För att inducera experimentell autoimmun encefalomyelit, en djurmodell av multipel skleros, immuniseras möss med en vatten-i-olja-emulsion innehållande ett autoantigen och kompletterar Freunds adjuvans. Medan flera protokoll finns för beredning av dessa emulsioner, presenteras ett snabbt, enkelt och standardiserat homogeniseringsprotokoll för emulsionsberedning här.
Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) delar liknande immunologiska och kliniska egenskaper med multipel skleros (MS), och används därför i stor utsträckning som en modell för att identifiera nya läkemedelsmål för bättre patientbehandling. MS kännetecknas av flera olika sjukdomsförlopp: skovvis förlöpande MS (RRMS), primär progressiv MS (PPMS), sekundär progressiv MS (SPMS) och en sällsynt progressiv återfallande form av MS (PRMS). Även om djurmodeller inte exakt efterliknar alla dessa kontrasterande fenotyper av mänskliga sjukdomar, finns det EAE-modeller som återspeglar några av de olika kliniska manifestationerna av MS. Till exempel efterliknar myelinoligodendrocytglykoprotein (MOG) -inducerad EAE i C57BL / 6J-möss humant PPMS, medan myelinproteolipidprotein (PLP) -inducerad EAE i SJL / J-möss liknar RRMS. Andra autoantigener, såsom myelinbasiskt protein (MBP), och ett antal olika musstammar används också för att studera EAE. För att inducera sjukdom i dessa autoantigen-immunisering EAE-modeller framställs en vatten-i-olja-emulsion och injiceras subkutant. Majoriteten av EAE-modellerna kräver också en injektion av kikhosttoxin för att sjukdomen ska utvecklas. För konsekvent och reproducerbar EAE-induktion krävs ett detaljerat protokoll för att förbereda reagenserna för att producera antigen-/adjuvansemulsioner. Metoden som beskrivs här utnyttjar en standardiserad metod för att generera vatten-i-olja-emulsioner. Det är enkelt och snabbt och använder en skakande homogenisator istället för sprutor för att förbereda kvalitetskontrollerade emulsioner.
En nedbrytning av immunologisk tolerans kan resultera i generering av autoimmuna störningar, såsom multipel skleros (MS). Det uppskattas att 2,8 miljoner människor lever med MS över hela världen1. Även om den exakta orsaken till MS fortfarande är till stor del okänd, spelar dysreglering av autoreaktiva T- och B-celler, liksom defekter i Treg-funktionen, viktiga roller i patogenesen av sjukdomen 2,3.
Djurmodeller av autoimmuna sjukdomar är viktiga verktyg för att undersöka potentiella terapeutiska metoder. Den experimentella modellen för autoimmun encefalomyelit (EAE) har använts i nästan ett sekel av forskare som är intresserade av MS4. I tidiga experiment var förekomsten av sjukdomen relativt låg. Introduktionen av komplett Freunds adjuvans (CFA), innehållande Mycobacterium och kikhosttoxin, möjliggjorde konsekvent induktion av EAE i möss4. Viktigast av allt är att det är nödvändigt att blanda CFA med ett antigen i centrala nervsystemet (CNS) för att generera en homogen vatten-i-olja-emulsion för att inducera EAE. De vanligaste för närvarande tillgängliga EAE-modellerna är baserade på aktiv immunisering av möss med encefalitogena peptider. Mössens genetiska bakgrund spelar en viktig roll för sjukdomskänslighet, med myelinoligodendrocytglykoprotein (MOG35-55) och myelinproteolipidprotein (PLP139-151) peptider som används för att inducera EAE i C57BL / 6J respektive SJL-möss5. Andra musstammar och CNS-härledda peptider kan dock också användas.
Kvaliteten på CFA/peptidemulsionen är en kritisk faktor som bestämmer sjukdomspenetransen i den aktiva immuniseringsmodellenEAE modell 6. En homogen vatten-i-olja-emulsion måste framställas genom att blanda de encefalitogena peptiderna upplösta i vattenhaltig buffert med CFA, annars kommer djur inte att utveckla sjukdomen. Många protokoll har publicerats om beredning av CFA/peptidemulsioner. Exempel inkluderar användning av en virvel7, ultraljudsbehandling8, sprutor och en trevägs T-kontakt9, eller en spruta endast5. Alla dessa metoder är dock svåra att standardisera och är ofta förknippade med långa och komplicerade protokoll.
Jämfört med alla ovanstående metoder erbjuder den enkla metoden som beskrivs här för emulsionsberedning fördelarna med att inte ha några person-till-person-skillnader och vara relativt snabb. Emulsionen genereras av en homogenisator som skakar reagenserna med en inställd hastighet, tid och temperatur, vilket säkerställer snabba och konsekventa resultat. Förutom att inducera sjukdom i EAE-modellen kan denna metod också användas för att studera andra autoimmuna sjukdomsmodeller såsom kollageninducerad artrit (CIA) och antigeninducerad artrit (AIA)6. Därför förväntas denna metod kunna användas för att konsekvent inducera sjukdom i andra djurmodeller som är beroende av vatten-i-olja-emulsioner med autoantigener, såsom experimentell autoimmun neurit (EAN)10, experimentell autoimmun tyreoidit (EAT)11, autoimmun uveit (EAU)12 och myasthenia gravis (MG)13. Denna metod inducerar också allmänna immunsvar som fördröjd överkänslighet (DTH) konsekvent6, och kan därför användas för att leverera cancer- och malariavacciner (se diskussion).
Således har en snabb (total beredningstid ~ 30 min), enkel (alla reagenser kan förberedas i förväg och lagras) och standardiserad (emulsionen uppnås med hjälp av en skakningshomogenisator) metod utvecklats och presenteras här. CFA/antigenemulsioner framställda med hjälp av detta protokoll inducerar konsekvent sjukdom i autoimmuna djurmodeller.
Vatten-i-olja-emulsioner, såsom antigen/Freunds adjuvans, har använts i mer än ett halvt sekel för att inducera EAE17. Det finns för närvarande ingen standardiserad metod för att framställa antigenemulsioner som är oberoende av mänsklig påverkan. Manuell blandning med sprutor är standard för de flesta laboratorier, men denna metod är tidskrävande, resulterar ofta i en överdriven förlust av material och kvaliteten skiljer sig beroende på forskaren som förbereder den.
<p class…The authors have nothing to disclose.
Författaren vill uppmärksamma djurhållningsenheterna vid Lunds universitet, Camilla Björklöv och Agnieszka Czopek, för deras stöd, och Richard Williams, Kennedy Institute of Rheumatology, University of Oxford, Storbritannien, för konstruktiv kritik och språkligt stöd för att producera detta manuskript.
1 mL Injection syringe | B. Braun | 9166017V | |
1 mL Injection syringe | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
7 ml empty tubes with caps | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | 7 mL tube |
50 mL sterile centrifuge tube | Fisher Scientific | 10788561 | 50 mL tube |
Bordetella pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P2980 | Store at -20 °C |
Dispersant, light mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Store at RT |
Emulsion kit | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | Containing a tube, cap, and plunger |
Incomplete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C |
Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Store at +4 °C |
Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | Particle size analyzer |
Minilys-Personal homogenizer | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | Shaking homogenizer |
MOG 35-55 Peptide | Innovagen | N/A | |
Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | FDA-approved oil adjuvant |
Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm | Fisher Scientific | 17124381 | Sterlie filter |
PBS, Ca2+/Mg2+ free | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
Phase-Constrast Microscope | Olympus | BX40-B | |
Steel Beads 3.2 mm | Fisher Scientific | NC0445832 | Autoclave and store at RT |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | Store at RT |