Summary
כדי לגרום לאנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית, מודל חייתי של טרשת נפוצה, עכברים מחוסנים בתחליב מים בשמן המכיל אוטואנטיגן ואדג'ובנט שלם של פרוינד. בעוד שקיימים מספר פרוטוקולים להכנת אמולסיות אלה, מוצג כאן פרוטוקול הומוגניזציה מהיר, פשוט וסטנדרטי להכנת אמולסיה.
Abstract
אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) חולקת מאפיינים אימונולוגיים וקליניים דומים עם טרשת נפוצה (MS), ולכן נעשה בה שימוש נרחב כמודל לזיהוי מטרות תרופות חדשות לטיפול טוב יותר בחולים. טרשת נפוצה מאופיינת במספר מסלולי מחלה שונים: טרשת נפוצה חוזרת (RRMS), טרשת נפוצה פרוגרסיבית ראשונית (PPMS), טרשת נפוצה פרוגרסיבית משנית (SPMS), וצורה נדירה של טרשת נפוצה מתקדמת (PRMS). למרות שמודלים של בעלי חיים אינם מחקים במדויק את כל הפנוטיפים המנוגדים הללו של מחלות אנושיות, ישנם מודלים של EAE המשקפים חלק מהביטויים הקליניים השונים של טרשת נפוצה. לדוגמה, EAE המושרה על-ידי מיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין (MOG) בעכברי C57BL/6J מחקה PPMS אנושי, בעוד ש-EAE המושרה על-ידי חלבון פרוטאוליפיד מיאלין (PLP) בעכברי SJL/J דומה ל-RRMS. נוגדי חמצון עצמיים אחרים, כגון חלבון בסיסי מיאלין (MBP), ומספר זנים שונים של עכברים משמשים גם הם לחקר EAE. כדי לגרום למחלה במודלים אלה של חיסון נגד אנטיגנים עצמיים, מכינים ומזריקים תחליב מים בשמן באופן תת-עורי. רוב המודלים של EAE דורשים גם הזרקה של רעלן שעלת כדי שהמחלה תתפתח. להשראת EAE עקבית וניתנת לשחזור, יש צורך בפרוטוקול מפורט להכנת הריאגנטים לייצור תחליבי אנטיגן/אדג'ובנטיים. השיטה המתוארת כאן מנצלת שיטה סטנדרטית ליצירת תחליבי מים בשמן. הוא פשוט ומהיר ומשתמש בהומוגנייזר מטלטל במקום במזרקים להכנת תחליבים מבוקרי איכות.
Introduction
התמוטטות של סובלנות חיסונית יכולה לגרום ליצירת הפרעות אוטואימוניות, כגון טרשת נפוצה (MS). ההערכה היא כי 2.8 מיליון אנשים חיים עם טרשת נפוצה ברחבי העולם1. למרות שהסיבה המדויקת לטרשת נפוצה עדיין אינה ידועה במידה רבה, חוסר ויסות של תאי T ו- B תגובתיים אוטומטיים, כמו גם פגמים בתפקוד Treg, ממלאים תפקידים חשובים בפתוגנזה של המחלה 2,3.
מודלים חייתיים של מחלות אוטואימוניות הם כלים חיוניים לחקר שיטות טיפוליות פוטנציאליות. המודל הניסיוני של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית (EAE) נמצא בשימוש כבר כמעט מאה שנה על ידי חוקרים המתעניינים בטרשת נפוצה4. בניסויים מוקדמים, שכיחות המחלה הייתה נמוכה יחסית. הכנסת האדג'ובנט השלם של פרוינד (CFA), המכיל מיקובקטריום ורעלן שעלת, אפשרה השראה עקבית של EAE בעכברים4. והכי חשוב, יש צורך לערבב CFA עם אנטיגן ספציפי למערכת העצבים המרכזית (CNS) כדי ליצור תחליב מים הומוגני בשמן לגרימת EAE. המודלים הנפוצים ביותר של EAE הזמינים כיום מבוססים על חיסון פעיל של עכברים עם פפטידים אנצפליטוגניים. הרקע הגנטי של העכברים ממלא תפקיד חשוב ברגישות למחלות, כאשר גליקופרוטאין מיאלין אוליגודנדרוציטים (MOG35-55) וחלבון פרוטאוליפיד מיאלין (PLP139-151) משמשים להשראת EAE בעכברי C57BL/6J ו-SJL, בהתאמה5. עם זאת, ניתן להשתמש גם בזני עכברים אחרים ובפפטידים שמקורם במערכת העצבים המרכזית.
האיכות של תחליב CFA/פפטיד היא גורם קריטי שקובע את חדירות המחלה בחיסון הפעיל EAE מודל6. יש להכין תחליב מים הומוגני בשמן על ידי ערבוב הפפטידים האנצפליטוגניים המומסים בחיץ מימי עם CFA, אחרת בעלי חיים לא יפתחו את המחלה. פרוטוקולים רבים פורסמו על הכנת תחליבי CFA/פפטידים. דוגמאות כוללות שימוש במערבולת7, סוניקציה8, מזרקים ומחבר T תלת-כיווני9, או מזרק אחד בלבד5. עם זאת, כל השיטות הללו קשות לסטנדרטיזציה ולעתים קרובות קשורות לפרוטוקולים ארוכים ומסובכים.
בהשוואה לכל השיטות הנ"ל, השיטה הפשוטה המתוארת כאן להכנת תחליב מציעה את היתרונות של היעדר הבדלים בין אדם לאדם והיותה מהירה יחסית. האמולסיה נוצרת על ידי הומוגנייזר שמטלטל את הריאגנטים במהירות, זמן וטמפרטורה מוגדרים, מה שמבטיח תוצאות מהירות ועקביות. בנוסף לגרימת מחלות במודל EAE, שיטה זו יכולה לשמש גם לחקר מודלים אחרים של מחלות אוטואימוניות כגון דלקת מפרקים הנגרמת על ידי קולגן (CIA) ודלקת מפרקים הנגרמת על ידי אנטיגן (AIA)6. לכן, צפוי כי שיטה זו יכולה לשמש כדי לגרום באופן עקבי למחלות במודלים אחרים של בעלי חיים התלויים בתחליבי מים בשמן עם אנטיגנים עצמיים, כגון דלקת עצבים אוטואימונית ניסיונית (EAN)10, דלקת אוטואימונית ניסיונית של בלוטת התריס (EAT)11, אובאיטיס אוטואימונית (EAU)12, ומיאסטניה גרביס (MG)13. שיטה זו גם גורמת לתגובות חיסוניות כלליות כגון רגישות יתר מסוג מושהה (DTH) באופן עקבי6, ולכן יכולה לשמש להעברת חיסונים נגד סרטן ומלריה (ראו דיון).
לפיכך, פותחה שיטה מהירה (זמן הכנה כולל ~ 30 דקות), פשוטה (ניתן להכין את כל הריאגנטים מראש ולאחסן אותה), וסטנדרטית (התחליב מתבצע באמצעות הומוגנייזר מטלטל) ומוצגת כאן. תחליבי CFA/אנטיגן שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה גורמים באופן עקבי למחלות במודלים אוטואימוניים של בעלי חיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו על פי נוהלי המועצה השוודית למחקר בבעלי חיים ואושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים, לונד-מאלמו, שבדיה (מספר היתר: M126-16).
הערה: זרימה סכמטית של השיטה מתוארת באיור 1.
1. הכנת חומרים
הערה: מכינים את כל הריאגנטים באופן אספטי במכסה מנוע סטרילי, ומכניסים ומאחסנים בטמפרטורה שצוינה. ניתן לאחסן את הריאגנטים עד שנתיים מבלי לאבד את השפעתם.
- יש להכין CFA המכיל 20 מ"ג/מ"ל מיקובקטריום שחפת כמתואר להלן.
- הוסיפו 100 מ"ג של שחפת M. מיובשת בהקפאה H37RA (ראו טבלת חומרים) וחמישה חרוזי פלדה בקוטר 3.2 מ"מ לצינור של 7 מ"ל (ראו טבלת חומרים). נערו את הצינור בהומוגנייזר (ראו טבלת חומרים) במשך 60 שניות במהירות הגבוהה ביותר (5,000 סל"ד).
- הוסיפו 5 מ"ל של אדג'ובנט (IFA) לא שלם של פרוינד לצינור ונערו שוב במשך 60 שניות במהירות הגבוהה ביותר. מעבירים את ה-slurry של שחפת M . הומוגנית ב-IFA (כיום נקראת CFA) לצינור טרי עם פיפטה, משאירים את החרוזים מאחור, ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
- הוסיפו מים אולטרה-פוריים לאבקה המיובשת בהקפאה של פפטיד MOG35-55 (ראו טבלת חומרים) כדי לקבל ריכוז פפטידי סופי של 10 מ"ג/מ"ל. לעקר את התמיסה על ידי העברתה דרך מסנן 0.2 מיקרומטר. יש להכין 60 μL aliquots ולאחסן בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.
הערה: הפפטיד MOG35-55 המשמש לניסוי זה הוא של טוהר ImmunoGrade (~ 70%), הוא מפוצל TFA, מתמוסס בקלות במים, ומכיל אמיד מסוף C (-NH2) כדי להגביר את יציבות in vivo 14. אליקוטים פפטידיים מעולם לא הופשרו והוקפאו מחדש יותר מפעמיים, ואוחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש. - הכינו 100 מ"ל של מאגר רעלני שעלת: המסו 2.9 גרם של NaCl ב-80 מ"ל של 1x Ca 2+/Mg 2+ PBS חופשי והוסיפו 100 μL של 10% טריטון X-100. התאם את עוצמת הקול ל-100 מ"ל באמצעות PBS ועקר את התמיסה על-ידי העברתה דרך מסנן של 0.2 מיקרומטר. מכינים 10 מ"ל ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
2. הכנת תחליבי CFA/פפטידים
- חישוב כמות התחליב הדרושה לחיסון. בפרוטוקול סטנדרטי זה, כל עכבר מקבל 50 מיקרוגרם של MOG35-55 פפטיד ו-300 מיקרוגרם של שחפת M. המפוזרת באדג'ובנט של פרוינד (CFA). ניתן לחשב את הכמות של כל מגיב (פפטיד MOG35-55 , PBS, CFA ו- IFA) הנדרשת להכנת התחליבים באמצעות קובץ משלים 1. 20% נוספים מכלל הריאגנטים, כדי לפצות על אובדן קטן של תחליב, נכלל בחישוב.
הערה: ערכת האמולסיה המסחרית (ראה טבלת חומרים) ששימשה במחקר זה כוללת צינור, מכסה בורג ובוכנה בשקית מעוקרת. כל צינור של ערכת האמולסיה מכיל מקסימום של 9.6 מ"ל, מה שמאפשר להכין 8 x 1 מ"ל מזרקים המספיקים לחיסון 40 עכברים (או 80 עכברים אם משתמשים בתחליב 100 μL לכל חיה). - הניחו את הצינור המכוסה בבורג (מתוך ערכת האמולסיה המסחרית) ואת הריאגנטים לשימוש על קרח.
- הוסף את רכיבי האמולסיה בסדר הבא בנפחים המחושבים בשלב 2.1: PBS, לאחר מכן את הפפטיד, לאחר מכן את M. שחפת ב- CFA, ולבסוף IFA.
- סגור את הצינור עם המכסה בחוזקה על ידי הידוק ושחרור אותו מספר פעמים. יש לנער את השפופרת במרץ במשך 5-10 שניות ביד כדי לערבב מראש את הריאגנטים.
- מניחים את הצינור בהומוגנייזר הרועד ומהדקים אותו באמצעות המוט. הגדר את המהירות להגדרה הגבוהה ביותר ואת הזמן ל-60 שניות. לאחר סיום הריצה, הניחו את הצינור על הקרח למשך 3 דקות. חזור על ההפעלה פעם או פעמיים נוספות עם אותן הגדרות.
- צנטריפוגה את הצינור ב 300 x גרם במשך 1 דקה כדי להסיר אוויר לכוד לדחוס את האמולסיה.
- הסר את המכסה מהצינור, הכנס את הבוכנה לתוך הצינור, ודחף אותו למטה לאט עד שהוא מגיע לחלק העליון של האמולסיה. הסר את סגירת ההצמדה בתחתית הצינור על ידי סיבובו.
- הסר את הבוכנה ממזרק הזרקה (1 מ"ל; ראה טבלת חומרים). מוסיפים מחט (רצוי 25-27 גרם) למזרק ההזרקה.
- חברו את הקצה האחורי של מזרק ההזרקה למנעול הייעודי בתחתית הצינור ונעלו אותו עם טוויסט קצר.
- העבר את האמולסיה מהצינור למזרק ההזרקה על ידי דחיפת הבוכנה בעדינות. עצור כאשר האמולסיה מגיעה לסיום 0.15 מ"ל של מזרק ההזרקה.
- הפרד את מזרק ההזרקה מהצינור והכנס את הבוכנה בזהירות, תוך הקפדה על כך ששום אוויר לא ייכנס למזרק. דוחפים את הבוכנה עד שהתחליב יוצא מהמחט.
הערה: בשלב זה, חלק מהתחליב יכול לשמש לבקרת איכות (ראה שלב 3). - חזור על שלבים 2.8-2.11 עבור שאר האמולסיה הקיימת בצינור.
הערה: כדי למזער את הבזבוז של תחליבי CFA/אנטיגן יקרים, יש להשתמש במזרקים של 1 מ"ל. ניתן להשתמש במזרקים אחרים המתאימים למנעול הייעודי בתחתית הצינור; עם זאת, ייתכן שיהיה צורך להכין נפח גדול יותר של תחליב. ניתן לאחסן את תחליב הפפטיד CFA/MOG35-55 בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 15 שבועות מבלי לאבד את יכולת גרימת ה-EAE שלו.
3. בקרת איכות של אמולסיה
- בדיקת טיפה: הוסף טיפה קטנה של התחליב לתוך צינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל מלא 20 מ"ל של מים קרים. סגור את הצינור ולחץ אותו ביד במשך כמה שניות. המראה של טיפות זעירות ומובהקות מאשר את היווצרותו של תחליב מים בשמן.
- בחן את האמולסיה באמצעות מיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה.
- כדי לנתח את הגודל של חלקיקי המים בשמן, הוסיפו טיפה זעירה (2-3 μL) של האמולסיה למגלשה במיקרוסקופ, מרחו אותה עם כיסוי מחליק, ואז דחפו חזק בתנועה מעגלית כדי לשטח את התחליב.
- בחנו את התחליב המרוח תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (ראו טבלת חומרים) בהגדלה של פי 400 והתמקדו בשדה עם חד-שכבתי של התחליב. ודאו שחלקיקים אפורים/לבנים קטנים ואחידים נראים לעין (איור 2A).
- נתח את גודל חלקיקי האמולסיה באמצעות עקיפת לייזר.
הערה: עקיפת לייזר מודדת התפלגויות גודל חלקיקים באמצעות קרן לייזר. זהו מבחן בקרת האיכות האולטימטיבי לתחליבים. תוצאה מייצגת של התפלגות גודל החלקיקים בשיטה המתוארת כאן מוצגת באיור 2B (לתיאור מפורט, ראו Topping et al.6). עם זאת, בדיקת הנפילה ובדיקת המיקרוסקופ מספיקות כדי לאמת אם נוצר תחליב משביע רצון.- הגדר את מדדי השבירה עבור לייזרים אדומים וכחולים עבור חומר הפיזור (ראו טבלת חומרים) ל-1.456 ועבור הדגימה ל-1.33 במנתח גודל החלקיקים (ראו טבלת חומרים). הגדר את ספיגת מקדם השבירה ל- 0.02.
- מוסיפים טיפה אחת מהמזרק המכיל את תחליב הפפטיד ליחידת הפיזור המכילה שמן מינרלי קל. התחל את רכישת הנתונים מיד לאחר פיזור האמולסיה.
הערה: מודל למטרות כלליות הופעל, והונחו חלקיקים כדוריים, להערכת התפלגות גודל החלקיקים.
4. אינדוקציה של EAE באמצעות תחליב פפטיד MOG 35-55 בעכברי C57BL6/J
הערה: בכל הניסויים נעשה שימוש בחמישה עכברי C57BL6/J בני 8-12 שבועות.
- לפני החיסון, מרדימים את העכברים באמצעות 2.5% איזופלורן מאודה ומאשרים באמצעות צביטה מוצקה של הבוהן.
- להזריק לכל עכבר תת עורית באמצעות מזרקים של 1 מ"ל לשני אתרים שונים, בצד ימין ובצד שמאל של האגף האחורי עם 200 μL של תחליב המכיל 50 מיקרוגרם של פפטיד MOG35-55 ביחס של 1:1 (v/v) של פפטיד/CFA.
- לפחות 1.5 שעות לאחר החיסון עם תחליב, ולאחר מכן שוב לאחר 24 שעות, לתת סך של 80 ng של שעלת Bordetella רעלן ב 200 μL של חיץ רעלן שעלת לכל עכבר, באמצעות זריקות intraperitoneal (100 μL בצד שמאל ו 100 μL באתר הימני של הבטן).
הערה: לוקליזציה מדויקת של הזרקה תוך-צפקית עם רעלן שעלת הוכחה כחיונית להפעלת תאי T בבלוטת הלימפה המתנקזת15. - אופציונלי: הזרקת פפטיד MOG35-55 שוב ביום 7 (כפי שנעשה שימוש בפרוטוקוליםמסוימים 16) על ידי חזרה על שלב 4.2.
הערה: והכי חשוב, יש לוודא שהמזרקים והמחטים המשמשים לחיסון המכילים MOG/CFA או רעלן שעלת מושלכים כראוי לשקיות/מיכלים ביולוגיים. - הערך את הציון הקליני מדי יום, תוך שימוש בסולם של 0-6 כפי שתואר קודםלכן 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול המהיר, הפשוט והסטנדרטי להכנת אמולסיות CFA/MOG מתואר באיור 1. שיטה זו תוארה לאחרונה במקום אחר6. ניתן להכין תחליבי CFA/MOG גם בשיטות אחרות, כגון שיטת המזרק המסורתית או על ידי מערבולת. שיטות אלה הושוו כאן על ידי הערכת איכות התחליבים. כל השיטות הפיקו תחליבי מים בשמן; ההומוגניות והאיכות של תחליבים אלה הוערכו על ידי הוספת טיפה קטנה על מגלשת זכוכית ואחריה תצפית תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. אמולסיות שנוצרו בשיטת ההומוגניזציה הרועדת הציגו חלקיקים אפורים/לבנים בצורת שעועית, המייצגים טיפות זעירות של תחליבי מים בשמן. לעומת זאת, טיפות האמולסיה שיוצרו בשיטת המזרק היו גדולות ולבנות יותר. בשיטת המערבולת נצפו חלקיקים אפורים/שחורים גדולים, המתאימים לבועות אוויר שנלכדו בתחליב (איור 2A).
כדי לבחון את היציבות ארוכת הטווח של תחליבי מים בשמן, ניתן למדוד את השינויים בהתפלגות גודל החלקיקים לאורך זמן באמצעות מנתח גודל חלקיקי עקיפת לייזר. אמולסיות שהוכנו עם הפרוטוקול המתוקנן המתואר כאן לא הראו כל שינוי בגודל החלקיקים במשך תקופה של 6 שבועות (איור 2B). לכן, נבדקה האפשרות כי תחליבים המכילים את הפפטיד MOG35-55 ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך תקופה ממושכת של זמן ועדיין לגרום למחלה. אמולסיות המכילות את הפפטיד CFA/MOG35-55 הוכנו בשיטה זו ונעשה בהן שימוש מיידי או אוחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במשך 3 או 15 שבועות (איור 3A). לעכברים הוזרקו 50 מיקרוגרם של פפטיד MOG35-55 והם קיבלו ציון עבור סימנים קליניים של מחלה כמתואר בפרוטוקול. למרבה הפלא, התחליבים הטריים, בני 3 שבועות ו-15 שבועות, גרמו כולם למחלת EAE דומה בכל בעלי החיים שנבדקו במהלך הניסוי (איור 3A). לפיכך, תוצאות אלה גילו כי תחליבים המכילים MOG35-55 פפטידים שהוכנו בשיטת הומוגניזציה רועדת ניתן לאחסן במשך 15 שבועות לפחות ועדיין לגרום EAE עם ציוני מחלה דומים לאלה שהושגו עם תחליבים טריים.
כדי לפשט ולהאיץ את מערך הניסויים וכדי להימנע מהפרש של ריאגנטים בין לוט ללוט, כל הרכיבים הדרושים הוכנו, צוטטו ואוחסנו בטמפרטורה המתאימה מראש. לאחר מכן בוצעו חמישה ניסויים על פני תקופה של 6 חודשים. עכברי C57BL6/J חוסנו בתחליבי MOG/CFA שהוכנו ביום החיסון, באמצעות ערכות תחליב, והוערכו לתסמינים קליניים. עכברים פיתחו תבנית מחלה דומה בכל הניסויים (איור 3B), וגילו ששיטת ההומוגניזציה המוצגת כאן ייצרה אמולסיות שהגרמו ל-EAE באופן עקבי וניתן לשחזור.
זמן ההכנה הכולל, מאחזור כל הריאגנטים, הוספתם וניעור הצינור שלוש פעמים, וטעינת המזרקים עם התחליב, מוכן לחיסון, לוקח לא יותר מ -30 דקות. בנוסף, רק 20% של תחליב נוסף צריך להיות מוכן. זאת בניגוד מוחלט לפרוטוקולים אחרים, שבהם זמן ההכנה יכול להיות עד 1.5-2 שעות וייתכן שיהיה צורך להכין 50%-100% של תחליב נוסף כדי להבטיח מספיק חומר לחיסון16.
איור 1: סכימה של תהליך הכנת תחליב באמצעות ערכת תחליב מסחרית. נעשה שימוש חוזר בנתון זה מתוך Topping et al6 באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: אפיון אמולסיות המיוצרות בשיטות שונות. (A) תמונות מייצגות משלוש שיטות הכנה שונות: שיטת הומוגניזציה סטנדרטית, שיטת מזרק מסורתית ושיטת מערבולת. כמות קטנה של תחליב הונחה על מגלשת זכוכית ונצפתה תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (400x). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. הכנה מייצגת מוצגת של כל שיטה מתוך >15 ניסויים. הממוצע D [4, 3] (הממוצע המשוקלל של הנפח) נמדד באמצעות מנתח גודל חלקיקים להיות 0.7 מיקרומטר עבור שיטת הומוגניזציה רועדת, 1.4 מיקרומטר עבור שיטת המזרק ו-5.4 מיקרומטר עבור שיטת המערבולת. (B) יציבות האמולסיה לאורך זמן נמדדה באמצעות מנתח גודל החלקיקים. תחליב של CFA/PBS הוכן עם ההומוגנייזר הרועד וערכת האמולסיה, וגודל החלקיקים נקבע, באמצעות עקיפת לייזר לאורך זמן. דגימה אחת נותחה מיד ואז התחליבים אוחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. דגימות אלה נותחו 1, 2, 4 ו -6 שבועות לאחר ההכנה. הממוצע המשוקלל של D [4, 3] עבור כל הדגימות היה 0.73 מיקרומטר ± 0.03 מיקרומטר (SD). נעשה שימוש חוזר בנתון זה מתוך Topping et al6 באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: אינדוקציה של EAE בעכברים שחוסנו בתכשיר פפטיד/CFAMOG 35-55 באמצעות ערכת תחליב מסחרית. (A) אינדוקציה EAE של התחליב המאוחסן. אמולסיות המכילות CFA ו-50 מיקרוגרם של פפטיד/עכבר MOG35-55 הוכנו בשיטת ההומוגניזציה ואוחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במשך 3 או 15 שבועות. התחליבים הטריים והמאוחסנים הוזרקו באותו יום לעכברי C57BL/6J (n = 5 לכל קבוצה). העכברים קיבלו 80 ננוגרם של רעלן שעלת באותו יום ו-24 שעות לאחר מכן, וקיבלו ניקוד עבור סימני מחלה באמצעות ציונים קליניים של 0-6. (B) אינדוקציה עקבית של EAE עם התחליבים שהוכנו בשיטת ההומוגניזציה. אמולסיות המכילות CFA ו-50 מיקרוגרם של פפטיד/עכבר MOG35-55 הוכנו בנקודות זמן שונות והוזרקו לעכברי C57BL/6J (n = 5 לכל קבוצה). העכברים קיבלו 80 ננוגרם של רעלן שעלת באותו יום ו-24 שעות לאחר מכן, וקיבלו ציון עבור סימני מחלה. נעשה שימוש חוזר בנתון זה מתוך Topping et al6 באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
קובץ משלים 1: חישוב הכמות של כל מגיב (MOG35-55 פפטיד, PBS, CFA ו- IFA) להכנת תחליב. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תחליבי מים בשמן, כגון אדג'ובנט של אנטיגן/פרוינד, שימשו במשך יותר מחצי מאה להשראת EAE17. אין כיום שיטה סטנדרטית להכנת תחליבי אנטיגן שאינם תלויים בהשפעת האדם. ערבוב ידני באמצעות מזרקים הוא סטנדרטי עבור רוב המעבדות, אולם שיטה זו היא זמן רב, לעתים קרובות גורם לאובדן מוגזם של חומר, ואת האיכות משתנה בהתאם המדען מכין אותו.
השיטה המוצגת בכתב יד זה משתמשת במכונת הומוגניזציה סטנדרטית כדי להכין את תחליבי האנטיגן/CFA. בנוסף, כל ריאגנטים המשמשים כאן ניתן aliquoted ומאוחסן במשך תקופה ארוכה של זמן, מה שהופך אותו נוח ומהיר להכין תחליבים. הזמן הכולל להכנת תחליבים עבור עד 80 עכברים הוא כ -30 דקות. זאת בניגוד גמור לשיטות אחרות שפורסמו, הדורשות 1-1.5 שעות להכנת אמולסיותMOG 35-55 16,18. שיטות ידניות אחרות, כגון שיטת מזרק אחד, קשורות לעתים קרובות עם הכנסת בועות אוויר בתוך המזרקים5. השיטה המוצגת כאן תוכננה כך שהתחליב נדחף למזרקים מהקצה האחורי שלהם, מה שמבטל את כניסתן של בועות אוויר וממזער את אובדן החומר.
כדי להבטיח תוצאות עקביות ובזבוז מינימלי של תחליב, ישנם כמה שלבים קריטיים בשיטת ההומוגניזציה הרועדת הדורשים תשומת לב ספציפית. יש להניח את הצינור והריאגנטים על הקרח לפני תחילת הניסוי ולאחר שלב ההומוגניזציה. יש להוסיף תחילה את ה-PBS והאנטיגן לצינור, ולאחר מכן את האדג'ובנט (CFA/IFA), על מנת למנוע ריכוזים מקומיים גבוהים של אנטיגן בעת ערבוב עם אדג'ובנט השמן. יש להדק את המכסה בחוזקה על ידי פתיחתו וסגירתו מספר פעמים כדי למנוע דליפות. בנוסף, מזרק לא צריך להיות מלא עם תחליב לחלוטין, רק עד סימן 0.15 מ"ל על חבית מזרק, כדי למנוע בזבוז תחליב. הבוכנה צריכה להיות מוכנסת לתוך המזרק בזהירות רבה, באמצעות שתי הידיים. לאחר שכל המזרקים מלאים בתחליב, ניתן לאחסן את המזרקים בטמפרטורת החדר אם יש להשתמש בהם באותו יום; אחרת, הם צריכים להיות מאוחסנים ב 4 מעלות צלזיוס עד השימוש.
תחליבי אנטיגן/CFA שהוכנו בשיטת ההומוגניזציה הרועדת יכולים להיראות פחות מוצקים בהשוואה לאלה שהוכנו בשיטת המזרק. ניתן להוסיף שלב טלטול נוסף (ראה שלב 2.5 בפרוטוקול), שעשוי לעבות את התחליב. עם זאת, אמולסיות שעוברות את "מבחן הנפילה" ובדיקת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה גורמות ל-EAE ללא קשר למצב הפיזי של התחליב.
ההשקעה הראשונית הנדרשת במכונת הומוגניזציה מטלטלת היא מגבלה. עם זאת, שלבי ההכנה המתוארים כאן מבטיחים בזבוז מינימלי של תחליב ואנטיגן, שלעתים קרובות יקר לרכוש או לוקח זמן רב להכין. לכן, בטווח הארוך, שיטה זו זולה יותר לשימוש שכן היא חוסכת זמן ריאגנטים. האנטיגן והמאגר המשמשים בשיטת ההומוגניזציה הרועדת יכולים להשפיע על איכות התחליב. הפפטיד MOG35-55 מומס ב-PBS ללא Ca 2+/Mg 2+ שנוצר באופן עקבי עם חלקיקי מים קטנים ואחידים (איור 2A). עם זאת, אנטיגנים פפטידיים המומסים ב-PBS עם Ca 2+/Mg2+, או פפטידים המכילים שאריות רבות של חומצות אמינו טעונות עשויים ליצור תחליבים שהם פחות צמיגים. השאלה אם תחליבים כאלה נוטים פחות לגרום למחלות במודלים של בעלי חיים לא נבדקה. מגבלה נוספת של שיטה זו היא שלא ניתן להכין יותר מ-8 מ"ל של תחליב אנטיגן/CFA מצינור אחד. אין לטעון את הצינורות ביותר מ-9.6 מ"ל בסך הכל (4.8 מ"ל של PBS/אנטיגן ו-4.8 מ"ל של CFA/IFA), מה שיספיק לטעינת שמונה מזרקים של 1 מ"ל. למרות שהצינור יכול להחזיק נפח גדול יותר, חלק מהאוויר חייב להיות נוכח בצינור, אחרת לא ייווצרו תחליבים מושלמים. אם יש צורך בתחליב נוסף, ניתן להכין אותו באמצעות צינורות נוספים.
בהשוואה לשיטות הקיימות, אין הבדל בין אדם לאדם בעת הכנת התחליבים בשיטת ההומוגניזציה המטלטלת. השיטה הנפוצה ביותר להכנת תחליבים לניסויים של EAE משתמשת במזרקים שנדחפים קדימה ואחורה ביד19. לא ניתן לשלוט היטב בכוח, בזמן ובטמפרטורה ולכן קשה לתקנן שיטה מבוססת מזרק. שיטות אחרות להכנת תחליבי מים בשמן מנצלות את היתרונות של קולי מים אמבטיה קוליים. אמולסיות שהוכנו בשיטת סוניקציה מסוגלות לגרום ל-EAE בעכברי BALB/c עמידים אחרת8. השיטה המתוארת יכולה להיות סטנדרטית ולכן שימושית. עם זאת, הבעיה עם אמבט מים קולי ובדיקות קוליות היא שקשה להעביר את התחליב בצינורות למזרקים המשמשים לחיסון מבלי להציג בועות אוויר. הצינורות המשמשים לשיטה המוצגת כאן מבטלים בעיה זו.
שיטת מערבולת יכולה להיחשב כשיטה סטנדרטית עם מהירות, זמן וטמפרטורה מוגדרים. עם זאת, בדיקת שיטה זו להכנת תחליב על ידי מערבולת הכנת MOG/CFA במשך 10 דקות לא הביאה להשראת מחלה בעכברי C57BL/6J (הנתונים לא מוצגים). עם זאת, EAE יכול להיות מושרה עם תערובת אנטיגן / CFA מוכן על ידי מערבולת במשך 45 דקות18, אשר יהיה הליך הרבה יותר ארוך בהשוואה לשיטה המוצגת בכתב יד זה.
אדג'ובנט נוסף על בסיס שמן (ראו טבלת חומרים), שאושר על ידי ה-FDA לשימוש על בני אדם, המייצר תחליב מים בשמן הוכח כאדג'ובנט מבטיח לחיסונים נגד סרטן ומלריה20,21,22. לכן, ניתן להתאים את הפרוטוקול הסטנדרטי המוצג כאן לשימוש במרפאה. ניסויים ראשוניים גילו כי שיטת ההומוגניזציה הרועדת מייצרת תחליבים עם שמן זה שאושר על ידי ה- FDA שהם באיכות טובה יותר בהשוואה לשיטת המזרק הידני (הנתונים לא מוצגים).
לסיכום, שיטת ההומוגניזציה הרועדת המוצגת כאן מספקת מספר יתרונות, כגון ייצור מהיר יותר של אמולסיות מבוקרות איכות, יכולת שכפול גבוהה במספר מודלים של מחלות אוטואימוניות, והפחתה של ריאגנטים יקרים הדרושים להכנת תחליבי אנטיגן/CFA. מכיוון שאין הבדל בין אדם לאדם היוצר תחליבי מים בשמן אלה, הוא מציע את האפשרות לתקנן שיטה זו הדרושה למחקר ביו-רפואי הניתן לשחזור וגילוי תרופות בתחום המחלות האוטואימוניות ופיתוח חיסונים טיפוליים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
BTB Emulsions AB הגישה בקשת פטנט לשימוש במכשיר ושיטה להכנת תחליבים לחיסון בעלי חיים ובני אדם (מספר בקשת פטנט אירופאית: EP3836884A1). BTB הוא המנכ"ל והמייסד של החברה, ובעל מניות באמולסיות BTB. ברטין-אינסטרומנטס מפיצה את ערכות האמולסיה המשמשות בפרסום זה ברחבי העולם.
Acknowledgments
המחבר מבקש להודות ליחידות הדיור לבעלי חיים באוניברסיטת לונד, קמילה ביורקלוב ואגניישקה צ'ופק, על תמיכתן, ולריצ'רד ויליאמס, מכון קנדי לראומטולוגיה, אוניברסיטת אוקספורד, בריטניה, על ביקורת בונה ותמיכה לשונית בהפקת כתב יד זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Injection syringe | B. Braun | 9166017V | |
| 1 mL Injection syringe | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
| 7 ml empty tubes with caps | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | 7 mL tube |
| 50 mL sterile centrifuge tube | Fisher Scientific | 10788561 | 50 mL tube |
| Bordetella pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P2980 | Store at -20 °C |
| Dispersant, light mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Store at RT |
| Emulsion kit | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | Containing a tube, cap, and plunger |
| Incomplete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C |
| Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Store at +4 °C |
| Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | Particle size analyzer |
| Minilys-Personal homogenizer | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | Shaking homogenizer |
| MOG 35-55 Peptide | Innovagen | N/A | |
| Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | FDA-approved oil adjuvant |
| Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm | Fisher Scientific | 17124381 | Sterlie filter |
| PBS, Ca2+/Mg2+ free | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| Phase-Constrast Microscope | Olympus | BX40-B | |
| Steel Beads 3.2 mm | Fisher Scientific | NC0445832 | Autoclave and store at RT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | Store at RT |
References
- Walton, C., et al. Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition. Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).
- van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers. Frontiers in Immunology. 11, 760 (2020).
- Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells' Multiple Identities in Neuroimmunity. Frontiers in Immunology. 10, 2947 (2019).
- Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. Animal models of multiple sclerosis--potentials and limitations. Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).
- Terry, R. L., Ifergan, I., Miller, S. D. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice. Methods in Molecular Biology. 1304, 145-160 (2016).
- Topping, L. M., et al. Standardization of antigen-emulsion preparations for the induction of autoimmune disease models. Frontiers in Immunology. 13, 892251 (2022).
- Flies, D. B., Chen, L. A simple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 276 (1-2), 239-242 (2003).
- Määttä, J. A., Erälinna, J. P., Röyttä, M., Salmi, A. A., Hinkkanen, A. E. Physical state of the neuroantigen in adjuvant emulsions determines encephalitogenic status in the BALB/c mouse. Journal of Immunological Methods. 190 (1), 133-141 (1996).
- Moncada, C., Torres, V., Israel, Y. Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 162 (1), 133-140 (1993).
- Waksman, B. H., Adams, R. D. Allergic neuritis: an experimental disease of rabbits induced by the injection of peripheral nervous tissue and adjuvants. The Journal of Experimental Medicine. 102 (2), 213-236 (1955).
- Vladutiu, A. O., Rose, N. R. Autoimmune murine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type. Science. 174 (4014), 1137-1139 (1971).
- Caspi, R. R. Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse. Current Protocols in Immunology. , Chapter 15 Unit 15.6 (2003).
- Tuzun, E., et al. Guidelines for standard preclinical experiments in the mouse model of myasthenia gravis induced by acetylcholine receptor immunization. Experimental Neurology. 270, 11-17 (2015).
- Brinckerhoff, L. H., et al. Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines. International Journal of Cancer. 83 (3), 326-334 (1999).
- Kool, M., et al. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells. The Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 869-882 (2008).
- Hasselmann, J. P. C., Karim, H., Khalaj, A. J., Ghosh, S., Tiwari-Woodruff, S. K. Consistent induction of chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice for the longitudinal study of pathology and repair. Journal of Neuroscience Methods. 284, 71-84 (2017).
- Freund, J., Lipton, M. M. Experimental allergic encephalomyelitis after the excision of the injection site of antigen-adjuvant emulsion. The Journal of Immunology. 75 (6), 454-459 (1955).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).
- Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. Journal of Visualized Experiments. (62), e3778 (2012).
- Arevalo-Herrera, M., et al. Randomized clinical trial to assess the protective efficacy of a Plasmodium vivax CS synthetic vaccine. Nature Communications. 13 (1), 1603 (2022).
- Jiang, C., et al. Potential association factors for developing effective peptide-based cancer vaccines. Frontiers in Immunology. 13, 931612 (2022).
- Neninger Vinageras, E., et al. Phase II randomized controlled trial of an epidermal growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (9), 1452-1458 (2008).
