Summary
Per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale, un modello animale di sclerosi multipla, i topi vengono immunizzati con un'emulsione acqua-in-olio contenente un autoantigene e un adiuvante completo di Freund. Mentre esistono diversi protocolli per la preparazione di queste emulsioni, qui viene presentato un protocollo di omogeneizzazione rapido, semplice e standardizzato per la preparazione dell'emulsione.
Abstract
L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) condivide caratteristiche immunologiche e cliniche simili alla sclerosi multipla (SM) ed è quindi ampiamente utilizzata come modello per identificare nuovi bersagli farmacologici per un migliore trattamento del paziente. La SM è caratterizzata da diversi decorsi di malattia: SM recidivante-remittente (SMRR), SM primaria progressiva (SMPP), SM secondaria progressiva (SPMS) e una rara forma progressiva-recidivante di SM (PRMS). Sebbene i modelli animali non imitino accuratamente tutti questi fenotipi contrastanti di malattia umana, ci sono modelli EAE che riflettono alcune delle diverse manifestazioni cliniche della SM. Ad esempio, l'EAE indotto dalla glicoproteina oligodendrocitaria mielina (MOG) nei topi C57BL / 6J imita la SMPP umana, mentre l'EAE indotto dalla proteina proteolipidica della mielina (PLP) nei topi SJL / J assomiglia alla SMRR. Altri autoantigeni, come la proteina basica della mielina (MBP), e un certo numero di diversi ceppi di topo sono anche usati per studiare EAE. Per indurre la malattia in questi modelli EAE di immunizzazione autoantigene, viene preparata e iniettata per via sottocutanea un'emulsione acqua-in-olio. La maggior parte dei modelli EAE richiede anche un'iniezione di tossina della pertosse per lo sviluppo della malattia. Per un'induzione EAE coerente e riproducibile, è necessario un protocollo dettagliato per preparare i reagenti a produrre emulsioni antigene/adiuvante. Il metodo qui descritto si avvale di un metodo standardizzato per generare emulsioni acqua-in-olio. È semplice e veloce e utilizza un omogeneizzatore agitatore al posto delle siringhe per preparare emulsioni di qualità controllata.
Introduction
Una rottura della tolleranza immunologica può provocare la generazione di malattie autoimmuni, come la sclerosi multipla (SM). Si stima che 2,8 milioni di persone convivono con SM in tutto il mondo1. Sebbene la causa esatta della SM sia ancora in gran parte sconosciuta, la disregolazione delle cellule T e B autoreattive, così come i difetti nella funzione Treg, svolgono un ruolo importante nella patogenesi della malattia 2,3.
I modelli animali di malattie autoimmuni sono strumenti essenziali per studiare potenziali modalità terapeutiche. Il modello sperimentale di encefalomielite autoimmune (EAE) è stato utilizzato per quasi un secolo dai ricercatori interessati alla SM4. Nei primi esperimenti, l'incidenza della malattia era relativamente bassa. L'introduzione dell'adiuvante completo di Freund (CFA), contenente Mycobacterium e tossina della pertosse, ha permesso l'induzione coerente di EAE nei topi4. Ancora più importante, è necessario mescolare CFA con un antigene specifico del sistema nervoso centrale (SNC) per generare un'emulsione acqua-in-olio omogenea per indurre EAE. I modelli EAE attualmente disponibili più comuni si basano sull'immunizzazione attiva di topi con peptidi encefalitogeni. Il background genetico dei topi gioca un ruolo importante nella suscettibilità alla malattia, con la glicoproteina oligodendrocitaria mielinica (MOG35-55) e la proteina proteolipidica mielinica (PLP139-151) peptidi utilizzati per indurre EAE nei topi C57BL / 6J e SJL, rispettivamente5. Tuttavia, possono essere utilizzati anche altri ceppi di topo e peptidi derivati dal SNC.
La qualità dell'emulsione CFA/peptide è un fattore critico che determina la penetranza della malattia nell'immunizzazione attiva EAE modello6. Un'emulsione omogenea acqua-in-olio deve essere preparata mescolando i peptidi encefalitogeni disciolti in tampone acquoso con CFA, altrimenti gli animali non svilupperanno la malattia. Sono stati pubblicati numerosi protocolli sulla preparazione di emulsioni CFA/peptidiche. Gli esempi includono l'uso di un vortice7, sonicazione8, siringhe e un connettore T a tre vie9, o una siringa solo5. Tuttavia, tutti questi metodi sono difficili da standardizzare e sono spesso associati a protocolli lunghi e complicati.
Rispetto a tutti i metodi di cui sopra, il semplice metodo qui descritto per la preparazione dell'emulsione offre il vantaggio di non avere differenze da persona a persona e di essere relativamente veloce. L'emulsione viene generata da un omogeneizzatore che agita i reagenti con una velocità, un tempo e una temperatura impostati, garantendo risultati rapidi e coerenti. Oltre a indurre la malattia nel modello EAE, questo metodo può anche essere utilizzato per studiare altri modelli di malattia autoimmune come l'artrite indotta dal collagene (CIA) e l'artrite indotta dall'antigene (AIA)6. Pertanto, si prevede che questo metodo possa essere utilizzato per indurre costantemente la malattia in altri modelli animali che dipendono da emulsioni acqua-in-olio con autoantigeni, come la neurite autoimmune sperimentale (EAN)10, la tiroidite autoimmune sperimentale (EAT)11, l'uveite autoimmune (EAU)12 e la miastenia grave (MG)13. Questo metodo induce anche risposte immunitarie generali come l'ipersensibilità di tipo ritardato (DTH) in modo coerente6, e potrebbe quindi essere utilizzato per la somministrazione di vaccini contro il cancro e la malaria (vedi discussione).
Pertanto, è stato sviluppato un metodo rapido (tempo di preparazione totale ~ 30 min), semplice (tutti i reagenti possono essere preparati in anticipo e conservati) e standardizzato (l'emulsione viene eseguita utilizzando un omogeneizzatore di agitazione) ed è presentato qui. Le emulsioni CFA/antigene preparate utilizzando questo protocollo inducono costantemente la malattia nei modelli animali autoimmuni.
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Protocol
Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite secondo le pratiche del Consiglio svedese per la ricerca sugli animali e sono state approvate dal Comitato etico degli animali, Lund-Malmö, Svezia (numero di permesso: M126-16).
NOTA: un flusso schematico del metodo è descritto nella Figura 1.
1. Preparazione del materiale
NOTA: Preparare tutti i reagenti in modo asettico in una cappa sterile, aliquote e conservare alla temperatura indicata. I reagenti possono essere conservati fino a 2 anni senza perdere il loro effetto.
- Preparare CFA contenente 20 mg/ml di Mycobacterium tuberculosis come descritto di seguito.
- Aggiungere 100 mg di M. tuberculosis H37RA liofilizzato (vedi Tabella dei materiali) e cinque sfere di acciaio da 3,2 mm in un tubo da 7 mL (vedi Tabella dei materiali). Agitare il tubo in un omogeneizzatore (vedere Tabella dei materiali) per 60 s alla massima velocità impostata (5.000 giri/min).
- Aggiungere 5 mL di adiuvante di Freund incompleto (IFA) al tubo e agitare nuovamente per 60 s alla massima velocità. Trasferire il liquame di M. tuberculosis omogeneizzato in IFA (ora chiamato CFA) in un tubo fresco con una pipetta, lasciando le perle dietro, e conservare a 4 °C fino all'uso.
- Aggiungere acqua ultrapura alla polvere liofilizzata del peptide MOG35-55 (vedere Tabella dei materiali) per ottenere una concentrazione finale di peptide di 10 mg/ml. Sterilizzare la soluzione facendola passare attraverso un filtro da 0,2 μm. Preparare 60 μL di aliquote e conservare a -20 °C fino all'uso.
NOTA: Il peptide MOG35-55 utilizzato per questo esperimento è di purezza ImmunoGrade (~ 70%), è TFA-scisso, si dissolve facilmente in acqua e contiene un'ammide C-terminale (-NH2) per aumentare la stabilità in vivo 14. Le aliquote peptidiche non sono mai state scongelate e ricongelate più di due volte e sono state conservate a -20 °C fino all'uso. - Preparare 100 ml di tampone per tossine pertosse: sciogliere 2,9 g di NaCl in 80 ml di PBS libero 1x Ca 2+/Mg 2+ e aggiungere 100 μL di Triton X-100 al 10%. Regolare il volume a 100 ml con PBS e sterilizzare la soluzione facendola passare attraverso un filtro da 0,2 μm. Preparare 10 mL di aliquote e conservare a 4 °C fino all'uso.
2. Preparazione di emulsioni CFA/peptidiche
- Calcolare la quantità di emulsione necessaria per l'immunizzazione. In questo protocollo standard, ogni topo riceve 50 μg di peptide MOG35-55 e 300 μg di M. tuberculosis dispersi nell'adiuvante di Freund (CFA). La quantità di ciascun reagente (peptide MOG35-55 , PBS, CFA e IFA) necessaria per la preparazione delle emulsioni può essere calcolata utilizzando il file supplementare 1. Un ulteriore 20% di tutti i reagenti, per compensare la piccola perdita di emulsione, è incluso nel calcolo.
NOTA: Il kit di emulsione commerciale (vedi Tabella dei materiali) utilizzato in questo studio comprende un tubo, un tappo a vite e uno stantuffo in una busta sterilizzata. Ogni tubo del kit di emulsione contiene un massimo di 9,6 ml, rendendo possibile la preparazione di 8 siringhe da 1 ml sufficienti per immunizzare 40 topi (o 80 topi se si utilizzano 100 μL di emulsione per animale). - Posizionare il tubo con tappo a vite (dal kit di emulsione commerciale) e i reagenti da utilizzare sul ghiaccio.
- Aggiungere i componenti dell'emulsione nel seguente ordine nei volumi calcolati al punto 2.1: PBS, poi il peptide, quindi M. tuberculosis in CFA e infine IFA.
- Chiudere saldamente il tubo con il tappo stringendolo e allentandolo più volte. Agitare vigorosamente il tubo per 5-10 s a mano per premiscelare i reagenti.
- Posizionare il tubo nell'omogeneizzatore agitatore e fissarlo con l'asta. Impostare la velocità sull'impostazione massima e il tempo su 60 s. Una volta terminata la corsa, posizionare il tubo sul ghiaccio per 3 minuti. Ripetere l'esecuzione una o due volte con le stesse impostazioni.
- Centrifugare il tubo a 300 x g per 1 minuto per rimuovere l'aria intrappolata e compattare l'emulsione.
- Rimuovere il tappo dal tubo, inserire lo stantuffo nel tubo e spingerlo lentamente verso il basso fino a raggiungere la parte superiore dell'emulsione. Rimuovere la chiusura a scatto nella parte inferiore del tubo ruotandola.
- Rimuovere lo stantuffo da una siringa per iniezione (1 ml; vedere la tabella dei materiali). Aggiungere un ago (preferibilmente 25-27 G) alla siringa per iniezione.
- Collegare l'estremità posteriore della siringa per iniezione all'apposito blocco nella parte inferiore del tubo e bloccarlo con una breve torsione.
- Trasferire l'emulsione dal tubo alla siringa per iniezione spingendo delicatamente lo stantuffo. Interrompere quando l'emulsione raggiunge la graduazione di 0,15 mL della siringa per iniezione.
- Separare la siringa per iniezione dal tubo e inserire lo stantuffo con attenzione, avendo cura che l'aria non entri nella siringa. Spinga lo stantuffo fino a quando l'emulsione esce dall'ago.
NOTA: A questo punto, parte dell'emulsione può essere utilizzata per il controllo qualità (vedere il punto 3). - Ripetere i passaggi 2.8-2.11 per il resto dell'emulsione presente nel tubo.
NOTA: Per ridurre al minimo lo spreco di costose emulsioni CFA/antigene, utilizzare siringhe da 1 ml. Possono essere utilizzate altre siringhe che si adattano alla serratura dedicata nella parte inferiore del tubo; tuttavia, potrebbe essere necessario preparare un volume maggiore di emulsione. L'emulsione peptidica CFA/MOG35-55 può essere conservata a 4 °C per un massimo di 15 settimane senza perdere la sua capacità di indurre EAE.
3. Controllo di qualità dell'emulsione
- Test di caduta: aggiungere una piccola goccia di emulsione in un tubo conico sterile da 50 mL riempito con 20 ml di acqua fredda. Chiudere il tubo e agitarlo a mano per un paio di secondi. La comparsa di minuscole goccioline distinte conferma la formazione di un'emulsione acqua-in-olio.
- Esaminare l'emulsione utilizzando la microscopia a contrasto di fase.
- Per analizzare la dimensione delle particelle di acqua in olio, aggiungere una piccola goccia (2-3 μL) dell'emulsione a un vetrino da microscopio, spalmarla con un vetrino di copertura e quindi spingere con forza con un movimento circolare per appiattire l'emulsione.
- Esaminare l'emulsione spalmata al microscopio a contrasto di fase (vedi Tabella dei materiali) con ingrandimento 400x e concentrarsi su un campo con un monostrato dell'emulsione. Assicurarsi che siano visibili piccole particelle grigie/bianche uniformi (Figura 2A).
- Analizzare la dimensione delle particelle dell'emulsione utilizzando la diffrazione laser.
NOTA: La diffrazione laser misura le distribuzioni granulometriche utilizzando un raggio laser. Questo è l'ultimo test di controllo qualità per le emulsioni. Un risultato rappresentativo delle distribuzioni granulometriche utilizzando il metodo qui descritto è mostrato nella Figura 2B (per una descrizione dettagliata, vedere Topping et al.6). Tuttavia, il test di caduta e l'esame al microscopio sono sufficienti per convalidare se si è formata un'emulsione soddisfacente.- Impostare gli indici di rifrazione per entrambi i laser rossi e blu per il disperdente (vedi Tabella dei materiali) a 1,456 e per il campione a 1,33 sull'analizzatore granulometrico (vedi Tabella dei materiali). Impostare l'assorbanza dell'indice di rifrazione su 0,02.
- Aggiungere una goccia dalla siringa contenente l'emulsione peptidica all'unità di dispersione contenente olio minerale leggero. Avviare l'acquisizione dei dati immediatamente dopo la dispersione dell'emulsione.
NOTA: È stato applicato un modello generico e sono state assunte particelle sferiche per la stima della distribuzione granulometrica.
4. Induzione EAE utilizzando l'emulsione peptidica MOG 35-55 in topi C57BL6/J
NOTA: In tutti gli esperimenti, sono stati utilizzati cinque topi femmina C57BL6 / J di 8-12 settimane.
- Prima dell'immunizzazione, anestetizzare i topi usando isoflurano vaporizzato al 2,5% e confermare usando un pizzico di punta ferma.
- Iniettare ogni topo per via sottocutanea usando siringhe da 1 mL in due siti diversi, sui lati destro e sinistro del fianco posteriore con 200 μL di emulsione contenente 50 μg di peptide MOG35-55 in un rapporto 1:1 (v/v) di peptide/CFA.
- Almeno 1,5 ore dopo l'immunizzazione con l'emulsione, e poi di nuovo dopo 24 ore, somministrare un totale di 80 ng di tossina Bordetella pertussis in 200 μL di tampone tossina pertosse a ciascun topo, attraverso iniezioni intraperitoneali (100 μL a sinistra e 100 μL sul sito destro della pancia).
NOTA: La localizzazione precisa dell'iniezione intraperitoneale con tossina della pertosse ha dimostrato di essere essenziale per l'attivazione delle cellule T nel linfonodo drenante15. - Facoltativo: iniettare nuovamente il peptide MOG35-55 il giorno 7 (come usato in alcuni protocolli16) ripetendo il passaggio 4.2.
NOTA: Soprattutto, assicurarsi che le siringhe e gli aghi utilizzati per l'immunizzazione contenenti MOG / CFA o tossina della pertosse siano adeguatamente smaltiti in sacchetti / contenitori a rischio biologico. - Valutare il punteggio clinico giornalmente, utilizzando una scala da 0 a 6 come precedentemente descritto6.
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Representative Results
Il protocollo rapido, semplice e standardizzato per la preparazione delle emulsioni CFA/MOG è illustrato nella Figura 1. Questo metodo è stato recentemente descritto altrove6. Le emulsioni CFA/MOG possono essere preparate anche con altri metodi, come il tradizionale metodo a siringa o mediante vortice. Questi metodi sono stati confrontati qui valutando la qualità delle emulsioni. Tutti i metodi producevano emulsioni acqua-in-olio; L'omogeneità e la qualità di queste emulsioni sono state valutate aggiungendo una piccola goccia su un vetrino seguita da un'osservazione al microscopio a contrasto di fase. Le emulsioni prodotte dal metodo di omogeneizzazione dello scuotimento mostravano particelle grigie / bianche a forma di fagiolo, che rappresentavano minuscole goccioline di emulsioni acqua-in-olio. Al contrario, le goccioline di emulsione prodotte utilizzando il metodo della siringa erano più grandi e più bianche. Nel metodo del vortice, sono state osservate grandi particelle grigie/nere, corrispondenti a bolle d'aria intrappolate nell'emulsione (Figura 2A).
Per testare la stabilità a lungo termine delle emulsioni acqua-in-olio, i cambiamenti nella distribuzione delle dimensioni delle particelle nel tempo possono essere misurati utilizzando un analizzatore di dimensioni delle particelle di diffrazione laser. Le emulsioni preparate con il protocollo standardizzato qui descritto non hanno mostrato alcun cambiamento nella dimensione delle particelle per un periodo di 6 settimane (Figura 2B). Pertanto, è stata testata la possibilità che le emulsioni contenenti il peptide MOG35-55 possano essere conservate a 4 °C per un lungo periodo di tempo e indurre ancora la malattia. Le emulsioni contenenti il peptide CFA/MOG35-55 sono state preparate con questo metodo e utilizzate immediatamente o conservate a 4 °C per 3 o 15 settimane (Figura 3A). I topi sono stati iniettati con 50 μg di peptide MOG35-55 e valutati per i segni clinici della malattia come descritto nel protocollo. Sorprendentemente, le emulsioni fresche, di 3 settimane e di 15 settimane hanno tutte indotto una malattia EAE simile in tutti gli animali testati durante l'esperimento (Figura 3A). Pertanto, questi risultati hanno rivelato che le emulsioni contenenti peptidi MOG35-55 preparati utilizzando il metodo di omogeneizzazione dello scuotimento possono essere conservate per almeno 15 settimane e indurre ancora EAE con punteggi di malattia paragonabili a quelli ottenuti con emulsioni appena preparate.
Per semplificare e accelerare la messa a punto degli esperimenti e per evitare differenze lotto per lotto dei reagenti, tutti i componenti necessari sono stati preparati, aliquotati e conservati alla temperatura appropriata in anticipo. Quindi, sono stati eseguiti cinque esperimenti per un periodo di 6 mesi. I topi C57BL6/J sono stati immunizzati con le emulsioni MOG/CFA preparate il giorno dell'immunizzazione, utilizzando kit di emulsione e valutati per i sintomi clinici. I topi hanno sviluppato un modello di malattia simile in tutti gli esperimenti (Figura 3B), rivelando che il metodo di omogeneizzazione qui presentato ha prodotto emulsioni che hanno indotto EAE in modo coerente e riproducibile.
Il tempo totale di preparazione, dal recupero di tutti i reagenti, all'aggiunta e agitando il tubo tre volte e caricando le siringhe con l'emulsione, pronta per l'immunizzazione, non richiede più di 30 minuti. Inoltre, deve essere preparato solo il 20% di emulsione extra. Questo è in netto contrasto con altri protocolli, in cui il tempo di preparazione può essere fino a 1,5-2 ore e potrebbe essere necessario preparare il 50% -100% dell'emulsione extra per garantire materiale sufficiente per l'immunizzazione16.
Figura 1: Schema del processo di preparazione dell'emulsione utilizzando un kit di emulsione commerciale. Questa figura è stata riutilizzata da Topping et al6 con il permesso. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Caratterizzazione delle emulsioni prodotte con metodi diversi. (A) Immagini rappresentative di tre diversi metodi di preparazione: metodo di omogeneizzazione standard, metodo tradizionale della siringa e metodo del vortice. Una piccola quantità di emulsione è stata posta su un vetrino e osservata al microscopio a contrasto di fase (400x). Barra di scala = 50 μm. Viene mostrata una preparazione rappresentativa di ciascun metodo da >15 esperimenti. La media D [4, 3] (la media ponderata in volume) è stata misurata con un analizzatore di dimensioni delle particelle per essere 0,7 μm per il metodo di omogeneizzazione a scuotimento, 1,4 μm per il metodo della siringa e 5,4 μm per il metodo a vortice. (B) La stabilità dell'emulsione nel tempo è stata misurata utilizzando l'analizzatore granulometrico. È stata preparata un'emulsione di CFA/PBS con l'omogeneizzatore di scuotimento e il kit di emulsione, e la dimensione delle particelle è stata determinata, utilizzando la diffrazione laser nel tempo. Un campione è stato analizzato immediatamente e quindi le emulsioni sono state conservate a 4 °C. Questi campioni sono stati analizzati 1, 2, 4 e 6 settimane dopo la preparazione. La media media ponderata del volume D [4, 3] per tutti i campioni è stata di 0,73 μm ± 0,03 μm (SD). Questa figura è stata riutilizzata da Topping et al6 con il permesso. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Induzione EAE in topi immunizzati con una preparazione di peptide MOG35-55 / CFA utilizzando un kit di emulsione commerciale. (A) Induzione EAE dell'emulsione immagazzinata. Le emulsioni contenenti CFA e 50 μg di MOG35-55 peptide/topo sono state preparate con il metodo di omogeneizzazione e conservate a 4 °C per 3 o 15 settimane. Le emulsioni appena preparate e quelle conservate sono state iniettate lo stesso giorno in topi C57BL/6J (n = 5 per gruppo). I topi hanno ricevuto 80 ng di tossina della pertosse lo stesso giorno e 24 ore dopo, e sono stati valutati per i segni di malattia utilizzando punteggi clinici da 0 a 6. (B) Induzione coerente di EAE con le emulsioni preparate utilizzando il metodo di omogeneizzazione. Emulsioni contenenti CFA e 50 μg di MOG35-55 peptide/topo sono state preparate in diversi punti temporali e iniettate in topi C57BL/6J (n = 5 per gruppo). I topi hanno ricevuto 80 ng di tossina della pertosse lo stesso giorno e 24 ore dopo, e sono stati valutati per i segni di malattia. Questa figura è stata riutilizzata da Topping et al6 con il permesso. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
File supplementare 1: Calcolo della quantità di ciascun reagente (peptide MOG35-55 , PBS, CFA e IFA) per la preparazione dell'emulsione. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Le emulsioni acqua-in-olio, come l'antigene/adiuvante di Freund, sono state utilizzate per più di mezzo secolo per indurre EAE17. Attualmente non esiste un metodo standardizzato per preparare emulsioni di antigene che sia indipendente dall'influenza umana. La miscelazione manuale con siringhe è standard per la maggior parte dei laboratori, tuttavia questo metodo richiede tempo, spesso comporta un'eccessiva perdita di materiale e la qualità varia a seconda dello scienziato che lo prepara.
Il metodo presentato in questo manoscritto utilizza una macchina di omogeneizzazione standard per preparare le emulsioni antigene/CFA. Inoltre, tutti i reagenti utilizzati qui possono essere aliquotati e conservati per un lungo periodo di tempo, rendendo conveniente e veloce la preparazione delle emulsioni. Il tempo totale per preparare emulsioni per un massimo di 80 topi è di circa 30 minuti. Questo è in netto contrasto con altri metodi pubblicati, che richiedono 1-1,5 ore per preparare le emulsioni MOG35-55 16,18. Altri metodi manuali, come il metodo a una siringa, sono spesso associati all'introduzione di bolle d'aria all'interno delle siringhe5. Il metodo qui presentato è stato progettato in modo che l'emulsione venga spinta in siringhe dalla loro estremità posteriore, eliminando l'introduzione di bolle d'aria e riducendo al minimo la perdita di materiale.
Per garantire risultati coerenti e minimo spreco di emulsione, ci sono alcuni passaggi critici nel metodo di omogeneizzazione dello scuotimento che richiedono un'attenzione specifica. Il tubo e i reagenti devono essere posizionati su ghiaccio prima di iniziare l'esperimento e dopo la fase di omogeneizzazione. Il PBS e l'antigene devono essere aggiunti prima al tubo, seguiti dall'adiuvante (CFA / IFA), al fine di evitare alte concentrazioni locali di antigene durante la miscelazione con l'adiuvante dell'olio. Il coperchio deve essere serrato saldamente aprendolo e chiudendolo un paio di volte per evitare perdite. Inoltre, la siringa non deve essere riempita completamente con l'emulsione, ma solo fino al segno di 0,15 mL sul cilindro della siringa per evitare di sprecare l'emulsione. Lo stantuffo deve essere inserito nella siringa con molta attenzione, usando entrambe le mani. Dopo che tutte le siringhe sono state riempite con l'emulsione, le siringhe possono essere conservate a temperatura ambiente se devono essere utilizzate lo stesso giorno; in caso contrario, devono essere conservati a 4 °C fino all'uso.
Le emulsioni di antigene/CFA preparate con il metodo di omogeneizzazione dell'agitazione possono apparire meno solide rispetto a quelle preparate con il metodo della siringa. È possibile aggiungere un'ulteriore fase di agitazione (vedere il punto 2.5 del protocollo), che potrebbe addensare l'emulsione. Tuttavia, le emulsioni che superano il "test di caduta" e l'esame al microscopio a contrasto di fase inducono EAE indipendentemente dallo stato fisico dell'emulsione.
L'investimento iniziale richiesto in una macchina di omogeneizzazione scuotente è una limitazione. Tuttavia, le fasi di preparazione qui descritte garantiscono uno spreco minimo di emulsione e dell'antigene, che è spesso costoso da acquistare o richiede molto tempo per la preparazione. Pertanto, a lungo termine, questo metodo è più economico da usare poiché consente di risparmiare tempo e reagenti. L'antigene e il tampone utilizzati nel metodo di omogeneizzazione dello scuotimento possono influire sulla qualità dell'emulsione. Il peptide MOG35-55 disciolto in PBS senza Ca 2+/Mg 2+ ha generato costantemente emulsioni con piccole particelle uniformi di acqua in olio (Figura 2A). Tuttavia, gli antigeni peptidici disciolti in PBS con Ca 2+/Mg2+, o peptidi contenenti molti residui di aminoacidi carichi, potrebbero generare emulsioni meno viscose. Non è stato testato se tali emulsioni abbiano meno probabilità di indurre malattie nei modelli animali. Un'altra limitazione di questo metodo è che non più di 8 ml di emulsione antigene / CFA possono essere preparati da una provetta. Le provette non devono essere caricate con più di 9,6 ml in totale (4,8 mL di PBS/antigene e 4,8 mL di CFA/IFA), che saranno sufficienti per caricare otto siringhe da 1 ml. Sebbene il tubo possa contenere un volume maggiore, nel tubo deve essere presente un po 'd'aria, altrimenti non verranno generate emulsioni perfette. Se è necessaria più emulsione, può essere preparata utilizzando tubi aggiuntivi.
Rispetto ai metodi esistenti, non vi è alcuna differenza da persona a persona quando si preparano le emulsioni con il metodo di omogeneizzazione dello scuotimento. Il metodo più comunemente usato per preparare emulsioni per esperimenti EAE utilizza siringhe che vengono spinte avanti e indietro a mano19. La forza, il tempo e la temperatura non possono essere ben controllati ed è quindi difficile standardizzare un metodo basato su siringhe. Altri metodi per produrre emulsioni acqua-in-olio sfruttano i sonicatori a bagno d'acqua ad ultrasuoni. Le emulsioni preparate con un metodo di sonicazione sono in grado di indurre EAE in topi BALB/c altrimenti resistenti8. Il metodo descritto potrebbe essere standardizzato e quindi utile. Tuttavia, il problema con i sonicatori a bagno d'acqua ad ultrasuoni e sonda ad ultrasuoni è che è difficile trasferire l'emulsione nei tubi alle siringhe utilizzate per l'immunizzazione senza introdurre bolle d'aria. I tubi utilizzati per il metodo qui presentato eliminano questo problema.
Un metodo a vortice potrebbe essere considerato un metodo standardizzato con una velocità, un tempo e una temperatura impostati. Tuttavia, testare questo metodo per preparare un'emulsione facendo vortice la preparazione MOG / CFA per 10 minuti non ha portato a nessuna induzione della malattia nei topi C57BL / 6J (dati non mostrati). Tuttavia, l'EAE può essere indotto con una miscela antigene/CFA preparata mediante vortice per 45 minuti18, che sarebbe una procedura molto più lunga rispetto al metodo presentato in questo manoscritto.
Un altro adiuvante a base di olio (vedi Tabella dei materiali), approvato dalla FDA per essere utilizzato sugli esseri umani, che produce un'emulsione acqua-in-olio ha dimostrato di essere un promettente adiuvante per i vaccini contro il cancro e la malaria20,21,22. Pertanto, il protocollo standardizzato qui presentato può essere adattato per l'uso in clinica. Esperimenti preliminari hanno rivelato che il metodo di omogeneizzazione dello scuotimento genera emulsioni con questo olio approvato dalla FDA che sono di qualità migliore rispetto al metodo della siringa manuale (dati non mostrati).
In conclusione, il metodo di omogeneizzazione dello scuotimento qui presentato offre una serie di vantaggi, come la generazione più rapida di emulsioni di qualità controllata, l'elevata riproducibilità in un certo numero di modelli di malattie autoimmuni e una riduzione dei costosi reagenti necessari per preparare emulsioni di antigene / CFA. Poiché non vi è alcuna differenza da persona a persona che genera queste emulsioni acqua-in-olio, offre la possibilità di standardizzare questo metodo necessario per la ricerca biomedica riproducibile e la scoperta di farmaci nell'area delle malattie autoimmuni e dello sviluppo di vaccini terapeutici.
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Disclosures
BTB Emulsions AB ha presentato una domanda di brevetto per l'uso di un dispositivo e di un metodo per la preparazione di emulsioni per l'immunizzazione e per animali ed esseri umani (numero di domanda di brevetto europeo: EP3836884A1). BTB è CEO e fondatore della società e azionista di BTB Emulsions. Bertin-Instruments distribuisce in tutto il mondo i kit di emulsione utilizzati in questa pubblicazione.
Acknowledgments
L'autore desidera ringraziare le unità abitative degli animali dell'Università di Lund, Camilla Björklöv e Agnieszka Czopek, per il loro sostegno, e Richard Williams, Kennedy Institute of Rheumatology, Università di Oxford, Regno Unito, per le critiche costruttive e il supporto linguistico che produce questo manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Injection syringe | B. Braun | 9166017V | |
| 1 mL Injection syringe | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
| 7 ml empty tubes with caps | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | 7 mL tube |
| 50 mL sterile centrifuge tube | Fisher Scientific | 10788561 | 50 mL tube |
| Bordetella pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P2980 | Store at -20 °C |
| Dispersant, light mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Store at RT |
| Emulsion kit | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | Containing a tube, cap, and plunger |
| Incomplete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C |
| Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Store at +4 °C |
| Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | Particle size analyzer |
| Minilys-Personal homogenizer | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | Shaking homogenizer |
| MOG 35-55 Peptide | Innovagen | N/A | |
| Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | FDA-approved oil adjuvant |
| Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm | Fisher Scientific | 17124381 | Sterlie filter |
| PBS, Ca2+/Mg2+ free | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| Phase-Constrast Microscope | Olympus | BX40-B | |
| Steel Beads 3.2 mm | Fisher Scientific | NC0445832 | Autoclave and store at RT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | Store at RT |
References
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