen fick krypterna växa normalt i 24 timmar. Efter 24 timmar behandlades krypterna med 3 μmol/L 4OH-Tamoxifen (TAM) och odlades i ytterligare 10 dagar. Odlingsmediet innehållande färsk 4OH-TAM ändrades var 2: e dag. DMSO användes som fordon i kontrollbrunnar. Claudin-7 bristfälliga krypter (claudin-7 KO) misslyckades med att bilda ordentliga sfäroider och började snabbt dö efter 1 dag med 4OH-TAM-behandling (Figur 1B).
Figur 2A belyser den framgångsrika tillväxten av kolonoider från normala krypter som innehåller claudin-7 (kontroll) när de utvecklas under de 9 dagarna av kulturen. Dessa krypter började bilda sfäroider vid dag 2, började spira på dag 5 och fortsatte att växa och spira tills de skördades på dag 9 (figur 2A). Däremot försämrades krypter som saknade claudin-7 (claudin-7 KO) mycket snabbt (figur 2B). Cirka 2-3 dagar efter behandling med 4OH-TAM hade claudin-7 KO-krypter inte bildat friska sfäroider och uppträdde endast som cirkulära klumpar av celler (figur 2B). Krypter isolerade från vildtypsmöss behandlades med 4OH-TAM för att bekräfta att det inte finns någon toxisk effekt på grund av Tamoxifen-behandling; Dessa krypter kunde överleva och växa normalt. För att undersöka klaudin-7-radering och överlevnadstillståndet för claudin-7 KO-koloider användes en immunfärgningsmetod och ett in situ-celldödsdetekteringssats (figur 3). Immunofluorescerande färgning för claudin-7 i skördad kontroll och cKO-organoider bekräftade framgångsrik knockout av claudin-7 i odling (Figur 3A). Dag 9 kontrollkolonioider uppvisade mycket liten apoptotisk signal (figur 3B); claudin-7 KO-koloider visade dock hög apoptos (figur 3B). Utan claudin-7 kunde stamcellerna inte överleva, förnya sig själv eller differentiera för att bilda kolonoider.
Figur 1: Schematisk representation som visar kryptisolering och kolonoidtillväxt . (A) Grafisk skildring av kryptisoleringsprocessen, plätering i 3D-matrisen och tillväxt fram till skörd. (B) Tidslinje för experiment och kolonoid tillväxt i kontroll och claudin-7 KO-härledda krypter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Claudin-7 bristfälliga kolonoider kan inte överleva och växa . (A) Representativa bilder av kontroll/DMSO-organoider dag 3 och dag 9. (B) Representativa bilder av 4OH-TAM/cKO-organoider dag 3 och dag 9, n = 10. Skalstänger = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Claudin-7 bristfälliga kolonioider genomgår snabbt apoptos. (A) Claudin-7 färgning i dag 9 kontroll/DMSO och claudin-7 cKO/4OH-TAM organoider, n = 3. Skalstänger = 250 μm. (B) Apoptotisk färgning i dag 9-kontroll och claudin-7 cKO / 4OH-TAM-kolonoider, n = 3. Skalstänger = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Organoidodling är en utmärkt modell för att studera stamcellsfunktion, tarmfysiologi, läkemedelsupptäckt, mänskliga tarmsjukdomar och vävnadsregenerering och reparation 7,8,9,10,11,26. Även om det har många fördelar kan det vara utmanande att etablera. Försiktighet måste vidtas i alla steg under hela protokollet, men viktigast av allt under pläteringssteget. När du blandar de isolerade krypterna med en gelmatris, se till att pipettera noggrant upp och ner för att bryta upp kryptpelleten som bildas efter centrifugering och fördela krypterna jämnt över hela matrisen. Undvik samtidigt att införa luftbubblor i matrisen medan du pipetterar. För att göra detta måste pipettering göras långsamt, med pipettspetsen mot botten av 1,5 ml röret.
Dessutom får gelmatrisen inte stelna helt under hela denna process. För att förhindra för tidig stelning, blanda med noggrann pipettering, placera sedan röret på is och upprepa denna process. När de isolerade krypterna och gelmatrisen är tillräckligt blandade, låt gelmatrisen stelna delvis. Denna process kan ta 1-5 min, beroende på vilken typ/märke av gelmatris som används. Det måste likna en gel som kommer att röra sig något om röret tippas, men bör inte vara för rinnande att det skulle spillas ut om det inverteras. Vid denna tidpunkt kan man börja plätera 10 μL i mitten av varje brunn. Gelmatrisen måste bilda en 3D-kupol och bör inte röra vid brunnens sidor. Om gelmatrisen sprider sig och träffar brunnens vägg, stelnar den inte tillräckligt; Vänta tills den är tillräckligt stelnad för att bilda en kupol, eftersom krypterna inte kommer att överleva och växa om kupolen inte bildas. När plätering är korrekt genomförd och krypter kompletteras tillräckligt, som förklarats ovan, förväntas organoiderna växa utan problem.
Detta protokoll etablerar ett kolonorganoidsystem med eller utan claudin-7 för att observera dess effekter på kolonstamcellsöverlevnad. Medan kolonorganoidkultur är ett innovativt och fördelaktigt system, har modellen fortfarande begränsningar. Beroende på typ av studie kan bristen på immunceller och mikrobiotan i tarmorganoider vara en fördel eller nackdel26. För den aktuella studien är det fördelaktigt att undersöka claudin-7:s regulatoriska roll på stamcellsfunktioner utan immunkomponenten. Man drog slutsatsen att en viss effekt specifikt beror på claudin-7, snarare än andra potentiella variabler såsom immunsvaret som skulle finnas i in vivo-djurmodeller . Omvänt kan denna faktor vara en begränsning för andra typer av studier. Etablering av kolonorganoidodling kan också vara dyrare och tidskrävande än traditionella 2D-cellinjer. De kan dock efterlikna den cellulära mikromiljön hos vävnader som ger in vivo-relevans, är mycket mer representativa för vävnad än 2D-cellodling och är fortfarande billigare än djurmodeller 4,7. Med tanke på tarmorganoidkulturens stora tillämpning och enorma potential kommer detta system sannolikt att bli den perfekta modellen inom laboratorieforskning över hela världen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Denna studie finansierades av NIH DK103166.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator | United States Plastic Corp | 78564 | anesthesia chamber |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | AM9261 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 1x Dulbecco’s Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
| 2-methylbutane | Sigma | 277258 | |
| 4% paraformaldehyde | ThermoFisher | J61899.AK | |
| 4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM) | Sigma | 579002 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 70 µm nylon cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96 well culture plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | |
| Claudin-7 anti-murine rabbit antibody | Immuno-Biological Laboratories | 18875 | |
| Cover glass (24 x 50-1.5) | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryomolds | vwr | 25608-916 | |
| Cultrex RCF BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | gel matrix |
| Cy3 anti-rabbit antibody | Jackson Immunoresearch | 111-165-003 | |
| Dewar Flask | Thomas Scientific | 1173F61 | |
| DMEM High Glucose with L-Glutamine | ATCC | 30-2002 | |
| EVOS FLoid Imaging System | ThermoFisher | 4477136 | |
| Fluoro-Gel II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 17985-50 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Glycine | JT Baker | 4059-02 | |
| HEPES (1 M) Buffer Solution | Gibco | 15630-080 | |
| Hoechst | ThermoFisher | 62249 | |
| In situ cell death detection kit, TMR Red | Roche | 12156792910 | |
| Isoflurane | Pivetal | 07-893-8440 | |
| L-WRN Media | Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core | N/A | |
| Mouse surgical kit | Kent Scientific Corporation | INSMOUSEKIT | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-500UG | |
| N2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Sequenza Rack | vwr | 10129-584 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S-279 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Vacuum filter (0.22 µm; cellulose acetate) | Corning | 430769 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 |
References
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Wallach, T. E., Bayrer, J. R. Intestinal organoids: new frontiers in the study of intestinal disease and physiology. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 180-185 (2017).
- Shankaran, A., Prasad, K., Chaudhari, S., Brand, A., Satyamoorthy, K. Advances in development and application of human organoids. 3 Biotech. 11 (6), 257 (2021).
- Angus, H., Butt, A., Schultz, M., Kemp, R. Intestinal organoids as a tool for inflammatory bowel disease research. Frontiers in Medicine. 6, 334 (2020).
- Fan, Y., Davidson, L. A., Chapkin, R. S. Murine colonic organoid culture system and down stream assay applications. Methods in Molecular Biology. 1576, 171-181 (2019).
- Gupta, N., et al. Microfluidics-based 3D cell culture models: Utility in novel drug discovery and delivery research. Bioengineering and Translational Medicine. 1 (1), 63-81 (2016).
- Yoo, J., Donowitz, M. Intesitnal enteroids/organoids: A novel platform for drug discovery in inflammatory bowel diseases. World Journal of Gastroenterology. 25 (30), 4125-4147 (2019).
- Qu, M., et al. Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration. Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).
- Xing, T., et al. Tight junction protein claudin-7 is essential for intestinal epithelial stem cell self-renewal and differentiation. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 641-659 (2020).
- Ding, L., et al. Inflammation and disruption of the mucosal architecture in claudin-7-deficient mice. Gastroenterology. 142 (2), 305-315 (2012).
- Lu, Z., Ding, L., Lu, Q., Chen, Y. H. Claudins in intestines: distribution and functional significance in health and diseases. Tissue Barriers. 1 (3), 24978 (2013).
- Ding, L., Lu, Z., Lu, Q., Chen, Y. H. The claudin family of proteins in human malignancy: a clinical perspective. Cancer Management and Research. 5, 367-375 (2013).
- Bhat, A. A., et al. Claudin-7 expression induces mesenchymal to epithelial transformation (MET) to inhibit colon tumorigenesis. Oncogene. 34 (35), 4570-4580 (2015).
- Lu, Z., et al. A non-tight junction function of claudin-7-interaction with integrin signaling in suppressing lung cancer cell proliferation and detachement. Molecular Cancer. 14, 120 (2015).
- Wang, K., Xu, C., Li, W., Ding, L. Emerging clinical significance of claudin-7 in colorectal cancer: a review. Cancer Management and Research. 10, 3741-3752 (2018).
- Wang, K., et al. Claudin-7 downregulation induces metastasis and invasion in colorectal cancer via the promotion of epithelial-mesenchymal transition. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (3), 797-804 (2019).
- Wang, F., et al. Isolation and characterization of intestinal stem cells based on surface marker combinations and colony-formation assay. Gastroenterology. 145 (2), 383 (2013).
- Li, W., et al. Severe intestinal inflammation in the small intestine of mice induced by controllable deletion of claudin-7. Digestive Diseases and Sciences. 63 (5), 1200-1209 (2018).
- Donovan, J., Brown, P. Euthanasia. Current Protocols in Immunology. 73 (1), (2006).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. Journal of Visual Experiments. (80), e50611 (2013).
- Sugimoto, K., et al. Cell adhesion signals regulate the nuclear receptor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (49), 24600-24609 (2019).
- Mansour, H., et al. Connexin 30 expression and frewuency of connexin heterogeneity in astrocyte gap junction plaques increase with age in the rat retina. PLoS One. 8 (3), 57038 (2013).
- Miranda, M., et al. Antioxidants rescue photoreceptors in rd1 mice: relationship with thiol metabolism. Free Radical Biology and Medicine. 48 (2), 216-222 (2010).
- Wang, L., et al. Mesenchymal stromal cells ameliorate oxidative stress-induced islet endothelium apoptosis and functional impairment via Wnt4-β-catenin signaling. Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 188 (2017).
- Almeqdadi, M., Mana, M., Roper, J., Yilmaz, O. Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).
