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Bioengineering

Mechano-Node-Pore Sensing: Eine schnelle, markierungsfreie Plattform für viskoelastische Multiparameter-Einzelzellmessungen

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64665
Automatic Translation
*1, *2, 1, 3, 1,3, 1,2
1Graduate Program in Bioengineering, University of California, Berkeley and University of California, San Francisco, 2Department of Mechanical Engineering, University of California, Berkeley, 3Department of Electrical Engineering and Computer Sciences, University of California, Berkeley
* These authors contributed equally

Summary

Hier wird eine Methode zur mechanischen Phänotypisierung einzelner Zellen unter Verwendung einer elektronikbasierten mikrofluidischen Plattform namens Mechano-Node-Pore Sensing (Mechano-NPS) vorgestellt. Diese Plattform hält einen moderaten Durchsatz von 1-10 Zellen / s aufrecht und misst gleichzeitig die elastischen und viskosen biophysikalischen Eigenschaften der Zellen.

Abstract

Zelluläre mechanische Eigenschaften sind an einer Vielzahl von biologischen Prozessen und Krankheiten beteiligt, die von der Stammzelldifferenzierung bis zur Krebsmetastasierung reichen. Herkömmliche Methoden zur Messung dieser Eigenschaften, wie Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Mikropipettenaspiration (MA), erfassen reichhaltige Informationen, die die volle viskoelastische Reaktion einer Zelle widerspiegeln. Diese Methoden sind jedoch durch einen sehr geringen Durchsatz begrenzt. Hochdurchsatzansätze wie die Echtzeit-Deformierbarkeitszytometrie (RT-DC) können nur begrenzte mechanische Informationen messen, da sie oft auf Einzelparameter-Anzeigen beschränkt sind, die nur die elastischen Eigenschaften einer Zelle widerspiegeln. Im Gegensatz zu diesen Methoden ist die Mechano-Node-Poren-Sensorik (Mechano-NPS) eine flexible, markierungsfreie mikrofluidische Plattform, die die Lücke schließt, um multiparameter-viskoelastische Messungen einer Zelle mit moderatem Durchsatz zu erreichen. Eine Gleichstrommessung (DC) wird verwendet, um Zellen zu überwachen, während sie einen mikrofluidischen Kanal durchlaufen, und verfolgt ihre Größe und Geschwindigkeit vor, während und nachdem sie durch eine enge Verengung gezwungen werden. Diese Informationen (d. H. Größe und Geschwindigkeit) werden verwendet, um die transversale Verformung jeder Zelle, den Widerstand gegen Verformung und die Erholung von der Verformung zu quantifizieren. Im Allgemeinen bietet diese elektronikbasierte mikrofluidische Plattform mehrere viskoelastische Zelleigenschaften und damit ein vollständigeres Bild des mechanischen Zustands einer Zelle. Da sie eine minimale Probenvorbereitung erfordert, eine einfache elektronische Messung (im Gegensatz zu einer Hochgeschwindigkeitskamera) verwendet und die Vorteile der Standard-Softlithographie-Fertigung nutzt, ist die Implementierung dieser Plattform einfach, zugänglich und an die nachgelagerte Analyse anpassbar. Die Flexibilität, der Nutzen und die Empfindlichkeit dieser Plattform haben einzigartige mechanische Informationen zu einer Vielzahl von Zellen geliefert, mit dem Potenzial für viele weitere Anwendungen in der Grundlagenforschung und klinischen Diagnostik.

Introduction

Einzelzellen sind dynamische, viskoelastische Materialien1. Eine Vielzahl von internen und externen Prozessen (z. B. Beginn der Mitose oder Umbau der extrazellulären Matrix [ECM]) beeinflussen ihre Struktur und Zusammensetzung 2,3,4, was oft zu unterschiedlichen biophysikalischen Eigenschaften führt, die ihren aktuellen Zustand ergänzen. Insbesondere mechanische Eigenschaften haben sich als wichtige Biomarker für die Zellentwicklung, Physiologie und Pathologie erwiesen und liefern wertvolle quantitative Informationen, die kanonische molekulare und genetische Ansätze ergänzen können 5,6,7. Zum Beispiel beschrieben Li et al. kürzlich die mechanischen Unterschiede zwischen arzneimittelresistenten und medikamentenresponsiven akuten promyelozytären Leukämiezellen, während sie auch RNA-seq verwendeten, um differentiell exprimierte Zytoskelett-assoziierte Gene aufzudecken8. Durch das Verständnis des komplexen Zusammenspiels zwischen Einzelzellmechanik und Zellfunktion hat die Mechanophänotypisierung breitere Anwendungen bei der Transformation der Grundlagenforschung und der klinischen Diagnostik9.

Das am weitesten verbreitete Werkzeug zur Messung der Einzelzellmechanik ist die Rasterkraftmikroskopie (AFM). Während AFM eine hochauflösende, lokalisierte Messung zellulärer mechanischer Eigenschaften ermöglicht, bleibt es auf einen Durchsatz von <0,01 Zellen/sbegrenzt 10. Alternativ sind optische Stretcher, die zwei divergente Laserstrahlen verwenden, um suspendierte Einzelzellen11 einzufangen und zu verformen, auf geringfügig höhere Durchsätze von <1 Zelle/n12 beschränkt. Jüngste Fortschritte in der mikrofluidischen Technologie haben eine neue Generation von Geräten für die schnelle, einzellige, mechanische Bewertung ermöglicht12,13. Diese Techniken verwenden enge Verengungskanäle14,15, Scherströmung16 oder hydrodynamische Dehnung 17, um Zellen bei Durchsätzen von 10-1.000 Zellen / s 18 schnell zu verformen. Während die Messrate dieser Ansätze wesentlich schneller ist als bei herkömmlichen Techniken, tauschen sie häufig Hochdurchsatzfähigkeiten gegen begrenzte mechanische Auslesungen aus (Zusatztabelle 1). Alle oben genannten schnellen mikrofluidischen Methoden konzentrieren sich auf grundlegende Einzelparametermetriken wie Transitzeit oder Verformbarkeitsverhältnisse, die nur die elastischen Eigenschaften einer Zelle widerspiegeln. Angesichts der intrinsischen viskoelastischen Natur einzelner Zellen erfordert eine robuste und gründliche mechanische Charakterisierung von Zellen jedoch nicht nur die Berücksichtigung elastischer Komponenten, sondern auch viskoser Reaktionen.

Mechano-node-pore sensing (mechano-NPS)2,8 (Abbildung 1A) ist eine mikrofluidische Plattform, die bestehende Einschränkungen bei der Einzelzell-Mechanophänotypisierung adressiert. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Messung mehrerer biophysikalischer Parameter, einschließlich Zelldurchmesser, relativer Verformbarkeit und Erholungszeit von Verformung, mit einem moderaten Durchsatz von 1-10 Zellen / s. Diese Technik basiert auf Node-Pore Sensing (NPS) 19,20,21,22,23,24, bei der eine Vier-Punkt-Sondenmessung verwendet wird, um den modulierten Stromimpuls zu messen, der von einer Zelle erzeugt wird, die einen mikrofluidischen Kanal durchquert, der durch breitere Regionen, sogenannte "Knoten", segmentiert wurde. Der modulierte Stromimpuls ist das Ergebnis der teilweisen Blockierung des Stromflusses in den Segmenten (d. H. "Poren") und Knoten, wobei in ersteren mehr Strom blockiert wird als in letzteren. Beim Mechano-NPS ist ein Segment, der "Kontraktionskanal", schmaler als ein Zelldurchmesser; Folglich muss sich eine Zelle verformen, um den gesamten Kanal zu durchlaufen (Abbildung 1B). Der Zelldurchmesser kann durch die Größe des Subpulses bestimmt werden, der erzeugt wird, wenn die Zelle die Knotenporen vor dem Kontraktionskanal durchquert (Abbildungen 1B,C). Hier ist |ΔInp|, der Stromabfall, wenn sich die Zelle in der Pore befindet, proportional zum Volumenverhältnis der Zelle zur Pore, V-Zelle/V-Pore 2,8,19. Die Zellsteifigkeit kann durch ΔTc bestimmt werden, die Dauer des dramatisch größeren Subpulses, der entsteht, wenn die Zelle den Kontraktionskanal durchquert (Abbildungen 1B,C). Eine steifere Zelle braucht länger, um den Kanal zu passieren als eine weichere 2,8. Schließlich kann die Zellerholung, die Fähigkeit der Zelle, nach der Verformung zu ihrer ursprünglichen Größe und Form zurückzukehren, durch die Reihe von Subpulsen bestimmt werden, die erzeugt werden, wenn die Zelle die Knotenporen nach dem Kontraktionskanal durchquert (Abbildungen 1B,C). Die Erholungszeit, ΔTr, ist die Zeit, die benötigt wird, bis die aktuellen Subpulse wieder die Größe der vorherigen Subpulse erreichen, bevor die Zelle gequetscht wird. Insgesamt werden die modulierten Stromimpulse, die erzeugt werden, wenn eine Zelle den mikrofluidischen Kanal durchquert, aufgezeichnet und analysiert, um die relevanten mechanischen Einzelzellparameter zu extrahieren (Abbildung 1D)2,8.

Die Reproduzierbarkeit und Benutzerfreundlichkeit dieser elektronikbasierten mikrofluidischen Plattform wurde bereits nachgewiesen25. Darüber hinaus bietet die Plattform eine niedrige Eintrittsbarriere für die Einzelzell-Mechanophänotypisierung. Standard-Softlithographie wird verwendet, um mikrofluidische Geräte herzustellen. Die Messhardware besteht aus kostengünstigen Komponenten, darunter eine einfache Leiterplatte (PCB), ein Netzteil, ein Vorverstärker, eine Datenerfassungsplatine (DAQ) und ein Computer. Schließlich steht benutzerfreundlicher Code für die Datenerfassung und -analyse zur Verfügung, der eine einfache Implementierung ermöglicht. Diese Mechanophänotypisierungstechnik kann Populationen von nicht-malignen und malignen Brust- und Lungenepithelzelllinien unterscheiden, zwischen Unterlinien in primären menschlichen Brustepithelzellen unterscheiden und die Auswirkungen von Zytoskelettstörungen und anderen pharmakologischen Wirkstoffen charakterisieren 2,8. Insgesamt ist diese Plattform ein effektiver Ansatz für die Mechanophänotypisierung einzelner Zellen.

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Protocol

1. Gerätegeometrie entwerfen

  1. Wählen Sie die Breite der Größen- und Wiederherstellungssegmente so, dass sie breiter als der Durchmesser der größten zu messenden Zellen ist, aber auch ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) beibehält. In der ergänzenden Tabelle 2 finden Sie Beispiele für unterschiedliche Größen- und Rückgewinnungssegmentbreiten für verschiedene Zelllinien.
  2. Wählen Sie die Breite des Kontraktionssegments, um eine Dehnung von 30% -40% auf die durchschnittliche Größe der Zellen anzuwenden, die einer Mechanophenotypisierung unterzogen werden sollen. Die Dehnung ist definiert als Equation 1, wobei d der Zelldurchmesser und wc die Kontraktionskanalbreite 2,8 ist. Siehe Zusatztabelle 2 für unterschiedliche Kontraktionssegmentbreiten für verschiedene Zelllinien.
    HINWEIS: Wenn man Zelltypen oder -bedingungen mit wesentlich unterschiedlichen Durchmessern vergleichen möchte, sollten separate Gerätedesigns mit Kontraktionssegmentbreiten verwendet werden, die für jeden Zelltyp / jede Zellbedingung spezifisch sind.
  3. Entwerfen Sie ein Referenzgerät für jede eindeutige Gerätegeometrie. Dies ist notwendig, um De, den effektiven Durchmesser des Größenporensegments des mikrofluidischen Kanals, zu bestimmen.
    HINWEIS: Das Referenzgerät verwendet dieselbe Geometrie wie das primäre Gerät. Die einzige Änderung besteht darin, dass das Kontraktionssegment gleich breit sein sollte wie das Porengrößensegment, um eine Kalibrierung mit Polystyrolperlen bekannter Größe zu ermöglichen. Die Verbreiterung der Kontraktion verhindert, dass die Polystyrolperlen den Kontraktionskanal während der Kalibrierung verstopfen. Der Kalibrierungsvorgang wird in den Schritten 4.1 und 5.3.1 näher beschrieben. Die Kalibrierung kann auch mit einem handelsüblichen Zellzähler erfolgen, wobei in diesem Fall kein Referenzgerät benötigt wird. Dieser Vorgang wird in Schritt 4.2 beschrieben.
  4. Wählen Sie die Kanalhöhe so, dass sich die größten interessierenden Zellen innerhalb des Kontraktionssegments2 ohne Einschränkung vollständig verlängern können. Stellen Sie sicher, dass die Kanalhöhe größer als hmin Equation 2 ist (dies setzt voraus, dass die Zelle eine sphärische Vorverformung aufweist und dass während der Verformung eine isometrische Verformung entlang der Kanallänge und -höhe auftritt).
    HINWEIS: Angesichts der Größe eines Stromsubpulses Equation 3ist das Gesamt-SNR umso niedriger, je größer das hmin ist.
  5. Entwerfen und erstellen Sie eine Fotomaske mit computergestützter Designsoftware mit den gewählten Kanalbreiten. Eine Beispieldatei finden Sie in Ergänzungsdatei 1. Skalieren Sie das mikrofluidische Maskendesign um 1,5 %, um die Schrumpfung von Polydimethylsiloxan (PDMS) nach dem Abziehen vom Negativmaster zu berücksichtigen.
    HINWEIS: Ein Array von Geräten kann auf einer einzelnen Maske enthalten sein, solange das gesamte Array die Größe des Wafers nicht überschreitet (ergänzende Abbildung 1A).
  6. Entwerfen und erstellen Sie eine Fotomaske mit Elektroden, die verwendet wird, um eine Vier-Punkt-Sondenmessung des mikrofluidischen Gerätestroms durchzuführen (Abbildung 1D). Eine Beispieldatei finden Sie in Ergänzungsdatei 1.
    HINWEIS: Eine Anordnung von Elektroden kann auf einer einzelnen Maske angebracht werden, solange die Anordnung die Größe des Objektträgers nicht überschreitet (ergänzende Abbildung 1B).

2. Geräte herstellen (Abbildung 2)

  1. Bereiten Sie Elektrodenmuster auf einem Glassubstrat vor.
    1. Schleudern, mustern und verarbeiten Sie einen positiven Fotolack auf einem einfachen Glasobjektträger gemäß Produktdatenblatt. Ein Beispiel für dieses Verfahren ist in der Zusatzakte 2 beschrieben.
    2. Führen Sie Metallabscheidung, Abheben und Goldätzen durch.
      1. Führen Sie eine Dünnschichtabscheidung von 75 Å Ti, 250 Å Pt und 250 Å Au auf dem Objektträger durch. Ein Beispiel für dieses Verfahren mit Elektronenkanonenverdampfung ist in der Zusatzakte 3 beschrieben.
      2. Tauchen Sie den Objektträger 15 Minuten lang in Aceton, um überschüssiges Metall abzuheben.
      3. Verwenden Sie in einem Abzug eine Einwegpipette, um Goldätzmittel auf den Bereich der Elektroden zu tropfen, die dem mikrofluidischen Kanal ausgesetzt werden, wie in der ergänzenden Abbildung 2 gezeigt. Seien Sie vorsichtig, um zu vermeiden, dass Ätzmittel an anderer Stelle auf der Folie fallen.
        ACHTUNG: Goldätzmittel können Haut- und Augenreizungen verursachen. Atmen Sie keine Dämpfe ein und nehmen Sie sie nicht ein. Behandeln Sie vorsichtig, tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) und entsorgen Sie Abfälle gemäß den örtlichen Entsorgungsvorschriften.
      4. Spülen Sie den Objektträger mit entionisiertem (DI) Wasser ab und trocknen Sie ihn mit trockenem Stickstoff (N2).
    3. Wenn mehrere Elektroden auf denselben Objektträger gedruckt sind, würfeln Sie den Objektträger in einzelne Chips.
      1. Verwenden Sie ein Glasschneidewerkzeug, um den Objektträger entlang der gemusterten Elektrodengrenzen zu ritzen.
      2. Zerbrechen Sie das Glas entlang der Partitur, um den Objektträger in einzelne Chips aufzuteilen.
    4. Untersuchen Sie die Elektroden visuell unter einem Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass einzelne Elektroden nicht elektrisch geöffnet sind oder dass Elektroden nicht miteinander kurzgeschlossen sind.
  2. Stellen Sie eine Negativ-Masterform für Kanäle her.
    1. Schichten, Mustern und Verarbeiten eines SU-8-Epoxidlacks auf einem polierten Siliziumwafer gemäß Produktdatenblatt. Ein Beispiel für dieses Verfahren ist in der Zusatzakte 2 beschrieben.
    2. Messen Sie die Merkmalshöhen mit einem Profilometer und untersuchen Sie die Merkmale visuell unter einem Mikroskop (ergänzende Abbildung 3). Stellen Sie sicher, dass die gewünschten Geometrien genau definiert sind.
  3. Form-PDMS-Kanäle mit weicher Lithographie.
    1. Bereiten Sie PDMS vor, indem Sie ein Elastomer und einen Vernetzer im Massenverhältnis 10:1 in einem Einwegbecher wiegen.
      HINWEIS: Für einen Wafer mit einem Durchmesser von 3 Zoll sind 30 g PDMS ausreichend.
    2. Mischen Sie das PDMS kräftig für 30 s mit einer Einweggabel, bis das PDMS undurchsichtig mit Blasen ist.
    3. Entgasen Sie das PDMS in einer Vakuumkammer für ca. 30-90 min oder bis das PDMS transparent und ohne sichtbare Blasen ist.
    4. Legen Sie den Wafer mit der SU-8-Masterform in eine Einweg-Petrischale und gießen Sie PDMS über die Mitte des Wafers.
    5. Die Petrischale mit PDMS und Wafer in eine Vakuumkammer stellen und ca. 30 min entgasen, oder bis keine Blasen mehr im PDMS verbleiben.
    6. Backen Sie das PDMS bei 80 °C für 2 h im Backofen oder auf einer Kochplatte.
    7. Schneiden Sie das PDMS mit einer scharfen Klinge ab und entfernen Sie es vom SU-8 Negativmaster.
    8. Die geformte PDMS-Platte mit einer scharfen Klinge in einzelne Formen schneiden
    9. Entkernen Sie die Ein- und Auslassöffnungen mit einem Einweg-Biopsiestempel. Die besten Ergebnisse erzielen Sie, wenn Sie für jede PDMS-Platte einen neuen Stempel verwenden. Ein schärferer Stempel erzeugt glattkantige Löcher und minimiert Partikel, die den Kontraktionskanal behindern könnten.
      HINWEIS: Der Durchmesser der Zugangslöcher sollte etwas kleiner sein als der Außendurchmesser des Rohres. Wenn beispielsweise Polytetrafluorethylen (PTFE)-Schläuche mit einem Außendurchmesser von 1/32 Zoll verwendet werden, sollte ein 1,5-mm-Loch gestanzt werden.
  4. Verkleben Sie ein Glas-/Elektrodensubstrat mit den PDMS-Kanälen.
    1. Reinigen Sie die Elektrodenglasträger mit Methanol (≥99,8%). Trocken mit trockenem N2.
    2. Reinigen Sie das PDMS-Gerät mit Klebeband, gefolgt von einer Spülung mit Isopropylalkohol (IPA) und entionisiertem Wasser (DI; 18 MΩ/cm2). Trocken mit trockenem N2. Dann noch einmal mit Klebeband reinigen.
    3. Legen Sie das Glassubstrat mit vorgefertigten Elektroden und die vorbereitete PDMS-Form (Feature Side Up) in einen Plasmareiniger.
    4. Beide 2 min (100-300 mTorr, 30 W) Sauerstoffplasma aussetzen.
    5. Richten Sie die PDMS-Form aus und platzieren Sie sie mit der Feature-Seite nach unten auf dem Glassubstrat mit vorgefertigten Elektroden.
      HINWEIS: Die Verklebung erfolgt sofort, sobald das plasmabehandelte PDMS und das Glas in Kontakt kommen. Weitere Trassenänderungen sind daher nicht möglich. Um die Ausrichtung zu erleichtern, können 20 μL einer 2:1-Verdünnung von Methanol in DI-Wasser auf die plasmabehandelte Glasoberfläche pipettiert werden. Die Methanollösung fungiert als physikalische Barriere zwischen dem behandelten Glas und PDMS und ermöglicht Ausrichtungsanpassungen. Wenn Sie Methanol verwenden, backen Sie die ausgerichtete und gesteckte Vorrichtung bei 50 °C für 2 h ein, um die Lösung zu verdampfen und den Klebevorgang abzuschließen.
    6. Untersuchen Sie das verklebte Gerät visuell unter einem Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass die Elektroden und Kanalgeometrien richtig ausgerichtet sind.

3. Zellen messen (Abbildung 1D)

  1. Bereiten Sie Druckquelle, Leiterplatte, Tischhardware und Datenerfassungssoftware vor.
    1. Verbinden Sie das mikrofluidische Gerät über die Klemme mit der Leiterplatte. Ein Beispiel für die Leiterplatte finden Sie in Supplementary File 4 (GERBER-Dateien) und Supplementary File 5 (Schaltplan-, Platinen- und PCB-Stücklistendateien).
      1. Richten Sie die federbelasteten Stifte der Klemme mit den Elektrodenkontaktpads auf dem mikrofluidischen Gerät aus und richten Sie die Stifte der Klemme mit den Löchern auf der Leiterplatte aus.
      2. Führen Sie die Stifte der Klemme fest in die Leiterplattenlöcher ein und stellen Sie sicher, dass die federbelasteten Stifte mit den Elektrodenkontaktpads ausgerichtet bleiben.
    2. Richten Sie die elektronische Hardware ein und schließen Sie sie an.
      1. Verbinden Sie zwei der Ausgangsanschlüsse des Netzteils mit einer Doppelbananenstecker-Bajonett-Neill-Concelman-Buchse (BNC) und einem BNC-Kabel mit dem Versorgungsspannungsanschluss der Leiterplatte.
      2. Schalten Sie das Netzteil ein. Stellen Sie den an den Innenleiter des BNC angeschlossenen Ausgang auf +15 V und den anderen Ausgang auf -15 V ein. Aktivieren Sie beide Ausgänge, um den Stromkreis mit Strom zu versorgen.
      3. Verbinden Sie den dritten Ausgangsanschluss des Netzteils mit einem BNC-Kabel mit dem Eingangsspannungsanschluss der Leiterplatte. Stellen Sie den Ausgang auf die gewünschte angelegte Spannung ein, aktivieren Sie ihn jedoch erst, wenn Sie das Experiment starten.
      4. Verbinden Sie den Ausgangsstromanschluss der Leiterplatte mit einem BNC-Kabel mit dem Eingang des Stromvorverstärkers.
      5. Verbinden Sie den Ausgang des Stromvorverstärkers mit einem BNC-Kabel mit einem analogen Eingang am BNC-Klemmblock des Datenerfassungssystems. Schließen Sie optional einen analogen Tiefpassfilter in Linie mit dem BNC-Kabel an, um hochfrequente Störungen herauszufiltern.
        HINWEIS: Um das SNR zu verbessern, können die Leiterplatte und das Gerät in einem dicken Metallgehäuse untergebracht sein. Alle BNC-Kabel und fluidischen Schläuche können durch in das Gehäuse gebohrte Löcher geführt werden.
    3. Installieren und Einrichten der erforderlichen Software auf dem PC
      1. Schalten Sie den Druckregler ein und schließen Sie ihn an den PC an. Installieren Sie die erforderliche Druckreglersoftware gemäß den Anweisungen des Herstellers.
      2. Installieren Sie MATLAB und die Data Acquisition Toolbox auf dem PC. Stellen Sie sicher, dass die erforderlichen Treiber für das Datenerfassungssystem installiert sind, damit die MATLAB Data Acquisition Toolbox-Schnittstelle es erkennen kann.
      3. Laden Sie das mitgelieferte Datenerfassungsskript "NPS.m" von https://github.com/sohnlab/node-pore-sensing-public herunter.
    4. Öffnen und konfigurieren Sie das Datenerfassungsskript.
      1. Legen Sie die richtigen Werte fest, um die Datenerfassungssitzung zu initialisieren, einschließlich der Hersteller-ID, der Geräte-ID des DAQ und der Nummer des analogen Eingangskanals (Zeilen 34-36 im enthaltenen Skript).
        HINWEIS: Die Geräte-ID kann über die Funktion "daq.getDevices" oder "daqlist" gefunden werden.
      2. Stellen Sie die gewünschte Abtastrate für die Erfassung ein (Zeile 23 im mitgelieferten Skript). Für optimale Ergebnisse sollte es auf mindestens 10 kHz eingestellt werden.
  2. Bereiten Sie die Zellsuspension vor.
    1. Eine Lösung von 2% fetalem Rinderserum (FBS) in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) herstellen und mit einem 0,22 μm Filter filtrieren.
    2. Kultur und Vorbereitung der Zellen nach dem entsprechenden Zellkulturprotokoll der Zelllinie der Wahl. Die Zellen werden in der vorbereiteten Lösung von 2% FBS in 1x PBS in einer Konzentration von 1-5 x 105 Zellen/ml suspendiert. Halten Sie die Zellen für die Dauer der Experimente auf Eis.
  3. Messen Sie die physikalischen Eigenschaften der Zellen.
    1. Legen Sie die Zellprobe in den Schlauch und verbinden Sie sie mit dem Geräteeinlass.
      1. Schneiden Sie 30 cm PTFE-Schläuche mit einer Rasierklinge oder einem scharfen Messer ab.
      2. Befestigen Sie ein Ende des Schlauchs an einer Luer-Lock-Spritze. Verwenden Sie die Spritze, um die Zellprobe in das andere Ende des Schlauchs zu ziehen.
      3. Führen Sie den Schlauch vorsichtig in den Einlass des Geräts ein.
      4. Verbinden Sie das gegenüberliegende Ende des Schlauchs mit dem mikrofluidischen Druckregler.
        HINWEIS: Ein Filter kann zwischen dem mikrofluidischen Druckregler und dem Schlauch hinzugefügt werden, um einen Flüssigkeitsrückfluss in den Druckregler zu verhindern.
    2. Führen Sie das Experiment aus.
      1. Stellen Sie den gewünschten konstanten Steuerdruck auf der Druckreglersoftware ein und lassen Sie die Probe das Gerät füllen.
        HINWEIS: Der Druck beträgt typischerweise 2-21 kPa. Die Strömungsgeschwindigkeit muss langsam genug sein, um klar definierte Impulse zu ermöglichen, aber schnell genug, um einen ausreichenden Durchsatz zu ermöglichen.
        1. Wenn sich in den mikrofluidischen Kanälen Blasen bilden, verwenden Sie eine Sackgassenfüllung: Stecken Sie den Geräteauslass und üben Sie einen niedrigen Druck auf den Einlass aus, um Luft durch das gasdurchlässige PDMS zu drücken. Das Hinterlassen von Blasen im Kanal führt zu einer instabilen Strombasislinie und verhindert genaue Messungen.
        2. Wenn Schmutz den mikrofluidischen Kanal verstopft, entfernen Sie ihn, indem Sie leicht auf die Oberseite des PDMS-Geräts drücken, während Sie den Antriebsdruck ausüben, einen höheren Druck "pulsieren", indem Sie den Druck ein- und ausschalten oder den Schlauch entfernen und wieder einsetzen. Wenn die Trümmer zurückbleiben, kann es notwendig sein, auf ein neues Gerät umzusteigen.
      2. Stellen Sie die gewünschte Spannung ein, indem Sie den Spannungsregler am Netzteil drehen, und aktivieren Sie die Spannung durch Drücken der Ein-Taste .
        HINWEIS: Die Spannung beträgt typischerweise 1-5 V. Wählen Sie die niedrigste Spannung, die für ein angemessenes SNR erforderlich ist. Für alle zu vergleichenden Bedingungen sollte die gleiche Spannung verwendet werden.
      3. Schalten Sie den Stromvorverstärker ein und stellen Sie die Empfindlichkeit (A/V) so niedrig wie möglich ein; Alternativ können Sie die Verstärkung (V/A) so hoch wie möglich einstellen, ohne den Vorverstärker zu überlasten oder die maximale analoge Eingangsspannung des Datenerfassungsgeräts zu überschreiten. In dieser Studie wurde die Empfindlichkeit auf 10-7 A / V eingestellt.
        HINWEIS: Der richtige Empfindlichkeits-/Verstärkungswert hängt sowohl von der angelegten Spannung als auch vom Basiswiderstand des mikrofluidischen Kanals ab.
      4. Klicken Sie auf die grüne Schaltfläche Ausführen im MATLAB-Menübandmenü, um das Datenerfassungsskript NPS.m zu starten und mit der Abtastung und Speicherung der Daten zu beginnen.
      5. Um das Experiment zu beenden, drücken Sie die Schaltfläche Stopp in der unteren linken Ecke des Abbildungsfensters, um das Datenerfassungsskript zu stoppen. Deaktivieren Sie den Netzteilausgang, indem Sie die Ein-Taste drücken . Stellen Sie die Druckquelle in der Druckreglersoftware auf Nulldruck ein.
      6. An diesem Punkt kann das Experiment angehalten werden, um eine oder mehrere der folgenden Aktionen auszuführen:
        1. Ersetzen Sie das aktuelle Gerät durch ein neues.
        2. Beladen Sie den Schlauch mit weiteren Zellproben.
          HINWEIS: Um eine Kreuzkontamination der Probe zu vermeiden, verwenden Sie neue Geräte, um Zellen verschiedener Typen oder Bedingungen zu messen.
        3. Lösen Sie das Gerät von der Leiterplatte und untersuchen Sie den Zustand des Kanals unter einem Mikroskop. Um das Experiment mit demselben Gerät neu zu starten, muss darauf geachtet werden, dass keine Luftblasen entstehen. Es kann notwendig sein, sanften Druck auf den Spritzenkolben auszuüben, um die Zellprobe am Ende des Schlauchs zu halten, während sie in den Geräteeinlass eingeführt wird.

4. Kalibrieren Sie das mikrofluidische Gerät

  1. Option 1: Messen Sie die Polystyrolperlen in Referenzgeräten.
    1. Wählen Sie eine Polystyrolperlengröße, die kleiner als der Größenkanal ist.
    2. Fügen Sie der gefilterten PBS- und FBS-Lösung, die während der Zellexperimente verwendet wurde, 1,5% Tween- und Styroporperlen in einer Konzentration von 1-3 x 105 Perlen / ml hinzu.
    3. Fahren Sie mit dem in Abschnitt 3 beschriebenen Experiment unter Verwendung des in Schritt 1.3 beschriebenen Referenzgeräts fort und legen Sie dieselbe Spannung an, die während des Experiments verwendet wurde. Verwenden Sie die durchschnittliche Größe des aktuellen Abfalls, der erzeugt wird, wenn Perlen die Größenporen passieren, und den bekannten Durchmesser der Perlen, um De zu berechnen, wie in Abschnitt 5 beschrieben.
  2. Option 2: Messen Sie die Zellgröße selbstständig mit einem separaten Messgerät.
    1. Anstatt dem Protokoll in Schritt 4.1 zu folgen, verwenden Sie ein handelsübliches Zellgrößenmessgerät, um die durchschnittliche Größe der Zellen in der Probe zu messen. In diesem Fall wird kein Referenzgerät benötigt. Verwenden Sie den durchschnittlichen Stromabfall, der erzeugt wird, wenn Zellen die Größenpore passieren, und den gemessenen durchschnittlichen Zelldurchmesser, um De wie in Abschnitt 5 beschrieben zu berechnen.

5. Analysieren Sie Daten, um Zellphänotypen zu extrahieren

HINWEIS: Die Datenverarbeitung kann mit der MATLAB-Befehlszeilenschnittstellen-Programmdatei mNPS_procJOVE.m auf https://github.com/sohnlab/NPS-analysis-JOVE durchgeführt werden. Weitere Anweisungen finden Sie in der Zusatzdatei 6 .

  1. Vorverarbeitung der Daten (Abbildung 3A).
    1. Berechnen Sie den gemessenen elektrischen Strom, indem Sie den im Strom-Spannungs-Vorverstärker verwendeten Verstärkungswert auf die vom Datenerfassungsgerät erfassten Rohdaten anwenden.
    2. Entfernen Sie hochfrequentes Rauschen, indem Sie eine rechteckige Glättungsfunktion und/oder einen Tiefpassfilter auf die Rohstrommessung anwenden. Berechnen Sie dann die gefilterten Daten erneut auf eine niedrigere Abtastrate. Berechnen Sie außerdem die entsprechenden Zeitstempeldaten mit dieser niedrigeren Abtastrate.
    3. Berechnen Sie ein angepasstes Basisstromsignal, indem Sie eine Methode wie asymmetrische Glättung der kleinsten Quadrateanwenden 26.
    4. Berechnen Sie die ungefähre erste Ableitung (Differenzsignal) der vorverarbeiteten aktuellen Daten, indem Sie die Differenz zwischen nachfolgenden Datenpunkten nehmen.
  2. Identifizieren Sie Zellereignisse und extrahieren Sie Subpulsdaten (Abbildung 3B).
    1. Suchen Sie nach Kandidatenzellereignissen, indem Sie die vorverarbeiteten Daten untersuchen. Zellereignisse zurückweisen, die sich mit anderen Zellereignissen überschneiden (d. h. Koinzidenzereignisse) (ergänzende Abbildung 4), eine schlechte Baseline-Anpassung aufweisen oder eine unerwartete oder fehlerhafte Pulsform aufweisen (z. B. wenn eine Verstopfung im Kanal vorhanden gewesen sein könnte).
    2. Extrahieren Sie Subpulsdaten für jedes Zellereignis.
      1. Jedes Knotenporensegment erscheint als entsprechender Subimpuls innerhalb des Gesamtsignalimpulses (Abbildungen 1B, C). Identifizieren Sie den Beginn jedes Subimpulses, indem Sie den Zeitpunkt berechnen, an dem das Differenzsignal einen lokalen Mindestwert erreicht. Identifizieren Sie das Ende jedes Subimpulses, indem Sie den Zeitpunkt berechnen, an dem das Differenzsignal einen lokalen Maximalwert erreicht.
      2. Bestimmen Sie die Breite jedes Subpulses als verstrichene Zeit zwischen Start- und Endzeitpunkt. Bestimmen Sie die Amplitude jedes Subimpulses, indem Sie den Mittelwert der Differenz zwischen dem gemessenen Strom und dem Basisstrom für alle Datenpunkte zwischen den Start- und Endzeitpunkten berechnen.
  3. Bestimmen Sie den Zellmechanophänotyp für jedes Zellereignis basierend auf Subpulsdaten.
    1. Bestimmen Sie den Zellendurchmesser d basierend auf der Gleichung von Deblois und Bean24:
      Equation 4
      Dabei ist ΔI/I das mittlere Verhältnis von Subpulsamplitude zu Basislinienstrom in den Größensubpulsen, De der effektive Durchmesser des Kanals (gemessen in Schritt 4) und L die Gesamtlänge des Knotenporenkanals.
      1. D e wird bestimmt, indem der Mittelwert ΔI/I berechnet wird, der von einer Gruppe von Partikeln eines bekannten Durchmessers (entweder Zellen oder Perlen, siehe Schritt 4) erzeugt wird, wobei der bekannte Durchmesser als d verwendet wird und Gleichung 1 für De gelöst wird.
    2. Quantifizieren Sie den Widerstand der Zelle gegen Verformung.
      1. Bestimmen Sie die Strömung der Fluidgeschwindigkeit U, indem Sie die mittlere Zellgeschwindigkeit in den Größensubpulsen unter Verwendung der bekannten Segmentlängen und der gemessenen Dauer jedes Subpulses berechnen.
      2. Bestimmen Sie den Ganzzellverformbarkeitsindex (wCDI), definiert von Kim et al.2 als:
        Equation 5
        wobei L c die Länge des Kontraktionssegments, derh-Kanal die Kanalhöhe und ΔTc die Dauer des Kontraktionssubpulses ist.
    3. Identifizieren Sie die Erholungszeit der Zelle von der Verformung, definiert als der erste Erholungssubpuls mit einer Amplitude innerhalb von 8% der mittleren Amplitude aus dem Größensubpuls2.
    4. Berechnen Sie die Querverformung der Zelle innerhalb des Kontraktionssegments.
      1. Berechnen Sie den effektiven Durchmesser des Kontraktionssegments (De,c) gemäß der Definition von Kim et al.2: Equation 6, wobei w c die Breite des Kontraktionssegments und wnp die Breite aller anderen Segmente ist.
      2. Berechnen Sie den äquivalenten sphärischen Durchmesser dc der Zelle innerhalb der Kontraktion, indem Sie erneut die Gleichung von Deblois und Bean24 verwenden:
        Equation 7
        wobei ΔI c/I c das Verhältnis von Subpulsamplitude zu Basisstrom im Kontraktionssubpuls und Lc die Länge des Kontraktionssegments ist.
      3. Berechnen Sie die Dehnungslänge derZelle , wie von Kim et al.2 beschrieben:
        Equation 8
      4. Schließlich berechnet man die transversale Verformung der Zelle δVerformung, die von Kim et al.2 als definiert wirdEquation 9.

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Representative Results

Die hier vorgestellte Mechanophänotypisierungsplattform ist ein einfacher und vielseitiger Ansatz, um die biophysikalischen Eigenschaften einzelner Zellen mit moderatem Durchsatz zu messen. Die Zellen werden durch den mikrofluidischen Kanal (Abbildung 1A) unter Verwendung eines konstanten druckgetriebenen Flusses geleitet. Während des Passierens der Zellen werden die Länge des mikrofluidischen Kanals und die erzeugten Stromimpulse mit der Datenerfassungshardware aufgezeichnet. Das erfasste Signal (Abbildung 1B,C) wird dann mit einer benutzerdefinierten Software auf MATLAB verarbeitet, um die relevanten mechanischen Einzelzelleigenschaften zu extrahieren. Abbildung 1D zeigt eine grafische Übersicht des Versuchsprotokolls.

Zur Herstellung von Geräten wird zunächst eine Negativ-Masterform erstellt und zum Gießen von PDMS verwendet (Abbildung 2). Erfolgreiche Masterformen, die in der ergänzenden Abbildung 3 dargestellt sind, enthalten glatte, vertikale Seitenwände und keine Defekte im mikrofluidischen Kanal (Abbildung 4Ai). Bei der Herstellung dieser ersten Masterform ist Vorsicht geboten, da bei schlecht gefertigten Wafern (ergänzende Abbildung 3) alle Defekte auf alle nachfolgenden PDMS-Gussteile übertragen werden (Abbildung 4Aii), wodurch sie unbrauchbar werden. Erfolgreiche PDMS-Abgüsse werden dann mit strukturierten Elektroden plasmagebunden an Glasobjektträger gebunden (Abbildung 1A).

Für Experimente werden die Elektrodenpads eines Geräts mit der Leiterplatte verbunden (Abbildung 1D), um die Strommessung zu ermöglichen. Schläuche, die eine Zellprobe enthalten, werden dann in den Geräteeinlass eingeführt und mit einem mikrofluidischen Durchflussregler verbunden, wodurch ein druckgetriebener Zellfluss durch den mikrofluidischen Kanal ermöglicht wird. Wichtig ist, dass während eines Experiments eine Live-Anzeige der aktuellen Messung angezeigt wird. Auf diese Weise können Benutzer sicherstellen, dass ihr Gerät wie vorgesehen funktioniert. Erfolgreiche Zelltransitereignisse bestehen aus leicht unterscheidbaren Subpulsen (Abbildung 4Bi). Komplikationen, wie Verstopfungen, können während des Experimentierens auftreten und können durch das Live-Auslesen von Ereignissen mit abnormalen Pulsformen identifiziert werden (Abbildung 4Bii).

Für die Datenanalyse sind die kritischen Signalparameter, die für jedes Zelltransitereignis extrahiert werden müssen, in Abbildung 1B detailliert beschrieben und in Schritt 5.2.2 beschrieben. Das Rohsignal sollte ein ausreichendes SNR aufweisen, um das Rauschen herauszufiltern und die wesentlichen Komponenten zu extrahieren (Abbildung 3A). Entscheidend ist, dass der Stromsignalanstieg von jedem Knoten robust genug sein sollte, so dass Subpulse leicht aus dem Differenzsignal ∂I/∂t identifiziert werden können (Abbildung 3B).

Die gemessenen wCDI und Erholungszeiten können verwendet werden, um direkte Vergleiche zwischen Zellen oder Bedingungen durchzuführen. Insbesondere ist wCDI ein relativer Indikator für die Zellsteifigkeit, der umgekehrt proportional zum Elastizitätsmodul ist (ergänzende Abbildung 5); daher entspricht ein höherer Wert von wCDI einem weicheren mechanischen Phänotyp. In Abbildung 5A haben beispielsweise maligne MCF-7-Zellen eine größere wCDI-Verteilung als nicht-maligne MCF-10A-Zellen, was darauf hindeutet, dass die malignen MCF-7-Zellen weicher sind als ihre nicht-malignen MCF-10A-Gegenstücke. Dies steht im Einklang mit zahlreichen empirischen Studien, die gezeigt haben, dass Krebszellen weicher sind als ihre nicht-bösartigen Gegenstücke27. Ebenso zeigen in Abbildung 5B MCF-10A- und MCF-7-Zellen, die mit Latrunculin behandelt wurden, einen Anstieg der wCDI. Latrunculin ist ein starkes pharmakologisches Mittel, das das Aktinzytoskelett28 stört. Folglich ist es konsistent, einen höheren wCDI und damit einen weicheren Phänotyp in Zellen zu beobachten, die mit diesem Medikament behandelt werden. Schließlich wird in Abbildung 5C wCDI zwischen zwei menschlichen Brustepithelzell-Sublinien verglichen, dem luminalen Epithel (LEP) und dem Myoepithel (MEP). In diesem Vergleich gibt es erneut eine deutliche wCDI-Verteilung , die die beiden primären Zelltypen unterscheidet, was darauf hindeutet, dass LEP-Zellen weicher sind als MEP-Zellen. Über wCDI hinaus können auch Erholungszeiten quantifiziert werden, um einen relativen Indikator für die Zellviskosität zu liefern. Eine längere Erholungszeit weist auf einen viskoseren Phänotyp hin. Abbildung 5D zeigt die Wiederherstellungszeiten, unterteilt in drei verschiedene Kategorien, für jede der Bedingungen in den Abbildungen 5A-C. Unbehandelte MCF-10As und MCF-7 haben einen größeren Anteil an Zellen, die sich sofort erholen (ΔTr = 0), was auf eine niedrigere Viskosität hinweist als ihr mit Latrunculin behandeltes Gegenstück.

wCDI und Erholungszeit sind relative Metriken der Einzelzellelastizität und Viskosität. Daher ist die hier vorgestellte Methode am besten geeignet, um die differentielle Reaktion zwischen mehreren Proben von Interesse zu charakterisieren. In seiner jetzigen Form liefert das hier vorgestellte Protokoll keine absoluten Quantifizierungen definierter mechanischer Parameter wie des Elastizitätsmoduls.

Figure 1
Abbildung 1: Überblick über die Mechanophänotypisierungsplattform. (A) Bild der mikrofluidischen Vorrichtung. (B) Kanalgeometrie mit einem repräsentativen Stromimpuls aus einem Einzelzelltransitereignis. Δ Inp stellt den Stromabfall von der Zelle dar, die in die Pore eintritt, und ΔIc stellt den aktuellen Abfall der Zelle dar, die in die Kontraktion eintritt. Δ T p steht für die Zeit, die die Zelle benötigt, um die Pore zu passieren, Δ Tc stellt die Zeit dar, die die Zelle benötigt, um den Kontraktionskanal zu passieren, und ΔTr stellt die Zeit dar, die die Zelle benötigt, um sich zu erholen. (C) Realer Stromimpuls von einem Zelltransitereignis. (D) Experimenteller Workflow: (1) Zellen werden in PBS suspendiert und (2) mit konstantem Druck durch das mikrofluidische Gerät getrieben. Während die Zellen den mikrofluidischen Kanal passieren, werden (3) Stromimpulse mit Datenerfassungshardware gemessen. (4) Die Stromimpulse werden analysiert, um mehrere mechanische Einzelzelleigenschaften zu extrahieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Überblick über die Geräteherstellung . (A) Negative Masterformen werden (1) mittels Fotolithographie hergestellt. (2) PDMS wird dann auf die Negativ-Masterformen gegossen. (3) Die geformten Geräte werden gewürfelt, mit Einlass- und Auslasslöchern gestanzt. (B) Gleichzeitig werden Glasobjektträger (1) so strukturiert, dass Metallelektroden hergestellt werden. (2) E-Beam-Verdampfung wird verwendet, um Metall auf dem Objektträger abzuscheiden, gefolgt von einem (3) Abhebeprozess, um überschüssiges Metall zu entfernen, wobei die gewünschten Metallelektroden zurückbleiben. (C) Das PDMS-Gerät und das Glas mit Metallelektroden werden dann mit Sauerstoffplasma miteinander verbunden, um den Herstellungsprozess abzuschließen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Datenverarbeitung und -analyse . (A) Die aktuellen Rohdaten (links) werden durch Anwendung einer rechteckigen Glättungsfunktion und eines Tiefpassfilters vorverarbeitet (rechts), gefolgt von einem Resampling auf eine niedrigere Abtastrate. Das Basisstromsignal wird anschließend mit einer asymmetrischen Glättung der kleinsten Quadrate26 versehen. (B) Die Zeitpunkte am Anfang und Ende jedes Subpulses werden im Differenzsignal ∂ I/∂t (links) als lokale Mindest- bzw. Maximalwerte identifiziert. Für jeden Subpuls wird die Breite Δt durch die verstrichene Zeit zwischen Beginn und Ende bestimmt, und die Amplitude ΔI wird durch die mittlere Differenz zwischen dem gemessenen Strom und dem Basislinienstrom bestimmt. Die extrahierten Subpulsdaten können als rechteckiges Signal dargestellt werden (rechts); Jeder Subpuls entspricht einem Segment in der Gerätegeometrie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Beispiele für erfolgreiche und fehlerhafte Ergebnisse während der Herstellung und des Experimentierens . (A) Bilder von PDMS-Abgüssen von Kontraktionssegmenten aus zwei verschiedenen Negativ-Master-Formen. (i) ist ein Beispiel für einen gut verarbeiteten Kanal mit glatten Seitenwänden, klar definierter Geometrie und ohne erkennbare Mängel. (ii) ist ein Beispiel für einen schlecht gefertigten Kanal mit signifikanten Defekten im Kontraktionskanal (rot rechteckig umrandet), der den Partikelfluss entweder ganz oder teilweise behindern würde (Maßstabsbalken = 150 μm). (B) Beispiele für gefilterte Stromimpulse, die von "NPS.m" während der Datenerfassung erzeugt werden. i) Beispiel für ein erfolgreiches Zellereignis, bei dem eine Zelle den Kanal wie vorgesehen durchläuft. ii) Beispiel für Stromimpulse, die erzeugt werden, wenn das Gerät "verstopft" ist. In diesem Fall behindern Trümmer den Zellfluss in der zweiten Pore des Kanals. Dies führt zu Zellereignissen, die in der Mitte des zweiten Größenimpulses "abgeschnitten" erscheinen (durch die rote Linie angezeigt). Die Abnahme des Stroms (gekennzeichnet durch die blauen Linien) nach der "Abschaltung" wird durch Partikel (Trümmer oder Zellen) verursacht, die sich um die Blockade herum ansammeln und daher einen größeren Teil des Stromflusses blockieren. Eine starke Stromspitze nach unten (angezeigt durch das grüne Rechteck) reflektiert ein Teilchen, das in der Lage ist, die Blockierung zu umgehen und daher nur vorübergehend einen größeren Teil des Stroms zu blockieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Beispiele für wCDI und Zellerholung zwischen verschiedenen Bedingungen. (A) wCDI-Verteilung zwischen zwei Brustepithelzelllinien, nicht-malignem MCF-10A und malignem MCF-7. (B) wCDI von MCF-10A oder MCF-7, wobei jeder Zelltyp unbehandelt, mit Lat-A behandelt und mit Lat-B behandelt wurde. (C) wCDI-Verteilung zwischen zwei primären humanen Brustepithel-Sublinien: myoepitheliale (MEP) und luminale epitheliale (LEP) Zellen. (D) Erholungszeiten, die den vier Bedingungen zwischen A, B und C entsprechen. Alle Bedingungen hatten eine Stichprobengröße von n = 99 Zellen. Diese Abbildung wurde mit freundlicher Genehmigung von Kim et al.2 reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Abbildung 1: Beispiele für Gerätearrays sowohl für die mikrofluidischen Kanäle als auch für die Elektroden. Beide Bilder, dargestellt als Transparenzmasken, sollten mit Weiß (transparent darstellend) in den Bereichen, in denen der Fotolack UV ausgesetzt wird, und Schwarz in den Bereichen, in denen er vor UV-Belichtung geschützt wird, gestaltet werden. (A) Eine Anordnung von mikrofluidischen Kanälen mit zwei parallelen Kanälen pro "Gerät" (Rechteck), die auf einem 3-Zoll-Si-Wafer angeordnet sind. Das Gerät ganz rechts ist als "ref" gekennzeichnet und ist, wie in Schritt 1.3 beschrieben, für die Verwendung in der Kalibrierung konzipiert. (B) Eine Anordnung von Elektroden mit zwei Elektroden pro Gerät, so dass beide Kanäle in einer Vorrichtung von (A) über jedem Elektrodendesign von (B) ausgerichtet werden. Dieses Array wurde für einen 2 in x 3 Zoll Glasobjektträger angeordnet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Schematische Darstellung der Bereiche des Elektrodendesigns und des korrekten Wegätzens von Gold (Schritt 2.1.2.3). Die oberste Goldschicht muss von den Messelektroden entfernt werden, da sonst während der Messung Biofouling und Elektrolyse auftreten. Allerdings sollte Gold auf den Kontaktpads verbleiben, denn das weiche Gold sorgt für eine hervorragende elektrische Verbindung mit den Pins des Pogo-Pin-Steckers. (A) Schematische Darstellung, wie sich der mikrofluidische Kanal (blau) mit dem gemusterten Metall (schwarz) schneidet. Wie bereits erwähnt, befindet sich das Metall senkrecht zum mikrofluidischen Kanal und direkt darunter die Messelektroden, an denen Gold geätzt werden muss, während die großen Metallrechtecke an der Seite des Kanals die Kontaktpads sind, in denen Gold verbleiben muss. (B) Schematische Darstellung, wo Goldätzmittel auf das gemusterte Metall aufgetragen werden sollten und wo nicht. Der grüne Bereich zeigt an, wo eine Ätzung erforderlich ist, der gelbe Bereich zeigt an, wo eine Ätzung stattfinden kann und die Wirksamkeit des Geräts nicht beeinträchtigt, und der rote Bereich zeigt an, wo Gold nicht geätzt werden darf. (C) Schematische Darstellung eines typischen, erfolgreich geätzten Geräts. Gelb zeigt Bereiche an, in denen noch Gold vorhanden ist, und Grau zeigt Bereiche an, in denen die Platinschicht freigelegt wurde. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Bilder von erfolgreich und schlecht hergestellten Kontraktionskanälen. (A) Bilder von Kontraktionskanälen auf Negativ-Masterformen von zwei einzelnen Si-Wafern. (i) Ein Beispiel für eine gut gefertigte Masterform, die einen idealen PDMS-Kanal wie den in Abbildung 4Ai gezeigten erzeugen würde. (ii) Ein Beispiel für eine schlecht gefertigte Master-Form, die verwendet wurde, um den PDMS-Kanal zu erzeugen, der in Abbildung 4Aii gezeigt wird. Die in roten Rechtecken umrandeten Bereiche entsprechen den in Abbildung 4Aii angegebenen Defekten und zeigen die Übertragung von Defekten von der Masterform auf die PDMS-Mikrokanäle (Maßstabsbalken = 150 μm). (B) Bilder des Querschnitts von PDMS-Kontraktionskanälen, die die Höhe und Breite verschiedener Formen zeigen. Diese Querschnitte wurden durch Schneiden des PDMS-Kontraktionskanals senkrecht zur Strömungsrichtung erfasst. (i) Ein Beispiel für eine gut hergestellte PDMS-Form, die unter Verwendung des in (Ai) gezeigten Wafers erstellt wurde und glatte vertikale Seitenwände zeigt. (ii) Ein Beispiel für eine schlecht hergestellte PDMS-Form, die unter Verwendung des in (Aii) gezeigten Wafers erstellt wurde und schräge Seitenwände zeigt (Maßstabsbalken = 20 μm). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: Beispiel für ein zusammenfallendes Zellereignis (erzeugt, wenn mehr als eine Zelle den Kanal gleichzeitig durchquert). Das Signal wurde gemäß den Schritten 5.1.1-5.1.3 in Abschnitt 5 des Protokolls verarbeitet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 5: Beziehung zwischen wCDI und Elastizitätsmodul 20,29,30,31,32,33,34,35. (A) Vergleich von Jurkat-, MCF7- und MCF10A-Zellen, gemessen mit dieser Technik und Mikropipettenaspiration. wCDI ist umgekehrt proportional zur kortikalen Spannung. (B) Vergleich von MCF7- und MCF10A-Zellen, gemessen mit dieser Technik und veröffentlichten AFM-Daten. (C) Vergleich von A549- und BEAS-2B-Zellen, gemessen mit dieser Technik und veröffentlichten AFM-Daten. Über mehrere Zelltypen ist wCDI umgekehrt proportional zum Elastizitätsmodul. Diese Abbildung wurde mit freundlicher Genehmigung von Kim et al.2 reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 1: Beispiele für einzellige Mechanophänotypisierungstechniken und deren Vergleich mit Mechano-NPS. Die Techniken sind in der Reihenfolge der Erhöhung des Durchsatzes 12,2,36,37 aufgeführt. Mechanische Informationen beziehen sich darauf, ob das Gerät sowohl die elastischen als auch die viskosen mechanischen Eigenschaften jeder Zelle messen kann. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 2: Beispiel für Größen-, Kontraktions- und Rückgewinnungssegmentbreiten für verschiedene Zelllinien. MEP und LEP beziehen sich auf zwei Linien primärer humaner Brustepithelzellen, wobei MEP sich auf Myoepithelzellen und LEP auf luminale Epithelzellen bezieht 2,8. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Zusatzdatei 1: AutoCAD-Konstruktionsbeispiel. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzdatei 2: Beispielprotokoll für die Fotolithographie-Verarbeitung. Es werden zwei Beispielprotokolle für die Strukturierung und Verarbeitung von Fotolack oder SU-8-Epoxidharz beschrieben. Die erste beschreibt die Anwendung von positivem Fotolack auf einem Objektträger, um als Opferschicht für die Elektrodenherstellung zu wirken. Die zweite beschreibt die Anwendung von SU-8-Epoxidharz auf einem Siliziumwafer, um Reliefstrukturen für das Formen von PDMS-Mikrofluidikkanälen zu erzeugen. Diese Protokolle wurden aus den Datenblättern MF-321 und SU8 3000 des Herstellers übernommen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzdatei 3: Beispielprotokoll für die Dünnschichtabscheidung von 75 Å Ti, 250 Å Pt und 250 Å Au mittels Elektronenstrahlverdampfung. Ein Beispielprotokoll für die Durchführung der Dünnschichtabscheidung von 75 Å Ti, 250 Å Pt und 250 Å Au mit einem Elektronenstrahlverdampfer wird skizziert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzdatei 4: GERBER-Dateien Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzdatei 5: Schaltplan-, Platinen- und PCB-Teilelistendateien Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzdatei 6: MATLAB-Befehlszeilenschnittstelle. Diese Datei enthält detaillierte Anweisungen für die Datenverarbeitung unter Verwendung der MATLAB-Befehlszeilenschnittstelle26. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Die Messung der mechanischen Eigenschaften einzelner Zellen mit dieser Mechanophänotypisierungstechnik besteht aus drei Phasen: Geräteherstellung, Datenerfassung und Datenanalyse. Innerhalb jeder Phase gibt es bemerkenswerte Aspekte, die die experimentellen Ergebnisse erheblich beeinflussen können. Bei der Geräteherstellung sind konsistente Kanalgeometrien und die Einheitlichkeit von Gerät zu Gerät für genaue und wiederholbare Ergebnisse unerlässlich. Insbesondere sollten die Seitenwände jedes Geräts relativ glatt sein (Abbildung 4Ai), und die Kanalhöhen zwischen Replikationsgeräten sollten vergleichbar sein. Alle Geräte mit Defekten, die den Zellfluss teilweise behindern, insbesondere im Kontraktionskanal (Abbildung 4Aii), sollten verworfen werden. Die Verwendung von Geräten mit erkennbaren Defekten in der Kanalgeometrie führt zu ungenauen und nicht reproduzierbaren Ergebnissen. Während der Datenerfassung ist es wichtig, dass der Benutzer während der Datenerfassung das Vorhandensein einer Verstopfung im Kanal erkennen kann. Ein Beispielskript, "NPS.m" (verfügbar unter https://github.com/sohnlab/node-pore-sensing-public), zeigt aktuelle Messungen an, so dass der Benutzer den Kanalzustand und die Zelltransitereignisse in Echtzeit überwachen kann. Die für eine Verstopfung charakteristischen Impulse sind in Abbildung 4B dargestellt. Eine Verstopfung innerhalb des Kontraktionskanals, die einigen Zellen immer noch den Fluss ermöglicht, ist besonders wichtig, da die Zellen an der Stelle der Obstruktion einer erhöhten Belastung ausgesetzt sind, was zu ungenauen wCDIsführt. Schließlich sollten Benutzer während der Datenanalyse sorgfältig genaue Schwellenwerte als Eingaben für den Analysealgorithmus auswählen. Wenn die Schwellenwerte zu hoch eingestellt sind, identifiziert das Programm keine Ereignisse, die von kleineren Zellen erzeugt werden, was die Ergebnisse verzerrt und die gemessene Zellpopulation falsch darstellt.

Über diese kritischen Phasen hinaus gibt es zusätzliche Aspekte des Protokolls, die bei der Untersuchung verschiedener Zelltypen oder -bedingungen angepasst werden müssen. Zum Beispiel erfordert die Anwendung dieser Technik auf Proben, die deutlich kleiner sind als die zuvor untersuchten, schmalere Kontraktionskanäle. Die Herstellung schmalerer Kanäle kann kostspieligere Herstellungsmethoden erfordern, wie z. B. Elektronenstrahllithographie38. Da Δ I / I ~ ΔV-Zelle / Δ V-Kontraktion (wobeiV-Zelle undV-Kontraktion die Volumina der deformierten Zelle bzw. des Kanals sind), führen engere Kanäle zu größeren Basislinienwiderständen und vermindertem SNR19. Schließlich können schmale Kanäle das Verstopfungsrisiko erhöhen, was die experimentelle Ausführung schwieriger macht. Dieses spezielle Problem könnte möglicherweise durch die Verwendung von mehr Einlassfiltern gemildert werden.

Eine Einschränkung dieser Technik ist der statische Kontraktionskanal, der nur eine einzige durchschnittliche Belastung auf eine Zellpopulation anwenden kann. Um die Verformbarkeit von Zellen unterschiedlicher Größe zu vergleichen oder eine einzelne Zellpopulation bei verschiedenen applizierten Stämmen zu untersuchen, müssen mehrere Geräte mit unterschiedlichen Kontraktionskanalbreiten eingesetzt werden. Die Plattform ist auch durch ihre PDMS-Wände begrenzt, die den Bereich der Steifigkeiten einschränken, die sie messen kann. Zum Beispiel sind einige sehr starre Pflanzenzellen steifer als die PDMS-Wände, von denen erwartet werden würde, dass sie sie verformen39,40. Darüber hinaus kann der Druck, der erforderlich ist, um solche steifen Partikel durch den Kontraktionskanal zu drücken, die Festigkeit der Verbindung zwischen PDMS und Glasobjektträger überwinden, was zu Delaminierung führt. Man könnte jedoch mikrofluidische Kanäle zu steiferen Materialien wie Glas oder Silizium herstellen, um so diese Einschränkungen zu überwinden. Trotz dieser geringfügigen Einschränkungen bleibt diese Plattform ideal für mechanische Messungen von Zellen mit mittlerem Durchsatz. Im Vergleich zu anderen Methoden wie optischen Stretchern oder AFM ermöglicht diese Technik einen höheren Durchsatz. Im Vergleich zu anderen mikrofluidischen Technologien mit mittlerem bis hohem Durchsatz, wie RT-DC, ist diese Technik in der Lage, mehr biophysikalische Eigenschaften zu untersuchen, indem sowohl die viskosen als auch die elastischen Eigenschaften einzelner Zellen gemessen werden. Schließlich macht der einfache Versuchsaufbau, der kostengünstige Elektronik im Gegensatz zu komplexen Optiken verwendet, diese Technik zu einer sehr zugänglichen Technologie.

Insgesamt ist diese Mechanophänotypisierungstechnik als Werkzeug für zahlreiche potenzielle Studien und Anwendungen vielversprechend. Es wurde zuvor auf eine Vielzahl von Zelltypen, einschließlich Primärproben, angewendet und hat seine Wirksamkeit bei der Messung des Einflusses von Zytoskelett- und Kernkomponenten auf zelluläre viskoelastische Eigenschaften gezeigt 2,8. Da die Zellen nach dem Screening mit dieser Plattform2 lebensfähig bleiben, haben die Forscher außerdem die Möglichkeit, nachgelagerte Analysen durchzuführen. Diese Plattform eignet sich auch ideal für die Kopplung mit der vorgeschalteten mikrofluidischen Zellsortierung und eignet sich für Anwendungen wie die Messung zirkulierender Tumorzellen. Mit Blick auf die Zukunft bleibt diese Plattform ein wettbewerbsfähiges und vielseitiges Werkzeug für multivariable mechanische Messungen von Einzelzellen, mit Anwendungen zum Verständnis des Zellverhaltens41, zur Bestimmung des Krankheitsverlaufs 42 und zur Überwachung der Arzneimittelreaktion43. Über die wissenschaftliche Grundlagenforschung hinaus ist diese Technik auch als klinisches Werkzeug vielversprechend, insbesondere als kostengünstige Tischplattform für schnelles diagnostisches Screening. Darüber hinaus eignet sich diese Technik aufgrund des geringen Strombedarfs und des minimalen Bedarfs an Probenvorbereitung vor der Messung besonders gut für Umgebungen mit geringen Ressourcen, in denen zugängliche Diagnoseinstrumente dringend benötigtwerden 44.

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Disclosures

L. L. S hält das US-Patent Nr. 11,383,241: "Mechano-node-pore sensing", J. Kim, S. Han und L. L. Sohn, erteilt am 12. Juli 2022.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde durch Zuschüsse von NIBIB 1R01EB024989-01 und NCI 1R01CA190843-01 unterstützt. A. L. und R. R. wurden durch ein H2H8 Association Graduate Research Fellowship unterstützt. K. L. C. wurde durch ein National Science Foundation Graduate Research Fellowship und ein Siebel Scholar Fellowship unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone J.T. Baker 5356-05 Purity (GC)  ≥ 99.5% (https://us.vwr.com/store/product/6057739/acetone-99-5-vlsi-j-t-baker)
Aluminum Foil n/a n/a
Analog Low-Pass Filter ThorLabs EF504 ≤240 kHz Passband, Coaxial BNC Feedthrough (https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=EF504#ad-image-0)
Biopsy Punch Integra Miltex 33-31AA-P/25 1mm, Disposable, with Plunger (https://mms.mckesson.com/product/573313/Miltex-33-31AA-P25)
Blade n/a n/a
BNC Cable Pomona Electronics 2249-C-12 https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/2249-C-12/603323?utm_adgroup=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&utm_source=google&utm_
medium=cpc&utm_campaign=
Shopping_Product_Cable%20Assemblies_NEW&utm_term=
&utm_content=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&gclid=Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO2sErQqnVJ
pj5OXVObuTI8ZUf1ZeIn7zvzGnx
mCWdePrG6SdEJMF3X6ubUaAs
w-EALw_wcB
Cleanroom Polyester Swab Thermo Fisher Scientific 18383 https://www.fishersci.com/shop/products/texwipe-cleantip-alpha-polyester-series-swabs-6/18383
Current Preamplifier DL Instruments 1211 https://www.brltest.com/index.php?main_page=product_info&products_
id=1419
Custom PCB (w/ components) n/a n/a see Supplemental files 4 and 5
DAQ Terminal Block National Instruments BNC-2120 https://www.ni.com/en-in/support/model.bnc-2120.html
DAQ to BNC-2110 cable  National Instruments SHC68-68-EPM https://www.ni.com/en-in/support/model.shc68-68-epm.html
Data Acquisition Board (DAQ) National Instruments PCI-6251 https://www.ni.com/docs/en-US/bundle/pci-6251-feature/page/overview.html
Dessicator Thermo Fisher Scientific 5311-0250 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/5311-0250
Female BNC To Banana Plug Adapter Pomona Electronics 72909 https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/72909/1196318
Fetal Bovine Serum (FBS) VWR 89510-186 https://us.vwr.com/store/product/18706419/avantor-seradigm-select-grade-usda-approved-origin-fetal-bovine-serum-fbs
Glass Cutter Chemglass CG-1179-21 https://chemglass.com/plate-glass-cutters-diamond-tips
Gold Etchant TFA Transene NC0977944 https://www.fishersci.com/shop/products/NC0977944/NC0977944
Hot Plate Thermo Fisher Scientific SP131825 
Isopropyl Alcohol Spectrum Chemical I1056-4LTPL Purity (GC)  ≥99.5% (https://www.spectrumchemical.com/isopropyl-alcohol-99-percent-fcc-i1056)
Metal Hardware Enclosure Hammond Manufacturing EJ12126 https://www.digikey.com/en/products/detail/hammond-manufacturing/EJ12126/2423415
Methanol Sigma-Aldrich 34860 Purity (GC)  ≥99.8% (https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/substance/methanol320467561)
MF-321 Developer Kayaku Advanced Materials n/a https://kayakuam.com/products/mf-321/
MICROPOSIT S1813 Positive Photoresist DuPont n/a https://kayakuam.com/products/microposit-s1800-g2-series-photoresists/
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010049 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010049?SID=srch-hj-10010049
Photomask Fineline Imaging n/a Photomask are custom ordered from our CAD designs (https://www.fineline-imaging.com/)
Plain Glass Microscope Slide Fisher Scientific 12-553-5B Material: Soda Lime, L75 x W50 mm, Thickness: 0.90–1.10 mm 
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-001 https://harrickplasma.com/plasma-cleaners/expanded-plasma-cleaner/
Plastic Petri Dish Thermo Fisher Scientific FB0875712 100 mm (https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-raised-ridge-100-x-15mm/FB0875712)
Pressure Controller Fluigent MFCS-EZ https://www.fluigent.com/research/instruments/pressure-flow-controllers/mfcs-series/
Pressure Controller Software Fluigent MAESFLO
Programming & Computation Software MATLAB R2021b for data acquisition and analysis (https://www.mathworks.com/products/matlab.html)
PTFE Tubing Cole Parmer 06417-31 0.032" ID x 0.056" (https://www.coleparmer.com/i/masterflex-transfer-tubing-microbore-ptfe-0-032-id-x-0-056-od-100-ft-roll/0641731)
Scepter 2.0 Handheld Automatic Cell Counter Millapore Sigma PHCC20060 https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/mm/phcc20060
Silicon Wafer Wafer World 2885 76.2 mm, Single Side Polished (https://www.waferworld.com/product/2885)
Spin Coater n/a n/a
SU-8 3025 Negative Photoresist Kayaku Advanced Materials n/a https://kayakuam.com/products/su-8-2000/
SU8 Developer Kayaku Advanced Materials n/a https://kayakuam.com/products/su-8-developer/
Sygard 184 Polydimethlysiloxane Dow Chemical 4019862 https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/
Tape Scotch 810-341296 https://www.staples.com/Scotch-Magic-Tape-810-3-4-x-36-yds-1-Core/product_130567?cid=PS:GS:SBD:PLA:OS&gclid=
Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO
2sErRwzrrgjU0NjFkDkne1xm
vT7ekS3tdzvAgiMDwPoxocgH
VTQZi7vJgaAvQZEALw_wcB
Titanium, Platinum, Gold n/a n/a
Triple Output Power Supply Keysight E36311A https://www.newark.com/keysight-technologies/e36311a/dc-power-supply-3o-p-6v-5a-prog/dp/15AC9653
UV Mask Aligner Karl Suss America MJB3 Mask Aligner 

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References

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Bioengineering Ausgabe 190
Mechano-Node-Pore Sensing: Eine schnelle, markierungsfreie Plattform für viskoelastische Multiparameter-Einzelzellmessungen
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Lai, A., Rex, R., Cotner, K. L., Dong, A., Lustig, M., Sohn, L. L. Mechano-Node-Pore Sensing: A Rapid, Label-Free Platform for Multi-Parameter Single-Cell Viscoelastic Measurements. J. Vis. Exp. (190), e64665, doi:10.3791/64665 (2022).

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