Hier wordt een methode gepresenteerd om afzonderlijke cellen mechanisch te fenotyperen met behulp van een op elektronica gebaseerd microfluïdisch platform dat mechano-node-pore sensing (mechano-NPS) wordt genoemd. Dit platform handhaaft een gematigde doorvoer van 1-10 cellen / s terwijl het zowel de elastische als viskeuze biofysische eigenschappen van cellen meet.
Cellulaire mechanische eigenschappen zijn betrokken bij een breed scala aan biologische processen en ziekten, variërend van stamceldifferentiatie tot kankermetastase. Conventionele methoden voor het meten van deze eigenschappen, zoals atoomkrachtmicroscopie (AFM) en micropipette-aspiratie (MA), vangen rijke informatie op, die de volledige visco-elastische respons van een cel weerspiegelt; deze methoden worden echter beperkt door een zeer lage doorvoer. High-throughput benaderingen, zoals real-time deformability cytometry (RT-DC), kunnen slechts beperkte mechanische informatie meten, omdat ze vaak beperkt zijn tot single-parameter uitlezingen die alleen de elastische eigenschappen van een cel weerspiegelen. In tegenstelling tot deze methoden is mechano-node-pore sensing (mechano-NPS) een flexibel, labelvrij microfluïdisch platform dat de kloof overbrugt in het bereiken van multi-parameter visco-elastische metingen van een cel met matige doorvoer. Een gelijkstroom (DC) meting wordt gebruikt om cellen te monitoren terwijl ze een microfluïdisch kanaal passeren en hun grootte en snelheid volgen voor, tijdens en nadat ze door een smalle vernauwing worden gedwongen. Deze informatie (d.w.z. grootte en snelheid) wordt gebruikt om de transversale vervorming van elke cel, weerstand tegen vervorming en herstel van vervorming te kwantificeren. Over het algemeen biedt dit op elektronica gebaseerde microfluïdische platform meerdere visco-elastische celeigenschappen en dus een completer beeld van de mechanische toestand van een cel. Omdat het minimale monstervoorbereiding vereist, een eenvoudige elektronische meting gebruikt (in tegenstelling tot een hogesnelheidscamera) en profiteert van standaard zachte lithografiefabricage, is de implementatie van dit platform eenvoudig, toegankelijk en aanpasbaar aan downstream-analyse. De flexibiliteit, bruikbaarheid en gevoeligheid van dit platform hebben unieke mechanische informatie opgeleverd over een breed scala aan cellen, met het potentieel voor veel meer toepassingen in de basiswetenschap en klinische diagnostiek.
Enkele cellen zijn dynamische, visco-elastische materialen1. Een veelheid aan interne en externe processen (bijv. het begin van mitose of remodellering van de extracellulaire matrix [ECM]), beïnvloeden hun structuur en samenstelling 2,3,4, wat vaak resulteert in verschillende biofysische eigenschappen die hun huidige toestand aanvullen. In het bijzonder is aangetoond dat mechanische eigenschappen belangrijke biomarkers zijn van cellulaire ontwikkeling, fysiologie en pathologie, wat waardevolle kwantitatieve informatie oplevert die canonieke moleculaire en genetische benaderingen kan aanvullen 5,6,7. Li et al. beschreven bijvoorbeeld onlangs de mechanische verschillen tussen geneesmiddelresistente en geneesmiddelresponsieve acute promyelocytaire leukemiecellen, terwijl ze ook RNA-seq gebruikten om differentieel tot expressie gebracht cytoskelet-geassocieerde genen te ontdekken8. Door het complexe samenspel tussen eencellige mechanica en cellulaire functie te begrijpen, heeft mechanofenotypering bredere toepassingen bij het transformeren van basiswetenschap en klinische diagnostiek9.
Het meest gebruikte hulpmiddel voor het meten van eencellige mechanica is atoomkrachtmicroscopie (AFM). Hoewel AFM een gelokaliseerde meting van cellulaire mechanische eigenschappen met hoge resolutie mogelijk maakt, blijft deze beperkt tot een doorvoer van <0,01 cellen /s10. Als alternatief zijn optische brancards, die twee divergente laserstralen gebruiken om gesuspendeerde enkele cellen11 te vangen en te vervormen, beperkt tot marginaal hogere doorvoersnelheden van <1 cel / s12. Recente ontwikkelingen in microfluïdische technologieën hebben een nieuwe generatie apparaten mogelijk gemaakt voor snelle, eencellige, mechanische beoordeling 12,13. Deze technieken maken gebruik van smalle vernauwingskanalen14,15, schuifstroom16 of hydrodynamischuitrekken van 17 om cellen snel te vervormen bij doorvoersnelheden van 10-1.000 cellen / s18. Hoewel de meetsnelheid van deze benaderingen aanzienlijk sneller is dan conventionele technieken, ruilen ze vaak high-throughput-mogelijkheden in voor beperkte mechanische uitlezingen (aanvullende tabel 1). Alle bovengenoemde snelle microfluïdische methoden richten zich op basisstatistieken met één parameter, zoals transittijd of vervormbaarheidsverhoudingen, die alleen de elastische eigenschappen van een cel weerspiegelen. Gezien de intrinsieke visco-elastische aard van afzonderlijke cellen, vereist een robuuste en grondige mechanische karakterisering van cellen echter niet alleen aandacht voor elastische componenten, maar ook voor viskeuze reacties.
Mechano-node-pore sensing (mechano-NPS)2,8 (Figuur 1A) is een microfluïdisch platform dat bestaande beperkingen met eencellige mechanofenotypering aanpakt. Deze methode maakt het mogelijk om meerdere biofysische parameters tegelijkertijd te meten, waaronder celdiameter, relatieve vervormbaarheid en hersteltijd van vervorming, met een matige doorvoer van 1-10 cellen / s. Deze techniek is gebaseerd op node-pore sensing (NPS)19,20,21,22,23,24, waarbij een vierpunts sondemeting wordt gebruikt om de gemoduleerde stroompuls te meten die wordt geproduceerd door een cel die een microfluïdisch kanaal passeert dat is gesegmenteerd door bredere regio’s, aangeduid als “knooppunten”. De gemoduleerde stroompuls is het gevolg van het feit dat de cel de stroomstroom in de segmenten (d.w.z. “poriën”) en knooppunten gedeeltelijk blokkeert, met meer stroom geblokkeerd in de eerste dan in de laatste. In mechano-NPS is één segment, het “contractiekanaal”, smaller dan een celdiameter; bijgevolg moet een cel vervormen om het hele kanaal te passeren (figuur 1B). De celdiameter kan worden bepaald door de grootte van de subpulse die wordt geproduceerd wanneer de cel de knoopporiën passeert voorafgaand aan het contractiekanaal (figuren 1B, C). Hier is |ΔInp|, de stroomdruppel wanneer de cel zich in de porie bevindt, evenredig met de volumeverhouding van de cel tot de porie, V-cel/V-porie 2,8,19. Celstijfheid kan worden bepaald door ΔTc, de duur van de dramatisch grotere subpulse die wordt geproduceerd wanneer de cel het contractiekanaal passeert (figuren 1B,C). Een stijvere cel zal er langer over doen om het kanaal te passeren dan een zachtere 2,8. Ten slotte kan celherstel, het vermogen van de cel om terug te keren naar zijn oorspronkelijke grootte en vorm na vervorming, worden bepaald door de reeks subpulsen die worden geproduceerd als de cel de knoopporiën passeert na het contractiekanaal (figuren 1B, C). De hersteltijd, ΔTr, is de tijd die nodig is voordat de huidige subpulsen terugkeren naar de grootte van de vorige subpulsen, voordat de cel wordt geperst. Over het algemeen worden de gemoduleerde stroompulsen die worden geproduceerd als een cel het microfluïdische kanaal passeert, geregistreerd en geanalyseerd om de relevante eencellige mechanische parameters te extraheren (figuur 1D) 2,8.
De reproduceerbaarheid en het gebruiksgemak van dit op elektronica gebaseerde microfluïdische platform zijn eerder aangetoond25. Bovendien biedt het platform een lage toetredingsdrempel voor eencellige mechanofenotypering. Standaard zachte lithografie wordt gebruikt om microfluïdische apparaten te fabriceren. De meethardware bestaat uit goedkope componenten, waaronder een eenvoudige printplaat (PCB), voeding, voorversterker, data-acquisitiebord (DAQ) en computer. Ten slotte is er gebruiksvriendelijke code beschikbaar voor data-acquisitie en -analyse, waardoor een eenvoudige implementatie mogelijk is. Deze mechanofenotyperingstechniek kan populaties van niet-kwaadaardige en kwaadaardige borst- en longepitheelcellijnen onderscheiden, onderscheid maken tussen sublijnen in primaire menselijke borstepitheelcellen en de effecten van cytoskeletale verstoringen en andere farmacologische middelen karakteriseren 2,8. Over het algemeen is dit platform een effectieve aanpak voor het mechanofenotyperen van afzonderlijke cellen.
Het meten van de mechanische eigenschappen van afzonderlijke cellen met behulp van deze mechanofenotyperingstechniek bestaat uit drie fasen: apparaatfabricage, gegevensverzameling en gegevensanalyse. Binnen elke fase zijn er opmerkelijke aspecten die de experimentele resultaten aanzienlijk kunnen beïnvloeden. Tijdens de fabricage van het apparaat zijn consistente kanaalgeometrieën en uniformiteit van apparaat tot apparaat essentieel voor nauwkeurige en herhaalbare resultaten. In het bijzonder moeten de zijwanden van el…
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van NIBIB 1R01EB024989-01 en NCI 1R01CA190843-01. A. L. en R. R. werden ondersteund door een H2H8 Association Graduate Research Fellowship. K. L. C. werd ondersteund door een National Science Foundation Graduate Research Fellowship en een Siebel Scholar Fellowship.
Acetone | J.T. Baker | 5356-05 | Purity (GC) ≥ 99.5% (https://us.vwr.com/store/product/6057739/acetone-99-5-vlsi-j-t-baker) |
Aluminum Foil | n/a | n/a | |
Analog Low-Pass Filter | ThorLabs | EF504 | ≤240 kHz Passband, Coaxial BNC Feedthrough (https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=EF504#ad-image-0) |
Biopsy Punch | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | 1mm, Disposable, with Plunger (https://mms.mckesson.com/product/573313/Miltex-33-31AA-P25) |
Blade | n/a | n/a | |
BNC Cable | Pomona Electronics | 2249-C-12 | https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/2249-C-12/603323?utm_adgroup=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&utm_source=google&utm_ medium=cpc&utm_campaign= Shopping_Product_Cable%20Assemblies_NEW&utm_term= &utm_content=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&gclid=Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO2sErQqnVJ pj5OXVObuTI8ZUf1ZeIn7zvzGnx mCWdePrG6SdEJMF3X6ubUaAs w-EALw_wcB |
Cleanroom Polyester Swab | Thermo Fisher Scientific | 18383 | https://www.fishersci.com/shop/products/texwipe-cleantip-alpha-polyester-series-swabs-6/18383 |
Current Preamplifier | DL Instruments | 1211 | https://www.brltest.com/index.php?main_page=product_info&products_ id=1419 |
Custom PCB (w/ components) | n/a | n/a | see Supplemental files 4 and 5 |
DAQ Terminal Block | National Instruments | BNC-2120 | https://www.ni.com/en-in/support/model.bnc-2120.html |
DAQ to BNC-2110 cable | National Instruments | SHC68-68-EPM | https://www.ni.com/en-in/support/model.shc68-68-epm.html |
Data Acquisition Board (DAQ) | National Instruments | PCI-6251 | https://www.ni.com/docs/en-US/bundle/pci-6251-feature/page/overview.html |
Dessicator | Thermo Fisher Scientific | 5311-0250 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/5311-0250 |
Female BNC To Banana Plug Adapter | Pomona Electronics | 72909 | https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/72909/1196318 |
Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-186 | https://us.vwr.com/store/product/18706419/avantor-seradigm-select-grade-usda-approved-origin-fetal-bovine-serum-fbs |
Glass Cutter | Chemglass | CG-1179-21 | https://chemglass.com/plate-glass-cutters-diamond-tips |
Gold Etchant TFA | Transene | NC0977944 | https://www.fishersci.com/shop/products/NC0977944/NC0977944 |
Hot Plate | Thermo Fisher Scientific | SP131825 | |
Isopropyl Alcohol | Spectrum Chemical | I1056-4LTPL | Purity (GC) ≥99.5% (https://www.spectrumchemical.com/isopropyl-alcohol-99-percent-fcc-i1056) |
Metal Hardware Enclosure | Hammond Manufacturing | EJ12126 | https://www.digikey.com/en/products/detail/hammond-manufacturing/EJ12126/2423415 |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Purity (GC) ≥99.8% (https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/substance/methanol320467561) |
MF-321 Developer | Kayaku Advanced Materials | n/a | https://kayakuam.com/products/mf-321/ |
MICROPOSIT S1813 Positive Photoresist | DuPont | n/a | https://kayakuam.com/products/microposit-s1800-g2-series-photoresists/ |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010049?SID=srch-hj-10010049 |
Photomask | Fineline Imaging | n/a | Photomask are custom ordered from our CAD designs (https://www.fineline-imaging.com/) |
Plain Glass Microscope Slide | Fisher Scientific | 12-553-5B | Material: Soda Lime, L75 x W50 mm, Thickness: 0.90–1.10 mm |
Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | https://harrickplasma.com/plasma-cleaners/expanded-plasma-cleaner/ |
Plastic Petri Dish | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | 100 mm (https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-raised-ridge-100-x-15mm/FB0875712) |
Pressure Controller | Fluigent | MFCS-EZ | https://www.fluigent.com/research/instruments/pressure-flow-controllers/mfcs-series/ |
Pressure Controller Software | Fluigent | MAESFLO | |
Programming & Computation Software | MATLAB | R2021b | for data acquisition and analysis (https://www.mathworks.com/products/matlab.html) |
PTFE Tubing | Cole Parmer | 06417-31 | 0.032" ID x 0.056" (https://www.coleparmer.com/i/masterflex-transfer-tubing-microbore-ptfe-0-032-id-x-0-056-od-100-ft-roll/0641731) |
Scepter 2.0 Handheld Automatic Cell Counter | Millapore Sigma | PHCC20060 | https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/mm/phcc20060 |
Silicon Wafer | Wafer World | 2885 | 76.2 mm, Single Side Polished (https://www.waferworld.com/product/2885) |
Spin Coater | n/a | n/a | |
SU-8 3025 Negative Photoresist | Kayaku Advanced Materials | n/a | https://kayakuam.com/products/su-8-2000/ |
SU8 Developer | Kayaku Advanced Materials | n/a | https://kayakuam.com/products/su-8-developer/ |
Sygard 184 Polydimethlysiloxane | Dow Chemical | 4019862 | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
Tape | Scotch | 810-341296 | https://www.staples.com/Scotch-Magic-Tape-810-3-4-x-36-yds-1-Core/product_130567?cid=PS:GS:SBD:PLA:OS&gclid= Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO 2sErRwzrrgjU0NjFkDkne1xm vT7ekS3tdzvAgiMDwPoxocgH VTQZi7vJgaAvQZEALw_wcB |
Titanium, Platinum, Gold | n/a | n/a | |
Triple Output Power Supply | Keysight | E36311A | https://www.newark.com/keysight-technologies/e36311a/dc-power-supply-3o-p-6v-5a-prog/dp/15AC9653 |
UV Mask Aligner | Karl Suss America | MJB3 Mask Aligner |