Summary
Hier wordt een methode gepresenteerd om afzonderlijke cellen mechanisch te fenotyperen met behulp van een op elektronica gebaseerd microfluïdisch platform dat mechano-node-pore sensing (mechano-NPS) wordt genoemd. Dit platform handhaaft een gematigde doorvoer van 1-10 cellen / s terwijl het zowel de elastische als viskeuze biofysische eigenschappen van cellen meet.
Abstract
Cellulaire mechanische eigenschappen zijn betrokken bij een breed scala aan biologische processen en ziekten, variërend van stamceldifferentiatie tot kankermetastase. Conventionele methoden voor het meten van deze eigenschappen, zoals atoomkrachtmicroscopie (AFM) en micropipette-aspiratie (MA), vangen rijke informatie op, die de volledige visco-elastische respons van een cel weerspiegelt; deze methoden worden echter beperkt door een zeer lage doorvoer. High-throughput benaderingen, zoals real-time deformability cytometry (RT-DC), kunnen slechts beperkte mechanische informatie meten, omdat ze vaak beperkt zijn tot single-parameter uitlezingen die alleen de elastische eigenschappen van een cel weerspiegelen. In tegenstelling tot deze methoden is mechano-node-pore sensing (mechano-NPS) een flexibel, labelvrij microfluïdisch platform dat de kloof overbrugt in het bereiken van multi-parameter visco-elastische metingen van een cel met matige doorvoer. Een gelijkstroom (DC) meting wordt gebruikt om cellen te monitoren terwijl ze een microfluïdisch kanaal passeren en hun grootte en snelheid volgen voor, tijdens en nadat ze door een smalle vernauwing worden gedwongen. Deze informatie (d.w.z. grootte en snelheid) wordt gebruikt om de transversale vervorming van elke cel, weerstand tegen vervorming en herstel van vervorming te kwantificeren. Over het algemeen biedt dit op elektronica gebaseerde microfluïdische platform meerdere visco-elastische celeigenschappen en dus een completer beeld van de mechanische toestand van een cel. Omdat het minimale monstervoorbereiding vereist, een eenvoudige elektronische meting gebruikt (in tegenstelling tot een hogesnelheidscamera) en profiteert van standaard zachte lithografiefabricage, is de implementatie van dit platform eenvoudig, toegankelijk en aanpasbaar aan downstream-analyse. De flexibiliteit, bruikbaarheid en gevoeligheid van dit platform hebben unieke mechanische informatie opgeleverd over een breed scala aan cellen, met het potentieel voor veel meer toepassingen in de basiswetenschap en klinische diagnostiek.
Introduction
Enkele cellen zijn dynamische, visco-elastische materialen1. Een veelheid aan interne en externe processen (bijv. het begin van mitose of remodellering van de extracellulaire matrix [ECM]), beïnvloeden hun structuur en samenstelling 2,3,4, wat vaak resulteert in verschillende biofysische eigenschappen die hun huidige toestand aanvullen. In het bijzonder is aangetoond dat mechanische eigenschappen belangrijke biomarkers zijn van cellulaire ontwikkeling, fysiologie en pathologie, wat waardevolle kwantitatieve informatie oplevert die canonieke moleculaire en genetische benaderingen kan aanvullen 5,6,7. Li et al. beschreven bijvoorbeeld onlangs de mechanische verschillen tussen geneesmiddelresistente en geneesmiddelresponsieve acute promyelocytaire leukemiecellen, terwijl ze ook RNA-seq gebruikten om differentieel tot expressie gebracht cytoskelet-geassocieerde genen te ontdekken8. Door het complexe samenspel tussen eencellige mechanica en cellulaire functie te begrijpen, heeft mechanofenotypering bredere toepassingen bij het transformeren van basiswetenschap en klinische diagnostiek9.
Het meest gebruikte hulpmiddel voor het meten van eencellige mechanica is atoomkrachtmicroscopie (AFM). Hoewel AFM een gelokaliseerde meting van cellulaire mechanische eigenschappen met hoge resolutie mogelijk maakt, blijft deze beperkt tot een doorvoer van <0,01 cellen /s10. Als alternatief zijn optische brancards, die twee divergente laserstralen gebruiken om gesuspendeerde enkele cellen11 te vangen en te vervormen, beperkt tot marginaal hogere doorvoersnelheden van <1 cel / s12. Recente ontwikkelingen in microfluïdische technologieën hebben een nieuwe generatie apparaten mogelijk gemaakt voor snelle, eencellige, mechanische beoordeling 12,13. Deze technieken maken gebruik van smalle vernauwingskanalen14,15, schuifstroom16 of hydrodynamischuitrekken van 17 om cellen snel te vervormen bij doorvoersnelheden van 10-1.000 cellen / s18. Hoewel de meetsnelheid van deze benaderingen aanzienlijk sneller is dan conventionele technieken, ruilen ze vaak high-throughput-mogelijkheden in voor beperkte mechanische uitlezingen (aanvullende tabel 1). Alle bovengenoemde snelle microfluïdische methoden richten zich op basisstatistieken met één parameter, zoals transittijd of vervormbaarheidsverhoudingen, die alleen de elastische eigenschappen van een cel weerspiegelen. Gezien de intrinsieke visco-elastische aard van afzonderlijke cellen, vereist een robuuste en grondige mechanische karakterisering van cellen echter niet alleen aandacht voor elastische componenten, maar ook voor viskeuze reacties.
Mechano-node-pore sensing (mechano-NPS)2,8 (Figuur 1A) is een microfluïdisch platform dat bestaande beperkingen met eencellige mechanofenotypering aanpakt. Deze methode maakt het mogelijk om meerdere biofysische parameters tegelijkertijd te meten, waaronder celdiameter, relatieve vervormbaarheid en hersteltijd van vervorming, met een matige doorvoer van 1-10 cellen / s. Deze techniek is gebaseerd op node-pore sensing (NPS)19,20,21,22,23,24, waarbij een vierpunts sondemeting wordt gebruikt om de gemoduleerde stroompuls te meten die wordt geproduceerd door een cel die een microfluïdisch kanaal passeert dat is gesegmenteerd door bredere regio's, aangeduid als "knooppunten". De gemoduleerde stroompuls is het gevolg van het feit dat de cel de stroomstroom in de segmenten (d.w.z. "poriën") en knooppunten gedeeltelijk blokkeert, met meer stroom geblokkeerd in de eerste dan in de laatste. In mechano-NPS is één segment, het "contractiekanaal", smaller dan een celdiameter; bijgevolg moet een cel vervormen om het hele kanaal te passeren (figuur 1B). De celdiameter kan worden bepaald door de grootte van de subpulse die wordt geproduceerd wanneer de cel de knoopporiën passeert voorafgaand aan het contractiekanaal (figuren 1B, C). Hier is |ΔInp|, de stroomdruppel wanneer de cel zich in de porie bevindt, evenredig met de volumeverhouding van de cel tot de porie, V-cel/V-porie 2,8,19. Celstijfheid kan worden bepaald door ΔTc, de duur van de dramatisch grotere subpulse die wordt geproduceerd wanneer de cel het contractiekanaal passeert (figuren 1B,C). Een stijvere cel zal er langer over doen om het kanaal te passeren dan een zachtere 2,8. Ten slotte kan celherstel, het vermogen van de cel om terug te keren naar zijn oorspronkelijke grootte en vorm na vervorming, worden bepaald door de reeks subpulsen die worden geproduceerd als de cel de knoopporiën passeert na het contractiekanaal (figuren 1B, C). De hersteltijd, ΔTr, is de tijd die nodig is voordat de huidige subpulsen terugkeren naar de grootte van de vorige subpulsen, voordat de cel wordt geperst. Over het algemeen worden de gemoduleerde stroompulsen die worden geproduceerd als een cel het microfluïdische kanaal passeert, geregistreerd en geanalyseerd om de relevante eencellige mechanische parameters te extraheren (figuur 1D) 2,8.
De reproduceerbaarheid en het gebruiksgemak van dit op elektronica gebaseerde microfluïdische platform zijn eerder aangetoond25. Bovendien biedt het platform een lage toetredingsdrempel voor eencellige mechanofenotypering. Standaard zachte lithografie wordt gebruikt om microfluïdische apparaten te fabriceren. De meethardware bestaat uit goedkope componenten, waaronder een eenvoudige printplaat (PCB), voeding, voorversterker, data-acquisitiebord (DAQ) en computer. Ten slotte is er gebruiksvriendelijke code beschikbaar voor data-acquisitie en -analyse, waardoor een eenvoudige implementatie mogelijk is. Deze mechanofenotyperingstechniek kan populaties van niet-kwaadaardige en kwaadaardige borst- en longepitheelcellijnen onderscheiden, onderscheid maken tussen sublijnen in primaire menselijke borstepitheelcellen en de effecten van cytoskeletale verstoringen en andere farmacologische middelen karakteriseren 2,8. Over het algemeen is dit platform een effectieve aanpak voor het mechanofenotyperen van afzonderlijke cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ontwerp apparaatgeometrie
- Kies de breedte van de maat- en herstelsegmenten zodat deze breder is dan de diameter van de grootste te meten cellen, maar ook een voldoende signaal-ruisverhouding (SNR) behoudt. Zie Aanvullende tabel 2 voor voorbeelden van verschillende grootte- en herstelsegmentbreedten voor verschillende cellijnen.
- Kies de breedte van het contractiesegment om een stam van 30% -40% toe te passen op de gemiddelde grootte van de cellen die mechanofenotypering moeten ondergaan. Stam wordt gedefinieerd als
, waarbij d de celdiameter is en wc de contractiekanaalbreedte 2,8. Zie aanvullende tabel 2 voor verschillende breedtes van het contractiesegment voor verschillende cellijnen.
OPMERKING: Als men celtypen of -omstandigheden met wezenlijk verschillende diameters wil vergelijken, moeten afzonderlijke apparaatontwerpen worden gebruikt met contractiesegmentbreedtes die specifiek zijn voor elk celtype / -conditie. - Ontwerp een referentieapparaat voor elke unieke apparaatgeometrie. Dit is nodig voor het bepalen van De, de effectieve diameter van het grootteporiënsegment van het microfluïdische kanaal.
OPMERKING: Het referentieapparaat gebruikt dezelfde geometrie als het primaire apparaat. De enige wijziging is dat het contractiesegment in breedte gelijk moet zijn aan het grootteporiënsegment om kalibratie met polystyreenparels van een bekende grootte mogelijk te maken. Het verbreden van de contractie voorkomt dat de polystyreenparels het contractiekanaal tijdens de kalibratie verstoppen. Het kalibratieproces wordt verder beschreven in stap 4.1 en 5.3.1. Kalibratie kan ook worden bereikt met behulp van een in de handel verkrijgbare celteller, in welk geval geen referentieapparaat nodig is. Dit proces wordt beschreven in stap 4.2. - Kies de kanaalhoogte zodanig dat de grootste cellen van belang volledig kunnen verlengen zonder beperking binnen het contractiesegment2. Zorg ervoor dat de kanaalhoogte groter is dan hmin
(dit veronderstelt dat de cel bolvormige voorvervorming is en dat isometrische vervorming optreedt langs de kanaallengte en -hoogte tijdens vervorming).
OPMERKING: Gezien de grootte van een stroomsubpulse,
hoe groter de hmin is, hoe lager de totale SNR zal zijn. - Ontwerp en maak een fotomasker met behulp van computerondersteunde ontwerpsoftware met de gekozen kanaalbreedtes. Een voorbeeldbestand is opgenomen in Aanvullend bestand 1. Schaal het microfluïdische maskerontwerp met 1,5% om rekening te houden met polydimethylsiloxaan (PDMS) krimp na het pellen van de negatieve master.
OPMERKING: Een array van apparaten kan op één masker worden opgenomen zolang de totale array de grootte van de wafer niet overschrijdt (aanvullende figuur 1A). - Ontwerp en maak een fotomasker met elektroden dat zal worden gebruikt om een vierpunts sondemeting van de microfluïdische apparaatstroom uit te voeren (figuur 1D). Een voorbeeldbestand is opgenomen in Aanvullend bestand 1.
OPMERKING: Een array van elektroden kan op een enkel masker worden opgenomen zolang de array de grootte van de glazen dia niet overschrijdt (aanvullende figuur 1B).
, waarbij d de celdiameter is en wc de contractiekanaalbreedte 2,8. Zie aanvullende tabel 2 voor verschillende breedtes van het contractiesegment voor verschillende cellijnen.
(dit veronderstelt dat de cel bolvormige voorvervorming is en dat isometrische vervorming optreedt langs de kanaallengte en -hoogte tijdens vervorming).
hoe groter de hmin is, hoe lager de totale SNR zal zijn.2. Fabricage-apparaten (figuur 2)
- Bereid elektrodepatronen voor op een glazen substraat.
- Draai de vacht, patroon en verwerk een positieve fotoresist op een gewone glazen dia volgens het productgegevensblad. Een voorbeeld van deze procedure wordt geschetst in Aanvullend Dossier 2.
- Voer metaalafzetting, lift-off en goudetsen uit.
- Voer dunne filmafzetting van 75 Å Ti, 250 Å Pt en 250 Å Au uit op de dia. Een voorbeeld van deze procedure met behulp van elektronenkanonverdamping wordt beschreven in aanvullend dossier 3.
- Dompel de glijbaan gedurende 15 minuten onder in aceton om een lift-off van overtollig metaal uit te voeren.
- Gebruik in een zuurkast een wegwerppipet om gegoten goudetsmiddel op het gebied van elektroden te laten vallen dat zal worden blootgesteld aan het microfluïdische kanaal, zoals weergegeven in aanvullende figuur 2. Wees voorzichtig om te voorkomen dat u etsmiddel elders op de dia laat vallen.
LET OP: Goudetsmiddel kan huid- en oogirritatie veroorzaken. Adem geen dampen in en neem niet in. Ga voorzichtig te werk, draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM' s) en gooi afval weg volgens de lokale verwijderingsvoorschriften. - Spoel de glijbaan af met gedeïoniseerd (DI) water en droog deze met droge stikstof (N2).
- Als er meerdere elektroden op dezelfde glazen dia worden afgedrukt, dobbelt u de dia in afzonderlijke chips.
- Gebruik een gereedschap voor het snijden van glas om de dia langs de randen van de elektrode met patroon te scoren.
- Breek het glas langs de partituur om de glijbaan in afzonderlijke chips te verdelen.
- Inspecteer de elektroden visueel onder een microscoop. Zorg ervoor dat afzonderlijke elektroden niet elektrisch open zijn of dat elektroden niet aan elkaar worden geknipt.
- Fabriceer een negatieve master mold voor kanalen.
- Spinlaag, patroon en verwerk een SU-8 epoxy resist op een gepolijste siliciumwafer volgens het productgegevensblad. Een voorbeeld van deze procedure wordt geschetst in Aanvullend Dossier 2.
- Meet de hoogte van functies met behulp van een profilometer en inspecteer de functies visueel onder een microscoop (aanvullende figuur 3). Zorg ervoor dat de gewenste geometrieën goed gedefinieerd zijn.
- Vorm PDMS-kanalen met zachte lithografie.
- Bereid PDMS door een elastomeer en een crosslinker te wegen in een massaverhouding van 10:1 in een wegwerpbeker.
OPMERKING: Voor een wafer met een diameter van 3 is 30 g PDMS voldoende. - Meng het PDMS gedurende 30 s krachtig met een wegwerpvork, totdat het PDMS ondoorzichtig is met bubbels.
- Ontgas het PDMS in een vacuümkamer gedurende ongeveer 30-90 minuten, of totdat het PDMS transparant is zonder zichtbare bellen.
- Plaats de wafer met de SU-8 mastervorm in een wegwerp petrischaaltje en giet PDMS over het midden van de wafer.
- Plaats de petrischaal met het PDMS en de wafer in een vacuümkamer en ontgas gedurende ongeveer 30 minuten, of totdat er geen bellen in het PDMS achterblijven.
- Bak het PDMS op 80 °C gedurende 2 uur in een oven of op een hete plaat.
- Snijd en verwijder met een scherp mes het PDMS van de SU-8 negatieve master.
- Dobbel de gegoten PDMS-plaat in individuele mallen met behulp van een scherp mes
- Kern de inlaat- en uitlaattoegangsgaten met behulp van een wegwerpbiopsiepons. Voor de beste resultaten gebruikt u een nieuwe pons voor elke PDMS-plaat. Een scherpere pons produceert gaten met gladde randen, waardoor deeltjes die het samentrekkingskanaal kunnen belemmeren, worden geminimaliseerd.
OPMERKING: De diameter van de toegangsgaten moet iets kleiner zijn dan de buitendiameter van de buis. Als u bijvoorbeeld polytetrafluorethyleen (PTFE) buizen met een buitendiameter van 1/32 inch gebruikt, moet een gat van 1,5 mm worden geponst.
- Bereid PDMS door een elastomeer en een crosslinker te wegen in een massaverhouding van 10:1 in een wegwerpbeker.
- Verlijm een glass/elektrode substraat aan de PDMS-kanalen.
- Reinig de elektrodeglasglaasjes met methanol (≥99,8%). Droog met droge N2.
- Reinig het PDMS-apparaat met plakband, gevolgd door een spoeling met isopropylalcohol (IPA) en gedeïoniseerd water (DI; 18 MΩ/cm2). Droog met droge N2. Maak vervolgens nogmaals schoon met plakband.
- Plaats het glazen substraat met geprefabriceerde elektroden en de voorbereide PDMS-mal (functiezijde naar boven) in een plasmareiniger.
- Stel beide gedurende 2 minuten bloot aan zuurstofplasma (100-300 mTorr, 30 W).
- Lijn en plaats de PDMS-mal met de functiezijde naar beneden gericht op het glazen substraat met geprefabriceerde elektroden.
OPMERKING: Hechting vindt onmiddellijk plaats zodra het plasmabehandelde PDMS en glas in contact komen; verdere aanpassingen aan de uitlijning zijn dan ook niet mogelijk. Om de uitlijning te vergemakkelijken, kan 20 μL van een 2:1 verdunning van methanol in DI-water op het plasmabehandelde glasoppervlak worden gepipetteerd. De methanoloplossing fungeert als een fysieke barrière tussen het behandelde glas en PDMS, waardoor uitlijningsaanpassingen mogelijk zijn. Als u methanol gebruikt, bakt u het uitgelijnde en gepaarde apparaat gedurende 2 uur op 50 °C om de oplossing te verdampen en het hechtingsproces te voltooien. - Inspecteer het verlijmde apparaat visueel onder een microscoop. Zorg ervoor dat de elektroden en kanaalgeometrieën goed zijn uitgelijnd.
3. Cellen meten (figuur 1D)
- Bereid de drukbron, PCB, benchtop hardware en data-acquisitiesoftware voor.
- Sluit het microfluïdische apparaat aan op de pcb met behulp van de klem. Een voorbeeld van de PCB wordt gegeven in Aanvullend bestand 4 ( GERBER-bestanden) en Aanvullend bestand 5 (schematische, bord- en PCB-onderdelenlijstbestanden).
- Lijn de veerbelaste pennen van de klem uit met de elektrodecontactpads op het microfluïdische apparaat en lijn de koppennen van de klem uit met de gaten op de pcb.
- Steek de koppennen van de klem stevig in de PCB-gaten en zorg ervoor dat de veerbelaste pennen uitgelijnd blijven met de elektrodecontactpads.
- Stel de elektronische hardware in en sluit deze aan.
- Sluit twee van de uitgangspoorten van de voeding aan op de voedingsspanningspoort van de pcb met een dubbele banaan plug-to-Bayonet Neill-Concelman (BNC) vrouwelijke adapter en een BNC-kabel.
- Schakel de voeding in. Stel de uitgang die is aangesloten op de binnengeleider van de BNC in op +15 V en stel de andere uitgang in op -15 V. Schakel beide uitgangen in om het circuit van stroom te voorzien.
- Sluit de derde uitgangspoorten van de voeding aan op de ingangsspanningspoort van de pcb met een BNC-kabel. Stel de uitgang in op de gewenste toegepaste spanning, maar schakel deze pas in als u het experiment start.
- Sluit de uitgangsstroompoort van de printplaat aan op de ingang van de huidige voorversterker met een BNC-kabel.
- Sluit de uitgang van de huidige voorversterker aan op één analoge ingang op het BNC-aansluitblok van het data-acquisitiesysteem met een BNC-kabel. Sluit optioneel een analoog low-pass filter aan in lijn met de BNC-kabel om hoogfrequente interferentie uit te filteren.
OPMERKING: Om de SNR te verbeteren, kunnen de pcb en het apparaat worden ondergebracht in een dikke metalen behuizing. Alle BNC-kabels en vloeistofbuizen kunnen door gaten worden geleid die in de behuizing zijn geboord.
- De vereiste software installeren en instellen op de pc
- Schakel de drukregelaar in en sluit deze aan op de pc. Installeer alle vereiste drukregelaarsoftware volgens de instructies van de fabrikant.
- Installeer MATLAB en de Data Acquisition Toolbox op de PC. Zorg ervoor dat de vereiste stuurprogramma's voor het data-acquisitiesysteem zijn geïnstalleerd, zodat de MATLAB Data Acquisition Toolbox-interface dit kan detecteren.
- Download het meegeleverde data-acquisitiescript, "NPS.m", van https://github.com/sohnlab/node-pore-sensing-public.
- Open en configureer het gegevensverzamelingsscript.
- Stel de juiste waarden in om de gegevensverzamelingssessie te initialiseren, waaronder de leveranciers-id, de apparaat-id van de DAQ en het analoge invoerkanaalnummer (regels 34-36 in het meegeleverde script).
OPMERKING: De apparaat-ID is te vinden met behulp van de functie "daq.getDevices" of "daqlist". - Stel de gewenste samplefrequentie in voor de acquisitie (regel 23 in het meegeleverde script). Voor optimale resultaten moet het worden ingesteld op ten minste 10 kHz.
- Stel de juiste waarden in om de gegevensverzamelingssessie te initialiseren, waaronder de leveranciers-id, de apparaat-id van de DAQ en het analoge invoerkanaalnummer (regels 34-36 in het meegeleverde script).
- Sluit het microfluïdische apparaat aan op de pcb met behulp van de klem. Een voorbeeld van de PCB wordt gegeven in Aanvullend bestand 4 ( GERBER-bestanden) en Aanvullend bestand 5 (schematische, bord- en PCB-onderdelenlijstbestanden).
- Bereid de celsuspensie voor.
- Bereid een oplossing van 2% foetaal runderserum (FBS) in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en filter met een filter van 0,22 μm.
- Kweek en bereid de cellen voor volgens het juiste celkweekprotocol van de cellijn van keuze. Suspensie de cellen in de bereide oplossing van 2% FBS in 1x PBS in een concentratie van 1-5 x 105 cellen / ml. Houd de cellen op ijs voor de duur van de experimenten.
- Meet de fysieke eigenschappen van de cellen.
- Laad het celmonster in de slang en sluit het aan op de inlaat van het apparaat.
- Snijd 30 cm PTFE-slang met een scheermesje of scherp mes.
- Bevestig het ene uiteinde van de slang aan een luerslotspuit. Gebruik de spuit om het celmonster in het andere uiteinde van de slang te trekken.
- Steek de slang voorzichtig in de inlaat van het apparaat.
- Sluit het andere uiteinde van de buis aan op de microfluïdische drukregelaar.
OPMERKING: Er kan een filter worden toegevoegd tussen de microfluïdische drukregelaar en de slang om te voorkomen dat vloeistof terugstroomt naar de drukregelaar.
- Voer het experiment uit.
- Stel de gewenste constante rijdruk in op de software van de drukregelaar en laat het monster het apparaat vullen.
OPMERKING: De druk is meestal 2-21 kPa. De stroomsnelheid moet langzaam genoeg zijn om duidelijk gedefinieerde pulsen mogelijk te maken, maar snel genoeg om voldoende doorvoer mogelijk te maken.- Als er bellen ontstaan in de microfluïdische kanalen, gebruik dan doodlopende vulling: sluit het stopcontact van het apparaat aan en oefen een lage druk uit op de inlaat om lucht door het gasdoorlatende PDMS naar buiten te persen. Het achterlaten van bellen in het kanaal zal leiden tot een onstabiele stroombasislijn en nauwkeurige metingen verhinderen.
- Als vuil het microfluïdische kanaal verstopt, maak het dan los door lichtjes op de bovenkant van het PDMS-apparaat te drukken terwijl de rijdruk wordt uitgeoefend, een hogere druk te "pulseren" door de druk in en uit te schakelen, of de slang te verwijderen en opnieuw te plaatsen. Als het vuil achterblijft, kan het nodig zijn om over te schakelen naar een nieuw apparaat.
- Stel de gewenste spanning in door aan de spanningsknop op de voeding te draaien en schakel de spanning in door op de aan-knop te drukken.
OPMERKING: Spanning is meestal 1-5 V. Kies de laagste spanning die nodig is voor een adequate SNR. Dezelfde spanning moet worden gebruikt onder alle omstandigheden die moeten worden vergeleken. - Zet de huidige voorversterker aan en stel de gevoeligheid (A/V) zo laag mogelijk in; u kunt ook de versterking (V/A) zo hoog mogelijk instellen zonder de voorversterker te overbelasten of de maximale analoge ingangsspanning van de DAQ te overschrijden. In dit onderzoek werd de gevoeligheid ingesteld op 10-7 A/V.
OPMERKING: De juiste gevoeligheids-/versterkingswaarde is afhankelijk van zowel de toegepaste spanning als de basisweerstand van het microfluïdische kanaal. - Druk op de groene knop Uitvoeren in het lintmenu van MATLAB om het NPS.m-gegevensverzamelingsscript te starten en te beginnen met het nemen van monsters en het opslaan van de gegevens.
- Als u het experiment wilt beëindigen, drukt u op de knop Stoppen in de linkerbenedenhoek van het figuurvenster om het gegevensverzamelingsscript te stoppen. Schakel de uitgang van de voeding uit door op de knop Aan te drukken. Stel de drukbron in op nuldruk in de software van de drukregelaar.
- Op dit punt kan het experiment worden onderbroken om een of meer van de volgende handelingen uit te voeren:
- Vervang het huidige apparaat door een nieuw apparaat.
- Laad de slang opnieuw met meer celmonsters.
OPMERKING: Om kruisbesmetting van monsters te voorkomen, gebruikt u nieuwe apparaten om cellen van verschillende typen of omstandigheden te meten. - Ontlamp het apparaat van de pcb en onderzoek de toestand van het kanaal onder een microscoop. Om het experiment opnieuw te starten met hetzelfde apparaat, moet ervoor worden gezorgd dat er geen luchtbellen worden geïntroduceerd. Het kan nodig zijn om zachte druk uit te oefenen op de zuiger van de spuit om het celmonster helemaal aan het einde van de slang te houden terwijl het in de inlaat van het apparaat wordt ingebracht.
- Stel de gewenste constante rijdruk in op de software van de drukregelaar en laat het monster het apparaat vullen.
- Laad het celmonster in de slang en sluit het aan op de inlaat van het apparaat.
4. Kalibreer het microfluïdische apparaat
- Optie 1: Meet de polystyreenparels in referentieapparaten.
- Kies een polystyreenkraalgrootte die kleiner is dan het maatkanaal.
- Voeg 1,5% Tween- en polystyreenparels toe aan de gefilterde PBS- en FBS-oplossing die tijdens de celexperimenten wordt gebruikt, in een concentratie van 1-3 x 105 kralen / ml.
- Ga verder met het experiment zoals beschreven in punt 3, met behulp van het referentieapparaat beschreven in stap 1.3, en pas dezelfde spanning toe die tijdens het experimenteren wordt gebruikt. Gebruik de gemiddelde grootte van de huidige druppel die wordt geproduceerd als kralen de grootteporiën en de bekende diameter van de kralen passeren om De te berekenen, zoals beschreven in sectie 5.
- Optie 2: Meet de celgrootte onafhankelijk met een apart meetapparaat.
- In plaats van het protocol in stap 4.1 te volgen, gebruikt u een in de handel verkrijgbaar meetinstrument voor celgrootte om de gemiddelde grootte van cellen in het monster te meten. In dit geval is er geen referentieapparaat nodig. Gebruik de gemiddelde stroomdruppel die wordt geproduceerd als cellen de grootteporie en de gemeten gemiddelde celdiameter passeren om De te berekenen zoals beschreven in sectie 5.
5. Analyseer gegevens om celfenotypen te extraheren
OPMERKING: Gegevensverwerking kan worden uitgevoerd met behulp van het MATLAB-opdrachtregelinterfaceprogrammabestand mNPS_procJOVE.m . op https://github.com/sohnlab/NPS-analysis-JOVE. Zie Aanvullend bestand 6 voor meer instructies.
- Verwerkt de gegevens voor (figuur 3A).
- Bereken de gemeten elektrische stroom door de versterkingswaarde die wordt gebruikt in de stroom-spanningsvoorversterker toe te passen op de onbewerkte gegevens die door de DAQ zijn verkregen.
- Verwijder hoogfrequente ruis door een rechthoekige afvlakfunctie en/of een laagdoorlaatfilter toe te passen op de onbewerkte stroommeting. Wijzig vervolgens het aantal pixels van de gefilterde gegevens naar een lagere steekproeffrequentie. Bereken ook de bijbehorende tijdstempelgegevens met deze lagere steekproeffrequentie.
- Bereken een aangepast basisstroomsignaal door een methode toe te passen zoals asymmetrische kleinste kwadraten die26 afvlakken.
- Bereken de geschatte eerste afgeleide (verschilsignaal) van de voorbewerkte huidige gegevens door het verschil tussen volgende gegevenspunten te nemen.
- Identificeer celgebeurtenissen en extraheer subpulsegegevens (figuur 3B).
- Zoek naar kandidaatcelgebeurtenissen door de voorbewerkte gegevens te onderzoeken. Weiger celgebeurtenissen die overlappen met andere celgebeurtenissen (d.w.z. toevallige gebeurtenissen) (aanvullende figuur 4), vertonen een slechte basislijn fit of hebben een onverwachte of foutieve pulsvorm (bijvoorbeeld waar een verstopping in het kanaal aanwezig kan zijn geweest).
- Extraheer subpulsegegevens voor elke celgebeurtenis.
- Elk knooppunt-poriesegment verschijnt als een overeenkomstige subpulse binnen de totale signaalpuls (figuren 1B, C). Identificeer het begin van elke subpulse door het tijdspunt te berekenen wanneer het verschilsignaal een lokale minimumwaarde bereikt. Identificeer het einde van elke subpulse door het tijdspunt te berekenen wanneer het verschilsignaal een lokale maximale waarde bereikt.
- Bepaal de breedte van elke subpulse als de verstreken tijd tussen het begin- en eindtijdpunt. Bepaal de amplitude van elke subpulse door het gemiddelde te berekenen van het verschil tussen de gemeten stroom en de basislijnstroom voor alle gegevenspunten tussen het begin- en eindtijdpunt.
- Bepaal het celmechanofenotype voor elke celgebeurtenis op basis van subpulsegegevens.
- Bepaal de celdiameter d op basis van de vergelijking gedefinieerd door Deblois en Bean24:
waarbij ΔI/I de gemiddelde verhouding is van de amplitude van de subpulse ten opzichte van de basisstroom in de maatsubpulsen, De de effectieve diameter van het kanaal (gemeten in stap 4) en L de totale lengte van het knooppunt-poriekanaal.- De wordt bepaald door de gemiddelde ΔI/I te berekenen die wordt geproduceerd door een reeks deeltjes met een bekende diameter (cellen of kralen, zie stap 4), met behulp van die bekende diameter als d, en het oplossen van Eq. 1 voor De.
- Kwantificeer de weerstand van de cel tegen vervorming.
- Bepaal de vloeistofsnelheid U-stroom door de gemiddelde celsnelheid in de maatsubpulsen te berekenen, met behulp van de bekende segmentlengtes en de gemeten duur van elke subpulse.
- Bepaal de hele cel vervormbaarheidsindex (wCDI), gedefinieerd door Kim et al.2 als:
waarbij Lc de lengte van het contractiesegment is, h-kanaal de kanaalhoogte en ΔTc de duur van de contractiesubpulse.
- Identificeer de hersteltijd van de cel van vervorming, gedefinieerd als de eerste herstelsubpulse met een amplitude binnen 8% van de gemiddelde amplitude van de groottesubpulse2.
- Bereken de transversale vervorming van de cel binnen het contractiesegment.
- Bereken de effectieve diameter van het contractiesegment (De,c) zoals gedefinieerd door Kim et al.2:
, waarbij wc de breedte van het contractiesegment is en wnp de breedte van alle andere segmenten. - Bereken de equivalente boldiameter dc van de cel binnen de samentrekking door opnieuw gebruik te maken van de vergelijking gedefinieerd door Deblois en Bean24:
waarbij ΔIc/Ic de verhouding is tussen de amplitude van de subpulse en de uitgangsstroom in de contractiesubpulse en Lc de lengte van het contractiesegment. - Bereken de reklengte L-vervorming van de cel zoals beschreven door Kim et al.2:
- Bereken ten slotte de transversale vervorming van de cel δvervorming, die door Kim et al.2 wordt gedefinieerd als .
- Bereken de effectieve diameter van het contractiesegment (De,c) zoals gedefinieerd door Kim et al.2:
- Bepaal de celdiameter d op basis van de vergelijking gedefinieerd door Deblois en Bean24:
, waarbij wc de breedte van het contractiesegment is en wnp de breedte van alle andere segmenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het hier gepresenteerde mechanofenotyperingsplatform is een eenvoudige en veelzijdige aanpak voor het meten van de biofysische eigenschappen van afzonderlijke cellen met een matige doorvoer. Cellen worden door het microfluïdische kanaal (figuur 1A) gestroomd met behulp van een constante drukgestuurde stroom. Terwijl de cellen passeren, worden de lengte van het microfluïdische kanaal en de huidige geproduceerde pulsen geregistreerd met behulp van de hardware voor gegevensverzameling. Het verkregen signaal (figuur 1B, C) wordt vervolgens verwerkt met behulp van aangepaste software op MATLAB om de relevante eencellige mechanische eigenschappen te extraheren. Figuur 1D geeft een grafisch overzicht van het experimentele protocol.
Om apparaten te fabriceren, wordt in eerste instantie een negatieve master mold gemaakt en gebruikt om PDMS te gieten (figuur 2). Succesvolle mastermallen, weergegeven in aanvullende figuur 3, bevatten gladde, verticale zijwanden en geen defecten in het microfluïdische kanaal (figuur 4Ai). Voorzichtigheid is geboden bij het vervaardigen van deze initiële hoofdmal, omdat in slecht gefabriceerde wafers (aanvullende figuur 3) eventuele defecten worden overgedragen naar alle volgende PDMS-afgietsels (figuur 4Aii), waardoor ze onbruikbaar worden. Succesvolle PDMS-afgietsels worden vervolgens plasmagebonden aan glazen dia's met patroonelektroden (figuur 1A).
Voor experimenten worden de elektrodepads van een apparaat aangesloten op de pcb (figuur 1D) om stroommeting mogelijk te maken. Tubing, die een celmonster bevat, wordt vervolgens in de inlaat van het apparaat ingebracht en aangesloten op een microfluïdische stroomregelaar, waardoor een drukgestuurde stroom van cellen door het microfluïdische kanaal mogelijk wordt. Belangrijk is dat een live uitlezing van de huidige meting wordt weergegeven tijdens een experiment. Dit stelt gebruikers in staat om ervoor te zorgen dat hun apparaat werkt zoals bedoeld. Succesvolle celtransitgebeurtenissen bestaan uit gemakkelijk te onderscheiden subpulsen (figuur 4Bi). Complicaties, zoals verstopping, kunnen optreden tijdens experimenten en kunnen worden geïdentificeerd door de live uitlezing van gebeurtenissen met abnormale pulsvormen (figuur 4Bii).
Voor gegevensanalyse worden de kritische signaalparameters die voor elke celtransitgebeurtenis moeten worden geëxtraheerd, gedetailleerd beschreven in figuur 1B en beschreven in stap 5.2.2. Het ruwe signaal moet voldoende SNR hebben om de ruis eruit te filteren en de significante componenten te extraheren (figuur 3A). Van cruciaal belang is dat de huidige signaalstijging van elk knooppunt robuust genoeg moet zijn, zodat subpulsen gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd aan de hand van het verschilsignaal ∂I / ∂t (figuur 3B).
De gemeten wCDI en hersteltijden kunnen worden gebruikt om directe vergelijkingen te maken tussen cellen of omstandigheden. In het bijzonder is wCDI een relatieve indicator van celstijfheid die omgekeerd evenredig is met de elastische modulus (aanvullende figuur 5); een grotere waarde van wCDI komt dus overeen met een zachter mechanisch fenotype. In figuur 5A hebben kwaadaardige MCF-7-cellen bijvoorbeeld een grotere wCDI-verdeling dan niet-kwaadaardige MCF-10A-cellen, wat aangeeft dat de kwaadaardige MCF-7-cellen zachter zijn dan hun niet-kwaadaardige MCF-10A-tegenhangers. Dit komt overeen met talrijke empirische studies die hebben aangetoond dat kankercellen zachter zijn dan hun niet-kwaadaardige tegenhangers27. Evenzo vertonen in figuur 5B MCF-10A- en MCF-7-cellen behandeld met latrunculine een toename van wCDI. Latrunculine is een krachtig farmacologisch middel dat het actinecytoskelet verstoort28. Bijgevolg is het consistent om een grotere wCDI, en dus een zachter fenotype, te observeren in cellen die met dit medicijn worden behandeld. Ten slotte wordt in figuur 5C wCDI vergeleken tussen twee sublijnen van menselijke borstepitheelcellen, luminaal epitheel (LEP) en myoepithelial (MEP). In deze vergelijking is er opnieuw een duidelijke wCDI-verdeling die de twee primaire celtypen onderscheidt, wat aangeeft dat LEP-cellen zachter zijn dan MEP-cellen. Naast wCDI kunnen hersteltijden ook worden gekwantificeerd om een relatieve indicator van de celviscositeit te geven. Een langere hersteltijd duidt op een stroperiger fenotype. Figuur 5D toont de hersteltijden, onderverdeeld in drie verschillende categorieën, voor elk van de omstandigheden in figuren 5A-C. Onbehandelde MCF-10A's en MCF-7's hebben een groter aandeel cellen die onmiddellijk herstellen (ΔTr = 0), wat wijst op een lagere viscositeit dan hun met latrunculine behandelde tegenhanger.
wCDI en hersteltijd zijn relatieve maatstaven voor eencellige elasticiteit en viscositeit. Daarom is de hier gepresenteerde methode het meest geschikt om de differentiële respons tussen meerdere steekproeven van belang te karakteriseren. In zijn huidige vorm biedt het hier gepresenteerde protocol geen absolute kwantificeringen van gedefinieerde mechanische parameters, zoals de modulus van Young.
Figuur 1: Overzicht van het mechanofenotyperingsplatform. (A) Afbeelding van het microfluïdische apparaat. (B) Kanaalgeometrie, met een representatieve stroompuls van een enkele celtransitgebeurtenis. ΔInp vertegenwoordigt de stroomdruppel van de cel die de porie binnenkomt, en ΔIc vertegenwoordigt de stroomdruppel van de cel die de contractie binnenkomt. ΔTp vertegenwoordigt de tijd die de cel nodig heeft om de porie te passeren, ΔTc vertegenwoordigt de tijd die de cel nodig heeft om het contractiekanaal te passeren en ΔTr vertegenwoordigt de tijd die nodig is voor de cel om te herstellen. (C) Reële stroompuls van een celdoorgangsgebeurtenis. (D) Experimentele workflow: (1) cellen worden gesuspendeerd in PBS en (2) met constante druk door het microfluïdische apparaat gedreven. Terwijl de cellen het microfluïdische kanaal passeren, (3) worden stroompulsen gemeten met behulp van data-acquisitiehardware. (4) De huidige pulsen worden geanalyseerd om meerdere eencellige mechanische eigenschappen te extraheren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Overzicht van de fabricage van apparaten. (A) Negatieve mastermalen worden (1) vervaardigd met behulp van fotolithografie. (2) PDMS wordt vervolgens op de negatieve master mallen gegoten. (3) De gegoten apparaten zijn in blokjes gesneden, met inlaat- en uitlaatgaten geponst. (B) Tegelijkertijd hebben glazen dia's (1) een patroon om metalen elektroden te fabriceren. (2) E-beam verdamping wordt gebruikt om metaal op de glijbaan te deponeren, gevolgd door een (3) lift-off proces om overtollig metaal te verwijderen, waardoor de gewenste metalen elektroden achterblijven. (C) Het PDMS-apparaat en glas met metalen elektroden worden vervolgens aan elkaar gebonden met behulp van zuurstofplasma om het fabricageproces te voltooien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Gegevensverwerking en -analyse. (A) Ruwe actuele gegevens (links) worden voorbewerkt (rechts) door een rechthoekige afvlakfunctie en een low-pass filter toe te passen, gevolgd door resampling naar een lagere samplefrequentie. Het basisstroomsignaal wordt vervolgens voorzien van asymmetrische kleinste kwadraten die26 afvlakken. (B) De tijdspunten aan het begin en het einde van elke subpulse worden geïdentificeerd als respectievelijk lokale minima en maxima in het verschilsignaal ∂I/∂t (links). Voor elke subpulse wordt de breedte Δt bepaald door de verstreken tijd tussen het begin en het einde, en de amplitude ΔI wordt bepaald door het gemiddelde verschil tussen de gemeten stroom en de basislijnstroom. De geëxtraheerde subpulsegegevens kunnen worden weergegeven als een rechthoekig signaal (rechts); elke subpulse komt overeen met één segment in de geometrie van het apparaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Voorbeelden van succesvolle en gebrekkige resultaten tijdens fabricage en experimenten. (A) Afbeeldingen van PDMS-afgietsels van contractiesegmenten afkomstig van twee verschillende negatieve-master mallen. (i) is een voorbeeld van een goed gefabriceerd kanaal met gladde zijwanden, goed gedefinieerde geometrie en geen merkbare defecten. (ii) is een voorbeeld van een slecht gefabriceerd kanaal met significante defecten in het contractiekanaal (omlijnd in rode rechthoeken), dat de deeltjesstroom geheel of gedeeltelijk zou belemmeren (schaalstaven = 150 μm). (B) Voorbeelden van gefilterde stroompulsen gegenereerd door "NPS.m" tijdens data-acquisitie. i) Voorbeeld van een succesvolle celgebeurtenis, waarbij een cel het kanaal passeert zoals bedoeld. ii) Voorbeeld van stroompulsen die worden geproduceerd wanneer het apparaat "verstopt" is. In dit geval belemmert puin de celstroom in de tweede porie van het kanaal. Dit leidt tot celgebeurtenissen die halverwege de tweede maatpuls "afgesneden" lijken (aangegeven door de rode lijn). De afname van de stroom (aangegeven door de blauwe lijnen) na de "cut off" wordt veroorzaakt door deeltjes (puin of cellen) die zich rond de blokkade ophopen en daardoor een groter deel van de stroom blokkeren. Een scherpe neerwaartse piek in de stroom (aangegeven door de groene rechthoek) weerspiegelt een deeltje dat in staat is om rond de blokkade te passeren en daarom slechts tijdelijk een groter deel van de stroom blokkeert. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Voorbeelden van wCDI en celherstel tussen verschillende omstandigheden. (A) wCDI-verdeling tussen twee borstepitheelcellijnen, niet-maligne MCF-10A en maligne MCF-7. B) wCDI van MCF-10A of MCF-7, waarbij elk celtype onbehandeld was, behandeld met Lat-A en behandeld met Lat-B. (C) wCDI-verdeling tussen twee primaire humane borstepitheelsublijnen: myoepitheliale (MEP) en luminale epitheliale (LEP) cellen. (D) Hersteltijden die overeenkomen met de vier voorwaarden tussen A, B en C. Hersteltijden werden in de prullenbak gegooid voor het gemak van het bekijken. Alle omstandigheden hadden een steekproefgrootte van n = 99 cellen. Deze figuur is gereproduceerd met toestemming van Kim et al.2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Voorbeelden van apparaatarrays voor zowel de microfluïdische kanalen als de elektroden. Beide afbeeldingen, weergegeven als de transparantiemaskers, moeten worden ontworpen met wit (dat transparant vertegenwoordigt) in de regio's waar de fotoresist wordt blootgesteld aan UV en zwart in de regio's waar deze wordt geblokkeerd door UV-blootstelling. (A) Een array van microfluïdische kanalen, met twee parallelle kanalen per "apparaat" (rechthoek), gerangschikt op een 3 in Si wafer. Het apparaat uiterst rechts is gelabeld als "ref" en is ontworpen, zoals beschreven in stap 1.3, voor gebruik bij kalibratie. (B) Een reeks elektroden, met twee elektroden per apparaat, zodat beide kanalen in een apparaat van (A) vanaf (B) over elk elektrodeontwerp worden uitgelijnd. Deze array was ingericht voor een 2 in x 3 in glazen schuif. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Schema's die gebieden van het elektrodeontwerp illustreren en hoe goud correct kan worden weggeëtst (stap 2.1.2.3). De bovenste laag goud moet uit de meetelektroden worden verwijderd, anders zullen tijdens de meting biofouling en elektrolyse optreden. Goud moet echter op de contactpads blijven, omdat het zachte goud zorgt voor een superieure elektrische verbinding met de pinnen van de pogo-pinconnector. (A) Schematisch dat laat zien hoe het microfluïdische kanaal (in blauw) kruist met het patroonmetaal (zwart). Zoals aangegeven, het metaal loodrecht op het microfluïdische kanaal en direct daaronder bevinden zich de meetelektroden, waar goud moet worden geëtst, terwijl de grote metalen rechthoeken aan de zijkant van het kanaal de contactkussens zijn, waar goud moet blijven. (B) Schematische weergave waar goudetsmiddel op het metaal met patroon moet worden aangebracht en waar niet. Het groene gebied geeft aan waar etsen nodig is, het gele gebied geeft aan waar etsen kan voorkomen en heeft geen invloed op de effectiviteit van het apparaat, en het rode gebied geeft aan waar goud niet mag worden geëtst. (C) Schematische weergave van een typisch, met succes geëtst apparaat. Geel geeft gebieden aan waar goud nog aanwezig is en grijs geeft gebieden aan waar de platinalaag is blootgesteld. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: Afbeeldingen van succesvol en slecht gefabriceerde contractiekanalen. (A) Afbeeldingen van samentrekkingskanalen op negatieve master mallen van twee individuele Si-wafers. (i) Een voorbeeld van een goed gefabriceerde mastermal die een ideaal PDMS-kanaal zou produceren zoals weergegeven in figuur 4Ai. (ii) Een voorbeeld van een slecht gefabriceerde mastermal, die werd gebruikt om het PDMS-kanaal te maken dat in figuur 4Aii wordt weergegeven. De in rode rechthoeken geschetste gebieden komen overeen met de defecten die zijn aangegeven in figuur 4Aii, wat de overdracht van defecten van de hoofdmal naar de PDMS-microkanalen aantoont (schaalbalken = 150 μm). (B) Afbeeldingen van de doorsnede van PDMS-contractiekanalen, die de hoogte en breedte van verschillende mallen weergeven. Deze doorsneden werden verkregen door het PDMS-contractiekanaal loodrecht op de stroomrichting te snijden. (i) Een voorbeeld van een goed gefabriceerde PDMS-mal gemaakt met behulp van de wafer weergegeven in (Ai), die gladde verticale zijwanden demonstreert. (ii) Een voorbeeld van een slecht gefabriceerde PDMS-mal gemaakt met behulp van de wafer weergegeven in (Aii) met schuine zijwanden (schaalbalken = 20 μm). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 4: Voorbeeld van een toevallige celgebeurtenis (geproduceerd wanneer meer dan één cel tegelijkertijd het kanaal passeert). Het signaal werd verwerkt volgens stappen 5.1.1-5.1.3 in paragraaf 5 van het protocol. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 5: Relatie tussen wCDI en de elastische modulus 20,29,30,31,32,33,34,35. (A) Vergelijking van Jurkat-, MCF7- en MCF10A-cellen gemeten met deze techniek versus micropipette-aspiratie. wCDI is omgekeerd evenredig met corticale spanning. (B) Vergelijking van MCF7- en MCF10A-cellen gemeten met deze techniek versus gepubliceerde AFM-gegevens. (C) Vergelijking van A549- en BEAS-2B-cellen gemeten met deze techniek met gepubliceerde AFM-gegevens. Over meerdere celtypen is wCDI omgekeerd evenredig met elastische modulus. Deze figuur is gereproduceerd met toestemming van Kim et al.2. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 1: Voorbeelden van eencellige mechanofenotyperingstechnieken en hoe deze zich verhouden tot mechano-NPS. Technieken worden vermeld in volgorde van verhoging van de doorvoer 12,2,36,37. Mechanische informatie verwijst naar de vraag of het apparaat zowel de elastische als de viskeuze mechanische eigenschappen van elke cel kan meten. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende tabel 2: Voorbeeld van grootte-, contractie- en herstelsegmentbreedten voor verschillende cellijnen. MEP en LEP verwijzen naar twee afstammingslijnen van primaire menselijke borstepitheelcellen, waarbij MEP verwijst naar myoepitheliale cellen en LEP verwijst naar luminale epitheelcellen 2,8. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullend bestand 1: Voorbeeld van autoCAD-ontwerp. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 2: Voorbeeldprotocol voor fotolithografieverwerking. Er worden twee voorbeeldprotocollen geschetst voor het patroon en de verwerking van fotoresist of SU-8 epoxy. De eerste beschrijft de toepassing van positieve fotoresist op een glazen dia om te fungeren als een opofferingslaag voor elektrodefabricage. De tweede beschrijft de toepassing van SU-8 epoxy op een silicium wafer om reliëfstructuren te creëren voor het vormen van PDMS microfluïdische kanalen. Deze protocollen zijn aangepast van MF-321 en SU8 3000 datasheets van de fabrikant. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 3: Voorbeeldprotocol voor dunnefilmdepositie van 75 Å Ti, 250 Å Pt en 250 Å Au met behulp van elektronenbundelverdamping. Een voorbeeldprotocol voor het uitvoeren van dunne filmafzetting van 75 Å Ti, 250 Å Pt en 250 Å Au met behulp van een elektronenbundelverdamper wordt geschetst. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 4: GERBER-bestanden Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 5: Schematische, bord- en PCB-onderdelenlijstbestanden Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 6: MATLAB-opdrachtregelinterface. Dit bestand bevat gedetailleerde instructies voor gegevensverwerking met behulp van de MATLAB-opdrachtregelinterface26. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het meten van de mechanische eigenschappen van afzonderlijke cellen met behulp van deze mechanofenotyperingstechniek bestaat uit drie fasen: apparaatfabricage, gegevensverzameling en gegevensanalyse. Binnen elke fase zijn er opmerkelijke aspecten die de experimentele resultaten aanzienlijk kunnen beïnvloeden. Tijdens de fabricage van het apparaat zijn consistente kanaalgeometrieën en uniformiteit van apparaat tot apparaat essentieel voor nauwkeurige en herhaalbare resultaten. In het bijzonder moeten de zijwanden van elk apparaat relatief glad zijn (figuur 4Ai) en moeten de kanaalhoogten tussen replicerende apparaten vergelijkbaar zijn. Alle apparaten met defecten die de celstroom gedeeltelijk belemmeren, met name in het contractiekanaal (figuur 4Aii), moeten worden weggegooid. Het gebruik van apparaten met waarneembare defecten in de kanaalgeometrie zal resulteren in onnauwkeurige en niet-produceerbare resultaten. Tijdens data-acquisitie is het van vitaal belang dat de gebruiker de aanwezigheid van een verstopping in het kanaal tijdens het verzamelen van gegevens kan herkennen. Een voorbeeldscript, "NPS.m" (beschikbaar op https://github.com/sohnlab/node-pore-sensing-public), geeft actuele metingen weer, zodat de gebruiker de kanaalconditie en celtransitgebeurtenissen in realtime kan volgen. Pulsen die kenmerkend zijn voor een verstopping zijn weergegeven in figuur 4B. Een verstopping in het contractiekanaal waardoor sommige cellen nog steeds kunnen stromen, is bijzonder belangrijk om aan te pakken, omdat cellen een verhoogde spanning zullen ervaren op de locatie van de obstructie, wat resulteert in onnauwkeurige wCDI's. Ten slotte moeten gebruikers tijdens data-analyse ijverig zijn in het kiezen van nauwkeurige drempels als input voor het analysealgoritme. Als de drempels te hoog zijn ingesteld, zal het programma geen gebeurtenissen identificeren die door kleinere cellen worden geproduceerd, waardoor de resultaten worden scheefgetrokken en de gemeten celpopulatie verkeerd wordt voorgesteld.
Naast deze kritieke stadia zijn er aanvullende aspecten van het protocol die mogelijk moeten worden aangepast bij het bestuderen van verschillende celtypen of -omstandigheden. Als u deze techniek bijvoorbeeld toepast op monsters die aanzienlijk kleiner zijn dan de eerder bestudeerde monsters, zijn smallere contractiekanalen nodig. Het fabriceren van smallere kanalen kan duurdere fabricagemethoden vereisen, zoals elektronenbundellithografie38. Bovendien, omdat ΔI / I ~ Δ V-cel / ΔV-contractie (waarbijV-cel enV-contractie respectievelijk de volumes van de vervormde cel en het kanaal zijn), resulteren smallere kanalen in grotere basislijnweerstanden en verminderde SNR19. Ten slotte kunnen smalle kanalen het risico op verstopping verhogen, waardoor experimentele uitvoering uitdagender wordt. Dit specifieke probleem kan mogelijk worden verholpen door meer inlaatfilters te gebruiken.
Een beperking van deze techniek is het statische contractiekanaal, dat slechts één gemiddelde stam kan toepassen op een populatie cellen. Om de vervormbaarheid van cellen met verschillende groottes te vergelijken, of om een enkele celpopulatie bij verschillende toegepaste stammen te onderzoeken, moeten meerdere apparaten met verschillende contractiekanaalbreedtes worden gebruikt. Het platform wordt ook beperkt door zijn PDMS-wanden, die het bereik van stijfheid beperken dat het kan meten. Sommige zeer stijve plantencellen zijn bijvoorbeeld stijver dan de PDMS-wanden waarvan verwacht zou worden dat ze39,40 zouden vervormen. Bovendien kan de druk die nodig is om dergelijke stijve deeltjes door het contractiekanaal te duwen, de sterkte van de binding tussen de PDMS en de glasschuif overwinnen, wat leidt tot delaminatie. Men zou echter microfluïdische kanalen kunnen fabriceren tot stijvere materialen zoals glas of silicium, om zo deze beperkingen te overwinnen. Ondanks deze kleine beperkingen blijft dit platform ideaal voor mechanische metingen van cellen met matige doorvoer. In vergelijking met andere methodieken, zoals optische brancards of AFM, maakt deze techniek een hogere doorvoer mogelijk. In vergelijking met andere microfluïdische technologieën met matige tot hoge doorvoer, zoals RT-DC, is deze techniek in staat om meer biofysische eigenschappen te onderzoeken door zowel de viskeuze als elastische eigenschappen van afzonderlijke cellen te meten. Ten slotte maakt de eenvoudige experimentele opstelling, met behulp van goedkope elektronica in tegenstelling tot complexe optica, deze techniek een zeer toegankelijke technologie.
Over het algemeen is deze mechanofenotyperingstechniek een enorme belofte als een hulpmiddel voor tal van potentiële studies en toepassingen. Het is eerder toegepast op een diverse reeks celtypen, waaronder primaire monsters, en heeft zijn effectiviteit aangetoond bij het meten van de impact van cytoskeletale en nucleaire componenten op cellulaire visco-elastische eigenschappen 2,8. Bovendien, omdat cellen levensvatbaar blijven na screening met dit platform2, hebben onderzoekers de mogelijkheid om downstream-analyse uit te voeren. Dit platform is ook ideaal voor koppeling met upstream microfluïdische celsortering, waardoor het zich leent voor toepassingen zoals het meten van circulerende tumorcellen. Vooruitblikkend, blijft dit platform een concurrerend en veelzijdig hulpmiddel voor multivariabele mechanische metingen van enkele cellen, met toepassingen in het begrijpen van celgedrag41, het bepalen van ziekteprogressie42 en het monitoren van medicijnrespons43. Naast fundamenteel wetenschappelijk onderzoek is deze techniek ook veelbelovend als klinisch hulpmiddel, met name een goedkoop, benchtop-platform voor snelle diagnostische screening. Bovendien is deze techniek, gezien de lage vermogensvereisten en de minimale behoefte aan monstervoorbereiding voorafgaand aan de meting, bijzonder geschikt voor omgevingen met weinig middelen, waar toegankelijke diagnostische instrumenten hard nodig zijn44.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
L. L. S heeft het Amerikaanse patent nr. 11.383.241: "Mechano-node-pore sensing", J. Kim, S. Han en L. L. Sohn, uitgegeven op 12 juli 2022.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van NIBIB 1R01EB024989-01 en NCI 1R01CA190843-01. A. L. en R. R. werden ondersteund door een H2H8 Association Graduate Research Fellowship. K. L. C. werd ondersteund door een National Science Foundation Graduate Research Fellowship en een Siebel Scholar Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | J.T. Baker | 5356-05 | Purity (GC) ≥ 99.5% (https://us.vwr.com/store/product/6057739/acetone-99-5-vlsi-j-t-baker) |
| Aluminum Foil | n/a | n/a | |
| Analog Low-Pass Filter | ThorLabs | EF504 | ≤240 kHz Passband, Coaxial BNC Feedthrough (https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=EF504#ad-image-0) |
| Biopsy Punch | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | 1mm, Disposable, with Plunger (https://mms.mckesson.com/product/573313/Miltex-33-31AA-P25) |
| Blade | n/a | n/a | |
| BNC Cable | Pomona Electronics | 2249-C-12 | https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/2249-C-12/603323?utm_adgroup=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&utm_source=google&utm_ medium=cpc&utm_campaign= Shopping_Product_Cable%20Assemblies_NEW&utm_term= &utm_content=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&gclid=Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO2sErQqnVJ pj5OXVObuTI8ZUf1ZeIn7zvzGnx mCWdePrG6SdEJMF3X6ubUaAs w-EALw_wcB |
| Cleanroom Polyester Swab | Thermo Fisher Scientific | 18383 | https://www.fishersci.com/shop/products/texwipe-cleantip-alpha-polyester-series-swabs-6/18383 |
| Current Preamplifier | DL Instruments | 1211 | https://www.brltest.com/index.php?main_page=product_info&products_ id=1419 |
| Custom PCB (w/ components) | n/a | n/a | see Supplemental files 4 and 5 |
| DAQ Terminal Block | National Instruments | BNC-2120 | https://www.ni.com/en-in/support/model.bnc-2120.html |
| DAQ to BNC-2110 cable | National Instruments | SHC68-68-EPM | https://www.ni.com/en-in/support/model.shc68-68-epm.html |
| Data Acquisition Board (DAQ) | National Instruments | PCI-6251 | https://www.ni.com/docs/en-US/bundle/pci-6251-feature/page/overview.html |
| Dessicator | Thermo Fisher Scientific | 5311-0250 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/5311-0250 |
| Female BNC To Banana Plug Adapter | Pomona Electronics | 72909 | https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/72909/1196318 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-186 | https://us.vwr.com/store/product/18706419/avantor-seradigm-select-grade-usda-approved-origin-fetal-bovine-serum-fbs |
| Glass Cutter | Chemglass | CG-1179-21 | https://chemglass.com/plate-glass-cutters-diamond-tips |
| Gold Etchant TFA | Transene | NC0977944 | https://www.fishersci.com/shop/products/NC0977944/NC0977944 |
| Hot Plate | Thermo Fisher Scientific | SP131825 | |
| Isopropyl Alcohol | Spectrum Chemical | I1056-4LTPL | Purity (GC) ≥99.5% (https://www.spectrumchemical.com/isopropyl-alcohol-99-percent-fcc-i1056) |
| Metal Hardware Enclosure | Hammond Manufacturing | EJ12126 | https://www.digikey.com/en/products/detail/hammond-manufacturing/EJ12126/2423415 |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Purity (GC) ≥99.8% (https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/substance/methanol320467561) |
| MF-321 Developer | Kayaku Advanced Materials | n/a | https://kayakuam.com/products/mf-321/ |
| MICROPOSIT S1813 Positive Photoresist | DuPont | n/a | https://kayakuam.com/products/microposit-s1800-g2-series-photoresists/ |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010049?SID=srch-hj-10010049 |
| Photomask | Fineline Imaging | n/a | Photomask are custom ordered from our CAD designs (https://www.fineline-imaging.com/) |
| Plain Glass Microscope Slide | Fisher Scientific | 12-553-5B | Material: Soda Lime, L75 x W50 mm, Thickness: 0.90–1.10 mm |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | https://harrickplasma.com/plasma-cleaners/expanded-plasma-cleaner/ |
| Plastic Petri Dish | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | 100 mm (https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-raised-ridge-100-x-15mm/FB0875712) |
| Pressure Controller | Fluigent | MFCS-EZ | https://www.fluigent.com/research/instruments/pressure-flow-controllers/mfcs-series/ |
| Pressure Controller Software | Fluigent | MAESFLO | |
| Programming & Computation Software | MATLAB | R2021b | for data acquisition and analysis (https://www.mathworks.com/products/matlab.html) |
| PTFE Tubing | Cole Parmer | 06417-31 | 0.032" ID x 0.056" (https://www.coleparmer.com/i/masterflex-transfer-tubing-microbore-ptfe-0-032-id-x-0-056-od-100-ft-roll/0641731) |
| Scepter 2.0 Handheld Automatic Cell Counter | Millapore Sigma | PHCC20060 | https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/mm/phcc20060 |
| Silicon Wafer | Wafer World | 2885 | 76.2 mm, Single Side Polished (https://www.waferworld.com/product/2885) |
| Spin Coater | n/a | n/a | |
| SU-8 3025 Negative Photoresist | Kayaku Advanced Materials | n/a | https://kayakuam.com/products/su-8-2000/ |
| SU8 Developer | Kayaku Advanced Materials | n/a | https://kayakuam.com/products/su-8-developer/ |
| Sygard 184 Polydimethlysiloxane | Dow Chemical | 4019862 | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Tape | Scotch | 810-341296 | https://www.staples.com/Scotch-Magic-Tape-810-3-4-x-36-yds-1-Core/product_130567?cid=PS:GS:SBD:PLA:OS&gclid= Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO 2sErRwzrrgjU0NjFkDkne1xm vT7ekS3tdzvAgiMDwPoxocgH VTQZi7vJgaAvQZEALw_wcB |
| Titanium, Platinum, Gold | n/a | n/a | |
| Triple Output Power Supply | Keysight | E36311A | https://www.newark.com/keysight-technologies/e36311a/dc-power-supply-3o-p-6v-5a-prog/dp/15AC9653 |
| UV Mask Aligner | Karl Suss America | MJB3 Mask Aligner |
References
- Pegoraro, A. F., Janmey, P., Weitz, D. A. Mechanical properties of the cytoskeleton and cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (11), 022038 (2017).
- Kim, J., et al. Characterizing cellular mechanical phenotypes with mechano-node-pore sensing. Microsystems & Nanoengineering. 4, 17091 (2018).
- Mierke, C. T. Bidirectional mechanical response between cells and their microenvironment. Frontiers in Physics. 9, 619 (2021).
- Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, and metastasis: The force journey of a tumor cell. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1), 113-127 (2009).
- Nia, H. T., Munn, L. L., Jain, R. K.
- Fletcher, D. A., Mullins, R. D.
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: The role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
- Li, B., et al. Mechanical phenotyping reveals unique biomechanical responses in retinoic acid-resistant acute promyelocytic leukemia. iScience. 25 (2), 103772 (2022).
- Kozminsky, M., Sohn, L. L. The promise of single-cell mechanophenotyping for clinical applications. Biomicrofluidics. 14 (3), 031301 (2020).
- Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic force microscopy in characterizing cell mechanics for biomedical applications: A review. IEEE Transactions on Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
- Wottawah, F., et al.
- Darling, E. M., Di Carlo, D. High-throughput assessment of cellular mechanical properties. Annual Review of Biomedical Engineering. 17 (1), 35-62 (2015).
- Carey, T. R., Cotner, K. L., Li, B., Sohn, L. L. Developments in label-free microfluidic methods for single-cell analysis and sorting. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 11 (1), 1529 (2019).
- Bagnall, J. S., et al. Deformability of tumor cells versus blood cells. Scientific Reports. 5, 18542 (2015).
- Byun, S., et al. Characterizing deformability and surface friction of cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).
- Otto, O., et al. Real-time deformability cytometry: On-the-fly cell mechanical phenotyping. Nature Methods. 12 (3), 199-202 (2015).
- Gossett, D. R., et al. Hydrodynamic stretching of single cells for large population mechanical phenotyping. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (20), 7630-7635 (2012).
- Guck, J., Chilvers, E. R.
- Balakrishnan, K. R., et al. Node-pore sensing: A robust, high-dynamic range method for detecting biological species. Lab on a Chip. 13 (7), 1302-1307 (2013).
- Carbonaro, A., Sohn, L. L. A resistive-pulse sensor chip for multianalyte immunoassays. Lab on a Chip. 5 (10), 1155-1160 (2005).
- Saleh, O. A., Sohn, L. L. Direct detection of antibody-antigen binding using an on-chip artificial pore. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (3), 820-824 (2003).
- Saleh, O. A., Sohn, L. L. An artificial nanopore for molecular sensing. Nano Letters. 3 (1), 37-38 (2003).
- Saleh, O. A., Sohn, L. L. Quantitative sensing of nanoscale colloids using a microchip Coulter counter. Review of Scientific Instruments. 72 (12), 4449-4451 (2001).
- DeBlois, R. W., Bean, C. P. Counting and sizing of submicron particles by the resistive pulse technique. Review of Scientific Instruments. 41 (7), 909-916 (1970).
- Li, B., et al. Evaluating sources of technical variability in the mechano-node-pore sensing pipeline and their effect on the reproducibility of single-cell mechanical phenotyping. PLoS ONE. 16 (10), 0258982 (2021).
- Zhang, Z. M., Chen, S., Liang, Y. Z. Baseline correction using adaptive iteratively reweighted penalized least squares. Analyst. 135 (5), 1138-1146 (2010).
- Alibert, C., Goud, B., Manneville, J. B. Are cancer cells really softer than normal cells. Biology of the Cell. 109 (5), 167-189 (2017).
- Fujiwara, I., Zweifel, M. E., Courtemanche, N., Pollard, T. D. Latrunculin A accelerates actin filament depolymerization in addition to sequestering actin monomers. Current Biology. 28 (19), 3183-3192 (2018).
- Saleh, O. A. A novel resistive pulse sensor for biological measurements. , Princeton University. Princeton. PhD Thesis (2003).
- Dokukin, M. E., Guz, N. V., Sokolov, I. Quantitative study of the elastic modulus of loosely attached cells in AFM indentation experiments. Biophysical Journal. 104 (10), 2123-2131 (2013).
- Li, Q., et al. Probing the elasticity of breast cancer cells using AFM. 13th International Conference on Biomedical Engineering. IFMBE Proceedings. Lim, C. T., Goh, J. C. H. 23, Springer. Berlin, Heidelberg. 2122-2125 (2009).
- Rother, J., et al. Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines. Open Biology. 4 (5), 140046 (2014).
- Li, Q., et al. AFM indentation study of breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (4), 609-613 (2008).
- Xu, C., et al. Elasticity measurement of breast cancer cells by atomic force microscopy. Proc. SPIE 9230. Twelfth International Conference on Photonics and Imaging in Biology and Medicine. (PIBM 2014). 92300, (2014).
- Alcaraz, J., et al. Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 84 (3), 2071-2079 (2003).
- Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic force microscopy in characterizing cell mechanics for biomedical applications: A review. IEEE Transactions on Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
- Urbanska, M., et al. A comparison of microfluidic methods for high-throughput cell deformability measurements. Nature Methods. 17, 587-593 (2020).
- Hill, R. T., Chilkoti, A. Surface Patterning. Biomaterials Science: An Introduction to Materials: Third Edition. , Elsevier Academic Press. NY. 276-301 (2013).
- Wang, Z., Volinsky, A. A., Gallant, N. D. Crosslinking effect on polydimethylsiloxane elastic modulus measured by custom-built compression instrument. Journal of Applied Polymer Science. 131 (22), 41050 (2014).
- Gibson, L. J. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society Interface. 9 (76), 2749-2766 (2012).
- Stephens, A. D., Banigan, E. J., Adam, S. A., Goldman, R. D., Marko, J. F. Chromatin and lamin a determine two different mechanical response regimes of the cell nucleus. Molecular Biology of the Cell. 28 (14), 1984-1996 (2017).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Force microscopy of nonadherent cells: A comparison of leukemia cell deformability. Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).
- Evers, T. M. J., Holt, L. J., Alberti, S., Mashaghi, A. Reciprocal regulation of cellular mechanics and metabolism. Nature Metabolism. 3 (4), 456-468 (2021).
- Balakrishnan, K. R., et al. Node-pore sensing enables label-free surface-marker profiling of single cells. Analytical Chemistry. 87 (5), 2988-2995 (2015).
