Summary
Чтобы вызвать экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, животную модель рассеянного склероза, мышей иммунизируют эмульсией «вода в масле», содержащей аутоантиген и полный адъювант Фройнда. Хотя для приготовления этих эмульсий существует несколько протоколов, здесь представлен быстрый, простой и стандартизированный протокол гомогенизации для получения эмульсии.
Abstract
Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE) имеет сходные иммунологические и клинические особенности с рассеянным склерозом (РС) и поэтому широко используется в качестве модели для определения новых лекарственных мишеней для лучшего лечения пациентов. РС характеризуется несколькими различными течениями заболевания: рецидивирующе-ремиттирующий РС (РРМС), первично-прогрессирующий РС (ППМС), вторичный прогрессирующий РС (СПМС) и редкая прогрессирующая рецидивирующая форма РС (ПРМС). Хотя животные модели не точно имитируют все эти контрастные фенотипы заболеваний человека, существуют модели EAE, которые отражают некоторые из различных клинических проявлений РС. Например, миелиновый олигодендроцитарный гликопротеин (MOG), индуцированный EAE у мышей C57BL/6J, имитирует человеческую PPMS, в то время как миелиновый протеолипидный белок (PLP), индуцированный EAE у мышей SJL / J, напоминает RRMS. Другие аутоантигены, такие как основной белок миелина (MBP), и ряд различных штаммов мышей также используются для изучения EAE. Чтобы вызвать заболевание в этих аутоантигенно-иммунизационных моделях EAE, готовят эмульсию «вода в масле» и вводят подкожно. Большинство моделей EAE также требуют инъекции коклюшного токсина для развития заболевания. Для последовательной и воспроизводимой индукции EAE необходим подробный протокол подготовки реагентов к получению эмульсий антигена/адъюванта. Метод, описанный здесь, использует преимущества стандартизированного метода для получения эмульсий «вода в масле». Он прост и быстр и использует встряхивающий гомогенизатор вместо шприцев для приготовления эмульсий с контролируемым качеством.
Introduction
Нарушение иммунологической толерантности может привести к генерации аутоиммунных расстройств, таких как рассеянный склероз (РС). По оценкам, 2,8 миллиона человек живут с РС во всем мире1. Хотя точная причина РС до сих пор в значительной степени неизвестна, дисрегуляция аутореактивных Т- и В-клеток, а также дефекты функции Treg играют важную роль в патогенезе заболевания 2,3.
Животные модели аутоиммунных заболеваний являются важными инструментами для исследования потенциальных терапевтических методов. Экспериментальная модель аутоиммунного энцефаломиелита (EAE) используется в течение почти столетия исследователями, заинтересованными в MS4. В ранних экспериментах заболеваемость была относительно низкой. Введение полного адъюванта Фройнда (CFA), содержащего микобактерии и токсин коклюша, позволило последовательно индукционировать EAE у мышей4. Самое главное, необходимо смешать CFA с антигеном, специфичным для центральной нервной системы (ЦНС), чтобы получить однородную эмульсию «вода в масле» для индуцирования EAE. Наиболее распространенные в настоящее время модели EAE основаны на активной иммунизации мышей энцефалогенными пептидами. Генетический фон мышей играет важную роль в восприимчивости к заболеванию, причем пептиды миелин-олигодендроцитарных гликопротеинов (MOG35-55) и протеолипидного белка миелина (PLP139-151) используются для индуцирования EAE у мышей C57BL/6J и SJL соответственно5. Тем не менее, другие мышиные штаммы и пептиды, полученные из ЦНС, также могут быть использованы.
Качество CFA/пептидной эмульсии является критическим фактором, определяющим пенетрантность заболевания в активной иммунизации EAE model6. Гомогенная эмульсия «вода в масле» должна быть получена путем смешивания энцефалтогенных пептидов, растворенных в водном буфере с CFA, иначе у животных не разовьется болезнь. Были опубликованы многочисленные протоколы по приготовлению CFA/пептидных эмульсий. Примеры включают использование вихря7, обработки ультразвуком8, шприцев и трехстороннего Т-образного разъема9 или одного шприца только5. Однако все эти методы трудно стандартизировать и часто связаны с длинными и сложными протоколами.
По сравнению со всеми вышеперечисленными методами, простой метод, описанный здесь для приготовления эмульсии, предлагает преимущества отсутствия различий между людьми и относительно быстроты. Эмульсия генерируется гомогенизатором, встряхивающим реагенты с заданной скоростью, временем и температурой, обеспечивая быстрые и последовательные результаты. В дополнение к индуцированию заболевания в модели EAE, этот метод также может быть использован для изучения других моделей аутоиммунных заболеваний, таких как коллаген-индуцированный артрит (CIA) и антиген-индуцированный артрит (AIA)6. Поэтому предполагается, что этот метод может быть использован для последовательного индуцирования заболевания на других животных моделях, которые зависят от эмульсий «вода в масле» с аутоантигенами, таких как экспериментальный аутоиммунный неврит (EAN)10, экспериментальный аутоиммунный тиреоидит (EAT)11, аутоиммунный увеит (EAU)12 и миастения (MG)13. Этот метод также вызывает общие иммунные реакции, такие как гиперчувствительность замедленного типа (DTH) последовательно6, и поэтому может быть использован для доставки противораковых и малярийных вакцин (см. обсуждение).
Таким образом, разработан и представлен здесь быстрый (общее время приготовления ~30 мин), простой (все реагенты могут быть приготовлены заранее и сохранены) и стандартизированный (эмульсия осуществляется с помощью встряхивающего гомогенизатора) способ. Эмульсии CFA/антигена, приготовленные с использованием этого протокола, последовательно индуцируют заболевание на аутоиммунных животных моделях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры для животных были выполнены в соответствии с практикой Шведского совета по исследованиям животных и были одобрены Комитетом по этике животных, Лунд-Мальмё, Швеция (номер разрешения: M126-16).
ПРИМЕЧАНИЕ: Схематический поток метода описан на рисунке 1.
1. Подготовка материала
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте все реагенты асептически в стерильной вытяжке, а также аликвотируйте и храните при указанной температуре. Реагенты могут храниться до 2 лет без потери эффекта.
- Приготовьте CFA, содержащий 20 мг/мл Mycobacterium tuberculosis , как описано ниже.
- Добавьте 100 мг сублимированного M. tuberculosis H37RA (см. Таблицу материалов) и пять стальных шариков толщиной 3,2 мм в трубку объемом 7 мл (см. Таблицу материалов). Встряхните трубку в гомогенизаторе (см. Таблицу материалов) в течение 60 с при максимальной скорости (5 000 об/мин).
- Добавьте 5 мл неполного адъюванта Фройнда (IFA) в трубку и снова встряхните в течение 60 с на самой высокой скорости. Переложите суспензию гомогенизированного M. tuberculosis в IFA (теперь называемой CFA) в свежий тюбик с пипеткой, оставив бусины, и храните при 4 °C до использования.
- Добавьте сверхчистую воду в лиофилизированный порошок пептида MOG35-55 (см. Таблицу материалов) для получения конечной концентрации пептида 10 мг/мл. Стерилизуйте раствор, пропуская его через фильтр 0,2 мкм. Приготовьте 60 мкл аликвот и храните при -20 °C до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пептид MOG35-55 , используемый для этого эксперимента, имеет чистоту ImmunoGrade (~ 70%), расщепляется TFA, легко растворяется в воде и содержит C-концевой амид (-NH2) для повышения стабильности in vivo 14. Пептидные аликвоты никогда не размораживали и повторно замораживали более двух раз и хранили при -20 °C до использования. - Приготовьте 100 мл буфера коклюшного токсина: растворите 2,9 г NaCl в 80 мл 1x Ca2 +/Mg2+ свободного PBS и добавьте 100 мкл 10% Triton X-100. Отрегулируйте объем до 100 мл с помощью PBS и стерилизуйте раствор, пропуская его через фильтр 0,2 мкм. Приготовьте 10 мл аликвот и храните при 4 °C до использования.
2. Получение CFA/пептидных эмульсий
- Рассчитайте количество эмульсии, необходимое для иммунизации. В этом стандартном протоколе каждая мышь получает 50 мкг пептида MOG35-55 и 300 мкг M. tuberculosis , рассеянного в адъюванте Фройнда (CFA). Количество каждого реагента (пептид MOG35-55 , PBS, CFA и IFA), необходимое для получения эмульсий, может быть рассчитано с использованием дополнительного файла 1. В расчет включается дополнительно 20% всех реагентов, чтобы компенсировать небольшие потери эмульсии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерческий набор эмульсий (см. Таблицу материалов), используемый в данном исследовании, включает трубку, винтовой колпачок и плунжер в стерилизованном мешочке. Каждая трубка эмульсионного набора вмещает максимум 9,6 мл, что позволяет приготовить шприцы размером 8 х 1 мл, достаточные для иммунизации 40 мышей (или 80 мышей при использовании 100 мкл эмульсии на животное). - Поместите завинчивающуюся трубку (из коммерческого эмульсионного комплекта) и реагенты для использования на льду.
- Добавьте компоненты эмульсии в следующем порядке в объемах, рассчитанных на этапе 2.1: PBS, затем пептид, затем M. tuberculosis в CFA и, наконец, IFA.
- Плотно закройте трубку колпачком, затянув и ослабив ее несколько раз. Энергично встряхните тюбик в течение 5-10 с вручную, чтобы предварительно перемешать реагенты.
- Поместите трубку в встряхивающий гомогенизатор и закрепите ее стержнем. Установите скорость на самую высокую настройку, а время на 60 с. Как только пробег закончится, поместите трубку на лед на 3 минуты. Повторите запуск еще один или два раза с теми же настройками.
- Центрифугируйте трубку при 300 х г в течение 1 мин, чтобы удалить захваченный воздух и уплотнить эмульсию.
- Снимите колпачок с трубки, вставьте поршень в трубку и медленно толкайте его вниз, пока он не достигнет верхней части эмульсии. Снимите застежку-защелку в нижней части трубки, скручив ее.
- Извлеките плунжер из инжекционного шприца (1 мл; см. Таблицу материалов). Добавьте иглу (предпочтительно 25-27 г) к инъекционному шприцу.
- Прикрепите задний конец инжекторного шприца к специальному замку в нижней части трубки и зафиксируйте его коротким поворотом.
- Перенесите эмульсию из трубки в шприц для инъекций, осторожно толкнув плунжер. Прекращается, когда эмульсия достигает градуировки 0,15 мл инъекционного шприца.
- Отделите инжекционный шприц от трубки и осторожно вставьте поршень, следя за тем, чтобы воздух не попадал в шприц. Толкайте плунжер до тех пор, пока эмульсия не выйдет из иглы.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе часть эмульсии может быть использована для контроля качества (см. шаг 3). - Повторите шаги 2.8-2.11 для остальной части эмульсии, присутствующей в трубке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму отходы дорогостоящих эмульсий CFA/антигена, следует использовать шприцы объемом 1 мл. Могут использоваться другие шприцы, которые подходят к специальному замку в нижней части трубки; однако, возможно, потребуется приготовить больший объем эмульсии. Пептидная эмульсия CFA/MOG35-55 может храниться при температуре 4 °C до 15 недель без потери своей способности, индуцирующей EAE.
3. Контроль качества эмульсии
- Испытание на каплю: Добавьте небольшую каплю эмульсии в стерильную коническую трубку объемом 50 мл, заполненную 20 мл холодной воды. Закройте трубку и встряхните ее вручную на пару секунд. Появление крошечных отчетливых капель подтверждает образование эмульсии «вода в масле».
- Исследуйте эмульсию с помощью фазово-контрастной микроскопии.
- Чтобы проанализировать размер частиц воды в масле, добавьте крошечную каплю (2-3 мкл) эмульсии на предметное стекло микроскопа, смажьте ее с помощью крышки, а затем сильно надавите круговыми движениями, чтобы сгладить эмульсию.
- Исследуйте смазанную эмульсию под фазово-контрастным микроскопом (см. Таблицу материалов) с 400-кратным увеличением и фокусируйтесь на поле с монослоем эмульсии. Убедитесь, что видны мелкие однородные серо-белые частицы (рисунок 2A).
- Анализируйте размер частиц эмульсии с помощью лазерной дифракции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лазерная дифракция измеряет распределение частиц по размерам с помощью лазерного луча. Это окончательный тест контроля качества эмульсий. Репрезентативный результат распределения частиц по размерам с использованием метода, описанного здесь, показан на рисунке 2B (подробное описание см. в Topping et al.6). Тем не менее, тест на падение и микроскопическое исследование достаточны для проверки того, была ли сформирована удовлетворительная эмульсия.- Установите показатели преломления как для красных, так и для синих лазеров для диспергатора (см. Таблицу материалов) на 1,456 и для образца на 1,33 на анализаторе размера частиц (см. Таблицу материалов). Установите коэффициент поглощения преломления равным 0,02.
- Добавьте одну каплю из шприца, содержащего пептидную эмульсию, в дисперсионную установку, содержащую легкое минеральное масло. Начните сбор данных сразу после дисперсии эмульсии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки распределения частиц по размерам применялась модель общего назначения и предполагались сферические частицы.
4. Индукция EAE с использованием пептидной эмульсии MOG 35-55 у мышей C57BL6/J
ПРИМЕЧАНИЕ: Во всех экспериментах использовались пять 8-12-недельных самок мышей C57BL6/J.
- Перед иммунизацией обезболивают мышей, используя 2,5% испаренного изофлурана, и подтверждают с помощью твердого щипка пальца ноги.
- Вводят каждой мыши подкожно, используя шприцы по 1 мл, в два разных участка, на правой и левой сторонах задней части боковой части с 200 мкл эмульсии, содержащей 50 мкг пептида MOG35-55 в соотношении 1:1 (v/v) пептида/CFA.
- По крайней мере, через 1,5 ч после иммунизации эмульсией, а затем снова через 24 ч вводят в общей сложности 80 нг токсина Bordetella pertussis в 200 мкл буфера коклюшного токсина каждой мыши, посредством внутрибрюшинных инъекций (100 мкл слева и 100 мкл на правом участке живота).
ПРИМЕЧАНИЕ: Было показано, что точная локализация внутрибрюшинной инъекции коклюшного токсина необходима для активации Т-клеток в дренирующем лимфатическом узле15. - Необязательно: Повторно ввести пептид MOG35-55 на 7-й день (как используется в некоторых протоколах16), повторив шаг 4.2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Самое главное, убедитесь, что шприцы и иглы, используемые для иммунизации, содержащие MOG / CFA или коклюшный токсин, надлежащим образом утилизируются в мешках / контейнерах для биологической опасности. - Оценивайте клинический балл ежедневно, используя шкалу от 0 до 6, как описано ранее6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Быстрый, простой и стандартизированный протокол приготовления эмульсий CFA/MOG показан на рисунке 1. Этот метод недавно был описан в другом месте6. Эмульсии CFA/MOG также могут быть получены с помощью других способов, таких как традиционный шприцевой метод или путем вихря. Эти методы сравнивали здесь путем оценки качества эмульсий. Всеми методами получали эмульсии «вода в масле»; однородность и качество этих эмульсий оценивали путем добавления небольшой капли на стеклянный слайд с последующим наблюдением под фазово-контрастным микроскопом. Эмульсии, полученные методом встряхивания гомогенизацией, отображали серо-белые бобообразные частицы, представляющие собой крошечные капли эмульсий «вода в масле». Напротив, капли эмульсии, полученные с использованием шприцевого метода, были больше и белее. В вихревом методе наблюдались крупные серые/черные частицы, соответствующие пузырькам воздуха, захваченным в эмульсии (рисунок 2А).
Для проверки долгосрочной стабильности эмульсий «вода в масле» изменения в распределении частиц по размерам с течением времени могут быть измерены с помощью лазерного дифракционного анализатора размера частиц. Эмульсии, приготовленные по стандартизированному протоколу, описанному здесь, не показали какого-либо изменения размера частиц в течение 6 недель (рисунок 2B). Поэтому была проверена возможность того, что эмульсии, содержащие пептид MOG35-55 , могут храниться при 4 °C в течение длительного периода времени и все еще вызывать заболевание. Эмульсии, содержащие пептид CFA/MOG35-55 , получали этим способом и использовали немедленно или хранили при 4 °C в течение 3 или 15 недель (фиг.3A). Мышам вводили 50 мкг пептида MOG35-55 и оценивали клинические признаки заболевания, как описано в протоколе. Примечательно, что свежие, 3-недельные и 15-недельные эмульсии индуцировали сходное заболевание EAE у всех животных, протестированных на протяжении всего эксперимента (рисунок 3A). Таким образом, эти результаты показали, что эмульсии, содержащие пептиды MOG35-55 , приготовленные с использованием метода гомогенизации встряхивания, могут храниться в течение по меньшей мере 15 недель и по-прежнему индуцировать EAE с показателями заболевания, сопоставимыми с показателями, полученными с помощью свежеприготовленных эмульсий.
Чтобы упростить и ускорить установку экспериментов и избежать многопартийной разницы реагентов, все необходимые компоненты были заранее подготовлены, аликвотированы и сохранены при соответствующей температуре. Затем было проведено пять экспериментов в течение 6 месяцев. Мышей C57BL6/J иммунизировали эмульсиями MOG/CFA, приготовленными в день иммунизации, с использованием наборов эмульсий, и оценивали на наличие клинических симптомов. Мыши развили аналогичную картину заболевания во всех экспериментах (рисунок 3B), показав, что метод гомогенизации, представленный здесь, производил эмульсии, которые индуцировали EAE последовательным и воспроизводимым образом.
Общее время приготовления, от извлечения всех реагентов, добавления их и трижды встряхивания трубки, а также загрузки шприцев эмульсией, готовой к иммунизации, занимает не более 30 мин. Кроме того, необходимо приготовить только 20% дополнительной эмульсии. Это резко контрастирует с другими протоколами, где время приготовления может составлять до 1,5-2 ч и 50%-100% дополнительной эмульсии, возможно, потребуется подготовить для обеспечения достаточного количества материала для иммунизации16.
Рисунок 1: Схема процесса получения эмульсии с использованием коммерческого эмульсионного набора. Эта цифра была повторно использована из Topping et al6 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Характеристика эмульсий, полученных с использованием различных методов. (A) Репрезентативные изображения из трех различных методов получения: стандартный метод гомогенизации, традиционный метод шприцев и вихревой метод. Небольшое количество эмульсии помещали на стеклянный предметный предмет и наблюдали под фазоконтрастным микроскопом (400х). Шкала бара = 50 мкм. Показана репрезентативная подготовка каждого метода из экспериментов >15. Среднее значение D [4, 3] (средневзвешенное по объему) измеряли с помощью анализатора размера частиц, равное 0,7 мкм для метода встряхивания гомогенизации, 1,4 мкм для шприцевого метода и 5,4 мкм для вихревого метода. (B) Стабильность эмульсии с течением времени измерялась с помощью анализатора размера частиц. Эмульсию CFA/PBS готовили с помощью встряхивающего гомогенизатора и эмульсионного набора, а размер частиц определяли с помощью лазерной дифракции с течением времени. Один образец анализировали немедленно, а затем эмульсии хранили при 4 °C. Эти образцы анализировали через 1, 2, 4 и 6 недель после подготовки. Средневзвешенное значение объема D [4, 3] для всех образцов составило 0,73 мкм ± 0,03 мкм (SD). Эта цифра была повторно использована из Topping et al6 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Индукция EAE у мышей, иммунизированных препаратом пептида MOG35-55 /CFA с использованием коммерческого эмульсионного набора. (A) Индукция EAE хранимой эмульсии. Эмульсии, содержащие CFA и 50 мкг пептида MOG35-55 /мышь, готовили методом гомогенизации и хранили при 4°C в течение 3 или 15 недель. Свежеприготовленные и сохраненные эмульсии вводили в тот же день мышам C57BL/6J (n = 5 на группу). Мыши получили 80 нг коклюшного токсина в тот же день и через 24 часа и были оценены по признакам заболевания с использованием клинических баллов от 0 до 6. (B) Последовательная индукция EAE с эмульсиями, полученными с использованием метода гомогенизации. Эмульсии, содержащие CFA и 50 мкг пептида MOG35-55 /мышь, готовили в разные моменты времени и вводили мышам C57BL/6J (n = 5 на группу). Мыши получили 80 нг коклюшного токсина в тот же день и через 24 часа, и были оценены по признакам заболевания. Эта цифра была повторно использована из Topping et al6 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: Расчет количества каждого реагента (пептид MOG35-55 , PBS, CFA и IFA) для получения эмульсии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эмульсии «вода в масле», такие как антиген / адъювант Фройнда, использовались более полувека для индуцирования EAE17. В настоящее время не существует стандартизированного метода получения антигенных эмульсий, который не зависел бы от влияния человека. Ручное смешивание с использованием шприцев является стандартным для большинства лабораторий, однако этот метод занимает много времени, часто приводит к чрезмерной потере материала, а качество отличается в зависимости от того, готовит ли его ученый.
Способ, представленный в этой рукописи, использует стандартную машину гомогенизации встряхивания для получения эмульсий антигена / CFA. Кроме того, все используемые здесь реагенты могут быть аликвотированы и храниться в течение длительного периода времени, что делает его удобным и быстрым для приготовления эмульсий. Общее время приготовления эмульсий для 80 мышей составляет примерно 30 мин. Это резко контрастирует с другими опубликованными методами, которые требуют 1-1,5 ч для приготовления MOG35-55 эмульсий16,18. Другие ручные методы, такие как метод одного шприца, часто связаны с введением пузырьков воздуха в шприцы5. Способ, представленный здесь, был разработан таким образом, что эмульсия проталкивается в шприцы с их заднего конца, что исключает введение пузырьков воздуха и минимизирует потери материала.
Чтобы обеспечить стабильные результаты и минимальные потери эмульсии, есть несколько критических этапов в методе гомогенизации встряхивания, которые требуют особого внимания. Трубку и реагенты следует поместить на лед до начала эксперимента и после этапа гомогенизации. PBS и антиген должны быть добавлены сначала в трубку, а затем адъювант (CFA / IFA), чтобы избежать высоких местных концентраций антигена при смешивании с масляным адъювантом. Крышка должна быть плотно затянута, открывая и закрывая ее пару раз, чтобы избежать протечек. Кроме того, шприц не должен быть заполнен эмульсией полностью, только до отметки 0,15 мл на шприце-бочке, чтобы избежать потери эмульсии. Плунжер следует вставлять в шприц очень осторожно, обеими руками. После того, как все шприцы заполнены эмульсией, шприцы могут храниться при комнатной температуре, если они будут использоваться в тот же день; в противном случае их следует хранить при температуре 4 °C до начала использования.
Эмульсии антиген/CFA, полученные методом встряхивания гомогенизации, могут казаться менее твердыми по сравнению с эмульсиями, приготовленными шприцевым методом. Может быть добавлена дополнительная стадия встряхивания (см. шаг 2.5 в протоколе), которая может привести к утолщению эмульсии. Однако эмульсии, которые проходят «тест на падение» и исследование фазово-контрастного микроскопа, индуцируют EAE независимо от физического состояния эмульсии.
Первоначальные инвестиции, необходимые для машины гомогенизации встряхивания, являются ограничением. Тем не менее, этапы приготовления, описанные здесь, обеспечивают минимальные потери эмульсии и антигена, который часто дорог в покупке или занимает много времени для приготовления. Поэтому в долгосрочной перспективе этот метод дешевле в использовании, так как экономит время и реагенты. Антиген и буфер, используемые в методе гомогенизации встряхивания, могут влиять на качество эмульсии. Пептид MOG35-55 , растворенный в PBS без Ca2+/Mg2+ , последовательно генерирует эмульсии с небольшими однородными частицами воды в масле (рисунок 2A). Однако пептидные антигены, растворенные в PBS с Ca2 + / Mg2 +, или пептиды, содержащие много заряженных аминокислотных остатков, могут генерировать эмульсии, которые являются менее вязкими. Вопрос о том, являются ли такие эмульсии менее склонными вызывать заболевание на животных моделях, не был проверен. Другим ограничением этого метода является то, что из одной пробирки можно получить не более 8 мл эмульсии антигена/CFA. Трубы не должны быть загружены в общей сложности более чем 9,6 мл (4,8 мл PBS/антигена и 4,8 мл CFA/IFA), чего будет достаточно для загрузки восьми шприцев по 1 мл. Хотя трубка может содержать больший объем, в трубке должно присутствовать некоторое количество воздуха, иначе идеальные эмульсии не будут генерироваться. Если требуется больше эмульсии, ее можно приготовить с помощью дополнительных пробирок.
По сравнению с существующими методами, нет никакой разницы между людьми при приготовлении эмульсий методом встряхивания гомогенизации. Наиболее часто используемый метод приготовления эмульсий для экспериментов EAE использует шприцы, которые толкаются назад и вперед вручную19. Сила, время и температура не могут быть хорошо контролируемы, и поэтому трудно стандартизировать метод на основе шприца. Другие методы изготовления эмульсий «вода в масле» используют ультразвуковые ультразвуковые ультразвуковые анализаторы для водяной бани. Эмульсии, приготовленные методом обработки ультразвуком, способны индуцировать EAE у в противном случае устойчивых мышей BALB/c8. Описанный метод может быть стандартизирован и, следовательно, полезен. Однако проблема с ультразвуковыми водяными банями и ультразвуковыми зондовыми ультразвуковыми аппаратами заключается в том, что трудно перенести эмульсию в трубках на шприцы, используемые для иммунизации, без введения пузырьков воздуха. Трубки, используемые для метода, представленного здесь, устраняют эту проблему.
Вихревой метод можно рассматривать как стандартизированный метод с заданной скоростью, временем и температурой. Однако тестирование этого метода для получения эмульсии путем вихря препарата MOG / CFA в течение 10 минут не привело к индукции заболевания у мышей C57BL / 6J (данные не показаны). Тем не менее, EAE может быть индуцирована смесью антигена / CFA, полученной путем вихря в течение 45 мин18, что было бы гораздо более длительной процедурой по сравнению с методом, представленным в этой рукописи.
Было показано, что другой адъювант на масляной основе (см. Таблицу материалов), одобренный FDA для использования на людях, который производит эмульсию «вода в масле», является многообещающим адъювантом для противораковых и малярийных вакцин 20,21,22. Поэтому представленный здесь стандартизированный протокол может быть адаптирован для использования в клинике. Предварительные эксперименты показали, что метод гомогенизации встряхивания генерирует эмульсии с этим одобренным FDA маслом, которые имеют лучшее качество по сравнению с методом ручного шприца (данные не показаны).
В заключение, метод гомогенизации встряхивания, представленный здесь, обеспечивает ряд преимуществ, таких как более быстрое производство эмульсий с контролируемым качеством, высокая воспроизводимость в ряде моделей аутоиммунных заболеваний и сокращение дорогостоящих реагентов, необходимых для приготовления эмульсий антигена / CFA. Поскольку нет никакой разницы между людьми, генерирующей эти эмульсии «вода в масле», это дает возможность стандартизировать этот метод, необходимый для воспроизводимых биомедицинских исследований и открытия лекарств в области аутоиммунных заболеваний и разработки терапевтической вакцины.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
BTB Emulsions AB подала патентную заявку на использование устройства и способа приготовления эмульсий для иммунизации животных и человека (номер заявки на европейский патент: EP3836884A1). BTB является генеральным директором и основателем компании, а также акционером BTB Emulsions. Bertin-Instruments распространяет эмульсионные наборы, используемые в этой публикации, по всему миру.
Acknowledgments
Автор хотел бы выразить признательность подразделениям по содержанию животных в Лундском университете, Камилле Бьорклёв и Агнешке Чопек за их поддержку, а также Ричарду Уильямсу, Институт ревматологии Кеннеди, Оксфордский университет, Великобритания, за конструктивную критику и лингвистическую поддержку при создании этой рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Injection syringe | B. Braun | 9166017V | |
| 1 mL Injection syringe | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
| 7 ml empty tubes with caps | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | 7 mL tube |
| 50 mL sterile centrifuge tube | Fisher Scientific | 10788561 | 50 mL tube |
| Bordetella pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P2980 | Store at -20 °C |
| Dispersant, light mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Store at RT |
| Emulsion kit | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | Containing a tube, cap, and plunger |
| Incomplete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C |
| Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Store at +4 °C |
| Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | Particle size analyzer |
| Minilys-Personal homogenizer | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | Shaking homogenizer |
| MOG 35-55 Peptide | Innovagen | N/A | |
| Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | FDA-approved oil adjuvant |
| Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm | Fisher Scientific | 17124381 | Sterlie filter |
| PBS, Ca2+/Mg2+ free | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| Phase-Constrast Microscope | Olympus | BX40-B | |
| Steel Beads 3.2 mm | Fisher Scientific | NC0445832 | Autoclave and store at RT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | Store at RT |
References
- Walton, C., et al. Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition. Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).
- van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers. Frontiers in Immunology. 11, 760 (2020).
- Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells' Multiple Identities in Neuroimmunity. Frontiers in Immunology. 10, 2947 (2019).
- Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. Animal models of multiple sclerosis--potentials and limitations. Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).
- Terry, R. L., Ifergan, I., Miller, S. D. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice. Methods in Molecular Biology. 1304, 145-160 (2016).
- Topping, L. M., et al. Standardization of antigen-emulsion preparations for the induction of autoimmune disease models. Frontiers in Immunology. 13, 892251 (2022).
- Flies, D. B., Chen, L. A simple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 276 (1-2), 239-242 (2003).
- Määttä, J. A., Erälinna, J. P., Röyttä, M., Salmi, A. A., Hinkkanen, A. E. Physical state of the neuroantigen in adjuvant emulsions determines encephalitogenic status in the BALB/c mouse. Journal of Immunological Methods. 190 (1), 133-141 (1996).
- Moncada, C., Torres, V., Israel, Y. Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 162 (1), 133-140 (1993).
- Waksman, B. H., Adams, R. D. Allergic neuritis: an experimental disease of rabbits induced by the injection of peripheral nervous tissue and adjuvants. The Journal of Experimental Medicine. 102 (2), 213-236 (1955).
- Vladutiu, A. O., Rose, N. R. Autoimmune murine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type. Science. 174 (4014), 1137-1139 (1971).
- Caspi, R. R. Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse. Current Protocols in Immunology. , Chapter 15 Unit 15.6 (2003).
- Tuzun, E., et al. Guidelines for standard preclinical experiments in the mouse model of myasthenia gravis induced by acetylcholine receptor immunization. Experimental Neurology. 270, 11-17 (2015).
- Brinckerhoff, L. H., et al. Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines. International Journal of Cancer. 83 (3), 326-334 (1999).
- Kool, M., et al. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells. The Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 869-882 (2008).
- Hasselmann, J. P. C., Karim, H., Khalaj, A. J., Ghosh, S., Tiwari-Woodruff, S. K. Consistent induction of chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice for the longitudinal study of pathology and repair. Journal of Neuroscience Methods. 284, 71-84 (2017).
- Freund, J., Lipton, M. M. Experimental allergic encephalomyelitis after the excision of the injection site of antigen-adjuvant emulsion. The Journal of Immunology. 75 (6), 454-459 (1955).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).
- Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. Journal of Visualized Experiments. (62), e3778 (2012).
- Arevalo-Herrera, M., et al. Randomized clinical trial to assess the protective efficacy of a Plasmodium vivax CS synthetic vaccine. Nature Communications. 13 (1), 1603 (2022).
- Jiang, C., et al. Potential association factors for developing effective peptide-based cancer vaccines. Frontiers in Immunology. 13, 931612 (2022).
- Neninger Vinageras, E., et al. Phase II randomized controlled trial of an epidermal growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (9), 1452-1458 (2008).
