Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

חישת נקבוביות Mechano-node: פלטפורמה מהירה ונטולת תוויות למדידות ויסקואלסיות של תאים בודדים מרובי פרמטרים

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64665
Automatic Translation
*1, *2, 1, 3, 1,3, 1,2
1Graduate Program in Bioengineering, University of California, Berkeley and University of California, San Francisco, 2Department of Mechanical Engineering, University of California, Berkeley, 3Department of Electrical Engineering and Computer Sciences, University of California, Berkeley
* These authors contributed equally

Summary

מוצגת כאן שיטה לפנוטיפ מכני של תאים בודדים באמצעות פלטפורמה מיקרופלואידית מבוססת אלקטרוניקה הנקראת חישת נקבוביות מכאנו-צומת (mechano-NPS). פלטפורמה זו שומרת על תפוקה מתונה של 1-10 תאים לשנייה תוך מדידת התכונות הביופיזיות האלסטיות והצמיגיות של התאים.

Abstract

תכונות מכניות תאיות מעורבות במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים ומחלות, החל מהתמיינות תאי גזע ועד גרורות סרטניות. שיטות קונבנציונליות למדידת תכונות אלה, כגון מיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM) ושאיפת מיקרופיפטה (MA), לוכדות מידע עשיר, המשקף את התגובה הצמיגית המלאה של התא; עם זאת, שיטות אלה מוגבלות על ידי תפוקה נמוכה מאוד. גישות בעלות תפוקה גבוהה, כגון ציטומטריה של עיוות בזמן אמת (RT-DC), יכולות למדוד רק מידע מכני מוגבל, מכיוון שלעתים קרובות הן מוגבלות לקריאות של פרמטר יחיד המשקפות רק את התכונות האלסטיות של התא. בניגוד לשיטות אלה, חישת נקבוביות מכאנו-צומת (mechano-NPS) היא פלטפורמה מיקרופלואידית גמישה, נטולת תוויות, המגשרת על הפער בהשגת מדידות ויסקו-אלסטיות מרובות פרמטרים של תא בעל תפוקה מתונה. מדידת זרם ישר (DC) משמשת לניטור תאים בזמן שהם עוברים בתעלה מיקרופלואידית, ועוקבת אחר גודלם ומהירותם לפני, במהלך ואחרי שהם נאלצים לעבור התכווצות צרה. מידע זה (כלומר, גודל ומהירות) משמש לכימות העיוות הרוחבי של כל תא, עמידות בפני דפורמציה והתאוששות מעיוות. באופן כללי, פלטפורמה מיקרופלואידית זו, המבוססת על אלקטרוניקה, מספקת תכונות ויסקו-אלסטיות מרובות של התא, ובכך תמונה מלאה יותר של המצב המכני של התא. מכיוון שהיא דורשת הכנת דגימה מינימלית, משתמשת במדידה אלקטרונית פשוטה (בניגוד למצלמה במהירות גבוהה), ומנצלת את ייצור הליתוגרפיה הרכה הסטנדרטית, היישום של פלטפורמה זו הוא פשוט, נגיש וניתן להתאמה לניתוח במורד הזרם. הגמישות, התועלת והרגישות של פלטפורמה זו סיפקו מידע מכני ייחודי על מגוון רחב של תאים, עם פוטנציאל ליישומים רבים נוספים במדע בסיסי ובאבחון קליני.

Introduction

תאים בודדים הם חומרים דינמיים, ויסקואלסטיים1. ריבוי תהליכים פנימיים וחיצוניים (למשל, הופעת מיטוזה או שיפוץ מחדש של המטריצה החוץ-תאית [ECM]), משפיעים על המבנה וההרכב שלהם 2,3,4, ולעתים קרובות התוצאה היא תכונות ביופיזיות נפרדות המשלימות את מצבם הנוכחי. בפרט, תכונות מכניות הוכחו כסמנים ביולוגיים חשובים של התפתחות תאים, פיזיולוגיה ופתולוגיה, המניבים מידע כמותי רב ערך שיכול להשלים גישות מולקולריות וגנטיות קנוניות 5,6,7. לדוגמה, Li et al. תיארו לאחרונה את ההבדלים המכניים בין תאי לוקמיה פרומיאלוציטיים חריפים עמידים לתרופות ומגיבים לתרופות, תוך שימוש ב-RNA-seq כדי לחשוף גנים הקשורים לציטוסקלטון8 המתבטאים באופן דיפרנציאלי. על ידי הבנת יחסי הגומלין המורכבים בין מכניקת התא הבודד לבין תפקוד התא, למכנופנוטיפינג יש יישומים רחבים יותר בשינוי המדע הבסיסי והאבחון הקליני9.

הכלי הנפוץ ביותר למדידת מכניקה של תא בודד הוא מיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM). בעוד ש-AFM מאפשר מדידה מקומית ברזולוציה גבוהה של תכונות מכניות סלולריות, הוא נותר מוגבל לתפוקה של <0.01 תאים לשנייה10. לחלופין, אלונקות אופטיות, המשתמשות בשתי קרני לייזר מסתעפות כדי ללכוד ולעוות תאים בודדים תלויים11, מוגבלות לתפוקה גבוהה יותר באופן שולי של <1 תאים/שנייה12. ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות מיקרופלואידיות אפשרה דור חדש של התקנים להערכה מכנית מהירה, חד-תאית,12,13. טכניקות אלה משתמשות בתעלות כיווץ צרות 14,15, זרימת גזירה 16, או מתיחה הידרודינמית17 כדי לעוות תאים במהירות בתפוקות של 10-1,000 תאים לשנייה 18. בעוד שקצב המדידה של גישות אלה מהיר משמעותית מטכניקות קונבנציונליות, לעתים קרובות הן מחליפות יכולות תפוקה גבוהה עבור קריאות מכניות מוגבלות (טבלה משלימה 1). כל השיטות המיקרופלואידיות המהירות שהוזכרו לעיל מתמקדות במדדים בסיסיים בעלי פרמטר יחיד, כגון זמן מעבר או יחסי עיוות, המשקפים רק את התכונות האלסטיות של התא. עם זאת, בהתחשב באופי הצמיגי הפנימי של תאים בודדים, אפיון מכני חזק ויסודי של תאים דורש התחשבות לא רק ברכיבים אלסטיים אלא גם בתגובות צמיגות.

חישת נקבוביות מכאנו-צומת (mechano-NPS)2,8 (איור 1A) היא פלטפורמה מיקרופלואידית שמטפלת במגבלות הקיימות באמצעות מכנופנוטיפ חד-תאי. שיטה זו מאפשרת מדידה של מספר פרמטרים ביופיזיים בו זמנית, כולל קוטר התא, עיוות יחסי וזמן התאוששות מעיוות, עם תפוקה מתונה של 1-10 תאים לשנייה. טכניקה זו מבוססת על חישת נקבוביות צמתים (NPS)19,20,21,22,23,24, הכוללת שימוש במדידת בדיקה בת ארבע נקודות כדי למדוד את פולס הזרם המווסת המיוצר על ידי תא העובר בתעלה מיקרופלואידית אשר פולחה על ידי אזורים רחבים יותר, המכונים "צמתים". פולס הזרם המווסת הוא תוצאה של התא שחוסם חלקית את זרימת הזרם במקטעים (כלומר, "נקבוביות") ובצמתים, כאשר יותר זרם חסום בראשון מאשר באחרון. במכאנו-NPS, מקטע אחד, "תעלת הכיווץ", צר יותר מקוטר התא; כתוצאה מכך, תא חייב להתעוות כדי לעבור את כל הערוץ (איור 1B). ניתן לקבוע את קוטר התא על ידי גודל התת-פולס שנוצר כאשר התא עובר את נקבוביות הצומת לפני ערוץ ההתכווצות (איורים 1B,C). כאן, |ΔInp|, הטיפה הנוכחית כאשר התא נמצא בנקבובית, פרופורציונלית ליחס הנפח של התא לנקבובית, נקבובית תא/V 2,8,19. ניתן לקבוע את קשיחות התא על ידי ΔTc, משך הזמן של תת-הדופק הגדול יותר באופן דרמטי שנוצר כאשר התא עובר את תעלת הכיווץ (איורים 1B,C). תא נוקשה יותר ייקח זמן רב יותר לעבור את התעלה מאשר תא רךיותר 2,8. לבסוף, "התאוששות" התא, יכולתו של התא לחזור לגודלו ולצורתו המקוריים לאחר העיוות, יכולה להיקבע על-ידי סדרת תת-הפולסים המיוצרים כאשר התא עובר את נקבוביות הצומת לאחר ערוץ ההתכווצות (איורים 1B,C). זמן ההחלמה, ΔTr, הוא הזמן שלוקח לתת-פולסים הנוכחיים לחזור לגודל של תת-הפולסים הקודמים, לפני שהתא נסחט. באופן כללי, פולסי הזרם המווסתים המיוצרים כאשר תא עובר את התעלה המיקרופלואידית מתועדים ומנותחים כדי לחלץ את הפרמטרים המכניים הרלוונטיים של תא יחיד (איור 1D)2,8.

יכולת השחזור וקלות השימוש בפלטפורמה מיקרופלואידית מבוססת אלקטרוניקה זו הודגמו בעבר25. בנוסף, הפלטפורמה מהווה חסם כניסה נמוך עבור מכנופנוטיפינג חד-תאי. ליתוגרפיה רכה סטנדרטית משמשת לייצור התקנים מיקרופלואידיים. חומרת המדידה מורכבת מרכיבים זולים, כולל מעגל מודפס פשוט (PCB), ספק כוח, preamplifier, לוח איסוף נתונים (DAQ) ומחשב. לבסוף, קוד ידידותי למשתמש זמין לרכישה וניתוח של נתונים, ומאפשר יישום פשוט. טכניקה זו של מכניופנוטיפינג יכולה להבחין בין אוכלוסיות של קווי תאי אפיתל שדיים וריאות לא ממאירים וממאירים, להבחין בין תת-שומנות בתאי אפיתל ראשוניים של יונקים אנושיים, ולאפיין את ההשפעות של הפרעות ציטוסקלטליות וחומרים פרמקולוגיים אחרים 2,8. באופן כללי, פלטפורמה זו היא גישה יעילה עבור mechanophenotyping של תאים בודדים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. עיצוב גיאומטריה של המכשיר

  1. בחר את רוחב מקטעי הגודל והשחזור כך שיהיה רחב יותר מקוטר התאים הגדולים ביותר שיש למדוד, אך גם שומר על יחס אות לרעש (SNR) מספיק. ראה טבלה משלימה 2 לקבלת דוגמאות לרוחב מקטעי גודל ושחזור שונים עבור קווי תאים שונים.
  2. בחר את רוחב מקטע הכיווץ כדי להחיל זן של 30%-40% על הגודל הממוצע של התאים שאמורים לעבור מכנופנוטיפ. זן מוגדר כEquation 1- , כאשר d הוא קוטר התא ו- wc הוא רוחב ערוץ הכיווץ 2,8. ראה טבלה משלימה 2 לרוחבי מקטעי כיווץ שונים עבור קווי תאים שונים.
    הערה: אם רוצים להשוות סוגי תאים או תנאים עם קטרים שונים באופן מהותי, יש להשתמש בעיצובי מכשירים נפרדים עם רוחבי מקטעי כיווץ ספציפיים לכל סוג/מצב תא.
  3. תכנן התקן ייחוס עבור כל גיאומטריה ייחודית של התקן. זה הכרחי לקביעת De, הקוטר האפקטיבי של קטע נקבוביות גודל של הערוץ microfluidic.
    הערה: התקן הייחוס משתמש באותה גיאומטריה כמו ההתקן הראשי. השינוי היחיד הוא שמקטע הכיווץ צריך להיות שווה ברוחבו למקטע הנקבוביות הגודל כדי לאפשר כיול עם חרוזי פוליסטירן בגודל ידוע. הרחבת הכיווץ מונעת מחרוזי הפוליסטירן לסתום את תעלת הכיווץ במהלך הכיול. תהליך הכיול מתואר בהרחבה בשלבים 4.1 ו- 5.3.1. כיול יכול להתבצע גם באמצעות מונה תאים זמין מסחרית, ובמקרה זה, אין צורך במכשיר ייחוס. תהליך זה מתואר בשלב 4.2.
  4. בחר את גובה הערוץ כך שהתאים הגדולים ביותר בעלי העניין יוכלו להתארך באופן מלא ללא הגבלה בתוך מקטע הכיווץ2. ודא שגובה התעלה גדול מ-h min Equation 2 (זאת בהנחה שהתא הוא כדורי לפני דפורמציה, ושהעיוות האיזומטרי מתרחש לאורך התעלה וגובהה במהלך העיוות).
    הערה: בהינתן הגודל של תת-פולס נוכחי, , ככל ש-h min גדול יותר, Equation 3כך ה-SNR הכולל יהיה נמוך יותר.
  5. תכנן וצור מסיכת צילום באמצעות תוכנת עיצוב בעזרת מחשב עם רוחב הערוצים שנבחר. קובץ לדוגמה מופיע בקובץ משלים 1. הגדילו את עיצוב המסכה המיקרופלואידית ב-1.5% כדי להסביר את ההתכווצות של פולידימתילסילוקסן (PDMS) לאחר קילוף מהמאסטר השלילי.
    הערה: ניתן לכלול מערך התקנים על מסכה אחת כל עוד המערך הכולל אינו חורג מגודל הוופל (איור משלים 1A).
  6. תכננו וצרו מסכת פוטו עם אלקטרודות שישמשו לביצוע מדידה של ארבע נקודות של זרם המכשיר המיקרופלואידי (איור 1D). קובץ לדוגמה מופיע בקובץ משלים 1.
    הערה: ניתן לכלול מערך של אלקטרודות על מסכה אחת כל עוד המערך אינו חורג מגודל שקופית הזכוכית (איור משלים 1B).

2. התקני ייצור (איור 2)

  1. הכינו תבניות אלקטרודה על מצע זכוכית.
    1. סובבו את הציפוי, התבנית ועבדו פוטו-סיסט חיובי על גבי שקופית זכוכית רגילה בהתאם לגיליון נתוני המוצר. דוגמה להליך זה מתוארת בקובץ משלים 2.
    2. בצע תצהיר מתכת, הרמה ותחריט זהב.
      1. בצע תצהיר סרט דק של 75 Å Ti, 250 Å Pt ו- 250 Å Au על המגלשה. דוגמה להליך זה באמצעות אידוי אקדח אלקטרונים מתוארת בקובץ משלים 3.
      2. יש לטבול את המגלשה באצטון למשך 15 דקות כדי לבצע הרמה של עודפי מתכת.
      3. במכסה אדים, השתמשו בפיפטה חד-פעמית כדי להפיל יציקת זהב על אזור האלקטרודות שייחשפו לתעלה המיקרופלואידית, כפי שמוצג באיור משלים 2. היזהר כדי להימנע מהשמטת etchant במקום אחר בשקופית.
        אזהרה: אצטרובל זהב עלול לגרום לגירוי בעור ובעיניים. אין לנשום אדים, ואין לבלוע. טפלו בזהירות, לבשו ציוד מגן אישי מתאים (PPE) והשליכו פסולת בהתאם לתקנות הסילוק המקומיות.
      4. שטפו את המגלשה במים שעברו דה-יוניזציה (DI) ויבשו אותה בחנקן יבש (N2).
    3. אם מספר אלקטרודות מודפסות על אותה שקופית זכוכית, חפרו את השקופית לשבבים בודדים.
      1. השתמש בכלי חיתוך זכוכית כדי להבקיע את השקופית לאורך גבולות האלקטרודה המעוצבת.
      2. שברו את הזכוכית לאורך הציון כדי לחלק את השקופית לשבבים בודדים.
    4. בדוק חזותית את האלקטרודות תחת מיקרוסקופ. ודא שאלקטרודות בודדות אינן פתוחות חשמלית או שאלקטרודות אינן מקוצרות זו לזו.
  2. לייצר תבנית אב שלילית עבור ערוצים.
    1. סובבו את הציפוי, התבנית ועבדו התנגדות אפוקסי SU-8 על פרוסת סיליקון מלוטשת בהתאם לגיליון נתוני המוצר. דוגמה להליך זה מתוארת בקובץ משלים 2.
    2. מדוד גבהי תכונות באמצעות פרופילומטר ובדוק באופן חזותי את התכונות תחת מיקרוסקופ (איור משלים 3). ודא שהגיאומטריות הרצויות מוגדרות היטב.
  3. עובש ערוצי PDMS עם ליתוגרפיה רכה.
    1. הכינו PDMS על ידי שקילת אלסטומר וקרוסלינקר ביחס מסה של 10:1 בכוס חד פעמית.
      הערה: עבור רקיק בקוטר 3 אינץ ', 30 גרם של PDMS מספיק.
    2. ערבבו את ה-PDMS במרץ במשך 30 שניות עם מזלג חד פעמי, עד שה-PDMS אטום עם בועות.
    3. נטרלו את הגז PDMS בתא ואקום למשך כ-30-90 דקות, או עד שה-PDMS יהיה שקוף ללא בועות נראות לעין.
    4. מניחים את הוופל עם התבנית הראשית SU-8 לתוך צלחת פטרי חד פעמית ויוצקים PDMS על מרכז הוופל.
    5. מניחים את צלחת הפטרי המכילה את ה-PDMS ואת הוופל בתא ואקום ומנטרלים את הגז למשך כ-30 דקות, או עד שלא נשארות בועות ב-PDMS.
    6. אופים את ה-PDMS בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס במשך שעתיים בתנור או על פלטה חשמלית.
    7. עם להב חד, לחתוך ולהסיר את PDMS מן המאסטר שלילי SU-8.
    8. חותכים את לוח ה-PDMS המעוצב לתבניות נפרדות באמצעות להב חד
    9. ליבת חורי הגישה לכניסה וליציאה באמצעות ניקוב ביופסיה חד פעמי. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, השתמש בניקוב חדש עבור כל לוח PDMS. ניקוב חד יותר מייצר חורים בעלי קצוות חלקים, הממזערים חלקיקים שעלולים לחסום את תעלת הכיווץ.
      הערה: קוטר חורי הגישה צריך להיות מעט פחות מהקוטר החיצוני של הצינורות. לדוגמה, אם משתמשים בצינורות polytetrafluoroethylene (PTFE) בקוטר חיצוני של 1/32 אינץ ', יש לנקב חור של 1.5 מ"מ.
  4. חברו מצע זכוכית/אלקטרודה לערוצי PDMS.
    1. נקו את שקופיות הזכוכית האלקטרודה עם מתנול (≥99.8%). יבש עם יבש N2.
    2. נקו את מכשיר ה-PDMS עם סרט סקוטש, ולאחר מכן שטפו אותו עם איזופרופיל אלכוהול (IPA) ומים שעברו דה-יוניזציה (DI; 18 MΩ/cm2). יבש עם יבש N2. לאחר מכן, לנקות עם סרט סקוטש פעם נוספת.
    3. הניחו את מצע הזכוכית עם אלקטרודות טרומיות ואת תבנית PDMS המוכנה (צד תכונה כלפי מעלה) לתוך חומר ניקוי פלזמה.
    4. חשוף את שניהם לפלסמה חמצן למשך 2 דקות (100-300 mTorr, 30 W).
    5. יישרו והניחו את תבנית ה-PDMS כשצד התכונה פונה כלפי מטה על מצע הזכוכית עם אלקטרודות טרומיות.
      הערה: ההדבקה מתבצעת באופן מיידי ברגע שה-PDMS והזכוכית המטופלים בפלזמה באים במגע; כתוצאה מכך, שינויי יישור נוספים לא יתאפשרו. כדי להקל על היישור, ניתן להעביר 20 μL של דילול 2:1 של מתנול במי DI על משטח הזכוכית המטופל בפלזמה. תמיסת המתנול משמשת כמחסום פיזי בין הזכוכית המטופלת לבין PDMS, ומאפשרת התאמות יישור. אם משתמשים במתנול, אופים את המכשיר המיושר והמזווג בטמפרטורה של 50°C למשך שעתיים כדי לאדות את התמיסה ולהשלים את תהליך ההדבקה.
    6. בדוק חזותית את המכשיר מלוכד תחת מיקרוסקופ. ודא שהאלקטרודות וגיאומטריות הערוץ מיושרות כהלכה.

3. מדידת תאים (איור 1D)

  1. הכן את מקור הלחץ, ה- PCB, חומרת הספסל ותוכנת איסוף הנתונים.
    1. חבר את ההתקן המיקרופלואידי ללוח המעגלים המודפסים באמצעות המהדק. דוגמה ל- PCB מופיעה בקובץ משלים 4 (קבצי GERBER) ובקובץ משלים 5 (קבצי רשימה סכמטיים, לוחות וחלקי PCB).
      1. יישר את הפינים הטעונים בקפיץ של המהדק עם רפידות המגע של האלקטרודה במכשיר המיקרופלואידי ויישר את פיני ראש המהדק עם החורים בלוח המעגלים המודפסים.
      2. הכנס בחוזקה את פיני הראש של המהדק לתוך חורי ה- PCB, וודא שהפינים הטעונים בקפיץ נשארים מיושרים עם רפידות המגע של האלקטרודה.
    2. הגדר וחבר את החומרה האלקטרונית.
      1. חבר שתיים מיציאות הפלט של ספק הכוח ליציאת מתח האספקה של ה-PCB באמצעות מתאם נקבה כפול של בננה ל-Baynet-Neill-Concelman (BNC) וכבל BNC.
      2. הפעל את ספק הכוח. הגדר את הפלט המחובר למוליך הפנימי של ה-BNC ל-+15 V והגדר את הפלט השני ל-15 V. אפשר לשתי היציאות להפעיל את המעגל.
      3. חבר את השלישי מבין יציאות היציאה של ספק הכוח ליציאת מתח הכניסה של ה- PCB באמצעות כבל BNC. הגדר את הפלט למתח המופעל הרצוי, אך אל תפעיל אותו עד לתחילת הניסוי.
      4. חבר את יציאת זרם הפלט של ה- PCB לקלט של קדם-המגבר הנוכחי באמצעות כבל BNC.
      5. חבר את הפלט של קדם-המגבר הנוכחי לכניסה אנלוגית אחת בבלוק מסוף BNC של מערכת רכישת הנתונים באמצעות כבל BNC. לחלופין, חבר מסנן אנלוגי בעל מעבר נמוך בקו עם כבל BNC כדי לסנן הפרעות בתדר גבוה.
        הערה: כדי לשפר את ה-SNR, ייתכן שה-PCB וההתקן מאוחסנים בתוך מארז מתכת עבה. ניתן לנתב את כל כבלי BNC וצינורות נוזליים דרך חורים שנקדחו לתוך המארז.
    3. התקן והגדר את התוכנה הנדרשת במחשב האישי (PC)
      1. הפעל וחבר את בקר הלחץ למחשב. התקן את כל תוכנות בקר הלחץ הנדרשות בהתאם להוראות היצרן.
      2. התקן את MATLAB ואת ארגז הכלים לרכישת נתונים במחשב. ודא שמנהלי ההתקנים הדרושים עבור מערכת רכישת הנתונים מותקנים כך שממשק ארגז הכלים לרכישת נתונים של MATLAB יוכל לזהות אותה.
      3. הורד את סקריפט רכישת הנתונים הכלול, "NPS.m", מתוך https://github.com/sohnlab/node-pore-sensing-public.
    4. פתח וקבע את התצורה של קובץ ה- Script לרכישת נתונים.
      1. הגדר את הערכים הנכונים לאתחול הפעלת רכישת הנתונים, הכוללת את מזהה הספק, מזהה ההתקן של ה- DAQ ומספר ערוץ הקלט האנלוגי (שורות 34-36 בסקריפט הכלול).
        הערה: ניתן למצוא את מזהה המכשיר באמצעות הפונקציה "daq.getDevices" או "daqlist".
      2. הגדר את קצב הדגימה הרצוי לרכישה (שורה 23 בסקריפט הכלול). לקבלת תוצאות אופטימליות, זה צריך להיות מוגדר לפחות 10 קילוהרץ.
  2. הכן את השעיית התא.
    1. הכינו תמיסה של 2% סרום בקר עוברי (FBS) בתמיסת מלח 1x עם אגירת פוספט (PBS), וסננו עם מסנן של 0.22 מיקרומטר.
    2. תרבית והכן את התאים על פי פרוטוקול תרבית התאים המתאים של קו התאים המועדף. להשעות את התאים בתמיסה מוכנה של 2% FBS ב 1x PBS בריכוז של 1-5 x 105 תאים / מ"ל. שמור את התאים על הקרח למשך הניסויים.
  3. מדוד את התכונות הפיזיקליות של התאים.
    1. טען את דגימת התא לתוך הצינורות וחבר אותה לכניסת המכשיר.
      1. חותכים 30 ס"מ של צינורות PTFE בעזרת סכין גילוח או סכין חדה.
      2. חברו קצה אחד של הצינורות למזרק מנעול לואר. השתמש במזרק כדי למשוך את דגימת התא לקצה השני של הצינור.
      3. הכנס בזהירות את הצינורות לתוך הכניסה של המכשיר.
      4. חבר את הקצה הנגדי של הצינורות לבקר הלחץ המיקרופלואידי.
        הערה: ניתן להוסיף מסנן בין בקר הלחץ המיקרופלואידי לבין הצינורות כדי למנוע זרימה חוזרת של נוזלים לבקר הלחץ.
    2. הפעל את הניסוי.
      1. הגדר את לחץ הנהיגה הקבוע הרצוי בתוכנת בקר הלחץ ואפשר לדגימה למלא את המכשיר.
        הערה: הלחץ הוא בדרך כלל 2-21 kPa. מהירות הזרימה חייבת להיות איטית מספיק כדי לאפשר פולסים מוגדרים בבירור, אך מהירה מספיק כדי לאפשר תפוקה מספקת.
        1. אם נוצרות בועות בתעלות המיקרופלואידיות, השתמש במילוי ללא מוצא: חבר את שקע ההתקן והפעל לחץ נמוך על הכניסה כדי להוציא אוויר דרך ה-PDMS החדיר לגז. השארת בועות בערוץ תוביל לקו בסיס זרם לא יציב ותמנע מדידות מדויקות.
        2. אם פסולת סותמת את התעלה המיקרופלואידית, יש לנתק אותה על-ידי לחיצה קלה על החלק העליון של התקן ה-PDMS תוך כדי הפעלת לחץ הנהיגה, "פעימת" לחץ גבוה יותר על-ידי הפעלה וכיבוי של הלחץ, או הסרת הצינור והכנסתו מחדש. אם הפסולת נשארת, ייתכן שיהיה צורך לעבור למכשיר חדש.
      2. הגדר את המתח הרצוי על-ידי סיבוב כפתור המתח בספק הכוח והפעל את המתח על-ידי לחיצה על לחצן מופעל .
        הערה: המתח הוא בדרך כלל 1-5 V. בחר את המתח הנמוך ביותר הדרוש עבור SNR הולם. יש להשתמש באותו מתח בכל התנאים להשוואה.
      3. הפעל את קדם-המגבר הנוכחי והגדר את הרגישות (A/V) נמוכה ככל האפשר; לחלופין, הגדר את הרווח (V/A) גבוה ככל האפשר מבלי להעמיס יתר על המידה על הקדם-אמפליפייר או לחרוג ממתח הכניסה האנלוגי המרבי של ה-DAQ. במחקר זה, הרגישות הוגדרה ל-10-7 A/V.
        הערה: ערך הרגישות/רווח הנכון יהיה תלוי הן במתח המופעל והן בהתנגדות הבסיסית של התעלה המיקרופלואידית.
      4. לחץ על לחצן ההפעלה הירוק בתפריט רצועת הכלים MATLAB כדי להתחיל את סקריפט רכישת הנתונים NPS.m ולהתחיל לדגום ולשמור את הנתונים.
      5. כדי לסיים את הניסוי, לחץ על לחצן עצור בפינה השמאלית התחתונה של חלון האיור כדי לעצור את סקריפט רכישת הנתונים. השבת את פלט ספק הכוח על-ידי לחיצה על לחצן מופעל . הגדר את מקור הלחץ ללחץ אפס בתוכנת בקר הלחץ.
      6. בשלב זה, ניתן להשהות את הניסוי כדי לבצע אחת או יותר מהפעולות הבאות:
        1. החלף את ההתקן הנוכחי בהתקן חדש.
        2. טען מחדש את הצינורות עם דגימות תאים נוספות.
          הערה: כדי למנוע זיהום צולב לדוגמה, השתמש בהתקנים חדשים כדי למדוד תאים מסוגים או תנאים שונים.
        3. שחרר את המכשיר מה- PCB ובדוק את מצב הערוץ תחת מיקרוסקופ. כדי להפעיל מחדש את הניסוי באמצעות אותו מכשיר, יש להיזהר שלא להכניס בועות אוויר. ייתכן שיהיה צורך להפעיל לחץ עדין על בוכנת המזרק כדי לשמור על דגימת התא בקצה הצינור תוך הכנסתה לכניסת המכשיר.

4. כיול המכשיר המיקרופלואידי

  1. אפשרות 1: מדוד את חרוזי הפוליסטירן במכשירי ייחוס.
    1. בחר גודל חרוז פוליסטירן הקטן מערוץ הגודל.
    2. הוסיפו 1.5% חרוזי טווין ופוליסטירן לתמיסת PBS ו-FBS המסוננת המשמשת במהלך ניסויי התא, בריכוז של 1-3 x 105 חרוזים/מ"ל.
    3. המשך בניסוי כמתואר בסעיף 3, תוך שימוש בהתקן הייחוס המתואר בשלב 1.3, והפעל את אותו מתח המשמש במהלך הניסוי. השתמש בגודל הממוצע של הטיפה הנוכחית המיוצרת כאשר חרוזים עוברים את נקבוביות הגודל ואת הקוטר הידוע של החרוזים כדי לחשב את D e, כמתואר בסעיף 5.
  2. אפשרות 2: מדוד באופן עצמאי את גודל התא באמצעות מכשיר מדידה נפרד.
    1. במקום לעקוב אחר הפרוטוקול בשלב 4.1, השתמש במכשיר מסחרי למדידת גודל התא כדי למדוד את הגודל הממוצע של התאים בדגימה. במקרה זה, אין צורך במכשיר ייחוס. השתמש בטיפת הזרם הממוצעת הנוצרת כאשר תאים עוברים את נקבובית הגודל ואת קוטר התא הממוצע הנמדד כדי לחשב את De כמתואר בסעיף 5.

5. ניתוח נתונים לחילוץ פנוטיפים של תאים

הערה: ניתן לבצע עיבוד נתונים באמצעות קובץ תוכנית ממשק שורת הפקודה MATLAB mNPS_procJOVE.m בשעה https://github.com/sohnlab/NPS-analysis-JOVE. ראה קובץ משלים 6 לקבלת הוראות נוספות.

  1. עיבוד מקדים של הנתונים (איור 3A).
    1. חשב את הזרם החשמלי הנמדד על-ידי החלת ערך הרווח המשמש בקדם-אמפליפייר מזרם למתח על הנתונים הגולמיים הנרכשים על-ידי ה- DAQ.
    2. הסר רעשים בתדר גבוה על-ידי החלת פונקציית החלקה מלבנית ו/או מסנן מעבר נמוך על מדידת הזרם הגולמי. לאחר מכן, דגום מחדש את הנתונים המסוננים לקצב דגימה נמוך יותר. כמו כן, חשב את נתוני חותמת הזמן המתאימים בקצב דגימה נמוך זה.
    3. חשב אות זרם בסיסי מותאם על-ידי יישום שיטה כגון החלקת ריבועים מינימליים אסימטריים26.
    4. חשב את הנגזרת הראשונה המשוערת (אות ההפרש) של הנתונים הנוכחיים המעובדים מראש על-ידי לקיחת ההפרש בין נקודות הנתונים הבאות.
  2. זהה אירועים בתאים וחלץ נתוני תת-פולסים (איור 3B).
    1. חפש אירועים סלולריים מועמדים על ידי בחינת הנתונים המעובדים מראש. דחיית אירועי תאים החופפים לאירועי תא אחרים (כלומר, אירועי צירוף מקרים) (איור משלים 4), הצגת התאמה בסיסית ירודה, או צורת פולס בלתי צפויה או שגויה (לדוגמה, כאשר ייתכן שסתום היה נוכח בערוץ).
    2. חלץ נתוני תת-פולס עבור כל אירוע תא.
      1. כל מקטע נקבוביות של צומת יופיע כתת-פולס מתאים בתוך פולס האות הכולל (איורים 1B, C). זהה את ההתחלה של כל תת-פולס על-ידי חישוב נקודת הזמן שבה אות ההפרש מגיע לערך מינימלי מקומי. זהה את הקצה של כל תת-פולס על-ידי חישוב נקודת הזמן שבה אות ההפרש מגיע לערך מרבי מקומי.
      2. קבע את הרוחב של כל תת-פולס כזמן שחלף בין נקודות זמן ההתחלה והסיום. קבע את המשרעת של כל תת-מתח על-ידי חישוב ממוצע ההפרש בין הזרם הנמדד לזרם הבסיסי עבור כל נקודות הנתונים בין נקודות זמן ההתחלה והסיום.
  3. קבע את המכנופנוטיפ של התא עבור כל אירוע תא בהתבסס על נתוני תת-התנועה.
    1. קבע את קוטר התא d בהתבסס על המשוואה שהוגדרה על ידי Deblois ו- Bean24:
      Equation 4
      כאשר ΔI/I הוא היחס הממוצע בין משרעת תת-פולס לזרם בסיסי בתת-פולסים של הגודל, De הוא הקוטר האפקטיבי של הערוץ (נמדד בשלב 4), ו-L הוא האורך הכולל של ערוץ הצומת-נקבובית.
      1. D e נקבע על ידי חישוב ה-ΔI/I הממוצע המיוצר על ידי קבוצה של חלקיקים בקוטר ידוע (תאים או חרוזים, ראה שלב 4), תוך שימוש בקוטר ידוע זה כ-d, ופתרון Eq. 1 עבור De.
    2. לכמת את עמידות התא בפני דפורמציה.
      1. קבע את מהירות הנוזל U זרימה על ידי חישוב מהירות התא הממוצעת בתת-פולסים של גודל, באמצעות אורכי המקטעים הידועים ומשך הזמן הנמדד של כל תת-פולס.
      2. קבע את מדד העיוותים של התא כולו (wCDI), המוגדר על ידי Kim et al.2 כ:
        Equation 5
        כאשר L c הוא אורך מקטע הכיווץ, ערוץ h הוא גובה הערוץ, ו- ΔTc הוא משך תת-ההתכווצות.
    3. זהה את זמן ההתאוששות של התא מעיוות, המוגדר כתת-ההתאוששות הראשון עם משרעת בטווח של 8% מהמשרעת הממוצעת מתת-העוצמה2.
    4. חשב את העיוות הרוחבי של התא בתוך מקטע הכיווץ.
      1. חשב את הקוטר האפקטיבי של מקטע הכיווץ (De,c) כפי שהוגדר על ידי Kim et al.2:Equation 6 , כאשר w c הוא רוחב מקטע הכיווץ ו-w np הוא הרוחב של כל המקטעים האחרים.
      2. חשב את הקוטר הכדורי המקביל dc של התא בתוך הכיווץ על ידי שימוש חוזר במשוואה שהוגדרה על ידי Deblois ו- Bean24:
        Equation 7
        כאשר ΔI c/I c הוא היחס בין משרעת תת-פולס לזרם בסיסי בתת-הכיווץ ו-Lc הוא אורך מקטע הכיווץ.
      3. חישוב אורך ההתארכות של התא L מעוות כפי שתואר על ידי Kim et al.2:
        Equation 8
      4. לבסוף, מחשב את העיוות הרוחבי של התא δמעוות, המוגדר על ידי Kim et al.2 להיות . Equation 9

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פלטפורמת המכנופנוטיפינג המוצגת כאן היא גישה פשוטה ורב-תכליתית למדידת התכונות הביופיזיות של תאים בודדים עם תפוקה מתונה. תאים מוזרמים דרך התעלה המיקרופלואידית (איור 1A) באמצעות זרימה מונעת לחץ קבוע. כאשר התאים עוברים, אורך התעלה המיקרופלואידית והפולסים הנוכחיים המיוצרים נרשמים באמצעות חומרת איסוף הנתונים. האות הנרכש (איור 1B,C) מעובד לאחר מכן באמצעות תוכנה מותאמת אישית ב-MATLAB כדי לחלץ את התכונות המכניות הרלוונטיות של תא יחיד. איור 1D מציג סקירה גרפית של פרוטוקול הניסוי.

כדי לייצר התקנים, תבנית אב שלילית נוצרת בתחילה ומשמשת ליציקת PDMS (איור 2). תבניות אב מוצלחות, המוצגות באיור 3 המשלים, מכילות דפנות חלקות ואנכיות וללא פגמים בתעלה המיקרופלואידית (איור 4Ai). יש לנקוט משנה זהירות בייצור התבנית הראשית הראשונית הזו, מכיוון שבפרוסות מפוברקות בצורה גרועה (איור משלים 3), כל הפגמים יעברו לכל יציקות ה-PDMS הבאות (איור 4Aii), מה שיהפוך אותן לבלתי שמישות. יציקות PDMS מוצלחות מלוכדות בפלזמה לשקופיות זכוכית עם אלקטרודות מעוצבות (איור 1A).

בניסויים, משטחי האלקטרודות של המכשיר מחוברים ל-PCB (איור 1D) כדי לאפשר מדידת זרם. צינורות, המכילים דגימת תא, מוכנסים לאחר מכן לכניסת המכשיר ומחוברים לבקר זרימה מיקרופלואידי, מה שמאפשר זרימה מונעת לחץ של תאים דרך התעלה המיקרופלואידית. חשוב לציין שקריאה חיה של המדידה הנוכחית מוצגת במהלך ניסוי. הדבר מאפשר למשתמשים לוודא שהמכשיר שלהם פועל כמתוכנן. אירועי מעבר תאים מוצלחים מורכבים מתת-פולסים הניתנים להבחנה בקלות (איור 4Bi). סיבוכים, כגון סתימה, עשויים להתרחש במהלך הניסוי, וניתן לזהותם על-ידי קריאה חיה של אירועים עם צורות דופק חריגות (איור 4Bii).

עבור ניתוח נתונים, פרמטרי האות הקריטיים שיש לחלץ עבור כל אירוע מעבר תא מפורטים באיור 1B ומתוארים בשלב 5.2.2. לאות הגולמי צריך להיות SNR מספיק כדי לסנן את הרעש ולחלץ את הרכיבים המשמעותיים (איור 3A). באופן קריטי, עליית האות הנוכחית מכל צומת צריכה להיות חזקה מספיק כך שניתן יהיה לזהות בקלות תת-פולסים מאות ההפרש ∂ I/∂t (איור 3B).

ניתן להשתמש בזמני ה-wCDI וההתאוששות הנמדדים כדי לבצע השוואות ישירות בין תאים או תנאים. באופן ספציפי, wCDI הוא אינדיקטור יחסי לנוקשות תאים ביחס הפוך למודולוס האלסטי (איור משלים 5); לפיכך, ערך גדול יותר של wCDI מתאים לפנוטיפ מכני רך יותר. לדוגמה, באיור 5A, לתאי MCF-7 ממאירים יש התפלגות wCDI גדולה יותר מאשר לתאי MCF-10A שאינם ממאירים, מה שמצביע על כך שתאי MCF-7 הממאירים רכים יותר ממקביליהם הלא ממאירים MCF-10A. זה עולה בקנה אחד עם מחקרים אמפיריים רבים שהראו כי תאים סרטניים רכים יותר ממקביליהם הלא ממאירים27. באופן דומה, באיור 5B, תאי MCF-10A ו-MCF-7 שטופלו בלטרונקולין מראים עלייה ב-wCDI. לטרונקולין הוא חומר פרמקולוגי רב עוצמה המשבש את שלד האקטין28. כתוצאה מכך, זה עקבי כדי לבחון wCDI גדול יותר, ובכך פנוטיפ רך יותר, בתאים שטופלו בתרופה זו. לבסוף, באיור 5C, wCDI מושווה בין שתי תת-שלוחות של תאי אפיתל של יונק אנושי, אפיתל לומינלי (LEP) ומיו-אפיתל (MEP). בהשוואה זו, קיימת שוב התפלגות wCDI מובחנת המבדילה בין שני סוגי התאים הראשוניים, מה שמצביע על כך שתאי LEP רכים יותר מתאי MEP. מעבר ל-wCDI, ניתן לכמת את זמני ההתאוששות גם כדי לספק אינדיקטור יחסי לצמיגות התא. זמן התאוששות ארוך יותר מצביע על פנוטיפ צמיג יותר. איור 5D מציג את זמני ההתאוששות, המחולקים לשלוש קטגוריות נפרדות, עבור כל אחד מהתנאים באיורים 5A-C. ל-MCF-10As ול-MCF-7 שלא טופלו יש שיעור גדול יותר של תאים שמתאוששים באופן מיידי (ΔTr = 0), מה שמעיד על צמיגות נמוכה יותר ממקביליהם שטופלו בלטרונקולין.

wCDI וזמן התאוששות הם מדדים יחסיים של גמישות וצמיגות של תא בודד. לכן, השיטה המוצגת כאן היא המתאימה ביותר לאפיון התגובה הדיפרנציאלית בין מספר דוגמאות מעניינות. בצורתו הנוכחית, הפרוטוקול המוצג כאן אינו מספק כימות מוחלט של פרמטרים מכניים מוגדרים, כגון המודולוס של יאנג.

Figure 1
איור 1: סקירה כללית של פלטפורמת המכנופנוטיפינג. (A) תמונה של ההתקן המיקרופלואידי. (B) גיאומטריית ערוץ, עם פולס זרם מייצג מאירוע מעבר של תא יחיד. Δ Inp מייצג את הטיפה הנוכחית מהתא הנכנס לנקבובית, ו- ΔIc מייצג את הטיפה הנוכחית מהתא הנכנס להתכווצות. Δ T p מייצג את הזמן הדרוש לתא כדי להעביר את הנקבובית, Δ Tc מייצג את הזמן הדרוש לתא כדי לעבור את תעלת הכיווץ, ו- ΔTr מייצג את הזמן הדרוש לתא להתאושש. (C) פולס זרם אמיתי מאירוע מעבר תא. (D) זרימת עבודה ניסיונית: (1) תאים מושעים ב-PBS ו-(2) מונעים דרך ההתקן המיקרופלואידי בלחץ קבוע. כאשר התאים עוברים בתעלה המיקרופלואידית, (3) פולסים נוכחיים נמדדים באמצעות חומרת איסוף נתונים. (4) הפולסים הנוכחיים מנותחים כדי לחלץ תכונות מכניות מרובות של תא יחיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: סקירה כללית של ייצור התקנים . (A) תבניות אב שליליות הן (1) מפוברקות באמצעות פוטוליתוגרפיה. (2) PDMS מושלך לאחר מכן על תבניות האב השליליות. (3) המכשירים היצוקים חתוכים לקוביות, עם חורי כניסה ויציאה מנוקבים. (B) בו זמנית, מגלשות זכוכית (1) מעוצבות לייצור אלקטרודות מתכת. (2) אידוי קרן אלקטרונית משמש להפקדת מתכת על המגלשה, ולאחר מכן (3) תהליך הרמה להסרת עודפי מתכת, תוך השארת אלקטרודות המתכת הרצויות. (C) התקן PDMS וזכוכית עם אלקטרודות מתכת מחוברים יחד באמצעות פלזמת חמצן כדי להשלים את תהליך הייצור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: עיבוד וניתוח נתונים . (A) נתוני זרם גולמיים (משמאל) מעובדים מראש (מימין) על-ידי החלת פונקציית החלקה מלבנית ומסנן בעל מעבר נמוך, ולאחר מכן דגימה מחדש לקצב דגימה נמוך יותר. אות הזרם הבסיסי מצויד לאחר מכן בריבועים הפחותים אסימטריים המחליקים26. (B) נקודות הזמן בהתחלה ובסוף של כל תת-פולס מזוהות כמינימום ומקסימום מקומיים, בהתאמה, באות ההפרש ∂I/∂t (משמאל). עבור כל תת-דופק, הרוחב Δt נקבע על ידי הזמן שחלף בין ההתחלה לסוף, והמשרעת ΔI נקבעת על ידי ההפרש הממוצע בין הזרם הנמדד לזרם הבסיסי. נתוני התת-פולס שחולצו יכולים להיות מיוצגים כאות מלבני (מימין); כל תת-תחום מתאים למקטע אחד בגיאומטריה של המכשיר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: דוגמאות לתוצאות מוצלחות ופגומות במהלך ייצור וניסויים . (A) תמונות של יציקות PDMS של מקטעי כיווץ שנלקחו משתי תבניות נגטיב-מאסטר שונות. (i) היא דוגמה לתעלה מפוברקת היטב עם דפנות חלקות, גיאומטריה מוגדרת היטב וללא פגמים בולטים. (ii) היא דוגמה לתעלה מפוברקת בצורה גרועה עם פגמים משמעותיים בתעלת הכיווץ (המתוארת במלבנים אדומים), אשר תחסום באופן מלא או חלקי את זרימת החלקיקים (פסי אבנית = 150 מיקרומטר). (B) דוגמאות לפעימות זרם מסוננות הנוצרות על-ידי "NPS.m" במהלך רכישת נתונים. (ט) דוגמה לאירוע תא מוצלח, שבו תא עובר בערוץ כמתוכנן. (ב) דוגמה לפולסים הנוכחיים המיוצרים כאשר המכשיר "סתום". במקרה זה, פסולת חוסמת את זרימת התא בנקבובית השנייה של התעלה. זה מוביל לאירועים בתאים שנראים "מנותקים" (מסומנים על ידי הקו האדום) באמצע הדופק הגודל השני. הירידות בזרם (המסומנות על ידי הקווים הכחולים) בעקבות ה"ניתוק" נגרמות על ידי חלקיקים (פסולת או תאים) שמצטברים סביב החסימה ולכן חוסמים חלק גדול יותר מזרימת הזרם. קפיצה חדה כלפי מטה בזרם (המסומנת על ידי המלבן הירוק) משקפת חלקיק המסוגל לנוע סביב הסתימה, ולכן חוסם רק באופן זמני חלק גדול יותר של הזרם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: דוגמאות ל-wCDI והתאוששות תאים בין מצבים שונים. (A) התפלגות wCDI בין שני קווי תאי אפיתל בשד, MCF-10A לא ממאיר ו-MCF-7 ממאיר. (B) wCDI של MCF-10A או MCF-7, שבו כל סוג תא לא טופל, טופל ב-Lat-A וטופל ב-Lat-B. (C) התפלגות wCDI בין שתי תת-שלוחות עיקריות של אפיתל החלב האנושי: תאי מיואפיתל (MEP) ותאי אפיתל לומינלי (LEP). (D) זמני ההחלמה המתאימים לארבעת התנאים בין A, B ו-C. זמני ההחלמה נקבעו כדי להקל על הצפייה. לכל התנאים היה גודל דגימה של n = 99 תאים. נתון זה מועתק באישורם של קים ואח '2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור משלים 1: דוגמאות למערכי התקנים הן עבור התעלות המיקרופלואידיות והן עבור האלקטרודות. שתי התמונות, המיוצגות כמסכות השקיפות, צריכות להיות מעוצבות בלבן (המייצג שקוף) באזורים שבהם הפוטורסיסט יהיה חשוף ל-UV ושחור באזורים שבהם הוא ייחסם מחשיפה לקרינת UV. (A) מערך של ערוצים מיקרופלואידיים, עם שני ערוצים מקבילים לכל "מכשיר" (מלבן), המסודרים על רקיק 3 ב-Si. המכשיר בקצה הימני מסומן כ-"ref" ומתוכנן, כמתואר בשלב 1.3, לשימוש בכיול. (B) מערך של אלקטרודות, עם שתי אלקטרודות לכל מכשיר, כך ששני הערוצים בהתקן מ-(A) יתיישרו מעל כל תכנון אלקטרודה מ-(B). מערך זה סודר עבור 2 ב x 3 בשקופית זכוכית. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: סכמות הממחישות אזורים בעיצוב האלקטרודה וכיצד לחרוט זהב בצורה נכונה (שלב 2.1.2.3). יש להסיר את השכבה העליונה של הזהב מאלקטרודות המדידה, אחרת יתרחשו ביופולינג ואלקטרוליזה במהלך המדידה. עם זאת, זהב צריך להישאר על רפידות המגע, כי הזהב הרך מספק חיבור חשמלי מעולה עם הפינים של מחבר פין פוגו. (A) סכמטי המראה כיצד התעלה המיקרופלואידית (בכחול) מצטלבת עם המתכת המעוצבת (שחורה). כפי שצוין, המתכת בניצב לתעלה המיקרופלואידית וממש מתחתיה נמצאות אלקטרודות המדידה, שבהן יש לחרוט זהב, ואילו מלבני המתכת הגדולים לצד התעלה הם רפידות המגע, שבהן הזהב חייב להישאר. (B) שרטוט סכמטי המראה היכן יש להחיל את המתכת המעוצבת על המתכת המעוצבת, וכן היכן לא. האזור הירוק מציין היכן יש צורך בתחריט, האזור הצהוב מציין היכן עלולה להתרחש תחריט ולא ישפיע על יעילות המכשיר, והאזור האדום מציין היכן אין לחרוט זהב. (C) סכמטי המציג התקן טיפוסי שנחרט בהצלחה. צהוב מציין אזורים שבהם הזהב עדיין קיים, ואפור מציין אזורים שבהם שכבת הפלטינה נחשפה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 3: תמונות של ערוצי כיווץ מפוברקים בהצלחה ובצורה גרועה. (A) תמונות של תעלות כיווץ על תבניות מאסטר שליליות משני פרוסות Si בודדות. (i) דוגמה לתבנית אב מפוברקת היטב שתייצר ערוץ PDMS אידיאלי כמו זה שמוצג באיור 4Ai. (ii) דוגמה לתבנית אב מפוברקת בצורה גרועה, ששימשה ליצירת ערוץ PDMS המוצג באיור 4Aii. האזורים המתוארים במלבנים אדומים תואמים את הפגמים המצוינים באיור 4Aii, ומדגימים את העברת הפגמים מהתבנית הראשית למיקרו-ערוצים של PDMS (פסי קנה מידה = 150 מיקרומטר). (B) תמונות של חתך רוחב של ערוצי כיווץ PDMS, המציגות את הגובה והרוחב של תבניות שונות. חתכים אלה נרכשו על ידי חיתוך תעלת הכיווץ PDMS בניצב לכיוון הזרימה. (i) דוגמה לתבנית PDMS מפוברקת היטב שנוצרה באמצעות הוופל המוצג ב-(Ai), המדגים דפנות אנכיות חלקות. (ii) דוגמה לתבנית PDMS מפוברקת היטב שנוצרה באמצעות הוופל המוצג ב-(Aii) המדגים דפנות משופעות (פסי קנה מידה = 20 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 4: דוגמה לאירוע תאי מקרי (שנוצר כאשר יותר מתא אחד עובר את הערוץ בו-זמנית). האות עובד על פי שלבים 5.1.1-5.1.3 בסעיף 5 של הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 5: הקשר בין wCDI לבין המודולוס האלסטי 20,29,30,31,32,33,34,35. (A) השוואה בין תאי Jurkat, MCF7 ו-MCF10A שנמדדו בטכניקה זו לעומת שאיפת מיקרו-פיפטה. wCDI הוא ביחס הפוך למתח קליפת המוח. (B) השוואה בין תאי MCF7 ו-MCF10A שנמדדו בטכניקה זו לעומת נתוני AFM שפורסמו. (C) השוואה בין תאי A549 ו-BEAS-2B שנמדדו בטכניקה זו לעומת נתוני AFM שפורסמו. על פני סוגי תאים מרובים, wCDI נמצא ביחס הפוך למודולוס אלסטי. נתון זה הועתק באישורם של קים ואחרים 2. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 1: דוגמאות לטכניקות של מכניופנופנוטיפ חד-תאי וכיצד הן משתוות למכנו-NPS. הטכניקות מפורטות לפי סדר הגדלת התפוקה 12,2,36,37. מידע מכני מתייחס לשאלה אם המכשיר יכול למדוד הן את התכונות המכניות האלסטיות והן את התכונות המכניות הצמיגיות של כל תא. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה משלימה 2: דוגמה לרוחבי מקטעי גודל, כיווץ ושחזור עבור קווי תאים שונים. MEP ו-LEP מתייחסים לשתי שושלות של תאי אפיתל ראשוניים של יונקים אנושיים, כאשר MEP מתייחס לתאי מיואפיתל ו-LEP מתייחס לתאי אפיתל לומינליים 2,8. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

קובץ משלים 1: דוגמה לעיצוב AutoCAD. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: פרוטוקול לדוגמה לעיבוד פוטוליתוגרפיה. שני פרוטוקולים לדוגמה מתוארים לדפוס ועיבוד פוטורסיסטים או אפוקסי SU-8. הראשון מתאר את היישום של פוטורסיסט חיובי על שקופית זכוכית כדי לשמש כשכבת הקרבה לייצור אלקטרודות. השני מתאר את היישום של אפוקסי SU-8 על פרוסת סיליקון כדי ליצור מבני הקלה ליציקת תעלות מיקרופלואידיות PDMS. פרוטוקולים אלה הותאמו מגיליונות הנתונים MF-321 ו- SU8 3000 מהיצרן. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 3: פרוטוקול לדוגמה לתצהיר סרט דק של 75 Å Ti, 250 Å Pt ו- 250 Å Au באמצעות אידוי קרן אלקטרונים. מתואר פרוטוקול לדוגמה לביצוע תצהיר סרט דק של 75 Å Ti, 250 Å Pt ו- 250 Å Au באמצעות מאייד קרן אלקטרונים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 4: קבצי GERBER אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 5: קבצי רשימת חלקים סכמטיים, לוח ו- PCB אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 6: ממשק שורת הפקודה MATLAB. קובץ זה כולל הוראות מפורטות לעיבוד נתונים באמצעות ממשק שורת הפקודה MATLAB26. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מדידת התכונות המכניות של תאים בודדים באמצעות טכניקת מכנופנוטיפינג זו מורכבת משלושה שלבים: ייצור מכשירים, איסוף נתונים וניתוח נתונים. בתוך כל שלב, ישנם היבטים בולטים שעשויים להשפיע באופן משמעותי על תוצאות הניסוי. במהלך ייצור התקנים, גיאומטריות ערוצים עקביות ואחידות בין התקן להתקן חיוניים לקבלת תוצאות מדויקות וניתנות לחזרה. באופן ספציפי, הדפנות של כל מכשיר צריכות להיות חלקות יחסית (איור 4Ai), וגבהי הערוצים בין התקנים משוכפלים צריכים להיות דומים. יש להשליך את כל המכשירים עם פגמים שמפריעים חלקית לזרימת התאים, במיוחד בתעלת הכיווץ (איור 4Aii). שימוש במכשירים עם פגמים ניכרים בגיאומטריית הערוץ יביא לתוצאות לא מדויקות ובלתי ניתנות לשחזור. במהלך רכישת נתונים, חיוני שהמשתמש יוכל לזהות נוכחות של סתום בערוץ במהלך איסוף הנתונים. סקריפט לדוגמה, "NPS.m" (זמין ב-https://github.com/sohnlab/node-pore-sensing-public), מציג את המדידות הנוכחיות, ומאפשר למשתמש לעקוב אחר מצב הערוץ ואירועי מעבר התא בזמן אמת. פולסים האופייניים לסתימה מוצגים באיור 4B. סתימה בתוך תעלת הכיווץ שעדיין מאפשרת לחלק מהתאים לזרום חשובה במיוחד לטיפול, מכיוון שהתאים יחוו עומס מוגבר במיקום החסימה, וכתוצאה מכך wCDIs לא מדויק. לבסוף, במהלך ניתוח נתונים, המשתמשים צריכים להיות חרוצים בבחירת ערכי סף מדויקים כתשומות לאלגוריתם הניתוח. אם ערכי הסף מוגדרים גבוהים מדי, התוכנית לא תזהה אירועים שנוצרו על ידי תאים קטנים יותר, תטה תוצאות ותסלף את אוכלוסיית התאים שנמדדה.

מעבר לשלבים קריטיים אלה, ישנם היבטים נוספים של הפרוטוקול שעשויים לדרוש התאמה כאשר חוקרים סוגי תאים או תנאים שונים. לדוגמה, יישום טכניקה זו על דגימות קטנות משמעותית מאלו שנחקרו בעבר מחייב ערוצי כיווץ צרים יותר. ייצור תעלות צרות יותר עשוי לדרוש מתודולוגיות ייצור יקרות יותר, כגון ליתוגרפיה של קרן אלקטרונים38. בנוסף, מכיוון שהתכווצות ΔI/I ~ Δ V תא/Δ V (כאשר התכווצות תא V ו-V הם הנפחים של התא והערוץ המעוותים, בהתאמה), ערוצים צרים יותר גורמים להתנגדותבסיסית גדולה יותר ולירידה ב-SNR19. לבסוף, ערוצים צרים עלולים להגביר את הסיכון לסתימה, מה שהופך את ביצוע הניסוי למאתגר יותר. ניתן לפתור בעיה ספציפית זו על-ידי שימוש במסנני כניסה רבים יותר.

מגבלה אחת של טכניקה זו היא תעלת הכיווץ הסטטית, שיכולה להפעיל רק זן ממוצע יחיד על אוכלוסיית תאים. על מנת להשוות את העיוות של תאים בגדלים שונים, או כדי לחקור אוכלוסיית תאים בודדים בזנים שונים המיושמים, יש להשתמש במכשירים מרובים עם רוחבי תעלות כיווץ משתנים. הפלטפורמה מוגבלת גם על ידי קירות ה-PDMS שלה, המגבילים את טווח הנוקשות שהיא יכולה למדוד. לדוגמה, חלק מתאי הצמח הנוקשים מאוד נוקשים יותר מקירות ה-PDMS שצפויים לעוות אותםב-39,40. יתר על כן, הלחץ הנדרש לדחיפת חלקיקים נוקשים כאלה דרך תעלת ההתכווצות עשוי להתגבר על חוזק הקשר בין ה-PDMS לשקופית הזכוכית, מה שמוביל לדלדול. עם זאת, ניתן לייצר תעלות מיקרופלואידיות לחומרים קשיחים יותר כגון זכוכית או סיליקון, ובכך להתגבר על מגבלות אלה. למרות אילוצים קלים אלה, פלטפורמה זו נותרה אידיאלית למדידה מכנית בתפוקה בינונית של תאים. בהשוואה למתודולוגיות אחרות, כגון אלונקות אופטיות או AFM, טכניקה זו מאפשרת תפוקה גבוהה יותר. בהשוואה לטכנולוגיות מיקרופלואידיות אחרות בעלות תפוקה בינונית עד גבוהה, כגון RT-DC, טכניקה זו מסוגלת לחקור תכונות ביופיזיות רבות יותר על ידי מדידת התכונות הצמיגיות והאלסטיות של תאים בודדים. לבסוף, מערך הניסוי הפשוט, תוך שימוש באלקטרוניקה זולה בניגוד לאופטיקה מורכבת, הופך את הטכניקה הזו לטכנולוגיה נגישה ביותר.

בסך הכל, טכניקת מכנופנוטיפינג זו טומנת בחובה הבטחה עצומה ככלי למחקרים ויישומים פוטנציאליים רבים. הוא יושם בעבר על קבוצה מגוונת של סוגי תאים, כולל דגימות ראשוניות, והראה את יעילותו במדידת ההשפעה של רכיבים ציטוסקטליים וגרעיניים על תכונות ויסקו-אלסטיות תאיות 2,8. יתר על כן, מכיוון שהתאים נשארים ברי קיימא לאחר סינון עם פלטפורמהזו 2, לחוקרים יש הזדמנות לבצע ניתוח במורד הזרם. פלטפורמה זו אידיאלית גם לצימוד עם מיון תאים מיקרופלואידי במעלה הזרם, ומתאימה את עצמה ליישומים כגון מדידת תאי גידול במחזור. במבט קדימה, פלטפורמה זו נותרה כלי תחרותי ורב-תכליתי למדידות מכניות רב-משתניות של תאים בודדים, עם יישומים בהבנת התנהגות התא 41, קביעת התקדמות המחלה42 וניטור התגובה התרופתית43. מעבר למחקר מדעי בסיסי, טכניקה זו טומנת בחובה גם הבטחה גדולה ככלי קליני, במיוחד פלטפורמה זולה ורחבת ידיים לסינון אבחוני מהיר. יתר על כן, בהתחשב בדרישות ההספק הנמוכות והצורך המינימלי בהכנת דגימה לפני המדידה, טכניקה זו מתאימה במיוחד לסביבות דלות משאבים, שבהן מכשירי אבחון נגישים נחוצים מאוד44.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

L. L. S מחזיקה בפטנט אמריקאי מס' 11,383,241: "חישת נקבוביות Mechano-no", J. Kim, S. Han ו- L. L. Sohn, שהונפק ב-12 ביולי 2022.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מ- NIBIB 1R01EB024989-01 ו- NCI 1R01CA190843-01. א' ל' ור' ר' נתמכו על ידי מלגת מחקר לתארים מתקדמים של אגודת H2H8. K. L. C. נתמך על ידי מלגת מחקר לתארים מתקדמים של הקרן הלאומית למדע ומלגת Siebel Scholar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone J.T. Baker 5356-05 Purity (GC)  ≥ 99.5% (https://us.vwr.com/store/product/6057739/acetone-99-5-vlsi-j-t-baker)
Aluminum Foil n/a n/a
Analog Low-Pass Filter ThorLabs EF504 ≤240 kHz Passband, Coaxial BNC Feedthrough (https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=EF504#ad-image-0)
Biopsy Punch Integra Miltex 33-31AA-P/25 1mm, Disposable, with Plunger (https://mms.mckesson.com/product/573313/Miltex-33-31AA-P25)
Blade n/a n/a
BNC Cable Pomona Electronics 2249-C-12 https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/2249-C-12/603323?utm_adgroup=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&utm_source=google&utm_
medium=cpc&utm_campaign=
Shopping_Product_Cable%20Assemblies_NEW&utm_term=
&utm_content=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&gclid=Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO2sErQqnVJ
pj5OXVObuTI8ZUf1ZeIn7zvzGnx
mCWdePrG6SdEJMF3X6ubUaAs
w-EALw_wcB
Cleanroom Polyester Swab Thermo Fisher Scientific 18383 https://www.fishersci.com/shop/products/texwipe-cleantip-alpha-polyester-series-swabs-6/18383
Current Preamplifier DL Instruments 1211 https://www.brltest.com/index.php?main_page=product_info&products_
id=1419
Custom PCB (w/ components) n/a n/a see Supplemental files 4 and 5
DAQ Terminal Block National Instruments BNC-2120 https://www.ni.com/en-in/support/model.bnc-2120.html
DAQ to BNC-2110 cable  National Instruments SHC68-68-EPM https://www.ni.com/en-in/support/model.shc68-68-epm.html
Data Acquisition Board (DAQ) National Instruments PCI-6251 https://www.ni.com/docs/en-US/bundle/pci-6251-feature/page/overview.html
Dessicator Thermo Fisher Scientific 5311-0250 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/5311-0250
Female BNC To Banana Plug Adapter Pomona Electronics 72909 https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/72909/1196318
Fetal Bovine Serum (FBS) VWR 89510-186 https://us.vwr.com/store/product/18706419/avantor-seradigm-select-grade-usda-approved-origin-fetal-bovine-serum-fbs
Glass Cutter Chemglass CG-1179-21 https://chemglass.com/plate-glass-cutters-diamond-tips
Gold Etchant TFA Transene NC0977944 https://www.fishersci.com/shop/products/NC0977944/NC0977944
Hot Plate Thermo Fisher Scientific SP131825 
Isopropyl Alcohol Spectrum Chemical I1056-4LTPL Purity (GC)  ≥99.5% (https://www.spectrumchemical.com/isopropyl-alcohol-99-percent-fcc-i1056)
Metal Hardware Enclosure Hammond Manufacturing EJ12126 https://www.digikey.com/en/products/detail/hammond-manufacturing/EJ12126/2423415
Methanol Sigma-Aldrich 34860 Purity (GC)  ≥99.8% (https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/substance/methanol320467561)
MF-321 Developer Kayaku Advanced Materials n/a https://kayakuam.com/products/mf-321/
MICROPOSIT S1813 Positive Photoresist DuPont n/a https://kayakuam.com/products/microposit-s1800-g2-series-photoresists/
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010049 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010049?SID=srch-hj-10010049
Photomask Fineline Imaging n/a Photomask are custom ordered from our CAD designs (https://www.fineline-imaging.com/)
Plain Glass Microscope Slide Fisher Scientific 12-553-5B Material: Soda Lime, L75 x W50 mm, Thickness: 0.90–1.10 mm 
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-001 https://harrickplasma.com/plasma-cleaners/expanded-plasma-cleaner/
Plastic Petri Dish Thermo Fisher Scientific FB0875712 100 mm (https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-raised-ridge-100-x-15mm/FB0875712)
Pressure Controller Fluigent MFCS-EZ https://www.fluigent.com/research/instruments/pressure-flow-controllers/mfcs-series/
Pressure Controller Software Fluigent MAESFLO
Programming & Computation Software MATLAB R2021b for data acquisition and analysis (https://www.mathworks.com/products/matlab.html)
PTFE Tubing Cole Parmer 06417-31 0.032" ID x 0.056" (https://www.coleparmer.com/i/masterflex-transfer-tubing-microbore-ptfe-0-032-id-x-0-056-od-100-ft-roll/0641731)
Scepter 2.0 Handheld Automatic Cell Counter Millapore Sigma PHCC20060 https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/mm/phcc20060
Silicon Wafer Wafer World 2885 76.2 mm, Single Side Polished (https://www.waferworld.com/product/2885)
Spin Coater n/a n/a
SU-8 3025 Negative Photoresist Kayaku Advanced Materials n/a https://kayakuam.com/products/su-8-2000/
SU8 Developer Kayaku Advanced Materials n/a https://kayakuam.com/products/su-8-developer/
Sygard 184 Polydimethlysiloxane Dow Chemical 4019862 https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/
Tape Scotch 810-341296 https://www.staples.com/Scotch-Magic-Tape-810-3-4-x-36-yds-1-Core/product_130567?cid=PS:GS:SBD:PLA:OS&gclid=
Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO
2sErRwzrrgjU0NjFkDkne1xm
vT7ekS3tdzvAgiMDwPoxocgH
VTQZi7vJgaAvQZEALw_wcB
Titanium, Platinum, Gold n/a n/a
Triple Output Power Supply Keysight E36311A https://www.newark.com/keysight-technologies/e36311a/dc-power-supply-3o-p-6v-5a-prog/dp/15AC9653
UV Mask Aligner Karl Suss America MJB3 Mask Aligner 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pegoraro, A. F., Janmey, P., Weitz, D. A. Mechanical properties of the cytoskeleton and cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (11), 022038 (2017).
  2. Kim, J., et al. Characterizing cellular mechanical phenotypes with mechano-node-pore sensing. Microsystems & Nanoengineering. 4, 17091 (2018).
  3. Mierke, C. T. Bidirectional mechanical response between cells and their microenvironment. Frontiers in Physics. 9, 619 (2021).
  4. Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, and metastasis: The force journey of a tumor cell. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1), 113-127 (2009).
  5. Nia, H. T., Munn, L. L., Jain, R. K. Physical traits of cancer. Science. 370 (6516), (2020).
  6. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).
  7. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: The role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  8. Li, B., et al. Mechanical phenotyping reveals unique biomechanical responses in retinoic acid-resistant acute promyelocytic leukemia. iScience. 25 (2), 103772 (2022).
  9. Kozminsky, M., Sohn, L. L. The promise of single-cell mechanophenotyping for clinical applications. Biomicrofluidics. 14 (3), 031301 (2020).
  10. Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic force microscopy in characterizing cell mechanics for biomedical applications: A review. IEEE Transactions on Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
  11. Wottawah, F., et al. Optical rheology of biological cells. Physical Review Letters. 94 (9), 1-4 (2005).
  12. Darling, E. M., Di Carlo, D. High-throughput assessment of cellular mechanical properties. Annual Review of Biomedical Engineering. 17 (1), 35-62 (2015).
  13. Carey, T. R., Cotner, K. L., Li, B., Sohn, L. L. Developments in label-free microfluidic methods for single-cell analysis and sorting. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 11 (1), 1529 (2019).
  14. Bagnall, J. S., et al. Deformability of tumor cells versus blood cells. Scientific Reports. 5, 18542 (2015).
  15. Byun, S., et al. Characterizing deformability and surface friction of cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).
  16. Otto, O., et al. Real-time deformability cytometry: On-the-fly cell mechanical phenotyping. Nature Methods. 12 (3), 199-202 (2015).
  17. Gossett, D. R., et al. Hydrodynamic stretching of single cells for large population mechanical phenotyping. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (20), 7630-7635 (2012).
  18. Guck, J., Chilvers, E. R. Mechanics meets medicine. Science Translational Medicine. 5 (212), 3-6 (2013).
  19. Balakrishnan, K. R., et al. Node-pore sensing: A robust, high-dynamic range method for detecting biological species. Lab on a Chip. 13 (7), 1302-1307 (2013).
  20. Carbonaro, A., Sohn, L. L. A resistive-pulse sensor chip for multianalyte immunoassays. Lab on a Chip. 5 (10), 1155-1160 (2005).
  21. Saleh, O. A., Sohn, L. L. Direct detection of antibody-antigen binding using an on-chip artificial pore. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (3), 820-824 (2003).
  22. Saleh, O. A., Sohn, L. L. An artificial nanopore for molecular sensing. Nano Letters. 3 (1), 37-38 (2003).
  23. Saleh, O. A., Sohn, L. L. Quantitative sensing of nanoscale colloids using a microchip Coulter counter. Review of Scientific Instruments. 72 (12), 4449-4451 (2001).
  24. DeBlois, R. W., Bean, C. P. Counting and sizing of submicron particles by the resistive pulse technique. Review of Scientific Instruments. 41 (7), 909-916 (1970).
  25. Li, B., et al. Evaluating sources of technical variability in the mechano-node-pore sensing pipeline and their effect on the reproducibility of single-cell mechanical phenotyping. PLoS ONE. 16 (10), 0258982 (2021).
  26. Zhang, Z. M., Chen, S., Liang, Y. Z. Baseline correction using adaptive iteratively reweighted penalized least squares. Analyst. 135 (5), 1138-1146 (2010).
  27. Alibert, C., Goud, B., Manneville, J. B. Are cancer cells really softer than normal cells. Biology of the Cell. 109 (5), 167-189 (2017).
  28. Fujiwara, I., Zweifel, M. E., Courtemanche, N., Pollard, T. D. Latrunculin A accelerates actin filament depolymerization in addition to sequestering actin monomers. Current Biology. 28 (19), 3183-3192 (2018).
  29. Saleh, O. A. A novel resistive pulse sensor for biological measurements. , Princeton University. Princeton. PhD Thesis (2003).
  30. Dokukin, M. E., Guz, N. V., Sokolov, I. Quantitative study of the elastic modulus of loosely attached cells in AFM indentation experiments. Biophysical Journal. 104 (10), 2123-2131 (2013).
  31. Li, Q., et al. Probing the elasticity of breast cancer cells using AFM. 13th International Conference on Biomedical Engineering. IFMBE Proceedings. Lim, C. T., Goh, J. C. H. 23, Springer. Berlin, Heidelberg. 2122-2125 (2009).
  32. Rother, J., et al. Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines. Open Biology. 4 (5), 140046 (2014).
  33. Li, Q., et al. AFM indentation study of breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (4), 609-613 (2008).
  34. Xu, C., et al. Elasticity measurement of breast cancer cells by atomic force microscopy. Proc. SPIE 9230. Twelfth International Conference on Photonics and Imaging in Biology and Medicine. (PIBM 2014). 92300, (2014).
  35. Alcaraz, J., et al. Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 84 (3), 2071-2079 (2003).
  36. Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic force microscopy in characterizing cell mechanics for biomedical applications: A review. IEEE Transactions on Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
  37. Urbanska, M., et al. A comparison of microfluidic methods for high-throughput cell deformability measurements. Nature Methods. 17, 587-593 (2020).
  38. Hill, R. T., Chilkoti, A. Surface Patterning. Biomaterials Science: An Introduction to Materials: Third Edition. , Elsevier Academic Press. NY. 276-301 (2013).
  39. Wang, Z., Volinsky, A. A., Gallant, N. D. Crosslinking effect on polydimethylsiloxane elastic modulus measured by custom-built compression instrument. Journal of Applied Polymer Science. 131 (22), 41050 (2014).
  40. Gibson, L. J. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society Interface. 9 (76), 2749-2766 (2012).
  41. Stephens, A. D., Banigan, E. J., Adam, S. A., Goldman, R. D., Marko, J. F. Chromatin and lamin a determine two different mechanical response regimes of the cell nucleus. Molecular Biology of the Cell. 28 (14), 1984-1996 (2017).
  42. Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Force microscopy of nonadherent cells: A comparison of leukemia cell deformability. Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).
  43. Evers, T. M. J., Holt, L. J., Alberti, S., Mashaghi, A. Reciprocal regulation of cellular mechanics and metabolism. Nature Metabolism. 3 (4), 456-468 (2021).
  44. Balakrishnan, K. R., et al. Node-pore sensing enables label-free surface-marker profiling of single cells. Analytical Chemistry. 87 (5), 2988-2995 (2015).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 190
חישת נקבוביות Mechano-node: פלטפורמה מהירה ונטולת תוויות למדידות ויסקואלסיות של תאים בודדים מרובי פרמטרים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lai, A., Rex, R., Cotner, K. L.,… More

Lai, A., Rex, R., Cotner, K. L., Dong, A., Lustig, M., Sohn, L. L. Mechano-Node-Pore Sensing: A Rapid, Label-Free Platform for Multi-Parameter Single-Cell Viscoelastic Measurements. J. Vis. Exp. (190), e64665, doi:10.3791/64665 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter