Summary
Denne protokollen beskriver etablering av et murine colonic organoid system for å studere aktiviteten og funksjonen til kolonstamceller i en claudin-7 knockout-modell.
Abstract
Tarmepitelet regenereres hver 5-7 dag, og styres av populasjonen av tarmepitelstamceller (IESC) som ligger nederst i kryptområdet. IESCs inkluderer aktive stamceller, som selvfornyer og differensierer i ulike epitelcelletyper, og hvilende stamceller, som fungerer som reserve stamceller i tilfelle skade. Regenerering av tarmepitelet styres av de selvfornyende og differensierende egenskapene til disse aktive IESC-ene. I tillegg er balansen mellom kryptstamcellepopulasjonen og vedlikehold av stamcellenisjen avgjørende for intestinal regenerering. Organoidkultur er en viktig og attraktiv tilnærming til å studere proteiner, signalmolekyler og miljømessige signaler som regulerer stamcelleoverlevelse og funksjoner. Denne modellen er billigere, mindre tidkrevende og mer manipulerbar enn dyremodeller. Organoider etterligner også vevets mikromiljø, og gir in vivo relevans. Den nåværende protokollen beskriver isoleringen av kolonkrypter, innebygging av disse isolerte kryptcellene i et tredimensjonalt gelmatrisesystem og dyrking av kryptceller for å danne kolonorganoider som er i stand til selvorganisasjon, spredning, selvfornyelse og differensiering. Denne modellen gjør det mulig å manipulere miljøet - slå ut spesifikke proteiner som claudin-7, aktivere / deaktivere signalveier, etc. - for å studere hvordan disse effektene påvirker funksjonen av kolonstamceller. Spesielt ble rollen som tett kryssprotein claudin-7 i kolon stamcellefunksjon undersøkt. Claudin-7 er viktig for å opprettholde intestinal homeostase og barrierefunksjon og integritet. Knockout av claudin-7 hos mus induserer en inflammatorisk tarmsykdomslignende fenotype som utviser tarmbetennelse, epitelhyperplasi, vekttap, slimhinnesår, epitelcellesloughing og adenomer. Tidligere ble det rapportert at claudin-7 er nødvendig for tarmepitelial stamcellefunksjoner i tynntarmen. I denne protokollen er et kolonorganoidkultursystem etablert for å studere rollen som claudin-7 i tyktarmen.
Introduction
Intestinal organoidkultur er et tredimensjonalt (3D) ex vivo-system der stamceller isoleres fra tarmkryptene i primærvev og belagt i en gelmatrise 1,2. Disse stamcellene er i stand til selvfornyelse, selvorganisering og organfunksjonalitet2. Organoider etterligner vevsmikromiljøet og ligner mer på in vivo-modeller enn todimensjonale (2D) in vitro cellekulturmodeller, selv om de er mindre manipulerbare enn celler 3,4. Denne modellen eliminerer hindringer som oppstår i 2D-modeller, for eksempel mangel på riktig celle-celle-adhesjoner, celle-matrise-interaksjoner og homogene populasjoner, og reduserer også begrensningene i dyremodeller, inkludert høye kostnader og lange tidsperioder5. Intestinale organoider - også referert til som kolonoider for de som vokser fra kolonkryptavledede stamceller - er i hovedsak miniorganer som inneholder et epitel, inkludert alle celletyper som ville være tilstede in vivo, samt et lumen. Denne modellen tillater manipulering av systemet for å studere mange aspekter av tarmen, for eksempel stamcellenisje, tarmfysiologi, patofysiologi og tarmmorfogenese 3,5,6. Det gir også en flott modell for narkotikaforskning, studerer menneskelige tarmlidelser som inflammatorisk tarmsykdom (IBD) og kolorektal kreft, pasientspesifikk personlig behandlingsutvikling og studerer vevregenerering 4,7,8,9. I tillegg kan organoidsystemet også brukes til å studere cellulær kommunikasjon, stoffmetabolisme, levedyktighet, spredning og respons på stimuli 7,8. Mens dyremodeller kan brukes til å teste potensielle terapier for intestinale patologiske forhold, er de ganske begrensede, da det er en utfordring å studere flere stoffer samtidig. Det er flere forvirrende variabler in vivo, og tilhørende kostnader og tid er henholdsvis høye og lange. På den annen side tillater organoidkultursystemet screening av mange terapier samtidig i en kortere tidsperiode og tillater også personlig behandling ved bruk av pasientavledet organoidkultur 4,8. Evnen til kolonorganoider til å etterligne vevsorganisasjon, mikromiljø og funksjonalitet gjør dem også til en utmerket modell for å studere regenerering og vevsreparasjon9. Vårt laboratorium har etablert et tynntarmorganoidkultursystem for å studere effekten av claudin-7 på tynntarmens stamcellefunksjoner10. I denne studien er et stort intestinal organoidkultursystem etablert for å studere stamcellers evne, eller mangel på evne, til selvfornyelse, differensiering og spredning i en betinget claudin-7 knockout (cKO) modell.
Claudin-7 er et svært viktig tett kryss (TJ) protein som er sterkt uttrykt i tarmen og er avgjørende for å opprettholde TJ-funksjon og integritet11. cKO-mus lider av en IBD-lignende fenotype, som viser alvorlig betennelse, sårdannelser, epitelcelle-sloughing, adenomer og økte cytokinnivåer11,12. Selv om det er allment akseptert at claudiner er avgjørende for epitelbarrierefunksjon, dukker det opp nye roller for claudiner; De er involvert i spredning, migrasjon, kreftprogresjon og stamcellefunksjon 10,12,13,14,15,16,17. Det er foreløpig ukjent hvordan claudin-7 påvirker stamcellenisjen og funksjonen til kolonstamceller. Siden tarmen raskt fornyes omtrent hver 5-7 dag, er vedlikehold av stamcellenisjen og riktig funksjon av de aktive stamcellene avgjørende18. Her etableres et system for å undersøke de potensielle regulatoriske effektene av claudin-7 på colonic stamcelle nisje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk og prosedyrer ble godkjent av East Carolina University (ECU) Animal Care and Use Committee (IACUC) og utført i samsvar med retningslinjer fra National Institutes of Health og ECU om pleie og bruk av forsøksdyr. Induserbare, tarmspesifikke claudin-7 knockoutmus ble generert ved å krysse C57BL6 claudin-7-flox transgene mus med Villin-CreERT2 mus19. Hann- og hunnmus i alderen 3 måneder ble brukt i denne studien.
1. Klargjøring av reagens/utstyr
- Avkjøl følgende reagenser/utstyr før du starter de tilknyttede eksperimentene: fosfatbufret saltvann (PBS) for vasking av kolonvev under kryptisolasjon; en vippe/rotator (plassert i et 4 °C kjøleskap) for inkubasjon med epiteldissosiasjonsmedier.
- Fjern gelmatrisen (se Materialfortegnelse) fra -20 °C og tine på is før plettering.
- Forkjøl sentrifugen til 4 °C før du spinner ned krypter for plating.
- Avkjøl 0,1 % natriumsitratbuffer (se materialfortegnelse) og hold på is før in situ celledødsdeteksjon.
- Varm følgende reagenser før du starter sine tilknyttede eksperimenter: en 96-brønns kulturplate i 24 timer før plating; L-WRN-medier (se Materialfortegnelse) før de legges til i belagte krypter og før hver medieendring.
- Varm opp vannbadet til 94 °C før farging.
2. Murine colonic krypt isolasjon
- Forbered det nødvendige mediet ved å følge trinnene nedenfor.
MERK: Medievolumene beregnes her for kolonvevet til to mus.- Forbered epiteldissosiasjonsmedier: 30 ml 1x PBS + 400 μL 0,5 M EDTA + 50 μL 10 mM Y-27632 dihydroklorid (se materialtabell). Hold på isen til bruk.
- Forbered kryptodissosiasjonsmedier: 10 ml 1x PBS + 10 μL 10 mM Y-27632 dihydroklorid. Hold på isen til bruk.
- Supplement L-WRN media: 50 ml L-WRN media + 47,5 ml DMEM høy glukose med L-glutamin + 500 μL L-glutamin + 500 μL av pennicilin / streptomycin + 1,000 μL av B-27 supplement (50x) + 500 μL av N2 supplement (100x) + 50 μL av HEPES (1 M) buffer løsning (se tabell over materialer).
- Filtrer hele (supplerte) L-WRN-mediet og aliquot for oppbevaring ved -20 °C i opptil 3 måneder.
MERK: Tinte medier er stabile ved 4 °C i opptil 2 uker.
- Utfør kryptisolasjonen.
- For generell anestesi, tilsett 1 ml isofluran til bomull og legg den inne i en plastkassett i et anestesikammer på 0,09 kubikkfot (se materialtabell). Plasser musen i anestesikammeret til pusten stopper (ca. 3-5 min) og utfør deretter livmorhalsforstyrrelse20.
- Gjør en ca 2 i snitt ned midtlinjen av musen, pinning baksiden huden for å eksponere magen. Isoler tykktarmen ved å kutte like under cecum fra proksimal side og over endetarmen fra distale side21.
- Bruk tang, fjern fettvevet festet til tykktarmen. Skyv avføringen forsiktig ut ved hjelp av den flate enden av tangen og kutt vevet åpent i lengderetningen.
- Vask vevet 10-15 ganger med kald 1x PBS ved hjelp av tang for å "virvle" vevet rundt i PBS mellom vasker.
- Bruk ren, skarp saks, kutt vevet i små biter, ca 3-5 mm i størrelse.
- Gjenta prosessen for den andre musen og kombiner vevsbitene i et 50 ml rør som inneholder kaldepiteldissosiasjonsmedier (trinn 2.1.1).
- Inkuber tykktarmsvevbitene i epiteldissosiasjonsmedier i 90 minutter ved 4 °C med skånsom gynging.
- La vevfragmentene synke til bunnen av røret, og kast deretter forsiktig epiteldissosiasjonsmediet uten å forstyrre vevet. Gjenta denne prosessen når du vasker vevet 10-15 ganger med kald 1x PBS. Kast så mye PBS som mulig under den endelige vasken.
- Tilsett kryptodissosiasjonsmedier (trinn 2.1.2) til 50 ml røret som inneholder kolonvevsstykker og rist kontinuerlig i 5-10 minutter for hånd.
MERK: Mediene må bli overskyet fra de dissosierte kryptene. - Under cellekulturhetten, filtrer vevet og mediet med en 70 μm nyloncellesil (se Materialtabell) i et friskt 50 ml rør.
- Sentrifuge ved 200 x g i 10 minutter ved romtemperatur og kast supernatanten uten å forstyrre den kryptholdige pelleten.
MERK: Avhengig av utstyret kan man overføre det anstrengte mediet til et 15 ml rør for sentrifugering. - Resuspender pelleten i ~ 3-4 ml kald 1x PBS.
- Pipette 10 μL av de isolerte kryptene i en linje på et mikroskop lysbilde. Under mikroskopet teller du antall fulle, lange krypter for å estimere kryptkonsentrasjonen per 10 μL.
- Beregn riktig volum av krypter å spinne ned for å plate 10 krypter / μL i en 96-brønns plate.
3. Kryptbelegg
- Sentrifuge et passende volum av isolerte krypter i et 1,5 ml mikrosentrifugerør ved 200 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Fjern supernatanten forsiktig ved hjelp av en pipette på 1000 μL uten å forstyrre pelletskryptene.
- Tilsett 100 μL gelmatrise (nok til ni brønner) til pelleterte krypter og pipette forsiktig for å unngå å introdusere luftbobler.
MERK: Se diskusjonsdelen for en detaljert beskrivelse av hvordan du blander gelmatrisen og kryptene. Vanligvis er 100 μL tilstrekkelig for ni brønner. - La gelmatrisen delvis stivne (~ 1-2 min).
- Plate 10 μL av gelmatrisen blandet med kryptene i hver brønn av en forvarmet 96-brønns kulturplate for å danne en kuppelform.
MERK: Plasser kuppelen i midten av brønnen. Vær forsiktig så ikke gelmatrisen sprer seg til sidene av brønnen. Se diskusjonsdelen for en detaljert beskrivelse av størkning og plating. - La gelmatrisen være helt innstilt i 10-20 minutter i en inkubator ved 37 °C med 5 % CO2.
- Forbered den endelige arbeidsløsningen for L-WRN-medier.
- Tilsett 100 μL pennicilin/streptomycin til en 10 ml aliquot av L-WRN media (se trinn 2.1.3) (stabil i 2 uker ved 4 °C).
- Legg til kosttilskudd til 900 μL L-WRN-medier med pennicilin / streptomycin: 0,9 μL 1 mg / ml EGF + 0,9 μL 10 mM Y-27632 dihydroklorid.
MERK: Volumene er basert på ni brønner. Y-27632 dihydroklorid tilsettes bare på dag 0 (på tidspunktet for plating).
- Tilsett 100 μL medier til hver brønn. Vær forsiktig så du ikke forstyrrer kuppelen.
- Inkuber ved 37 °C med 5 % CO2 i 24 timer.
4. Opprette claudin-7 knockout i kultur
- La kryptene vokse normalt i kultur i 24 timer etter plating.
- I et 1,5 ml mikrosentrifugerør tilsettes 2,7 μL 1 mmol / L 4-hydroksytamoxifen (4OH-Tamoxifen) til 900 μL L-WRN-medier (endelig konsentrasjon på 3 μmol / L) + 0,9 μL 1 mg / ml EGF.
MERK: Stamløsningen av 4OH-Tamoxifen fremstilles ved blanding av pulverisert 4OH-Tamoxifen (se Materialfortegnelse) med 1x PBS til en konsentrasjon på 1 mmol / L. - Fjern gamle medier fra brønnene via vakuumsug.
- Tilsett 100 μL 4OH-Tamoxifen-holdige medier til hver brønn og merk dem som claudin-7 cKO/4OH-TAM.
MERK: DMSO må legges til kontrollbrønnene. Ferske 4OH-Tamoxifen-holdige medier må tilsettes hver 2. - Inkuber ved 37 °C til neste medieendring (~2-3 dager).
5. Kolonisk organoid vedlikehold
MERK: Media må endres hver 2-3 dag. Kultur opptil 12 dager.
- Forbered en ny endelig arbeidsløsning av L-WRN-medier: 900 μL L-WRN-medier + 0,9 μL 1 mg / ml EGF.
- Fjern gamle medier fra brønnene via vakuumsug. Legg til ferske medier i brønnene.
MERK: Vær forsiktig så du ikke forstyrrer kuppelen. - Inkuber ved 37 °C til neste medieskifte.
MERK: Kulturer kan opprettholdes og passasjen i den varigheten som er ønsket for eksperimentet. Kulturene for denne studien ble vanligvis opprettholdt i mellom 9-12 dager, men man kan ønske å fortsette videre, i 15 eller 20 dager.
6. Høsting og innebygging av kolonorganoider
- Fjern gamle medier fra brønnene via vakuumsug.
- Fest organoider med 4% paraformaldehyd (PFA) i 1 time ved romtemperatur.
MERK: PFA er et giftig materiale. Ta forholdsregler når du bruker dette reagenset. - Fjern 4 % PFA fra brønnene via vakuumsug og tilsett 30 % sukrose i 24 timer ved 4 °C.
- Merk en plastform og fyll den til 90 % med optimal skjæretemperatur (OCT) (se materialfortegnelse).
- Fjern 30 % sukrose fra brønnene via vakuumsug. Tilsett 10 μL 1x PBS til hver brønn.
- Skrap bunnen av brønnen forsiktig med en pipettespiss for å dissosiere kuppelen som inneholder organoider.
- Med en pipette, fjern PBS som inneholder de dissosierte organoider og legg væsken inn i formen som inneholder OCT.
MERK: Unngå å introdusere bobler i OCT-forbindelsen. - Fortsett denne prosessen til alle organoider er fjernet fra alle brønner.
- I en Dewar-kolbe i rustfritt stål, tilsett tørrispellets og 2-metylbutan (nok til å dekke tørrispelletsene) (se materialtabell).
- Hold den organoidholdige OCT-blokken jevnt over 2-metylbutan for å blinke fryse.
- Oppbevar den organoidholdige OCT-blokken ved -80 °C til den er klar til snitt (kan oppbevares i opptil 1 år).
7. Immunfluorescens
- Seksjon den organoidholdige OCT-blokken med en tykkelse på 5 μm ved bruk av en kryostat (se materialtabell) ved -20 °C.
- For hver seksjon, sjekk under mikroskopet for å sikre at en organoid ble fanget. Når snittingen er fullført, oppbevar lysbildene ved -80 °C til de er klare til å flekke (kan oppbevares i opptil 6 måneder).
- Varm lysbildene i 10 mM natriumsitratbuffer i 10 minutter ved 94 °C.
MERK: Bufferen er laget ved å oppløse natriumcitrat i avionisert vann. Juster pH til 6 med saltsyre. - La skliene avkjøles på benken i 20 min. Skyll med destillert vann i 5 min.
- Monter lysbildene i et fargestativ (se materialtabell) med 0,2% Triton X-100 og inkuber med 100 mM glycin i 15 minutter.
- Skyll tre ganger med 1x PBS i 5 minutter hver. Blokk med 5% bovint serumalbumin (BSA) i 45 minutter ved romtemperatur.
- Inkuber med claudin-7 anti-murine kanin primært antistoff22 (fortynnet i 1% BSA) over natten ved 4 ° C. Skyll tre ganger med 1x PBS i 10 minutter hver.
- Inkuber med Cy3 anti-kanin sekundært antistoff23 (fortynnet i 1% BSA) i 1 time ved romtemperatur. Skyll tre ganger med 1x PBS i 10 minutter hver.
- Monter lysbildene med et passende monteringsmedium (se Materialfortegnelse) med DAPI og legg til et deksel.
8. Påvisning av celledød
- Fest organoider inne i brønnene med 4% paraformaldehyd i 1 time ved romtemperatur. Skyll med 1x PBS i 5 min.
- Inkuber kulturplaten på is med 0,1% Triton X-100 i kald 0,1% natriumcitratbuffer i 2 minutter. Skyll to ganger med 1x PBS i 5 minutter hver.
- Klargjør TUNEL-reaksjon24,25 ved hjelp av TMR Red, et in situcelledødsdeteksjonssett (se materialfortegnelse). Tilsett 50 μL TUNEL reaksjonsreagenser til hver brønn.
- Inkuber i en fuktet atmosfære i 1 time ved 37 °C i mørket.
MERK: Alle de gjenværende trinnene må fullføres i mørket. - Skyll tre ganger med 1x PBS i 5 minutter hver. Inkuber med 1: 2,500 Hoechst (fortynnet i 1x PBS, se materialtabell) i 3 minutter.
- Skyll tre ganger med 1x PBS i 5 minutter hver. Bruk TRITC-filteret til å visualisere bilder på et fluorescerende mikroskop (se Materialtabell).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å undersøke reguleringseffektene av claudin-7 på kolonstamceller ble kolonkrypter isolert fra murine kolonvev som beskrevet ovenfor og vist i figur 1A. Når kryptene var isolert fra primærvevet, ble de belagt i en 3D-matrise i en 96-brønnsplate for å vokse i 11 dager (figur 1). Normale friske krypter vil lukke lumen og bli sfæroider innen dag 2 og til slutt begynne å spire og danne de forskjellige epitelcelletypene omtrent på dag 5 (figur 1B). Kolonoider fikk vokse til dag 11, hvor de deretter ble høstet for videre eksperimenter (figur 1B). For å knockout claudin-7 i kultur, fikk kryptene lov til å vokse normalt i 24 timer. Etter 24 timer ble kryptene behandlet med 3 μmol / L 4OH-Tamoxifen (TAM) og dyrket i ytterligere 10 dager. Kulturmediet med fersk 4OH-TAM ble endret hver 2. DMSO ble brukt som kjøretøy i kontrollbrønner. Claudin-7 mangelfulle krypter (claudin-7 KO) klarte ikke å danne riktige sfæroider og begynte raskt å dø etter 1 dag med 4OH-TAM-behandling (figur 1B).
Figur 2A fremhever den vellykkede veksten av kolonoider fra normale krypter som inneholder claudin-7 (kontroll) når de utvikler seg gjennom de 9 dagene av kulturen. Disse kryptene begynte å danne sfæroider ved dag 2, begynte å spire på dag 5, og fortsatte å vokse og spire til de ble høstet på dag 9 (figur 2A). I motsetning til dette ble krypter som manglet claudin-7 (claudin-7 KO) forverret veldig raskt (figur 2B). Omtrent 2-3 dager etter behandling med 4OH-TAM hadde claudin-7 KO-krypter ikke dannet sunne sfæroider og dukket bare opp som sirkulære klumper av celler (figur 2B). Krypter isolert fra villtypemus ble behandlet med 4OH-TAM for å bekrefte at det ikke er noen toksisk effekt på grunn av Tamoxifen-behandling; Disse kryptene var i stand til å overleve og vokse normalt. For å undersøke claudin-7-delesjon og overlevelsestilstanden til claudin-7 KO-kolonoider ble det benyttet immunostaining-metode og in situ celledødsdeteksjonssett (figur 3). Immunfluorescerende farging for claudin-7 i høstet kontroll og cKO-organoider bekreftet vellykket knockout av claudin-7 i kultur (figur 3A). Dag 9 kontrollkolonoider viste svært lite apoptotisk signal (figur 3B); Claudin-7 KO-kolonoider viste imidlertid høy apoptose (figur 3B). Uten claudin-7 kunne stamcellene ikke overleve, fornye seg selv eller differensiere for å danne kolonoider.
Figur 1: Skjematisk fremstilling som viser kryptisolasjon og kolonoidvekst . (A) Grafisk skildring av kryptisolasjonsprosessen, plating i 3D-matrisen og vekst til høsting. (B) Tidslinje for eksperimenter og kolonioid vekst i kontroll og claudin-7 KO-avledede krypter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Claudin-7 mangelfulle kolonoider er ikke i stand til å overleve og vokse . (A) Representative bilder av kontroll/DMSO-organoider på dag 3 og dag 9. (B) Representative bilder av 4OH-TAM/cKO-organoider på dag 3 og dag 9, n = 10. Skala barer = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Claudin-7 mangelfulle kolonoider gjennomgår raskt apoptose. (A) Claudin-7-farging i dag 9 kontroll/DMSO og claudin-7 cKO/4OH-TAM organoider, n = 3. Skalastenger = 250 μm. (B) Apoptotisk farging i dag 9 kontroll og claudin-7 cKO/4OH-TAM kolonoider, n = 3. Skala barer = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Organoidkultur er en utmerket modell for å studere stamcellefunksjon, tarmfysiologi, narkotikaforskning, menneskelige tarmsykdommer og vevregenerering og reparasjon 7,8,9,10,11,26. Selv om det har mange fordeler, kan det være utfordrende å etablere. Det må utvises forsiktighet i alle trinn gjennom protokollen, men viktigst under platingfasen. Når du blander de isolerte kryptene med en gelmatrise, må du sørge for å pipette grundig opp og ned for å bryte opp kryptpelleten dannet etter sentrifugering og fordele kryptene jevnt over hele matrisen. Unngå samtidig å introdusere luftbobler i matrisen under pipettering. For å gjøre dette må pipettering gjøres sakte, med pipettespissen mot bunnen av 1,5 ml røret.
I tillegg må gelmatrisen ikke størknes fullstendig gjennom denne prosessen. For å forhindre for tidlig størkning, bland ved forsiktig pipettering, legg deretter røret på is og gjenta denne prosessen. Når de isolerte kryptene og gelmatrisen er tilstrekkelig blandet, la gelmatrisen stivne delvis. Denne prosessen kan ta 1-5 min, avhengig av type / merke av gelmatrise som brukes. Det må ligne en gel som vil bevege seg litt hvis røret er tippet, men bør ikke være for rennende at det ville søle ut hvis invertert. På dette tidspunktet kan man begynne å plating 10 μL inn i midten av hver brønn. Gelmatrisen må danne en 3D-kuppel og skal ikke berøre sidene av brønnen. Hvis gelmatrisen sprer seg og treffer veggen av brønnen, blir den ikke størknet nok; Vent til den er tilstrekkelig størknet til å danne en kuppel, da kryptene ikke vil overleve og vokse hvis kuppelen ikke dannes. Når plating er fullført riktig, og krypter er tilstrekkelig supplert, som forklart ovenfor, forventes organoider å vokse uten problemer.
Denne protokollen etablerer et kolonorganoidsystem med eller uten claudin-7 for å observere dens effekter på kolonstamcelleoverlevelse. Mens kolonorganoidkultur er et innovativt og fordelaktig system, har modellen fortsatt begrensninger. Avhengig av type studie kan mangel på immunceller og mikrobiota i tarmorganoider være en fordel eller ulempe26. For denne studien er det fordelaktig å undersøke claudin-7s regulatoriske rolle på stamcellefunksjoner uten immunkomponenten. Det ble konkludert med at en viss effekt er spesielt på grunn av claudin-7, snarere enn andre potensielle variabler som immunresponsen som ville være tilstede i in vivo dyremodeller. Omvendt kan denne faktoren være en begrensning for andre typer studier. Etablering av kolonorganoidkultur kan også være mer kostbart og tidkrevende enn tradisjonelle 2D-cellelinjer. Imidlertid kan de etterligne det cellulære mikromiljøet i vev som gir in vivo relevans, er mye mer representative for vev enn 2D-cellekultur, og er fortsatt mindre kostbare enn dyremodeller 4,7. Gitt tarmorganoidkulturens enorme anvendelse og enorme potensial, vil dette systemet sannsynligvis bli den ideelle modellen i laboratorieforskning over hele verden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne studien ble finansiert av NIH DK103166.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator | United States Plastic Corp | 78564 | anesthesia chamber |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | AM9261 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 1x Dulbecco’s Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
| 2-methylbutane | Sigma | 277258 | |
| 4% paraformaldehyde | ThermoFisher | J61899.AK | |
| 4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM) | Sigma | 579002 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 70 µm nylon cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96 well culture plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | |
| Claudin-7 anti-murine rabbit antibody | Immuno-Biological Laboratories | 18875 | |
| Cover glass (24 x 50-1.5) | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryomolds | vwr | 25608-916 | |
| Cultrex RCF BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | gel matrix |
| Cy3 anti-rabbit antibody | Jackson Immunoresearch | 111-165-003 | |
| Dewar Flask | Thomas Scientific | 1173F61 | |
| DMEM High Glucose with L-Glutamine | ATCC | 30-2002 | |
| EVOS FLoid Imaging System | ThermoFisher | 4477136 | |
| Fluoro-Gel II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 17985-50 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Glycine | JT Baker | 4059-02 | |
| HEPES (1 M) Buffer Solution | Gibco | 15630-080 | |
| Hoechst | ThermoFisher | 62249 | |
| In situ cell death detection kit, TMR Red | Roche | 12156792910 | |
| Isoflurane | Pivetal | 07-893-8440 | |
| L-WRN Media | Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core | N/A | |
| Mouse surgical kit | Kent Scientific Corporation | INSMOUSEKIT | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-500UG | |
| N2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Sequenza Rack | vwr | 10129-584 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S-279 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Vacuum filter (0.22 µm; cellulose acetate) | Corning | 430769 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 |
References
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Wallach, T. E., Bayrer, J. R. Intestinal organoids: new frontiers in the study of intestinal disease and physiology. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 180-185 (2017).
- Shankaran, A., Prasad, K., Chaudhari, S., Brand, A., Satyamoorthy, K. Advances in development and application of human organoids. 3 Biotech. 11 (6), 257 (2021).
- Angus, H., Butt, A., Schultz, M., Kemp, R. Intestinal organoids as a tool for inflammatory bowel disease research. Frontiers in Medicine. 6, 334 (2020).
- Fan, Y., Davidson, L. A., Chapkin, R. S. Murine colonic organoid culture system and down stream assay applications. Methods in Molecular Biology. 1576, 171-181 (2019).
- Gupta, N., et al. Microfluidics-based 3D cell culture models: Utility in novel drug discovery and delivery research. Bioengineering and Translational Medicine. 1 (1), 63-81 (2016).
- Yoo, J., Donowitz, M. Intesitnal enteroids/organoids: A novel platform for drug discovery in inflammatory bowel diseases. World Journal of Gastroenterology. 25 (30), 4125-4147 (2019).
- Qu, M., et al. Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration. Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).
- Xing, T., et al. Tight junction protein claudin-7 is essential for intestinal epithelial stem cell self-renewal and differentiation. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 641-659 (2020).
- Ding, L., et al. Inflammation and disruption of the mucosal architecture in claudin-7-deficient mice. Gastroenterology. 142 (2), 305-315 (2012).
- Lu, Z., Ding, L., Lu, Q., Chen, Y. H. Claudins in intestines: distribution and functional significance in health and diseases. Tissue Barriers. 1 (3), 24978 (2013).
- Ding, L., Lu, Z., Lu, Q., Chen, Y. H. The claudin family of proteins in human malignancy: a clinical perspective. Cancer Management and Research. 5, 367-375 (2013).
- Bhat, A. A., et al. Claudin-7 expression induces mesenchymal to epithelial transformation (MET) to inhibit colon tumorigenesis. Oncogene. 34 (35), 4570-4580 (2015).
- Lu, Z., et al. A non-tight junction function of claudin-7-interaction with integrin signaling in suppressing lung cancer cell proliferation and detachement. Molecular Cancer. 14, 120 (2015).
- Wang, K., Xu, C., Li, W., Ding, L. Emerging clinical significance of claudin-7 in colorectal cancer: a review. Cancer Management and Research. 10, 3741-3752 (2018).
- Wang, K., et al. Claudin-7 downregulation induces metastasis and invasion in colorectal cancer via the promotion of epithelial-mesenchymal transition. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (3), 797-804 (2019).
- Wang, F., et al. Isolation and characterization of intestinal stem cells based on surface marker combinations and colony-formation assay. Gastroenterology. 145 (2), 383 (2013).
- Li, W., et al. Severe intestinal inflammation in the small intestine of mice induced by controllable deletion of claudin-7. Digestive Diseases and Sciences. 63 (5), 1200-1209 (2018).
- Donovan, J., Brown, P. Euthanasia. Current Protocols in Immunology. 73 (1), (2006).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. Journal of Visual Experiments. (80), e50611 (2013).
- Sugimoto, K., et al. Cell adhesion signals regulate the nuclear receptor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (49), 24600-24609 (2019).
- Mansour, H., et al. Connexin 30 expression and frewuency of connexin heterogeneity in astrocyte gap junction plaques increase with age in the rat retina. PLoS One. 8 (3), 57038 (2013).
- Miranda, M., et al. Antioxidants rescue photoreceptors in rd1 mice: relationship with thiol metabolism. Free Radical Biology and Medicine. 48 (2), 216-222 (2010).
- Wang, L., et al. Mesenchymal stromal cells ameliorate oxidative stress-induced islet endothelium apoptosis and functional impairment via Wnt4-β-catenin signaling. Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 188 (2017).
- Almeqdadi, M., Mana, M., Roper, J., Yilmaz, O. Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).
