Summary
Um eine experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis, ein Tiermodell für Multiple Sklerose, zu induzieren, werden Mäuse mit einer Wasser-in-Öl-Emulsion immunisiert, die ein Autoantigen und ein komplettes Freund-Adjuvans enthält. Während für die Herstellung dieser Emulsionen mehrere Protokolle existieren, wird hier ein schnelles, einfaches und standardisiertes Homogenisierungsprotokoll für die Emulsionsherstellung vorgestellt.
Abstract
Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) weist ähnliche immunologische und klinische Merkmale wie Multiple Sklerose (MS) auf und wird daher häufig als Modell verwendet, um neue Wirkstoffziele für eine bessere Patientenbehandlung zu identifizieren. MS ist durch verschiedene Krankheitsverläufe gekennzeichnet: schubförmig-remittierende MS (RRMS), primär progrediente MS (PPMS), sekundär progrediente MS (SPMS) und eine seltene progressiv-schubförmige Form der MS (PRMS). Obwohl Tiermodelle nicht alle diese kontrastierenden Phänotypen menschlicher Krankheiten genau nachahmen, gibt es EAE-Modelle, die einige der verschiedenen klinischen Manifestationen von MS widerspiegeln. Zum Beispiel ahmt Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG)-induzierte EAE in C57BL / 6J-Mäusen menschliches PPMS nach, während Myelin-Proteolipidprotein (PLP)-induzierte EAE in SJL / J-Mäusen RRMS ähnelt. Andere Autoantigene, wie Myelin Basic Protein (MBP), und eine Reihe verschiedener Mausstämme werden ebenfalls verwendet, um EAE zu untersuchen. Um eine Erkrankung in diesen Autoantigen-Immunisierungs-EAE-Modellen zu induzieren, wird eine Wasser-in-Öl-Emulsion hergestellt und subkutan injiziert. Die meisten EAE-Modelle erfordern auch eine Injektion von Pertussis-Toxin, damit sich die Krankheit entwickeln kann. Für eine konsistente und reproduzierbare EAE-Induktion ist ein detailliertes Protokoll zur Herstellung der Reagenzien zur Herstellung von Antigen-/Adjuvansemulsionen erforderlich. Das hier beschriebene Verfahren nutzt ein standardisiertes Verfahren zur Erzeugung von Wasser-in-Öl-Emulsionen. Es ist einfach und schnell und verwendet einen Schüttelhomogenisator anstelle von Spritzen, um qualitätskontrollierte Emulsionen herzustellen.
Introduction
Ein Zusammenbruch der immunologischen Toleranz kann zur Entstehung von Autoimmunerkrankungen wie Multipler Sklerose (MS) führen. Es wird geschätzt, dass weltweit 2,8 Millionen Menschen mit MS leben1. Obwohl die genaue Ursache der MS noch weitgehend unbekannt ist, spielen Dysregulation autoreaktiver T- und B-Zellen sowie Defekte in der Treg-Funktion eine wichtige Rolle bei der Pathogenese der Erkrankung 2,3.
Tiermodelle von Autoimmunerkrankungen sind wesentliche Werkzeuge, um mögliche therapeutische Modalitäten zu untersuchen. Das experimentelle Modell der autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) wird seit fast einem Jahrhundert von Forschern verwendet, die sich für MS4 interessieren. In frühen Experimenten war die Inzidenz der Krankheit relativ gering. Die Einführung eines vollständigen Freund-Adjuvans (CFA), das Mycobacterium und Pertussis-Toxin enthält, ermöglichte die konsistente Induktion von EAE bei Mäusen4. Am wichtigsten ist, dass CFA mit einem ZNS-spezifischen Antigen gemischt werden muss, um eine homogene Wasser-in-Öl-Emulsion zur Induktion von EAE zu erzeugen. Die derzeit gebräuchlichsten EAE-Modelle basieren auf der aktiven Immunisierung von Mäusen mit enzephalitogenen Peptiden. Der genetische Hintergrund der Mäuse spielt eine wichtige Rolle bei der Krankheitsanfälligkeit, wobei Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG35-55) und Myelin-Proteolipidprotein (PLP139-151) Peptide verwendet werden, um EAE in C57BL / 6J- bzw. SJL-Mäusen zu induzieren5. Es können jedoch auch andere Mausstämme und ZNS-abgeleitete Peptide verwendet werden.
Die Qualität der CFA/Peptid-Emulsion ist ein kritischer Faktor, der die Krankheitspenetranz im aktiven ImmunisierungsmodellEAE 6 bestimmt. Eine homogene Wasser-in-Öl-Emulsion muss hergestellt werden, indem die in wässrigem Puffer gelösten enzephalitogenen Peptide mit CFA gemischt werden, da sonst Tiere die Krankheit nicht entwickeln. Zur Herstellung von CFA/Peptid-Emulsionen wurden zahlreiche Protokolle veröffentlicht. Beispiele umfassen die Verwendung eines Wirbels7, Ultraschall8, Spritzen und eines Drei-Wege-T-Steckers9 oder einer Spritze nur5. Alle diese Methoden sind jedoch schwer zu standardisieren und oft mit langwierigen und komplizierten Protokollen verbunden.
Im Vergleich zu allen oben genannten Methoden bietet die hier beschriebene einfache Methode zur Emulsionsherstellung den Vorteil, dass sie keine Unterschiede von Mensch zu Mensch aufweist und relativ schnell ist. Die Emulsion wird durch einen Homogenisator erzeugt, der die Reagenzien mit einer eingestellten Geschwindigkeit, Zeit und Temperatur schüttelt, um schnelle und konsistente Ergebnisse zu gewährleisten. Neben der Induktion von Krankheiten im EAE-Modell kann diese Methode auch verwendet werden, um andere Autoimmunerkrankungsmodelle wie Kollagen-induzierte Arthritis (CIA) und Antigen-induzierte Arthritis (AIA) zu untersuchen6. Daher wird erwartet, dass diese Methode verwendet werden kann, um Krankheiten in anderen Tiermodellen konsistent zu induzieren, die auf Wasser-in-Öl-Emulsionen mit Autoantigenen angewiesen sind, wie experimentelle Autoimmunneuritis (EAN)10, experimentelle Autoimmunthyreoiditis (EAT)11, autoimmune Uveitis (EAU)12 und Myasthenia gravis (MG)13. Diese Methode induziert auch allgemeine Immunantworten wie verzögerte Typ-Überempfindlichkeit (DTH) konsistent6 und könnte daher für die Verabreichung von Krebs- und Malariaimpfstoffen verwendet werden (siehe Diskussion).
So wurde eine schnelle (Gesamtherstellungszeit ~30 min), einfache (alle Reagenzien können im Voraus hergestellt und gelagert werden) und standardisierte (die Emulsion wird mit einem Schüttelhomogenisator erreicht) Methode entwickelt und hier vorgestellt. Die nach diesem Protokoll hergestellten CFA/Antigen-Emulsionen induzieren in Autoimmuntiermodellen durchweg Krankheiten.
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Protocol
Alle Tierverfahren wurden nach den Praktiken des schwedischen Tierversuchsamtes durchgeführt und von der Tierethikkommission, Lund-Malmö, Schweden genehmigt (Genehmigungsnummer: M126-16).
HINWEIS: Ein schematischer Ablauf der Methode ist in Abbildung 1 beschrieben.
1. Materialaufbereitung
HINWEIS: Bereiten Sie alle Reagenzien aseptisch in einer sterilen Haube vor, aliquot und lagern Sie sie bei der angegebenen Temperatur. Die Reagenzien können bis zu 2 Jahre gelagert werden, ohne ihre Wirkung zu verlieren.
- Bereiten Sie CFA mit 20 mg/ml Mycobacterium tuberculosis wie unten beschrieben vor.
- 100 mg gefriergetrocknete M. tuberculosis H37RA (siehe Materialtabelle) und fünf 3,2 mm Stahlperlen in ein 7-ml-Röhrchen geben (siehe Materialtabelle). Schütteln Sie das Röhrchen in einem Homogenisator (siehe Materialtabelle) 60 s bei höchster Drehzahleinstellung (5.000 U/min).
- 5 mL unvollständiges Freund-Adjuvans (IFA) in die Tube geben und erneut 60 s bei höchster Geschwindigkeit schütteln. Die Aufschlämmung der homogenisierten M. tuberculosis in IFA (jetzt CFA) in ein frisches Röhrchen mit einer Pipette geben, die Perlen zurücklassen und bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.
- Fügen Sie dem gefriergetrockneten Pulver des MOG35-55-Peptids Reinstwasser hinzu (siehe Materialtabelle), um eine endgültige Peptidkonzentration von 10 mg / ml zu erhalten. Sterilisieren Sie die Lösung, indem Sie sie durch einen 0,2-μm-Filter leiten. 60 μL Aliquots vorbereiten und bis zum Gebrauch bei -20 °C lagern.
HINWEIS: Das für dieses Experiment verwendete MOG35-55-Peptid ist von ImmunoGrade-Reinheit (~ 70%), ist TFA-gespalten, löst sich leicht in Wasser auf und enthält ein C-terminales Amid (-NH2), um die In-vivo-Stabilität zu erhöhen14. Peptidaliquots wurden nie mehr als zweimal aufgetaut und wieder eingefroren und wurden bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert. - Bereiten Sie 100 ml Keuchhustentoxinpuffer vor: Lösen Sie 2,9 g NaCl in 80 ml 1x Ca 2+/Mg 2+ freies PBS und fügen Sie 100 μL 10% Triton X-100 hinzu. Stellen Sie das Volumen mit PBS auf 100 ml ein und sterilisieren Sie die Lösung, indem Sie sie durch einen 0,2-μm-Filter leiten. 10 ml Aliquots vorbereiten und bis zum Gebrauch bei 4 °C lagern.
2. Herstellung von CFA/Peptid-Emulsionen
- Berechnen Sie die Menge an Emulsion, die für die Immunisierung benötigt wird. In diesem Standardprotokoll erhält jede Maus 50 μg MOG35-55 Peptid und 300 μg M. tuberculosis dispergiert in Freunds Adjuvans (CFA). Die Menge jedes Reagenzes (MOG35-55-Peptid , PBS, CFA und IFA), die für die Herstellung der Emulsionen benötigt wird, kann mit Hilfe der Zusatzdatei 1 berechnet werden. Weitere 20% aller Reagenzien, um den geringen Emulsionsverlust auszugleichen, werden in die Berechnung einbezogen.
HINWEIS: Das in dieser Studie verwendete handelsübliche Emulsionskit (siehe Materialtabelle) besteht aus einem Schlauch, einem Schraubverschluss und einem Kolben in einem sterilisierten Beutel. Jedes Röhrchen des Emulsions-Kits fasst maximal 9,6 ml, wodurch 8 x 1 ml Spritzen hergestellt werden können, die für die Immunisierung von 40 Mäusen ausreichen (oder 80 Mäuse bei Verwendung von 100 μL Emulsion pro Tier). - Legen Sie das verschraubte Röhrchen (aus dem handelsüblichen Emulsionskit) und die Reagenzien auf Eis.
- Fügen Sie die Emulsionskomponenten in der folgenden Reihenfolge in den in Schritt 2.1 berechneten Volumina hinzu: PBS, dann das Peptid, dann M. tuberculosis in CFA und schließlich IFA.
- Verschließen Sie den Schlauch mit der Kappe fest, indem Sie ihn mehrmals festziehen und lösen. Schütteln Sie das Röhrchen kräftig für 5-10 s von Hand, um die Reagenzien vorzumischen.
- Legen Sie das Röhrchen in den Schüttelhomogenisator und sichern Sie es mit dem Stab. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf die höchste Einstellung und die Zeit auf 60 s ein. Sobald der Lauf beendet ist, legen Sie die Röhre für 3 min auf Eis. Wiederholen Sie die Ausführung noch ein oder zwei Mal mit den gleichen Einstellungen.
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 x g für 1 Minute, um eingeschlossene Luft zu entfernen und die Emulsion zu verdichten.
- Entfernen Sie die Kappe aus dem Röhrchen, führen Sie den Kolben in das Röhrchen ein und drücken Sie ihn langsam nach unten, bis er die Oberseite der Emulsion erreicht. Entfernen Sie den Schnappverschluss an der Unterseite des Röhrchens, indem Sie ihn drehen.
- Entfernen Sie den Kolben aus einer Injektionsspritze (1 ml; siehe Materialtabelle). Fügen Sie der Injektionsspritze eine Nadel (vorzugsweise 25-27 G) hinzu.
- Befestigen Sie das hintere Ende der Injektionsspritze am speziellen Schloss am Boden des Röhrchens und verriegeln Sie es mit einer kurzen Drehung.
- Übertragen Sie die Emulsion aus dem Röhrchen in die Injektionsspritze, indem Sie den Kolben vorsichtig drücken. Stoppen Sie, wenn die Emulsion die 0,15-ml-Graduierung der Injektionsspritze erreicht hat.
- Trennen Sie die Injektionsspritze vom Röhrchen und führen Sie den Kolben vorsichtig ein, wobei darauf zu achten ist, dass keine Luft in die Spritze gelangt. Drücken Sie den Kolben, bis die Emulsion aus der Nadel kommt.
HINWEIS: An dieser Stelle kann ein Teil der Emulsion zur Qualitätskontrolle verwendet werden (siehe Schritt 3). - Wiederholen Sie die Schritte 2.8-2.11 für den Rest der im Röhrchen vorhandenen Emulsion.
HINWEIS: Um die Verschwendung teurer CFA / Antigen-Emulsionen zu minimieren, sollten 1-ml-Spritzen verwendet werden. Andere Spritzen, die in den speziellen Verschluss am Boden des Röhrchens passen, können verwendet werden; Möglicherweise muss jedoch ein größeres Emulsionsvolumen hergestellt werden. Die Peptidemulsion CFA/MOG35-55 kann bis zu 15 Wochen bei 4 °C gelagert werden, ohne ihre EAE-induzierende Kapazität zu verlieren.
3. Qualitätskontrolle der Emulsion
- Falltest: Geben Sie einen kleinen Tropfen der Emulsion in ein steriles 50 ml konisches Röhrchen, das mit 20 mL kaltem Wasser gefüllt ist. Schließen Sie die Tube und schütteln Sie sie einige Sekunden lang von Hand. Das Auftreten winziger Tröpfchen bestätigt die Bildung einer Wasser-in-Öl-Emulsion.
- Untersuchen Sie die Emulsion mittels Phasenkontrastmikroskopie.
- Um die Größe der Wasser-in-Öl-Partikel zu analysieren, fügen Sie einen winzigen Tropfen (2-3 μL) der Emulsion zu einem Objektträger hinzu, schmieren Sie ihn mit einem Abdeckstreifen aus und drücken Sie dann in kreisenden Bewegungen fest, um die Emulsion abzuflachen.
- Untersuchen Sie die verschmierte Emulsion unter einem Phasenkontrastmikroskop (siehe Materialtabelle) mit 400-facher Vergrößerung und fokussieren Sie auf ein Feld mit einer Monoschicht der Emulsion. Stellen Sie sicher, dass kleine, gleichmäßige graue/weiße Partikel sichtbar sind (Abbildung 2A).
- Analysieren Sie die Partikelgröße der Emulsion mit Laserbeugung.
HINWEIS: Die Laserbeugung misst Partikelgrößenverteilungen mit einem Laserstrahl. Dies ist der ultimative Qualitätskontrolltest für Emulsionen. Ein repräsentatives Ergebnis der Partikelgrößenverteilungen nach der hier beschriebenen Methode ist in Abbildung 2B dargestellt (für eine detaillierte Beschreibung siehe Topping et al.6). Dennoch reichen Falltest und mikroskopische Untersuchung aus, um zu validieren, ob eine zufriedenstellende Emulsion gebildet wurde.- Stellen Sie die Brechungsindizes für rote und blaue Laser für das Dispergiermittel (siehe Materialtabelle) auf 1,456 und für die Probe auf 1,33 auf dem Partikelgrößenanalysator ein (siehe Materialtabelle). Stellen Sie die Absorption des Brechungsindex auf 0,02 ein.
- Geben Sie einen Tropfen aus der Spritze mit der Peptidemulsion in die Dispersionseinheit mit leichtem Mineralöl. Starten Sie die Datenerfassung sofort nach der Dispergierung der Emulsion.
HINWEIS: Für die Abschätzung der Partikelgrößenverteilung wurde ein Allzweckmodell angewendet und sphärische Partikel wurden angenommen.
4. EAE-Induktion mit der MOG 35-55-Peptidemulsion in C57BL6/J-Mäusen
HINWEIS: In allen Experimenten wurden fünf 8-12 Wochen alte weibliche C57BL6 / J-Mäuse verwendet.
- Vor der Immunisierung betäuben Sie die Mäuse mit 2,5% verdampftem Isofluran und bestätigen Sie mit einer festen Zehenklemme.
- Injizieren Sie jede Maus subkutan mit 1-ml-Spritzen in zwei verschiedene Stellen, auf der rechten und linken Seite der Hinterflanke, mit 200 μL Emulsion, die 50 μg MOG35-55-Peptid in einem Verhältnis von 1: 1 (v / v) von Peptid / CFA enthält.
- Mindestens 1,5 h nach der Immunisierung mit der Emulsion und dann wieder nach 24 h insgesamt 80 ng Bordetella pertussis-Toxin in 200 μL Keuchhustentoxinpuffer an jede Maus durch intraperitoneale Injektionen (100 μL auf der linken und 100 μL auf der rechten Seite des Bauches) verabreichen.
HINWEIS: Die genaue Lokalisation der intraperitonealen Injektion mit Keuchhustentoxin hat sich als essentiell für die Aktivierung von T-Zellen im drainierenden Lymphknoten15 erwiesen. - Optional: Injizieren Sie MOG35-55 Peptid erneut an Tag 7 (wie in einigen Protokollen16 verwendet), indem Sie Schritt 4.2 wiederholen.
HINWEIS: Am wichtigsten ist, dass die Spritzen und Nadeln, die für die Immunisierung verwendet werden, die MOG / CFA oder Keuchhustentoxin enthalten, ordnungsgemäß in Biogefahrenbeuteln / -behältern entsorgt werden. - Bewerten Sie den klinischen Score täglich auf einer Skala von 0-6, wie zuvor beschrieben6.
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Representative Results
Das schnelle, einfache und standardisierte Protokoll für die Herstellung von CFA/MOG-Emulsionen ist in Abbildung 1 dargestellt. Diese Methode wurde kürzlich an anderer Stelle beschrieben6. Die CFA/MOG-Emulsionen können auch mit anderen Methoden hergestellt werden, wie z.B. dem traditionellen Spritzenverfahren oder durch Vortexen. Diese Methoden wurden hier verglichen, indem die Qualität der Emulsionen bewertet wurde. Alle Methoden erzeugten Wasser-in-Öl-Emulsionen; Die Homogenität und Qualität dieser Emulsionen wurde durch Zugabe eines kleinen Tropfens auf einen Objektträger beurteilt, gefolgt von einer Beobachtung unter einem Phasenkontrastmikroskop. Emulsionen, die durch die Schüttelhomogenisierungsmethode hergestellt wurden, zeigten graue / weiße bohnenförmige Partikel, die winzige Tröpfchen von Wasser-in-Öl-Emulsionen darstellten. Im Gegensatz dazu waren die mit der Spritzenmethode hergestellten Emulsionströpfchen größer und weißer. Bei der Wirbelmethode wurden große graue/schwarze Partikel beobachtet, die Luftblasen entsprechen, die in der Emulsion eingeschlossen sind (Abbildung 2A).
Um die Langzeitstabilität von Wasser-in-Öl-Emulsionen zu testen, können die Änderungen der Partikelgrößenverteilung über die Zeit mit einem Laserbeugungspartikelgrößenanalysator gemessen werden. Emulsionen, die mit dem hier beschriebenen standardisierten Protokoll hergestellt wurden, zeigten über einen Zeitraum von 6 Wochen keine Veränderung der Partikelgröße (Abbildung 2B). Daher wurde die Möglichkeit getestet, dass Emulsionen, die das Peptid MOG35-55 enthalten, über einen längeren Zeitraum bei 4 °C gelagert werden können und dennoch eine Erkrankung auslösen. Emulsionen, die das Peptid CFA/MOG35-55 enthielten, wurden mit dieser Methode hergestellt und sofort verwendet oder bei 4 °C für 3 oder 15 Wochen gelagert (Abbildung 3A). Mäusen wurden 50 μg MOG35-55-Peptid injiziert und auf klinische Krankheitszeichen untersucht, wie im Protokoll beschrieben. Bemerkenswerterweise induzierten die frischen, 3 Wochen alten und 15 Wochen alten Emulsionen bei allen während des Experiments getesteten Tieren eine ähnliche EAE-Erkrankung (Abbildung 3A). So zeigten diese Ergebnisse, dass Emulsionen, die MOG35-55-Peptide enthalten, die mit der Schüttelhomogenisierungsmethode hergestellt wurden, mindestens 15 Wochen gelagert werden können und dennoch EAE mit Krankheitswerten induzieren, die mit denen von frisch hergestellten Emulsionen vergleichbar sind.
Um den Aufbau der Experimente zu vereinfachen und zu beschleunigen und Chargenunterschiede von Reagenzien zu vermeiden, wurden alle notwendigen Komponenten im Voraus vorbereitet, aliquotiert und bei der entsprechenden Temperatur gelagert. Dann wurden fünf Experimente über einen Zeitraum von 6 Monaten durchgeführt. C57BL6/J-Mäuse wurden mit den MOG/CFA-Emulsionen immunisiert, die am Tag der Immunisierung unter Verwendung von Emulsionskits hergestellt wurden, und auf klinische Symptome untersucht. Mäuse entwickelten in allen Experimenten ein ähnliches Krankheitsbild (Abbildung 3B) und zeigten, dass die hier vorgestellte Homogenisierungsmethode Emulsionen erzeugte, die EAE konsistent und reproduzierbar induzierten.
Die gesamte Vorbereitungszeit vom Entnehmen aller Reagenzien, dem Hinzufügen und dreimaligen Schütteln des Röhrchens und dem Beladen der Spritzen mit der immunisierungsbereiten Emulsion dauert nicht mehr als 30 Minuten. Darüber hinaus müssen nur 20% der zusätzlichen Emulsion hergestellt werden. Dies steht im krassen Gegensatz zu anderen Protokollen, bei denen die Vorbereitungszeit bis zu 1,5-2 h betragen kann und 50%-100% der zusätzlichen Emulsion möglicherweise vorbereitet werden müssen, um ausreichend Material für die Immunisierung zu gewährleisten16.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Prozesses der Emulsionsherstellung mit einem handelsüblichen Emulsionskit. Diese Abbildung wurde von Topping et al6 mit Genehmigung wiederverwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Charakterisierung von Emulsionen, die mit verschiedenen Methoden hergestellt wurden. (A) Repräsentative Bilder von drei verschiedenen Herstellungsmethoden: Standardhomogenisierungsmethode, traditionelle Spritzenmethode und Wirbelmethode. Eine kleine Menge Emulsion wurde auf einen Objektträger gegeben und unter einem Phasenkontrastmikroskop (400x) beobachtet. Maßstabsbalken = 50 μm. Von jeder Methode wird eine repräsentative Präparation aus >15 Experimenten gezeigt. Der Mittelwert D [4, 3] (der volumengewichtete Mittelwert) wurde mit einem Partikelgrößenanalysator mit 0,7 μm für die Schüttelhomogenisierungsmethode, 1,4 μm für die Spritzenmethode und 5,4 μm für die Wirbelmethode gemessen. (B) Die Stabilität der Emulsion über die Zeit wurde mit dem Partikelgrößenanalysator gemessen. Eine Emulsion aus CFA/PBS wurde mit dem Schüttelhomogenisator und dem Emulsionskit hergestellt und die Partikelgröße unter Verwendung von Laserbeugung im Laufe der Zeit bestimmt. Eine Probe wurde sofort analysiert und dann wurden die Emulsionen bei 4 °C gelagert. Diese Proben wurden 1, 2, 4 und 6 Wochen nach der Präparation analysiert. Der mittlere volumengewichtete D[4, 3] Mittelwert für alle Proben betrug 0,73 μm ± 0,03 μm (SD). Diese Abbildung wurde von Topping et al6 mit Genehmigung wiederverwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: EAE-Induktion bei Mäusen, die mit einem MOG35-55-Peptid/CFA-Präparat unter Verwendung eines kommerziellen Emulsionskits immunisiert wurden. (A) EAE-Induktion der gelagerten Emulsion. Emulsionen, die CFA und 50 μg MOG35-55 Peptid/Maus enthielten, wurden mit der Homogenisierungsmethode hergestellt und bei 4 °C für 3 oder 15 Wochen gelagert. Die frisch zubereiteten und gelagerten Emulsionen wurden noch am selben Tag in C57BL/6J-Mäuse injiziert (n = 5 pro Gruppe). Die Mäuse erhielten 80 ng Pertussis-Toxin am selben Tag und 24 Stunden später und wurden für Krankheitszeichen mit klinischen Werten von 0-6 bewertet. (B) Konsistente Induktion von EAE mit den nach dem Homogenisierungsverfahren hergestellten Emulsionen. Emulsionen, die CFA und 50 μg MOG35-55 Peptid/Maus enthielten, wurden zu verschiedenen Zeitpunkten hergestellt und in C57BL/6J-Mäuse injiziert (n = 5 pro Gruppe). Die Mäuse erhielten 80 ng Keuchhustentoxin am selben Tag und 24 Stunden später und wurden auf Anzeichen einer Krankheit untersucht. Diese Abbildung wurde von Topping et al6 mit Genehmigung wiederverwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Zusatzdatei 1: Berechnung der Menge jedes Reagenzes (MOG35-55 Peptid, PBS, CFA und IFA) für die Emulsionsherstellung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Wasser-in-Öl-Emulsionen, wie das Antigen/Freund-Adjuvans, werden seit mehr als einem halben Jahrhundert verwendet, um EAE17 zu induzieren. Derzeit gibt es keine standardisierte Methode zur Herstellung von Antigenemulsionen, die unabhängig vom menschlichen Einfluss ist. Das manuelle Mischen mit Spritzen ist in den meisten Laboratorien Standard, jedoch ist diese Methode zeitaufwendig, führt oft zu einem übermäßigen Materialverlust und die Qualität unterscheidet sich je nach Wissenschaftler, der sie zubereitet.
Das in diesem Manuskript vorgestellte Verfahren verwendet eine Standard-Schüttelhomogenisierungsmaschine zur Herstellung der Antigen/CFA-Emulsionen. Darüber hinaus können alle hier verwendeten Reagenzien aliquotiert und über einen langen Zeitraum gelagert werden, was die Herstellung von Emulsionen bequem und schnell macht. Die Gesamtzeit für die Herstellung von Emulsionen für bis zu 80 Mäuse beträgt ca. 30 min. Dies steht in krassem Gegensatz zu anderen veröffentlichten Methoden, die 1-1,5 h zur Herstellung der MOG35-55-Emulsionen 16,18 benötigen. Andere manuelle Methoden, wie die Einspritzenmethode, sind oft mit dem Einbringen von Luftblasen in die Spritzen verbunden5. Das hier vorgestellte Verfahren wurde so konzipiert, dass die Emulsion von ihrem hinteren Ende in Spritzen gedrückt wird, wodurch das Einbringen von Luftblasen eliminiert und der Materialverlust minimiert wird.
Um konsistente Ergebnisse und minimale Verschwendung von Emulsion zu gewährleisten, gibt es einige kritische Schritte bei der Schüttelhomogenisierungsmethode, die besondere Aufmerksamkeit erfordern. Das Röhrchen und die Reagenzien sollten vor Beginn des Experiments und nach dem Homogenisierungsschritt auf Eis gelegt werden. PBS und Antigen sollten zuerst in das Röhrchen gegeben werden, gefolgt vom Adjuvans (CFA/IFA), um hohe lokale Antigenkonzentrationen beim Mischen mit dem Öladjuvans zu vermeiden. Der Deckel sollte durch mehrmaliges Öffnen und Schließen fest angezogen werden, um Leckagen zu vermeiden. Darüber hinaus sollte die Spritze nicht vollständig mit der Emulsion gefüllt werden, sondern nur bis zur 0,15-ml-Markierung auf dem Spritzenzylinder, um eine Verschwendung der Emulsion zu vermeiden. Der Kolben sollte sehr vorsichtig mit beiden Händen in die Spritze eingeführt werden. Nachdem alle Spritzen mit der Emulsion gefüllt sind, können die Spritzen bei Raumtemperatur gelagert werden, wenn sie am selben Tag verwendet werden sollen. andernfalls sollten sie bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert werden.
Antigen/CFA-Emulsionen, die nach der Schüttelhomogenisierungsmethode hergestellt werden, können im Vergleich zu solchen, die mit der Spritzenmethode hergestellt werden, weniger fest erscheinen. Ein zusätzlicher Schüttelschritt kann hinzugefügt werden (siehe Schritt 2.5 im Protokoll), der die Emulsion verdicken kann. Emulsionen, die den "Falltest" und die phasenkontrastmikroskopische Untersuchung bestehen, induzieren jedoch EAE, unabhängig vom physikalischen Zustand der Emulsion.
Die anfängliche Investition in eine schüttelnde Homogenisierungsmaschine ist eine Einschränkung. Die hier beschriebenen Herstellungsschritte sorgen jedoch für minimale Verschwendung von Emulsion und Antigen, was oft teuer in der Anschaffung ist oder lange Zeit in Anspruch nimmt. Daher ist diese Methode auf lange Sicht billiger zu verwenden, da sie Zeit und Reagenzien spart. Das Antigen und der Puffer, die bei der Schüttelhomogenisierung verwendet werden, können die Qualität der Emulsion beeinflussen. Das in PBS gelöste MOG 35-55-Peptid erzeugtekonsequent Emulsionen mit kleinen gleichmäßigen Wasser-in-Öl-Partikeln (Abbildung 2A). Peptidantigene, die in PBS mit Ca2 + / Mg2+ gelöst sind, oder Peptide, die viele geladene Aminosäurereste enthalten, können jedoch Emulsionen erzeugen, die weniger viskos sind. Ob solche Emulsionen in Tiermodellen weniger wahrscheinlich Krankheiten auslösen, wurde nicht getestet. Eine weitere Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass nicht mehr als 8 ml Antigen/CFA-Emulsion aus einem Röhrchen hergestellt werden können. Die Röhrchen sollten nicht mit insgesamt mehr als 9,6 ml (4,8 ml PBS/Antigen und 4,8 ml CFA/IFA) beladen werden, was ausreicht, um acht 1-ml-Spritzen zu laden. Obwohl das Rohr ein größeres Volumen aufnehmen kann, muss etwas Luft im Rohr vorhanden sein, da sonst keine perfekten Emulsionen entstehen. Wenn mehr Emulsion benötigt wird, kann diese mit zusätzlichen Röhrchen hergestellt werden.
Im Vergleich zu bestehenden Methoden gibt es bei der Herstellung der Emulsionen mit der Schüttelhomogenisierungsmethode keinen Unterschied von Mensch zu Mensch. Die am häufigsten verwendete Methode zur Herstellung von Emulsionen für EAE-Experimente verwendet Spritzen, die von Hand hin und her geschoben werden19. Kraft, Zeit und Temperatur können nicht gut kontrolliert werden, und es ist daher schwierig, eine spritzenbasierte Methode zu standardisieren. Andere Methoden zur Herstellung von Wasser-in-Öl-Emulsionen nutzen Ultraschall-Wasserbad-Ultraschallgeräte. Emulsionen, die mit einem Ultraschallverfahren hergestellt wurden, sind in der Lage, EAE in ansonsten resistenten BALB/c-Mäusen zu induzieren8. Die beschriebene Methode könnte standardisiert und daher nützlich sein. Das Problem bei Ultraschall-Wasserbad- und Ultraschallsonden-Ultraschallgeräten besteht jedoch darin, dass es schwierig ist, die Emulsion in den Röhrchen auf Spritzen zu übertragen, die für die Immunisierung verwendet werden, ohne Luftblasen einzuführen. Die für das hier vorgestellte Verfahren verwendeten Röhrchen beseitigen dieses Problem.
Eine Wirbelmethode könnte als standardisierte Methode mit einer festgelegten Geschwindigkeit, Zeit und Temperatur betrachtet werden. Das Testen dieser Methode zur Herstellung einer Emulsion durch Wirbeln des MOG/CFA-Präparats für 10 Minuten führte jedoch zu keiner Krankheitsinduktion bei C57BL/6J-Mäusen (Daten nicht gezeigt). Dennoch kann EAE mit einem Antigen/CFA-Gemisch induziert werden, das durch Vortexing für 45 min18 hergestellt wird, was im Vergleich zu der in diesem Manuskript vorgestellten Methode ein viel längeres Verfahren wäre.
Ein weiteres Adjuvans auf Ölbasis (siehe Materialtabelle), das von der FDA für die Anwendung beim Menschen zugelassen ist und eine Wasser-in-Öl-Emulsion herstellt, hat sich als vielversprechendes Adjuvans für Krebs- und Malariaimpfstoffeerwiesen 20,21,22. Daher kann das hier vorgestellte standardisierte Protokoll für den Einsatz in der Klinik angepasst werden. Vorläufige Experimente haben gezeigt, dass die Schüttelhomogenisierungsmethode mit diesem von der FDA zugelassenen Öl Emulsionen erzeugt, die im Vergleich zur manuellen Spritzenmethode von besserer Qualität sind (Daten nicht gezeigt).
Zusammenfassend bietet die hier vorgestellte Schüttelhomogenisierungsmethode eine Reihe von Vorteilen, wie die schnellere Erzeugung qualitätskontrollierter Emulsionen, eine hohe Reproduzierbarkeit in einer Reihe von Autoimmunerkrankungsmodellen und eine Reduzierung teurer Reagenzien, die zur Herstellung von Antigen/CFA-Emulsionen benötigt werden. Da es keinen persönlichen Unterschied gibt, der diese Wasser-in-Öl-Emulsionen erzeugt, bietet es die Möglichkeit, diese Methode zu standardisieren, die für die reproduzierbare biomedizinische Forschung und Wirkstoffforschung im Bereich der Autoimmunerkrankungen und der therapeutischen Impfstoffentwicklung benötigt wird.
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Disclosures
BTB Emulsions AB hat eine Patentanmeldung für die Verwendung einer Vorrichtung und eines Verfahrens zur Herstellung von Emulsionen für die Immunisierung sowie für Tiere und Menschen eingereicht (europäische Patentanmeldungsnummer: EP3836884A1). BTB ist CEO und Gründer des Unternehmens und Aktionär von BTB Emulsions. Bertin-Instruments vertreibt die in dieser Publikation verwendeten Emulsionskits weltweit.
Acknowledgments
Der Autor dankt den Tierhaltungseinheiten der Universität Lund, Camilla Björklöv und Agnieszka Czopek, für ihre Unterstützung und Richard Williams, Kennedy Institute of Rheumatology, University of Oxford, UK, für konstruktive Kritik und linguistische Unterstützung bei der Erstellung dieses Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Injection syringe | B. Braun | 9166017V | |
| 1 mL Injection syringe | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
| 7 ml empty tubes with caps | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | 7 mL tube |
| 50 mL sterile centrifuge tube | Fisher Scientific | 10788561 | 50 mL tube |
| Bordetella pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P2980 | Store at -20 °C |
| Dispersant, light mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Store at RT |
| Emulsion kit | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | Containing a tube, cap, and plunger |
| Incomplete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C |
| Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Store at +4 °C |
| Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | Particle size analyzer |
| Minilys-Personal homogenizer | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | Shaking homogenizer |
| MOG 35-55 Peptide | Innovagen | N/A | |
| Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | FDA-approved oil adjuvant |
| Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm | Fisher Scientific | 17124381 | Sterlie filter |
| PBS, Ca2+/Mg2+ free | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| Phase-Constrast Microscope | Olympus | BX40-B | |
| Steel Beads 3.2 mm | Fisher Scientific | NC0445832 | Autoclave and store at RT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | Store at RT |
References
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