Summary
Para inducir la encefalomielitis autoinmune experimental, un modelo animal de esclerosis múltiple, los ratones son inmunizados con una emulsión de agua en aceite que contiene un autoantígeno y un adyuvante completo de Freund. Si bien existen varios protocolos para la preparación de estas emulsiones, aquí se presenta un protocolo de homogeneización rápido, simple y estandarizado para la preparación de emulsiones.
Abstract
La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) comparte características inmunológicas y clínicas similares con la esclerosis múltiple (EM) y, por lo tanto, se usa ampliamente como modelo para identificar nuevos objetivos farmacológicos para un mejor tratamiento del paciente. La EM se caracteriza por varios cursos diferentes de la enfermedad: EM recurrente-remitente (EMRR), EM progresiva primaria (EMPP), EM progresiva secundaria (EMSP) y una forma rara de EM progresiva-recurrente (EMPR). Aunque los modelos animales no imitan con precisión todos estos fenotipos contrastantes de enfermedades humanas, existen modelos EAE que reflejan algunas de las diferentes manifestaciones clínicas de la EM. Por ejemplo, la EAE inducida por la glicoproteína oligodendrocitos de mielina (MOG) en ratones C57BL / 6J imita la EMPP humana, mientras que la EAE inducida por la proteína proteolípida de mielina (PLP) en ratones SJL / J se asemeja a RRMS. Otros autoantígenos, como la proteína básica de mielina (MBP), y una serie de cepas de ratón diferentes también se utilizan para estudiar la EAE. Para inducir la enfermedad en estos modelos EAE de autoinmunización con antígenos, se prepara una emulsión de agua en aceite y se inyecta por vía subcutánea. La mayoría de los modelos de EAE también requieren una inyección de toxina pertussis para que la enfermedad se desarrolle. Para una inducción EAE consistente y reproducible, es necesario un protocolo detallado para preparar los reactivos para producir emulsiones antígeno/adyuvantes. El método descrito aquí aprovecha un método estandarizado para generar emulsiones de agua en aceite. Es simple y rápido y utiliza un homogeneizador agitador en lugar de jeringas para preparar emulsiones de calidad controlada.
Introduction
Una ruptura de la tolerancia inmunológica puede resultar en la generación de trastornos autoinmunes, como la esclerosis múltiple (EM). Se estima que 2,8 millones de personas viven con EM en todo el mundo1. Aunque la causa exacta de la EM es todavía en gran parte desconocida, la desregulación de las células T y B autorreactivas, así como los defectos en la función Treg, juegan un papel importante en la patogénesis de la enfermedad 2,3.
Los modelos animales de enfermedades autoinmunes son herramientas esenciales para investigar posibles modalidades terapéuticas. El modelo experimental de encefalomielitis autoinmune (EAE) ha sido utilizado durante casi un siglo por investigadores interesados en la EM4. En los primeros experimentos, la incidencia de la enfermedad era relativamente baja. La introducción del adyuvante completo de Freund (CFA), que contiene Mycobacterium y toxina pertussis, permitió la inducción consistente de EAE en ratones4. Lo más importante es que es necesario mezclar CFA con un antígeno específico del sistema nervioso central (SNC) para generar una emulsión homogénea de agua en aceite para inducir EAE. Los modelos EAE más comunes actualmente disponibles se basan en la inmunización activa de ratones con péptidos encefalitogénicos. Los antecedentes genéticos de los ratones juegan un papel importante en la susceptibilidad a la enfermedad, con péptidos de glicoproteína oligodendrocitos de mielina (MOG35-55) y proteína proteolípida de mielina (PLP139-151) utilizados para inducir EAE en ratones C57BL / 6J y SJL, respectivamente5. Sin embargo, también se pueden usar otras cepas de ratón y péptidos derivados del SNC.
La calidad de la emulsión CFA/péptido es un factor crítico que determina la penetrancia de la enfermedad en el modelo6 de inmunización activa EAE. Se debe preparar una emulsión homogénea de agua en aceite mezclando los péptidos encefalitogénicos disueltos en tampón acuoso con CFA, de lo contrario los animales no desarrollarán la enfermedad. Se han publicado numerosos protocolos sobre la preparación de emulsiones CFA/péptidos. Los ejemplos incluyen el uso de un vórtice7, sonicación8, jeringas y un conector T de tres vías9, o una jeringa solo5. Sin embargo, todos estos métodos son difíciles de estandarizar y a menudo se asocian con protocolos largos y complicados.
En comparación con todos los métodos anteriores, el método simple descrito aquí para la preparación de emulsiones ofrece las ventajas de no tener diferencias de persona a persona y ser relativamente rápido. La emulsión es generada por un homogeneizador que agita los reactivos con una velocidad, tiempo y temperatura establecidos, asegurando resultados rápidos y consistentes. Además de inducir enfermedad en el modelo EAE, este método también puede ser utilizado para estudiar otros modelos de enfermedades autoinmunes como la artritis inducida por colágeno (CIA) y la artritis inducida por antígenos (AIA)6. Por lo tanto, se anticipa que este método puede ser utilizado para inducir consistentemente la enfermedad en otros modelos animales que dependen de emulsiones de agua en aceite con autoantígenos, como la neuritis autoinmune experimental (EAN)10, la tiroiditis autoinmune experimental (EAT)11, la uveítis autoinmune (EAU)12 y la miastenia gravis (MG)13. Este método también induce respuestas inmunes generales, como la hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) de manera consistente6, y por lo tanto podría usarse para administrar vacunas contra el cáncer y la malaria (ver discusión).
Por lo tanto, se ha desarrollado un método rápido (tiempo total de preparación ~ 30 min), simple (todos los reactivos se pueden preparar y almacenar) y estandarizado (la emulsión se logra utilizando un homogeneizador de agitación) y se presenta aquí. Las emulsiones CFA/antígeno preparadas utilizando este protocolo inducen consistentemente la enfermedad en modelos animales autoinmunes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las prácticas de la Junta Sueca de Investigación Animal y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal, Lund-Malmö, Suecia (Número de permiso: M126-16).
NOTA: En la figura 1 se describe un flujo esquemático del método.
1. Preparación del material
NOTA: Preparar todos los reactivos asépticamente en una campana estéril, y alícuota y almacenar a la temperatura indicada. Los reactivos se pueden almacenar hasta 2 años sin perder su efecto.
- Prepare CFA que contenga 20 mg/ml de Mycobacterium tuberculosis como se describe a continuación.
- Agregue 100 mg de M. tuberculosis H37RA liofilizada (consulte la Tabla de materiales) y cinco perlas de acero de 3,2 mm a un tubo de 7 ml (consulte la Tabla de materiales). Agite el tubo en un homogeneizador (consulte la Tabla de materiales) durante 60 s a la velocidad máxima (5.000 rpm).
- Añadir 5 ml de adyuvante de Freund incompleto (IFA) al tubo y agitar de nuevo durante 60 s a la velocidad más alta. Transfiera la suspensión de M. tuberculosis homogeneizada en IFA (ahora llamada CFA) a un tubo nuevo con una pipeta, dejando atrás las perlas, y guárdela a 4 °C hasta su uso.
- Agregue agua ultrapura al polvo liofilizado del péptido MOG35-55 (consulte la Tabla de materiales) para obtener una concentración final de péptidos de 10 mg / ml. Esterilizar la solución pasándola a través de un filtro de 0,2 μm. Preparar 60 μL de alícuotas y conservar a -20 °C hasta su uso.
NOTA: El péptido MOG35-55 utilizado para este experimento es de pureza ImmunoGrade (~70%), está escindido con TFA, se disuelve fácilmente en agua y contiene una amida C-terminal (-NH2) para aumentar la estabilidad in vivo 14. Las alícuotas peptídicas nunca se descongelaron y volvieron a congelar más de dos veces, y se almacenaron a -20 °C hasta su uso. - Preparar 100 ml de tampón de toxina pertussis: Disolver 2,9 g de NaCl en 80 ml de 1x Ca 2+/Mg 2+ PBS libre y añadir 100 μL de Triton X-100 al 10%. Ajuste el volumen a 100 ml con PBS y esterilice la solución pasándola a través de un filtro de 0,2 μm. Preparar 10 ml de alícuotas y conservar a 4 °C hasta su uso.
2. Preparación de emulsiones CFA/péptidos
- Calcule la cantidad de emulsión necesaria para la inmunización. En este protocolo estándar, cada ratón recibe 50 μg de péptido MOG35-55 y 300 μg de M. tuberculosis dispersos en el adyuvante de Freund (CFA). La cantidad de cada reactivo (péptido MOG35-55 , PBS, CFA e IFA) requerida para preparar las emulsiones se puede calcular utilizando el Archivo Suplementario 1. Un 20% adicional de todos los reactivos, para compensar la pequeña pérdida de emulsión, se incluye en el cálculo.
NOTA: El kit de emulsión comercial (ver Tabla de materiales) utilizado en este estudio comprende un tubo, tapón de rosca y un émbolo en una bolsa esterilizada. Cada tubo del kit de emulsión contiene un máximo de 9,6 ml, lo que permite preparar 8 jeringas de 1 ml suficientes para inmunizar a 40 ratones (u 80 ratones si se utilizan 100 μL de emulsión por animal). - Coloque el tubo tapado de rosca (del kit de emulsión comercial) y los reactivos que se utilizarán en hielo.
- Agregue los componentes de la emulsión en el siguiente orden en los volúmenes calculados en el paso 2.1: PBS, luego el péptido, luego M. tuberculosis en CFA y finalmente IFA.
- Cierre el tubo con la tapa firmemente apretándolo y aflojándolo varias veces. Agite el tubo vigorosamente durante 5-10 s a mano para mezclar previamente los reactivos.
- Coloque el tubo en el homogeneizador de agitación y asegúrelo con la varilla. Ajuste la velocidad a la configuración más alta y el tiempo a 60 s. Una vez finalizada la carrera, coloque el tubo en hielo durante 3 minutos. Repita la ejecución una o dos veces más con la misma configuración.
- Centrifugar el tubo a 300 x g durante 1 min para eliminar el aire atrapado y compactar la emulsión.
- Retire la tapa del tubo, inserte el émbolo en el tubo y empújelo lentamente hacia abajo hasta que llegue a la parte superior de la emulsión. Retire el cierre a presión en la parte inferior del tubo girándolo.
- Retire el émbolo de una jeringa inyectable (1 ml; ver Tabla de materiales). Añadir una aguja (preferiblemente 25-27 G) a la jeringa de inyección.
- Fije el extremo posterior de la jeringa de inyección a la cerradura dedicada en la parte inferior del tubo y bloquéelo con un giro corto.
- Transfiera la emulsión del tubo a la jeringa de inyección empujando suavemente el émbolo. Deténgase cuando la emulsión alcance la graduación de 0,15 ml de la jeringa de inyección.
- Separe la jeringa de inyección del tubo e inserte el émbolo cuidadosamente, teniendo cuidado de que no entre aire en la jeringa. Empuje el émbolo hasta que la emulsión salga de la aguja.
NOTA: En este punto, parte de la emulsión se puede utilizar para el control de calidad (ver paso 3). - Repita los pasos 2.8-2.11 para el resto de la emulsión presente en el tubo.
NOTA: Para minimizar el desperdicio de costosas emulsiones de CFA/antígeno, se deben usar jeringas de 1 ml. Se pueden usar otras jeringas que se ajusten a la cerradura dedicada en la parte inferior del tubo; sin embargo, puede ser necesario preparar un mayor volumen de emulsión. La emulsión peptídica CFA/MOG35-55 puede almacenarse a 4 °C durante un máximo de 15 semanas sin perder su capacidad de inducción de EAE.
3. Control de calidad de la emulsión
- Prueba de caída: Agregue una pequeña gota de la emulsión en un tubo cónico estéril de 50 ml lleno de 20 ml de agua fría. Cierre el tubo y agítelo con la mano durante un par de segundos. La aparición de pequeñas gotas distintas confirma la formación de una emulsión de agua en aceite.
- Examine la emulsión utilizando microscopía de contraste de fase.
- Para analizar el tamaño de las partículas de agua en aceite, agregue una pequeña gota (2-3 μL) de la emulsión a un portaobjetos de microscopio, unte con un cubreobjetos y luego empuje con fuerza con un movimiento circular para aplanar la emulsión.
- Examine la emulsión manchada bajo un microscopio de contraste de fase (consulte la Tabla de materiales) con un aumento de 400x y concéntrese en un campo con una monocapa de la emulsión. Asegúrese de que las pequeñas partículas grises/blancas uniformes sean visibles (Figura 2A).
- Analice el tamaño de partícula de la emulsión mediante difracción láser.
NOTA: La difracción láser mide las distribuciones de tamaño de partícula utilizando un rayo láser. Esta es la prueba de control de calidad definitiva para emulsiones. Un resultado representativo de las distribuciones de tamaño de partícula utilizando el método descrito aquí se muestra en la Figura 2B (para una descripción detallada, ver Topping et al.6). Sin embargo, la prueba de gota y el examen con microscopio son suficientes para validar si se ha formado una emulsión satisfactoria.- Establezca los índices de refracción para los láseres rojo y azul para el dispersante (consulte la Tabla de materiales) en 1.456 y para la muestra en 1.33 en el analizador de tamaño de partícula (consulte la Tabla de materiales). Establezca la absorbancia del índice de refracción en 0,02.
- Añadir una gota de la jeringa que contiene la emulsión peptídica a la unidad de dispersión que contiene aceite mineral ligero. Inicie la adquisición de datos instantáneamente después de la dispersión de la emulsión.
NOTA: Se aplicó un modelo de propósito general, y se asumieron partículas esféricas, para la estimación de la distribución del tamaño de partícula.
4. Inducción EAE utilizando la emulsión peptídica MOG 35-55 en ratones C57BL6/J
NOTA: En todos los experimentos, se utilizaron cinco ratones hembra C57BL6 / J de 8-12 semanas de edad.
- Antes de la inmunización, anestesiar a los ratones con isoflurano vaporizado al 2,5% y confirmar con un pellizco firme en el dedo del pie.
- Inyecte cada ratón por vía subcutánea usando jeringas de 1 ml en dos sitios diferentes, en los lados derecho e izquierdo del flanco posterior con 200 μL de emulsión que contiene 50 μg de péptido MOG35-55 en una proporción 1: 1 (v / v) de péptido / CFA.
- Al menos 1,5 h después de la inmunización con la emulsión, y luego de nuevo después de 24 h, administrar un total de 80 ng de toxina Bordetella pertussis en 200 μL de tampón toxina pertussis a cada ratón, a través de inyecciones intraperitoneales (100 μL a la izquierda y 100 μL en el sitio derecho del vientre).
NOTA: La localización precisa de la inyección intraperitoneal con toxina pertussis ha demostrado ser esencial para la activación de las células T en el ganglio linfático drenante15. - Opcional: Inyecte de nuevo el péptido MOG35-55 el día 7 (como se utiliza en algunos protocolos16) repitiendo el paso 4.2.
NOTA: Lo más importante es asegurarse de que las jeringas y agujas utilizadas para la inmunización que contienen MOG/CFA o toxina pertussis se desechen adecuadamente en bolsas/recipientes de riesgo biológico. - Evaluar la puntuación clínica diariamente, utilizando una escala de 0-6 como se describió anteriormente6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El protocolo rápido, simple y estandarizado para la preparación de emulsiones CFA/MOG se muestra en la Figura 1. Este método ha sido descrito recientemente en otra parte6. Las emulsiones CFA/MOG también se pueden preparar con otros métodos, como el método tradicional de jeringa o por vórtice. Estos métodos se compararon aquí evaluando la calidad de las emulsiones. Todos los métodos produjeron emulsiones de agua en aceite; La homogeneidad y la calidad de estas emulsiones se evaluaron mediante la adición de una pequeña gota en un portaobjetos de vidrio seguida de observación bajo un microscopio de contraste de fase. Las emulsiones producidas por el método de homogeneización por agitación mostraron partículas en forma de frijol gris / blanco, que representan pequeñas gotas de emulsiones de agua en aceite. En contraste, las gotas de emulsión producidas usando el método de jeringa eran más grandes y más blancas. En el método de vórtice, se observaron grandes partículas grises/negras, correspondientes a burbujas de aire atrapadas en la emulsión (Figura 2A).
Para probar la estabilidad a largo plazo de las emulsiones de agua en aceite, los cambios en la distribución del tamaño de partícula a lo largo del tiempo se pueden medir utilizando un analizador de tamaño de partícula de difracción láser. Las emulsiones preparadas con el protocolo estandarizado descrito aquí no mostraron ningún cambio en el tamaño de partícula durante un período de 6 semanas (Figura 2B). Por lo tanto, se probó la posibilidad de que las emulsiones que contienen el péptido MOG35-55 puedan almacenarse a 4 °C durante un período prolongado de tiempo y aún así inducir enfermedades. Las emulsiones que contenían el péptido CFA/MOG35-55 se prepararon con este método y se utilizaron inmediatamente o se almacenaron a 4 °C durante 3 o 15 semanas (Figura 3A). A los ratones se les inyectaron 50 μg del péptido MOG35-55 y se calificaron para detectar signos clínicos de enfermedad como se describe en el protocolo. Sorprendentemente, las emulsiones frescas de 3 semanas y 15 semanas de edad indujeron una enfermedad EAE similar en todos los animales probados durante todo el experimento (Figura 3A). Por lo tanto, estos resultados revelaron que las emulsiones que contienen péptidos MOG35-55 preparados utilizando el método de homogeneización por agitación pueden almacenarse durante al menos 15 semanas y aún así inducir EAE con puntuaciones de enfermedad comparables a las logradas con emulsiones recién preparadas.
Para simplificar y acelerar la configuración de los experimentos y evitar la diferencia de reactivos de lote a lote, todos los componentes necesarios se prepararon, alícuotas y almacenaron a la temperatura adecuada por adelantado. Luego, se realizaron cinco experimentos durante un período de 6 meses. Los ratones C57BL6/J fueron inmunizados con las emulsiones MOG/CFA preparadas el día de la inmunización, utilizando kits de emulsión, y evaluados para detectar síntomas clínicos. Los ratones desarrollaron un patrón de enfermedad similar en todos los experimentos (Figura 3B), revelando que el método de homogeneización presentado aquí produjo emulsiones que indujeron EAE de manera consistente y reproducible.
El tiempo total de preparación, desde recuperar todos los reactivos, agregarlos y agitar el tubo tres veces, y cargar las jeringas con la emulsión, lista para la inmunización, no toma más de 30 minutos. Además, solo se debe preparar el 20% de la emulsión adicional. Esto está en marcado contraste con otros protocolos, donde el tiempo de preparación puede ser de hasta 1,5-2 h y puede ser necesario preparar entre el 50% y el 100% de la emulsión adicional para garantizar suficiente material para la inmunización16.
Figura 1: Esquema del proceso de preparación de emulsiones utilizando un kit de emulsión comercial. Esta figura ha sido reutilizada de Topping et al6 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Caracterización de emulsiones producidas utilizando diferentes métodos. (A) Imágenes representativas de tres métodos de preparación diferentes: método de homogeneización estándar, método de jeringa tradicional y método de vórtice. Se colocó una pequeña cantidad de emulsión en un portaobjetos de vidrio y se observó bajo un microscopio de contraste de fase (400x). Barra de escala = 50 μm. Se muestra una preparación representativa de cada método de >15 experimentos. El promedio D [4, 3] (la media ponderada por volumen) se midió con un analizador de tamaño de partícula de 0,7 μm para el método de homogeneización por agitación, 1,4 μm para el método de jeringa y 5,4 μm para el método de vórtice. (B) La estabilidad de la emulsión a lo largo del tiempo se midió utilizando el analizador de tamaño de partícula. Se preparó una emulsión de CFA/PBS con el homogeneizador de agitación y el kit de emulsión, y se determinó el tamaño de partícula, utilizando difracción láser a lo largo del tiempo. Una muestra se analizó inmediatamente y luego las emulsiones se almacenaron a 4 °C. Estas muestras se analizaron 1, 2, 4 y 6 semanas después de la preparación. La media ponderada por volumen D [4, 3] promedio para todas las muestras fue de 0,73 μm ± 0,03 μm (DE). Esta figura ha sido reutilizada de Topping et al6 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Inducción de EAE en ratones inmunizados con una preparación de péptido/CFA MOG35-55 utilizando un kit de emulsión comercial. (A) Inducción EAE de la emulsión almacenada. Las emulsiones que contenían CFA y 50 μg de péptido MOG35-55 /ratón se prepararon con el método de homogeneización y se almacenaron a 4 °C durante 3 o 15 semanas. Las emulsiones recién preparadas y almacenadas se inyectaron el mismo día en ratones C57BL / 6J (n = 5 por grupo). Los ratones recibieron 80 ng de toxina pertussis el mismo día y 24 h después, y fueron calificados para signos de enfermedad utilizando puntuaciones clínicas de 0-6. (B) Inducción consistente de EAE con las emulsiones preparadas mediante el método de homogeneización. Las emulsiones que contenían CFA y 50 μg de péptido MOG35-55 / ratón se prepararon en diferentes puntos de tiempo y se inyectaron en ratones C57BL / 6J (n = 5 por grupo). Los ratones recibieron 80 ng de toxina pertussis el mismo día y 24 h después, y fueron calificados por signos de enfermedad. Esta figura ha sido reutilizada de Topping et al6 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo complementario 1: Cálculo de la cantidad de cada reactivo (péptido MOG35-55 , PBS, CFA e IFA) para la preparación de emulsión. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Las emulsiones de agua en aceite, como el antígeno/adyuvante de Freund, se han utilizado durante más de medio siglo para inducir EAE17. Actualmente no existe un método estandarizado para preparar emulsiones de antígenos que sea independiente de la influencia humana. La mezcla manual con jeringas es estándar para la mayoría de los laboratorios, sin embargo, este método lleva mucho tiempo, a menudo resulta en una pérdida excesiva de material y la calidad difiere según el científico que lo prepara.
El método presentado en este manuscrito utiliza una máquina de homogeneización de agitación estándar para preparar las emulsiones antígeno/CFA. Además, todos los reactivos utilizados aquí pueden ser alicitados y almacenados durante un largo período de tiempo, por lo que es conveniente y rápido preparar emulsiones. El tiempo total para preparar emulsiones para hasta 80 ratones es de aproximadamente 30 minutos. Esto está en marcado contraste con otros métodos publicados, que requieren 1-1.5 h para preparar emulsiones MOG35-55 16,18. Otros métodos manuales, como el método de una jeringa, a menudo se asocian con la introducción de burbujas de aire dentro de las jeringas5. El método presentado aquí ha sido diseñado para que la emulsión se introduzca en las jeringas desde su extremo posterior, lo que elimina la introducción de burbujas de aire y minimiza la pérdida de material.
Para garantizar resultados consistentes y un desperdicio mínimo de emulsión, hay algunos pasos críticos en el método de homogeneización por agitación que requieren atención específica. El tubo y los reactivos deben colocarse en hielo antes de comenzar el experimento y después de la etapa de homogeneización. El PBS y el antígeno deben agregarse primero al tubo, seguidos por el adyuvante (CFA / IFA), para evitar altas concentraciones locales de antígeno al mezclarse con el adyuvante de aceite. La tapa debe apretarse firmemente abriéndolo y cerrándolo un par de veces para evitar fugas. Además, la jeringa no debe llenarse completamente con la emulsión, solo hasta la marca de 0,15 ml en el cilindro de la jeringa para evitar el desperdicio de la emulsión. El émbolo debe insertarse en la jeringa con mucho cuidado, usando ambas manos. Después de que todas las jeringas se llenan con la emulsión, las jeringas se pueden almacenar a temperatura ambiente si se van a utilizar el mismo día; de lo contrario, deben conservarse a 4 °C hasta su uso.
Las emulsiones antígeno/CFA preparadas por el método de homogeneización por agitación pueden parecer menos firmes en comparación con las preparadas con el método de jeringa. Se puede añadir un paso de agitación adicional (consulte el paso 2.5 del protocolo), que podría espesar la emulsión. Sin embargo, las emulsiones que pasan la "prueba de caída" y el examen de microscopio de contraste de fase inducen EAE independientemente del estado físico de la emulsión.
La inversión inicial requerida en una máquina de homogeneización por agitación es una limitación. Sin embargo, los pasos de preparación descritos aquí aseguran un desperdicio mínimo de emulsión y antígeno, que a menudo es costoso de comprar o lleva mucho tiempo prepararlo. Por lo tanto, a largo plazo, este método es más barato de usar ya que ahorra tiempo y reactivos. El antígeno y el tampón utilizados en el método de homogeneización por agitación pueden afectar la calidad de la emulsión. El péptido MOG35-55 disuelto en PBS sin Ca 2+/Mg 2+ generó consistentemente emulsiones con pequeñas partículas uniformes de agua en aceite (Figura 2A). Sin embargo, los antígenos peptídicos disueltos en PBS con Ca 2+/Mg2+, o los péptidos que contienen muchos residuos de aminoácidos cargados pueden generar emulsiones que son menos viscosas. No se ha probado si tales emulsiones tienen menos probabilidades de inducir enfermedades en modelos animales. Otra limitación de este método es que no se pueden preparar más de 8 ml de emulsión antígeno/CFA a partir de un tubo. Los tubos no deben cargarse con más de 9,6 ml en total (4,8 ml de PBS/antígeno y 4,8 ml de CFA/IFA), lo que será suficiente para cargar ocho jeringas de 1 ml. Aunque el tubo puede contener un volumen mayor, algo de aire debe estar presente en el tubo, de lo contrario no se generarán emulsiones perfectas. Si se necesita más emulsión, se puede preparar con tubos adicionales.
En comparación con los métodos existentes, no hay diferencia de persona a persona al preparar las emulsiones con el método de homogeneización por agitación. El método más utilizado para preparar emulsiones para los experimentos de EAE utiliza jeringas que se empujan hacia adelante y hacia atrás con la mano19. La fuerza, el tiempo y la temperatura no se pueden controlar bien y, por lo tanto, es difícil estandarizar un método basado en jeringas. Otros métodos para hacer emulsiones de agua en aceite aprovechan los sonicadores ultrasónicos de baño de agua. Las emulsiones preparadas con un método de sonicación son capaces de inducir EAE en ratones BALB/c resistentes8. El método descrito podría ser estandarizado y, por lo tanto, útil. Sin embargo, el problema con el baño de agua ultrasónico y los sonicadores de sonda ultrasónica es que es difícil transferir la emulsión en los tubos a las jeringas utilizadas para la inmunización sin introducir burbujas de aire. Los tubos utilizados para el método presentado aquí eliminan este problema.
Un método de vórtice podría considerarse un método estandarizado con una velocidad, tiempo y temperatura establecidos. Sin embargo, probar este método para preparar una emulsión mediante vórtice de la preparación MOG / CFA durante 10 minutos no dio como resultado la inducción de la enfermedad en ratones C57BL / 6J (datos no mostrados). Sin embargo, EAE puede ser inducida con una mezcla antígeno/CFA preparada por vórtice durante 45 min18, lo que sería un procedimiento mucho más largo en comparación con el método presentado en este manuscrito.
Otro adyuvante a base de aceite (ver Tabla de materiales), aprobado por la FDA para ser utilizado en humanos, que produce una emulsión de agua en aceite ha demostrado ser un adyuvante prometedor para las vacunas contra el cáncer y la malaria20,21,22. Por lo tanto, el protocolo estandarizado presentado aquí se puede adaptar para su uso en la clínica. Los experimentos preliminares han revelado que el método de homogeneización por agitación genera emulsiones con este aceite aprobado por la FDA que son de mejor calidad en comparación con el método de jeringa manual (datos no mostrados).
En conclusión, el método de homogeneización por agitación presentado aquí proporciona una serie de beneficios, como la generación más rápida de emulsiones de calidad controlada, alta reproducibilidad en varios modelos de enfermedades autoinmunes y una reducción de los costosos reactivos necesarios para preparar emulsiones de antígeno / CFA. Dado que no hay diferencia de persona a persona que genere estas emulsiones de agua en aceite, ofrece la posibilidad de estandarizar este método necesario para la investigación biomédica reproducible y el descubrimiento de fármacos en el área de enfermedades autoinmunes y desarrollo de vacunas terapéuticas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
BTB Emulsions AB ha presentado una solicitud de patente para el uso de un dispositivo y método para preparar emulsiones para inmunización y animales y humanos (número de solicitud de patente europea: EP3836884A1). BTB es el CEO y fundador de la compañía, y accionista de BTB Emulsions. Bertin-Instruments está distribuyendo los kits de emulsión utilizados en esta publicación en todo el mundo.
Acknowledgments
El autor desea agradecer a las unidades de alojamiento de animales de la Universidad de Lund, Camilla Björklöv y Agnieszka Czopek, por su apoyo, y a Richard Williams, del Instituto Kennedy de Reumatología, Universidad de Oxford, Reino Unido, por la crítica constructiva y el apoyo lingüístico que produce este manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Injection syringe | B. Braun | 9166017V | |
| 1 mL Injection syringe | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
| 7 ml empty tubes with caps | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | 7 mL tube |
| 50 mL sterile centrifuge tube | Fisher Scientific | 10788561 | 50 mL tube |
| Bordetella pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P2980 | Store at -20 °C |
| Dispersant, light mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Store at RT |
| Emulsion kit | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | Containing a tube, cap, and plunger |
| Incomplete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C |
| Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Store at +4 °C |
| Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | Particle size analyzer |
| Minilys-Personal homogenizer | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | Shaking homogenizer |
| MOG 35-55 Peptide | Innovagen | N/A | |
| Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | FDA-approved oil adjuvant |
| Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm | Fisher Scientific | 17124381 | Sterlie filter |
| PBS, Ca2+/Mg2+ free | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| Phase-Constrast Microscope | Olympus | BX40-B | |
| Steel Beads 3.2 mm | Fisher Scientific | NC0445832 | Autoclave and store at RT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | Store at RT |
References
- Walton, C., et al. Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition. Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).
- van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers. Frontiers in Immunology. 11, 760 (2020).
- Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells' Multiple Identities in Neuroimmunity. Frontiers in Immunology. 10, 2947 (2019).
- Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. Animal models of multiple sclerosis--potentials and limitations. Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).
- Terry, R. L., Ifergan, I., Miller, S. D. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice. Methods in Molecular Biology. 1304, 145-160 (2016).
- Topping, L. M., et al. Standardization of antigen-emulsion preparations for the induction of autoimmune disease models. Frontiers in Immunology. 13, 892251 (2022).
- Flies, D. B., Chen, L. A simple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 276 (1-2), 239-242 (2003).
- Määttä, J. A., Erälinna, J. P., Röyttä, M., Salmi, A. A., Hinkkanen, A. E. Physical state of the neuroantigen in adjuvant emulsions determines encephalitogenic status in the BALB/c mouse. Journal of Immunological Methods. 190 (1), 133-141 (1996).
- Moncada, C., Torres, V., Israel, Y. Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 162 (1), 133-140 (1993).
- Waksman, B. H., Adams, R. D. Allergic neuritis: an experimental disease of rabbits induced by the injection of peripheral nervous tissue and adjuvants. The Journal of Experimental Medicine. 102 (2), 213-236 (1955).
- Vladutiu, A. O., Rose, N. R. Autoimmune murine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type. Science. 174 (4014), 1137-1139 (1971).
- Caspi, R. R. Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse. Current Protocols in Immunology. , Chapter 15 Unit 15.6 (2003).
- Tuzun, E., et al. Guidelines for standard preclinical experiments in the mouse model of myasthenia gravis induced by acetylcholine receptor immunization. Experimental Neurology. 270, 11-17 (2015).
- Brinckerhoff, L. H., et al. Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines. International Journal of Cancer. 83 (3), 326-334 (1999).
- Kool, M., et al. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells. The Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 869-882 (2008).
- Hasselmann, J. P. C., Karim, H., Khalaj, A. J., Ghosh, S., Tiwari-Woodruff, S. K. Consistent induction of chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice for the longitudinal study of pathology and repair. Journal of Neuroscience Methods. 284, 71-84 (2017).
- Freund, J., Lipton, M. M. Experimental allergic encephalomyelitis after the excision of the injection site of antigen-adjuvant emulsion. The Journal of Immunology. 75 (6), 454-459 (1955).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).
- Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. Journal of Visualized Experiments. (62), e3778 (2012).
- Arevalo-Herrera, M., et al. Randomized clinical trial to assess the protective efficacy of a Plasmodium vivax CS synthetic vaccine. Nature Communications. 13 (1), 1603 (2022).
- Jiang, C., et al. Potential association factors for developing effective peptide-based cancer vaccines. Frontiers in Immunology. 13, 931612 (2022).
- Neninger Vinageras, E., et al. Phase II randomized controlled trial of an epidermal growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (9), 1452-1458 (2008).
