Summary
Apresentamos aqui um método para fenótipo mecânico de células individuais usando uma plataforma microfluídica baseada em eletrônica chamada detecção de mechano-node-pore (mechano-NPS). Esta plataforma mantém um rendimento moderado de 1-10 células/s enquanto mede as propriedades biofísicas elásticas e viscosas das células.
Abstract
As propriedades mecânicas celulares estão envolvidas em uma ampla variedade de processos biológicos e doenças, que vão desde a diferenciação de células-tronco até a metástase do câncer. Métodos convencionais para medir essas propriedades, como microscopia de força atômica (AFM) e aspiração de micropipeta (MA), capturam informações ricas, refletindo a resposta viscoelástica completa de uma célula; no entanto, esses métodos são limitados por uma taxa de transferência muito baixa. Abordagens de alto rendimento, como a citometria de deformabilidade em tempo real (RT-DC), só podem medir informações mecânicas limitadas, pois geralmente são restritas a leituras de parâmetro único que refletem apenas as propriedades elásticas de uma célula. Em contraste com esses métodos, o sensoriamento de poros de nós mecânicos (mecanano-NPS) é uma plataforma microfluídica flexível e livre de rótulos que preenche a lacuna na obtenção de medições viscoelásticas multiparâmetros de uma célula com rendimento moderado. Uma medição de corrente contínua (CC) é usada para monitorar as células à medida que elas transitam por um canal microfluídico, rastreando seu tamanho e velocidade antes, durante e depois de serem forçadas através de uma constrição estreita. Essas informações (ou seja, tamanho e velocidade) são usadas para quantificar a deformação transversal de cada célula, a resistência à deformação e a recuperação da deformação. Em geral, essa plataforma microfluídica baseada em eletrônica fornece múltiplas propriedades de células viscoelásticas e, portanto, uma imagem mais completa do estado mecânico de uma célula. Como requer preparação mínima da amostra, utiliza uma medição eletrônica direta (em contraste com uma câmera de alta velocidade) e aproveita a fabricação de litografia suave padrão, a implementação dessa plataforma é simples, acessível e adaptável à análise a jusante. A flexibilidade, a utilidade e a sensibilidade dessa plataforma forneceram informações mecânicas exclusivas em uma gama diversificada de células, com o potencial para muitas outras aplicações em ciência básica e diagnóstico clínico.
Introduction
As células individuais são materiais dinâmicos e viscoelásticos1. Uma infinidade de processos internos e externos (por exemplo, início da mitose ou remodelamento da matriz extracelular [MEC]) influenciam sua estrutura e composição 2,3,4, resultando muitas vezes em propriedades biofísicas distintas que complementam seu estado atual. Em particular, as propriedades mecânicas têm se mostrado importantes biomarcadores do desenvolvimento celular, fisiologia e patologia, produzindo informações quantitativas valiosas que podem complementar as abordagens moleculares e genéticas canônicas 5,6,7. Por exemplo, Li et al. descreveram recentemente as diferenças mecânicas entre células de leucemia promielocítica aguda resistentes e responsivas a medicamentos, ao mesmo tempo em que usaram RNA-seq para descobrir genes associados ao citoesqueleto diferencialmente expressos8. Ao compreender a complexa interação entre a mecânica unicelular e a função celular, a mecanofenotipagem tem aplicações mais amplas na transformação da ciência básica e do diagnóstico clínico9.
A ferramenta mais amplamente adotada para medir a mecânica unicelular é a microscopia de força atômica (AFM). Embora o AFM permita uma medição localizada de alta resolução das propriedades mecânicas celulares, ele permanece limitado a uma taxa de transferência de <0,01 células/s10. Alternativamente, as macas ópticas, que usam dois feixes de laser divergentes para prender e deformar células únicas suspensas11, são limitadas a rendimentos marginalmente mais altos de <1 célula/s12. Avanços recentes em tecnologias microfluídicas permitiram uma nova geração de dispositivos para avaliação mecânica rápida, unicelular12,13. Essas técnicas empregam canais de constrição estreitos14,15, fluxo de cisalhamento 16 ou alongamento hidrodinâmico17 para deformar células rapidamente em rendimentos de 10-1.000 células/s 18. Embora a taxa de medição dessas abordagens seja consideravelmente mais rápida do que as técnicas convencionais, elas geralmente trocam recursos de alto rendimento por leituras mecânicas limitadas (Tabela Suplementar 1). Todos os métodos microfluídicos rápidos acima mencionados se concentram em métricas básicas de parâmetro único, como tempo de trânsito ou taxas de deformabilidade, que refletem apenas as propriedades elásticas de uma célula. No entanto, dada a natureza viscoelástica intrínseca de células individuais, uma caracterização mecânica robusta e completa das células requer a consideração não apenas de componentes elásticos, mas também de respostas viscosas.
Mechano-node-pore sensing (mechano-NPS)2,8 (Figura 1A) é uma plataforma microfluídica que aborda as limitações existentes com a mechanofenotipagem de célula única. Este método permite a medição de múltiplos parâmetros biofísicos simultaneamente, incluindo diâmetro celular, deformabilidade relativa e tempo de recuperação da deformação, com um rendimento moderado de 1-10 células/s. Essa técnica é baseada no node-pore sensing (NPS)19,20,21,22,23,24, que envolve o uso de uma medição de sonda de quatro pontos para medir o pulso de corrente modulada produzido por uma célula transitando por um canal microfluídico que foi segmentado por regiões mais amplas, referidas como "nós". O pulso de corrente modulada é resultado de a célula bloquear parcialmente o fluxo de corrente nos segmentos (ou seja, "poros") e nós, com mais corrente bloqueada no primeiro do que no segundo. No mecano-NPS, um segmento, o "canal de contração", é mais estreito do que o diâmetro de uma célula; consequentemente, uma célula deve se deformar para transitar por todo o canal (Figura 1B). O diâmetro da célula pode ser determinado pela magnitude do subpulso produzido quando a célula transita pelos poros do nó antes do canal de contração (Figuras 1B,C). Aqui, |ΔInp|, a queda de corrente quando a célula está no poro, é proporcional à razão de volume da célula para o poro, célula V/poro V 2,8,19. A rigidez celular pode ser determinada por ΔTc, a duração do subpulso dramaticamente maior produzido quando a célula transita pelo canal de contração (Figuras 1B,C). Uma célula mais rígida levará mais tempo para transitar pelo canal do que uma mais macia 2,8. Finalmente, a "recuperação" celular, a capacidade da célula de retornar ao seu tamanho original e forma pós-deformação, pode ser determinada pela série de subpulsos produzidos à medida que a célula transita pelos poros dos nós após o canal de contração (Figuras 1B,C). O tempo de recuperação, ΔTr, é o tempo que leva para que os subpulsos atuais retornem à magnitude dos subpulsos anteriores, antes da célula ser espremida. De modo geral, os pulsos de corrente modulada produzidos à medida que uma célula transita pelo canal microfluídico são registrados e analisados para extrair os parâmetros mecânicos de célula única relevantes (Figura 1D)2,8.
A reprodutibilidade e a facilidade de uso dessa plataforma microfluídica baseada em eletrônica foram previamente demonstradas25. Além disso, a plataforma apresenta uma baixa barreira de entrada para a mecanofenotipagem unicelular. A litografia suave padrão é empregada para fabricar dispositivos microfluídicos. O hardware de medição consiste em componentes baratos, incluindo uma placa de circuito impresso simples (PCB), fonte de alimentação, pré-amplificador, placa de aquisição de dados (DAQ) e computador. Finalmente, o código amigável está disponível para aquisição e análise de dados, permitindo uma implementação direta. Essa técnica de mecanofenotipagem pode distinguir populações de linhagens celulares epiteliais mamárias e pulmonares não malignas e malignas, discriminar sublinhagens em células epiteliais mamárias humanas primárias e caracterizar os efeitos de perturbações citoesqueléticas e outros agentes farmacológicos 2,8. No geral, esta plataforma é uma abordagem eficaz para a mecanofenotipagem de células individuais.
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Protocol
1. Projete a geometria do dispositivo
- Escolha a largura dos segmentos de dimensionamento e recuperação para que seja maior do que o diâmetro das maiores células a serem medidas, mas também mantenha uma relação sinal-ruído (SNR) suficiente. Consulte a Tabela Suplementar 2 para obter exemplos de diferentes larguras de segmento de dimensionamento e recuperação para várias linhas celulares.
- Escolha a largura do segmento de contração para aplicar uma tensão de 30% a 40% ao tamanho médio das células que serão submetidas à mecanofenotipagem. A deformação é definida como
, onde d é o diâmetro da célula e wc é a largura do canal de contração 2,8. Consulte a Tabela Suplementar 2 para diferentes larguras de segmento de contração para várias linhas celulares.
NOTA: Se alguém deseja comparar tipos de células ou condições com diâmetros substancialmente diferentes, projetos de dispositivos separados devem ser usados com larguras de segmento de contração específicas para cada tipo/condição de célula. - Projete um dispositivo de referência para cada geometria de dispositivo exclusiva. Isso é necessário para determinar De, o diâmetro efetivo do segmento de poros de dimensionamento do canal microfluídico.
Observação : O dispositivo de referência usa a mesma geometria que o dispositivo primário. A única modificação é que o segmento de contração deve ser igual em largura ao segmento de poros de dimensionamento para permitir a calibração com esferas de poliestireno de tamanho conhecido. O alargamento da contração impede que as esferas de poliestireno entupam o canal de contração durante a calibração. O processo de calibração é descrito em pormenor nas etapas 4.1 e 5.3.1. A calibração também pode ser obtida usando um contador de células comercialmente disponível, caso em que nenhum dispositivo de referência é necessário. Esse processo é descrito na etapa 4.2. - Escolha a altura do canal de tal forma que as maiores células de interesse possam se alongar totalmente sem restrição dentro do segmento de contração2. Certifique-se de que a altura do canal é maior que hmin
(isso pressupõe que a célula é pré-deformação esférica e que a deformação isométrica ocorre ao longo do comprimento e altura do canal durante a deformação).
NOTA: Dada a magnitude de um subpulso de corrente,
, quanto maior for o hmin , menor será o SNR geral. - Projete e crie uma fotomáscara usando um software de design assistido por computador com as larguras de canal escolhidas. Um arquivo de exemplo é fornecido no Arquivo Suplementar 1. Dimensione o design da máscara microfluídica em 1,5% para explicar o encolhimento do polidimetilsiloxano (PDMS) após o peeling do mestre negativo.
NOTA: Uma matriz de dispositivos pode ser incluída em uma única máscara, desde que a matriz geral não exceda o tamanho da bolacha (Figura 1A Suplementar). - Projetar e criar uma fotomáscara com eletrodos que serão usados para realizar uma medição de sonda de quatro pontos da corrente do dispositivo microfluídico (Figura 1D). Um arquivo de exemplo é fornecido no Arquivo Suplementar 1.
NOTA: Uma matriz de eletrodos pode ser incluída em uma única máscara, desde que a matriz não exceda o tamanho da lâmina de vidro (Figura 1B suplementar).
, onde d é o diâmetro da célula e wc é a largura do canal de contração 2,8. Consulte a Tabela Suplementar 2 para diferentes larguras de segmento de contração para várias linhas celulares.
(isso pressupõe que a célula é pré-deformação esférica e que a deformação isométrica ocorre ao longo do comprimento e altura do canal durante a deformação).
, quanto maior for o hmin , menor será o SNR geral.2. Fabricar dispositivos (Figura 2)
- Prepare padrões de eletrodos em um substrato de vidro.
- Gire o revestimento, o padrão e processe uma fotorresistência positiva em uma lâmina de vidro liso de acordo com a folha de dados do produto. Um exemplo desse procedimento é descrito no Arquivo Suplementar 2.
- Realize deposição de metal, decolagem e gravação de ouro.
- Execute a deposição de filme fino de 75 Å Ti, 250 Å Pt e 250 Å Au no slide. Um exemplo desse procedimento usando evaporação por pistola de elétrons é descrito no Arquivo Suplementar 3.
- Mergulhe a lâmina em acetona por 15 minutos para realizar uma decolagem do excesso de metal.
- Em um exaustor, use uma pipeta descartável para gota de ouro fundido etchant na região dos eletrodos que serão expostos ao canal microfluídico, como mostrado na Figura Suplementar 2. Seja cauteloso para evitar deixar cair etchant em outro lugar no slide.
CUIDADO: O etchant dourado pode causar irritação da pele e dos olhos. Não respire vapores e não ingerie. Manuseie com cuidado, use equipamentos de proteção individual (EPI) apropriados e descarte os resíduos de acordo com os regulamentos locais de descarte. - Enxaguar a lâmina com água deionizada (DI) e secar com nitrogênio seco (N2).
- Se vários eletrodos forem impressos na mesma lâmina de vidro, cubra a lâmina em chips individuais.
- Use uma ferramenta de corte de vidro para marcar a deslizamento ao longo dos limites padronizados do eletrodo.
- Quebre o vidro ao longo da pontuação para dividir o slide em chips individuais.
- Inspecione visualmente os eletrodos sob um microscópio. Certifique-se de que os eletrodos individuais não estejam eletricamente abertos ou que os eletrodos não estejam em curto-circuito.
- Fabrice um molde mestre negativo para canais.
- Gire o revestimento, o padrão e o processo de um SU-8 epóxi resistem a uma bolacha de silício polido de acordo com a folha de dados do produto. Um exemplo desse procedimento é descrito no Arquivo Suplementar 2.
- Meça as alturas dos recursos usando um perfilômetro e inspecione visualmente os recursos sob um microscópio (Figura Suplementar 3). Certifique-se de que as geometrias desejadas estejam bem definidas.
- Molde de canais PDMS com litografia suave.
- Prepare o PDMS pesando um elastômero e um reticulador na proporção de massa de 10:1 em um copo descartável.
NOTA: Para uma bolacha com 3 de diâmetro, 30 g de PDMS são suficientes. - Misture o PDMS vigorosamente por 30 s com um garfo descartável, até que o PDMS fique opaco com bolhas.
- Desgaseifique o PDMS em uma câmara de vácuo por aproximadamente 30-90 min, ou até que o PDMS seja transparente sem bolhas visíveis.
- Coloque a bolacha com o molde mestre SU-8 em uma placa de Petri descartável e despeje PDMS sobre o centro da bolacha.
- Coloque a placa de Petri contendo o PDMS e a bolacha em uma câmara de vácuo e desgaseifique por aproximadamente 30 min, ou até que nenhuma bolha permaneça no PDMS.
- Asse o PDMS a 80 °C durante 2 h no forno ou numa placa quente.
- Com uma lâmina afiada, corte e remova o PDMS do mestre negativo SU-8.
- Corte a laje PDMS moldada em moldes individuais usando uma lâmina afiada
- Núcleo dos orifícios de acesso de entrada e saída usando um soco de biópsia descartável. Para obter melhores resultados, use um novo punção para cada laje PDMS. Um soco mais nítido produz orifícios de bordas lisas, minimizando as partículas que poderiam obstruir o canal de contração.
NOTA: O diâmetro dos orifícios de acesso deve ser ligeiramente inferior ao diâmetro exterior da tubagem. Por exemplo, se estiver usando tubos de politetrafluoroetileno (PTFE) com um diâmetro externo de 1/32 pol, um orifício de 1,5 mm deve ser perfurado.
- Prepare o PDMS pesando um elastômero e um reticulador na proporção de massa de 10:1 em um copo descartável.
- Ligue um substrato de vidro/eletrodo aos canais PDMS.
- Limpe as lâminas de vidro do eletrodo com metanol (≥99,8%). Secar com N2 seco.
- Limpar o dispositivo PDMS com fita adesiva, seguido de enxágue com álcool isopropílico (IPA) e água deionizada (DI; 18 MΩ/cm2). Secar com N2 seco. Em seguida, limpe com fita adesiva mais uma vez.
- Coloque o substrato de vidro com eletrodos pré-fabricados e o molde PDMS preparado (lado a lado do recurso) em um limpador a plasma.
- Expor ambos ao plasma de oxigênio por 2 min (100-300 mTorr, 30 W).
- Alinhe e coloque o molde PDMS com o lado do recurso virado para baixo no substrato de vidro com eletrodos pré-fabricados.
NOTA: A ligação é instantânea uma vez que o PDMS tratado com plasma e o vidro entram em contato; consequentemente, não serão possíveis novas modificações de alinhamento. Para facilitar o alinhamento, 20 μL de uma diluição 2:1 de metanol em água DI podem ser pipetados na superfície de vidro tratada com plasma. A solução de metanol atua como uma barreira física entre o vidro tratado e o PDMS, permitindo ajustes de alinhamento. Se utilizar metanol, cozer o dispositivo alinhado e acoplado a 50 °C durante 2 h para evaporar a solução e completar o processo de colagem. - Inspecione visualmente o dispositivo ligado sob um microscópio. Certifique-se de que os eletrodos e as geometrias do canal estejam devidamente alinhados.
3. Meça as células (Figura 1D)
- Prepare a fonte de pressão, a PCB, o hardware de bancada e o software de aquisição de dados.
- Conecte o dispositivo microfluídico à PCB usando a braçadeira. Um exemplo da PCB é fornecido no Arquivo Suplementar 4 (arquivos GERBER) e no Arquivo Suplementar 5 (arquivos esquemáticos, de placa e de lista de peças PCB).
- Alinhe os pinos carregados por mola da braçadeira com as almofadas de contato do eletrodo no dispositivo microfluídico e alinhe os pinos do conector da braçadeira com os orifícios da PCB.
- Insira firmemente os pinos do cabeçote da braçadeira nos orifícios da PCB, certificando-se de que os pinos carregados por mola permaneçam alinhados com as almofadas de contato do eletrodo.
- Configure e conecte o hardware eletrônico.
- Conecte duas das portas de saída da fonte de alimentação à porta de tensão de alimentação da PCB com um adaptador fêmea duplo banana plug-to-Bayonet Neill-Concelman (BNC) e um cabo BNC.
- Ligue a fonte de alimentação. Defina a saída conectada ao condutor interno do BNC para +15 V e defina a outra saída como -15 V. Habilite ambas as saídas para alimentar o circuito.
- Conecte a terceira das portas de saída da fonte de alimentação à porta de tensão de entrada da PCB com um cabo BNC. Defina a saída para a tensão aplicada desejada, mas não a habilite até iniciar o experimento.
- Conecte a porta de corrente de saída da PCB à entrada do pré-amplificador de corrente com um cabo BNC.
- Conecte a saída do pré-amplificador de corrente a uma entrada analógica no bloco de terminais BNC do sistema de aquisição de dados com um cabo BNC. Opcionalmente, conecte um filtro passa-baixas analógico alinhado com o cabo BNC para filtrar a interferência de alta frequência.
NOTA: Para melhorar o SNR, a PCB e o dispositivo podem ser alojados dentro de um gabinete de metal espesso. Todos os cabos BNC e tubulações fluídicas podem ser encaminhados através de furos perfurados no gabinete.
- Instalar e configurar o software necessário no computador pessoal (PC)
- Ligue e conecte o controlador de pressão ao PC. Instale qualquer software controlador de pressão necessário de acordo com as instruções do fabricante.
- Instale o MATLAB e a Caixa de Ferramentas de Aquisição de Dados no PC. Verifique se os drivers necessários para o sistema de aquisição de dados estão instalados para que a interface do MATLAB Data Acquisition Toolbox possa detectá-lo.
- Baixe o script de aquisição de dados incluído, "NPS.m", de https://github.com/sohnlab/node-pore-sensing-public.
- Abra e configure o script de aquisição de dados.
- Defina os valores corretos para inicializar a sessão de aquisição de dados, que inclui a ID do fornecedor, a ID do dispositivo do DAQ e o número do canal de entrada analógico (linhas 34-36 no script incluído).
NOTA: O ID do dispositivo pode ser encontrado usando a função "daq.getDevices" ou "daqlist". - Defina a taxa de amostragem desejada para a aquisição (linha 23 no script incluído). Para obter resultados ótimos, ele deve ser ajustado para pelo menos 10 kHz.
- Defina os valores corretos para inicializar a sessão de aquisição de dados, que inclui a ID do fornecedor, a ID do dispositivo do DAQ e o número do canal de entrada analógico (linhas 34-36 no script incluído).
- Conecte o dispositivo microfluídico à PCB usando a braçadeira. Um exemplo da PCB é fornecido no Arquivo Suplementar 4 (arquivos GERBER) e no Arquivo Suplementar 5 (arquivos esquemáticos, de placa e de lista de peças PCB).
- Prepare a suspensão celular.
- Preparar uma solução de soro fetal bovino a 2% (FBS) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 1x e filtrar com um filtro de 0,22 μm.
- Cultivar e preparar as células de acordo com o protocolo de cultura celular apropriado da linhagem celular de escolha. Suspender as células na solução preparada de FBS a 2% em 1x PBS na concentração de 1-5 x 105 células/mL. Mantenha as células no gelo durante a duração dos experimentos.
- Meça as propriedades físicas das células.
- Carregue a amostra de célula na tubulação e conecte-a à entrada do dispositivo.
- Corte 30 cm de tubo de PTFE com uma lâmina de barbear ou faca afiada.
- Fixe uma extremidade da tubulação a uma seringa luer lock. Utilize a seringa para extrair a amostra de células para a outra extremidade da tubagem.
- Insira cuidadosamente a tubulação na entrada do dispositivo.
- Conecte a extremidade oposta da tubulação ao controlador de pressão microfluídica.
NOTA: Um filtro pode ser adicionado entre o controlador de pressão microfluídico e a tubulação para evitar o refluxo de líquido para o controlador de pressão.
- Execute o experimento.
- Defina a pressão de acionamento constante desejada no software controlador de pressão e permita que a amostra encha o dispositivo.
NOTA: A pressão é tipicamente de 2-21 kPa. A velocidade do fluxo deve ser lenta o suficiente para permitir pulsos claramente definidos, mas rápida o suficiente para permitir uma taxa de transferência adequada.- Se formarem bolhas nos canais microfluídicos, use o enchimento sem saída: conecte a saída do dispositivo e aplique uma baixa pressão na entrada para forçar a saída do ar através do PDMS permeável ao gás. Deixar bolhas no canal levará a uma linha de base de corrente instável e impedirá medições precisas.
- Se os detritos obstruírem o canal microfluídico, desaloje-o pressionando levemente a parte superior do dispositivo PDMS enquanto aplica a pressão de condução, "pulsando" uma pressão mais alta alternando a pressão para cima e para fora, ou removendo a tubulação e reinserindo-a. Se os detritos permanecerem, pode ser necessário mudar para um novo dispositivo.
- Defina a tensão desejada girando o botão Voltage na fonte de alimentação e ative a tensão pressionando o botão On .
NOTA: A tensão é tipicamente de 1-5 V. Escolha a tensão mais baixa necessária para um SNR adequado. A mesma tensão deve ser usada em todas as condições a serem comparadas. - Ligue o pré-amplificador de corrente e defina a sensibilidade (A/V) o mais baixa possível; alternativamente, defina o ganho (V/A) o mais alto possível sem sobrecarregar o pré-amplificador ou exceder a tensão máxima de entrada analógica do DAQ. Neste estudo, a sensibilidade foi ajustada para 10-7 A/V.
NOTA: O valor adequado de sensibilidade/ganho dependerá tanto da tensão aplicada quanto da resistência basal do canal microfluídico. - Pressione o botão verde Executar no menu da faixa de opções do MATLAB para iniciar o script de aquisição de dados NPS.m e iniciar a amostragem e o salvamento dos dados.
- Para encerrar o experimento, pressione o botão Parar no canto inferior esquerdo da janela de figura para interromper o script de aquisição de dados. Desative a saída da fonte de alimentação pressionando o botão Ligado . Ajuste a fonte de pressão para pressão zero no software do controlador de pressão.
- Neste ponto, o experimento pode ser pausado para executar um ou mais dos seguintes procedimentos:
- Substitua o dispositivo atual por um novo.
- Recarregue a tubulação com mais amostras de células.
NOTA: Para evitar a contaminação cruzada da amostra, use novos dispositivos para medir células de diferentes tipos ou condições. - Desaperte o dispositivo da PCB e examine a condição do canal sob um microscópio. Para reiniciar o experimento usando o mesmo dispositivo, deve-se tomar cuidado para não introduzir bolhas de ar. Pode ser necessário aplicar uma pressão suave no êmbolo da seringa para manter a amostra de célula no final da tubulação enquanto a insere na entrada do dispositivo.
- Defina a pressão de acionamento constante desejada no software controlador de pressão e permita que a amostra encha o dispositivo.
- Carregue a amostra de célula na tubulação e conecte-a à entrada do dispositivo.
4. Calibre o dispositivo microfluídico
- Opção 1: Meça as esferas de poliestireno em dispositivos de referência.
- Escolha um tamanho de grânulo de poliestireno que seja menor que o canal de dimensionamento.
- Adicionar contas de Tween e poliestireno a 1,5% à solução filtrada de PBS e FBS utilizada durante os experimentos celulares, na concentração de 1-3 x 105 contas/mL.
- Prosseguir com a experiência conforme descrito na secção 3, utilizando o dispositivo de referência descrito no passo 1.3, e aplicar a mesma tensão utilizada durante a experimentação. Utilizar a magnitude média da gota de corrente produzida à medida que as esferas transitam pelos poros de dimensionamento e o diâmetro conhecido das esferas para calcular De, conforme descrito na secção 5.
- Opção 2: Meça independentemente o tamanho da célula com um dispositivo de medição separado.
- Em vez de seguir o protocolo na etapa 4.1, use um instrumento de medição de tamanho de célula comercialmente disponível para medir o tamanho médio das células na amostra. Nesse caso, nenhum dispositivo de referência é necessário. Utilizar a gota de corrente média produzida à medida que as células transitam pelo poro de dimensionamento e o diâmetro médio da célula medido para calcular De conforme descrito na secção 5.
5. Analise dados para extrair fenótipos celulares
Observação : processamento de dados pode ser executado usando o arquivo de programa de interface de linha de comando MATLAB mNPS_procJOVE.m em https://github.com/sohnlab/NPS-analysis-JOVE. Consulte Arquivo Suplementar 6 para obter mais instruções.
- Pré-processe os dados (Figura 3A).
- Calcule a corrente elétrica medida aplicando o valor de ganho usado no pré-amplificador de corrente para tensão aos dados brutos adquiridos pelo DAQ.
- Remova o ruído de alta frequência aplicando uma função de suavização retangular e/ou um filtro passa-baixas à medição de corrente bruta. Em seguida, refaça a amostra dos dados filtrados para uma taxa de amostragem mais baixa. Além disso, calcule os dados de carimbo de data/hora correspondentes a essa taxa de amostragem mais baixa.
- Calcule um sinal de corrente de linha de base ajustado aplicando um método como a suavização assimétrica de mínimos quadrados26.
- Calcule a primeira derivada aproximada (sinal de diferença) dos dados atuais pré-processados tomando a diferença entre os pontos de dados subsequentes.
- Identifique eventos celulares e extraia dados de subpulso (Figura 3B).
- Procure eventos de célula candidata examinando os dados pré-processados. Rejeite eventos celulares que se sobreponham a outros eventos celulares (ou seja, eventos de coincidência) (Figura 4 Suplementar), exiba um ajuste basal ruim ou tenha uma forma de pulso inesperada ou errônea (por exemplo, onde um entupimento pode ter estado presente no canal).
- Extraia dados de subpulso para cada evento de célula.
- Cada segmento nó-poro aparecerá como um subpulso correspondente dentro do pulso de sinal global (Figuras 1B, C). Identifique o início de cada subpulso calculando o ponto de tempo em que o sinal de diferença atinge um valor mínimo local. Identifique o final de cada subpulso calculando o ponto de tempo em que o sinal de diferença atinge um valor máximo local.
- Determine a largura de cada subpulso como o tempo decorrido entre os pontos de tempo inicial e final. Determine a amplitude de cada subpulso calculando a média da diferença entre a corrente medida e a corrente de linha de base para todos os pontos de dados entre os pontos de tempo inicial e final.
- Determine o mecanofenótipo celular para cada evento celular com base em dados de subpulso.
- Determine o diâmetro da célula d com base na equação definida por Deblois e Bean24:
onde ΔI/I é a razão média da amplitude do subpulso para a corrente basal nos subpulsos de dimensionamento, D e é o diâmetro efetivo do canal (medido na etapa 4) e L é o comprimento total do canal nó-poro.- D e é determinado calculando-se a média ΔI/I produzida por um conjunto de partículas de diâmetro conhecido (células ou contas, ver passo 4), utilizando esse diâmetro conhecido como d, e resolvendo Eq. 1 para De.
- Quantificar a resistência da célula à deformação.
- Determine a velocidade do fluido Ufluindo calculando a velocidade média da célula nos subpulsos de dimensionamento, usando os comprimentos de segmento conhecidos e a duração medida de cada subpulso.
- Determinar o índice de deformabilidade de células inteiras (wCDI), definido por Kim et al.2 como:
onde L c é o comprimento do segmento de contração, o canal h é a altura do canal e ΔT c é a duração do subpulso de contração.
- Identificar o tempo de recuperação da célula a partir da deformação, definido como o primeiro subpulso de recuperação com uma amplitude dentro de 8% da amplitude média do subpulso de dimensionamento2.
- Calcule a deformação transversal da célula dentro do segmento de contração.
- Calcule o diâmetro efetivo do segmento de contração (D e,c) conforme definido por Kim et al.2:
, onde w c é a largura do segmento de contração e wnp é a largura de todos os outros segmentos. - Calcule o diâmetro esférico equivalente dc da célula dentro da contração usando novamente a equação definida por Deblois e Bean24:
onde ΔI c/I c é a razão entre a amplitude do subpulso e a corrente basal no subpulso de contração e Lc é o comprimento do segmento de contração. - Calcule o comprimento de alongamento da célula Ldeforma conforme descrito por Kim et al.2:
- Finalmente, calcule-se a deformação transversal da célula δdeforma, que é definida por Kim et al.2 como sendo
.
- Calcule o diâmetro efetivo do segmento de contração (D e,c) conforme definido por Kim et al.2:
- Determine o diâmetro da célula d com base na equação definida por Deblois e Bean24:
, onde w c é a largura do segmento de contração e wnp é a largura de todos os outros segmentos.
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Representative Results
A plataforma de mecanofenotipagem aqui apresentada é uma abordagem simples e versátil para medir as propriedades biofísicas de células individuais com rendimento moderado. As células são fluídas através do canal microfluídico (Figura 1A) usando fluxo constante impulsionado por pressão. À medida que as células transitam, o comprimento do canal microfluídico e os pulsos de corrente produzidos são registrados usando o hardware de aquisição de dados. O sinal adquirido (Figura 1B,C) é então processado usando software personalizado no MATLAB para extrair as propriedades mecânicas de célula única relevantes. A Figura 1D apresenta uma visão geral gráfica do protocolo experimental.
Para fabricar dispositivos, um molde mestre negativo é inicialmente criado e usado para fundir PDMS (Figura 2). Os moldes mestres bem-sucedidos, mostrados na Figura 3 Suplementar, contêm paredes laterais lisas e verticais e sem defeitos no canal microfluídico (Figura 4Ai). Deve-se ter cuidado na fabricação desse molde mestre inicial, pois, em wafers mal fabricados (Figura 3 Suplementar), quaisquer defeitos serão transferidos para todos os moldes PDMS subsequentes (Figura 4Aii), tornando-os inutilizáveis. Os moldes PDMS bem-sucedidos são então ligados a plasma a lâminas de vidro com eletrodos padronizados (Figura 1A).
Para experimentos, as almofadas de eletrodo de um dispositivo são conectadas à PCB (Figura 1D) para permitir a medição de corrente. A tubulação, contendo uma amostra de célula, é então inserida na entrada do dispositivo e conectada a um controlador de fluxo microfluídico, permitindo um fluxo de células impulsionado pela pressão através do canal microfluídico. É importante ressaltar que uma leitura ao vivo da medição atual é exibida durante um experimento. Isso permite que os usuários garantam que seu dispositivo esteja operando como pretendido. Os eventos de trânsito celular bem-sucedidos consistem em subpulsos facilmente distinguíveis (Figura 4Bi). Complicações, como entupimento, podem ocorrer durante a experimentação e podem ser identificadas pela leitura ao vivo de eventos com formas de pulso anormais (Figura 4Bii).
Para a análise dos dados, os parâmetros críticos do sinal que precisam ser extraídos para cada evento de trânsito celular são detalhados na Figura 1B e descritos na etapa 5.2.2. O sinal bruto deve ter um SNR suficiente para filtrar o ruído e extrair os componentes significativos (Figura 3A). Criticamente, o aumento do sinal de corrente de cada nó deve ser robusto o suficiente para que os subpulsos possam ser facilmente identificados a partir do sinal de diferença ∂ I/∂t (Figura 3B).
O wCDI medido e os tempos de recuperação podem ser usados para fazer comparações diretas entre células ou condições. Especificamente, o wCDI é um indicador relativo de rigidez celular que é inversamente proporcional ao módulo elástico (Figura 5 Suplementar); assim, um maior valor de wCDI corresponde a um fenótipo mecânico mais suave. Por exemplo, na Figura 5A, as células malignas MCF-7 têm uma distribuição wCDI maior do que as células MCF-10A não malignas, indicando que as células MCF-7 malignas são mais macias do que suas contrapartes MCF-10A não malignas. Isso é consistente com numerosos estudos empíricos que mostraram que as células cancerosas são mais macias do que suas contrapartes não malignas27. Da mesma forma, na Figura 5B, as células MCF-10A e MCF-7 tratadas com latrunculina mostram um aumento na wCDI. A latrunculina é um potente agente farmacológico que interrompe o citoesqueleto da actina28. Consequentemente, é consistente observar um maior wCDI e, portanto, um fenótipo mais suave, nas células tratadas com esta droga. Finalmente, na Figura 5C, o wCDI é comparado entre duas sublinhagens de células epiteliais mamárias humanas, epitelial luminal (LEP) e mioepitelial (MEP). Nesta comparação, há mais uma vez uma distribuição wCDI distinta diferenciando os dois tipos de células primárias, indicando que as células LEP são mais macias do que as células MEP. Além do wCDI, os tempos de recuperação também podem ser quantificados para fornecer um indicador relativo da viscosidade celular. Um tempo de recuperação mais longo indica um fenótipo mais viscoso. A Figura 5D apresenta os tempos de recuperação, agrupados em três categorias distintas, para cada uma das condições da Figura 5A-C. MCF-10As e MCF-7s não tratados têm uma maior proporção de células que se recuperam instantaneamente (ΔTr = 0), indicando uma viscosidade menor do que sua contraparte tratada com latrunculina.
wCDI e tempo de recuperação são métricas relativas de elasticidade e viscosidade de célula única. Portanto, o método aqui apresentado é o mais adequado para caracterizar a resposta diferencial entre múltiplas amostras de interesse. Em sua forma atual, o protocolo aqui apresentado não fornece quantificações absolutas de parâmetros mecânicos definidos, como o módulo de Young.
Figura 1: Visão geral da plataforma de mecanofenotipagem. (A) Imagem do dispositivo microfluídico. (B) Geometria do canal, com um pulso de corrente representativo de um único evento de trânsito celular. Δ Inp representa a gota de corrente da célula que entra no poro, e ΔIc representa a gota de corrente da célula que entra na contração. Δ T p representa o tempo necessário para a célula transitar pelo poro, Δ Tc representa o tempo necessário para a célula transitar pelo canal de contração e ΔTr representa o tempo necessário para a célula se recuperar. (C) Pulso de corrente real de um evento de trânsito celular. (D) Fluxo de trabalho experimental: (1) as células são suspensas em PBS e (2) conduzidas através do dispositivo microfluídico com pressão constante. À medida que as células transitam pelo canal microfluídico, (3) os pulsos de corrente são medidos usando hardware de aquisição de dados. (4) Os pulsos de corrente são analisados para extrair múltiplas propriedades mecânicas de célula única. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Visão geral da fabricação do dispositivo . (A) Os moldes mestres negativos são (1) fabricados usando fotolitografia. (2) PDMS é então fundido sobre os moldes mestres negativos. (3) Os dispositivos moldados são cortados em cubos, com furos de entrada e saída perfurados. (B) Simultaneamente, as lâminas de vidro são (1) padronizadas para fabricar eletrodos de metal. (2) A evaporação do feixe E é usada para depositar metal na corrediça, seguida por um (3) processo de decolagem para remover o excesso de metal, deixando para trás os eletrodos de metal desejados. (C) O dispositivo PDMS e o vidro com eletrodos metálicos são então ligados entre si usando plasma de oxigênio para completar o processo de fabricação. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Processamento e análise de dados. (A) Os dados brutos de corrente (à esquerda) são pré-processados (à direita) aplicando uma função de suavização retangular e um filtro passa-baixa, seguido de reamostragem para uma taxa de amostragem mais baixa. O sinal de corrente basal é subsequentemente equipado com mínimos quadrados assimétricos suavizando26. (B) Os pontos de tempo no início e no final de cada subpulso são identificados como mínimos e máximos locais, respectivamente, no sinal de diferença ∂ I/∂t (esquerda). Para cada subpulso, a largura Δt é determinada pelo tempo decorrido entre o início e o fim, e a amplitude ΔI é determinada pela diferença média entre a corrente medida e a corrente basal. Os dados de subpulso extraídos podem ser representados como um sinal retangular (à direita); cada subpulso corresponde a um segmento na geometria do dispositivo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Exemplos de resultados bem-sucedidos e falhos durante a fabricação e experimentação . (A) Imagens de moldes PDMS de segmentos de contração retirados de dois moldes mestres negativos diferentes. (i) é um exemplo de um canal bem fabricado, com paredes laterais lisas, geometria bem definida e sem defeitos perceptíveis. (ii) é um exemplo de um canal mal fabricado com defeitos significativos no canal de contração (delineado em retângulos vermelhos), que obstruiria total ou parcialmente o fluxo de partículas (barras de escala = 150 μm). (B) Exemplos de pulsos de corrente filtrados gerados por "NPS.m" durante a aquisição de dados. i) Exemplo de um evento de célula bem-sucedido, em que uma célula transita pelo canal conforme pretendido. ii) Exemplo de pulsos de corrente produzidos quando o dispositivo está "entupido". Neste caso, os detritos obstruem o fluxo celular no segundo poro do canal. Isso leva a eventos celulares que aparecem "cortados" (indicados pela linha vermelha) no meio do segundo pulso de dimensionamento. As diminuições na corrente (indicadas pelas linhas azuis) após o "corte" são causadas por partículas (detritos ou células) que estão se acumulando em torno do bloqueio e, portanto, estão bloqueando uma porção maior do fluxo de corrente. Um pico descendente acentuado na corrente (indicado pelo retângulo verde) reflete uma partícula que é capaz de transitar em torno do bloqueio e, portanto, bloquear apenas temporariamente uma porção maior da corrente. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Exemplos de wCDI e recuperação de células entre várias condições. (A) distribuição do wCDI entre duas linhagens celulares epiteliais mamárias, MCF-10A não maligno e MCF-7 maligno. (B) wCDI de MCF-10A ou MCF-7, onde cada tipo de célula não foi tratado, tratado com Lat-A e tratado com Lat-B. (C) distribuição do wCDI entre duas sublinhagens epiteliais mamárias humanas primárias: células mioepiteliais (MEP) e epiteliais luminais (LEP). (D) Os tempos de recuperação correspondentes às quatro condições entre A, B e C. Os tempos de recuperação foram fixados para facilitar a visualização. Todas as condições apresentaram tamanho amostral de n = 99 células. Essa figura é reproduzida com permissão de Kim et al.2. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 1 Suplementar: Exemplos de matrizes de dispositivos para os canais microfluídicos e eletrodos. Ambas as imagens, representadas como máscaras de transparência, devem ser projetadas com branco (representando transparente) nas regiões onde o fotorresistente será exposto ao UV e preto nas regiões onde será bloqueado pela exposição UV. (A) Uma matriz de canais microfluídicos, com dois canais paralelos por "dispositivo" (retângulo), dispostos em uma bolacha de 3 em Si. O dispositivo na extrema direita é rotulado como "ref" e é projetado, conforme descrito na etapa 1.3, para uso em calibração. (B) Uma matriz de eletrodos, com dois eletrodos por dispositivo, de tal forma que ambos os canais em um dispositivo de (A) se alinhem sobre cada projeto de eletrodo de (B). Esta matriz foi disposta para uma lâmina de vidro de 2 em x 3. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura 2 suplementar: Esquemas que ilustram regiões do projeto do eletrodo e como gravar o ouro corretamente (etapa 2.1.2.3). A camada superior de ouro deve ser removida dos eletrodos de medição, ou a bioincrustação e a eletrólise ocorrerão durante a medição. No entanto, o ouro deve permanecer nas almofadas de contato, porque o ouro macio fornece uma conexão elétrica superior com os pinos do conector do pino pogo. (A) Esquema mostrando como o canal microfluídico (em azul) se cruza com o metal padronizado (preto). Como indicado, o metal perpendicular ao canal microfluídico e diretamente abaixo dele estão os eletrodos de medição, onde o ouro deve ser gravado, enquanto os grandes retângulos metálicos ao lado do canal são as almofadas de contato, onde o ouro deve permanecer. (B) Esquema mostrando onde o etchant de ouro deve ser aplicado ao metal padronizado, bem como onde não deve. A região verde indica onde a gravação é necessária, a região amarela indica onde a gravura pode ocorrer e não afetará a eficácia do dispositivo e a região vermelha indica onde o ouro não deve ser gravado. (C) Esquema mostrando um dispositivo típico e gravado com sucesso. Amarelo indica regiões onde o ouro ainda está presente e cinza indica regiões onde a camada de platina foi exposta. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura 3 suplementar: Imagens de canais de contração bem fabricados e mal fabricados. (A) Imagens de canais de contração em moldes mestres negativos de duas bolachas Si individuais. (i) Um exemplo de um molde mestre bem fabricado que produziria um canal PDMS ideal, como o mostrado na Figura 4Ai. (ii) Um exemplo de um molde mestre mal fabricado, que foi usado para criar o canal PDMS mostrado na Figura 4Aii. As regiões delineadas em retângulos vermelhos correspondem aos defeitos indicados na Figura 4Aii, demonstrando a transferência de defeitos do molde mestre para os microcanais PDMS (barras de escala = 150 μm). (B) Imagens da seção transversal dos canais de contração PDMS, mostrando a altura e a largura de diferentes moldes. Essas seções transversais foram adquiridas cortando o canal de contração do PDMS perpendicularmente à direção do fluxo. (i) Um exemplo de um molde PDMS bem fabricado criado usando a bolacha mostrada em (Ai), demonstrando paredes laterais verticais lisas. (ii) Um exemplo de um molde PDMS mal fabricado criado usando a bolacha mostrada em (Aii) demonstrando paredes laterais inclinadas (barras de escala = 20 μm). Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura 4 suplementar: Exemplo de um evento de célula coincidente (produzido quando mais de uma célula está transitando pelo canal de uma só vez). O sinal foi processado de acordo com as etapas 5.1.1-5.1.3 da seção 5 do protocolo. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura 5 Suplementar: Relação entre o wCDI e o módulo elástico 20,29,30,31,32,33,34,35. (A) Comparação das células de Jurkat, MCF7 e MCF10A medidas por esta técnica versus aspiração de micropipetas. O wCDI é inversamente proporcional à tensão cortical. (B) Comparação das células MCF7 e MCF10A medidas por esta técnica versus dados AFM publicados. (C) Comparação das células A549 e BEAS-2B medidas por esta técnica versus dados publicados da AFM. Em vários tipos de células, o wCDI é inversamente proporcional ao módulo elástico. Essa figura foi reproduzida com permissão de Kim et al.2. Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela Suplementar 1: Exemplos de técnicas de mecanofenotipagem unicelular e como elas se comparam ao mecano-NPS. As técnicas são listadas em ordem crescente de rendimento 12,2,36,37. As informações mecânicas referem-se a se o dispositivo pode medir as propriedades mecânicas elásticas e viscosas de cada célula. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela Suplementar 2: Exemplo de dimensionamento, contração e largura de segmento de recuperação para diferentes linhas celulares. PEmáx e LEP referem-se a duas linhagens de células epiteliais mamárias primárias humanas, onde PEmáx refere-se a células mioepiteliais e LEP refere-se a células epiteliais luminais 2,8. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Arquivo suplementar 1: exemplo de design do AutoCAD. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 2: Exemplo de protocolo para processamento de fotolitografia. Dois protocolos de exemplo são delineados para padronização e processamento de fotorresistência ou epóxi SU-8. O primeiro descreve a aplicação de fotorresistência positiva em uma lâmina de vidro para atuar como uma camada de sacrifício para a fabricação de eletrodos. O segundo descreve a aplicação de epóxi SU-8 em uma bolacha de silício para criar estruturas de relevo para moldagem de canais microfluídicos PDMS. Esses protocolos foram adaptados das fichas técnicas MF-321 e SU8 3000 do fabricante. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 3: Exemplo de protocolo para deposição de filme fino de 75 Å Ti, 250 Å Pt e 250 Å Au usando evaporação por feixe de elétrons. Um exemplo de protocolo para realizar a deposição de filme fino de 75 Å Ti, 250 Å Pt e 250 Å Au usando um evaporador de feixe de elétrons é delineado. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 4: Arquivos GERBER Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 5: Arquivos de lista de peças esquemáticas, de placa e PCB Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo suplementar 6: Interface de linha de comando MATLAB. Esse arquivo inclui instruções detalhadas para o processamento de dados usando a interface de linha de comando MATLAB26. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
A medição das propriedades mecânicas de células individuais usando essa técnica de mecanofenotipagem consiste em três etapas: fabricação de dispositivos, aquisição de dados e análise de dados. Dentro de cada etapa, há aspectos notáveis que podem impactar significativamente os resultados experimentais. Durante a fabricação do dispositivo, geometrias de canal consistentes e uniformidade dispositivo-a-dispositivo são essenciais para resultados precisos e repetíveis. Especificamente, as paredes laterais de cada dispositivo devem ser relativamente lisas (Figura 4Ai) e as alturas dos canais nos dispositivos replicados devem ser comparáveis. Quaisquer dispositivos com defeitos que obstruam parcialmente o fluxo celular, particularmente no canal de contração (Figura 4Aii) devem ser descartados. O uso de dispositivos com defeitos discerníveis na geometria do canal resultará em resultados imprecisos e não reproduzíveis. Durante a aquisição de dados, é vital que o usuário possa reconhecer a presença de um entupimento no canal durante a coleta de dados. Um script de exemplo, "NPS.m" (disponível em https://github.com/sohnlab/node-pore-sensing-public), exibe as medições atuais, permitindo que o usuário monitore a condição do canal e os eventos de trânsito celular em tempo real. Os pulsos característicos de um entupimento são mostrados na Figura 4B. Um entupimento dentro do canal de contração que ainda permite que algumas células fluam é particularmente importante de abordar, pois as células experimentarão maior tensão no local da obstrução, resultando em wCDIs imprecisos. Finalmente, durante a análise de dados, os usuários devem ser diligentes na escolha de limiares precisos como entradas para o algoritmo de análise. Se os limiares forem definidos muito altos, o programa não identificará eventos produzidos por células menores, distorcendo os resultados e deturpando a população de células medida.
Além desses estágios críticos, existem aspectos adicionais do protocolo que podem exigir ajuste ao estudar diferentes tipos ou condições celulares. Por exemplo, a aplicação desta técnica a amostras que são significativamente menores do que as estudadas anteriormente requer canais de contração mais estreitos. A fabricação de canais mais estreitos pode exigir metodologias de fabricação mais dispendiosas, como a litografia por feixe de elétrons38. Além disso, como a contração de Δ I/I ~ Δ V cell/Δ V (ondea contração deV eV são os volumes da célula e do canal deformados, respectivamente), canais mais estreitos resultam em maiores resistências basais e diminuição do SNR19. Finalmente, canais estreitos podem aumentar o risco de entupimento, tornando a execução experimental mais desafiadora. Esse problema específico poderia ser mitigado com a utilização de mais filtros de entrada.
Uma limitação desta técnica é o canal de contração estática, que só pode aplicar uma única tensão média a uma população de células. A fim de comparar a deformabilidade de células com diferentes tamanhos, ou para investigar uma única população celular em diferentes cepas aplicadas, vários dispositivos com diferentes larguras de canal de contração devem ser empregados. A plataforma também é limitada por suas paredes PDMS, que restringem a gama de rigidezes que pode medir. Por exemplo, algumas células vegetais muito rígidas são mais rígidas do que as paredes do PDMS que se esperaria que as deformassem39,40. Além disso, a pressão necessária para empurrar essas partículas rígidas através do canal de contração pode superar a força da ligação entre o PDMS e a lâmina de vidro, levando à delaminação. No entanto, pode-se fabricar canais microfluídicos em materiais mais rígidos, como vidro ou silício, para superar essas limitações. Apesar dessas pequenas restrições, essa plataforma permanece ideal para a medição mecânica de células de rendimento moderado. Em comparação com outras metodologias, como macas ópticas ou AFM, essa técnica permite maior rendimento. Em comparação com outras tecnologias microfluídicas de rendimento moderado a alto, como o RT-DC, essa técnica é capaz de investigar mais propriedades biofísicas, medindo as propriedades viscosas e elásticas de células individuais. Finalmente, a configuração experimental simples, utilizando eletrônicos baratos em oposição à óptica complexa, torna essa técnica uma tecnologia altamente acessível.
No geral, esta técnica de mecanofenotipagem é uma imensa promessa como uma ferramenta para inúmeros estudos e aplicações potenciais. Já foi aplicado a um conjunto diversificado de tipos celulares, incluindo amostras primárias, e mostrou sua eficácia na mensuração do impacto de componentes citoesqueléticos e nucleares nas propriedades viscoelásticas celulares 2,8. Além disso, como as células permanecem viáveis após a triagem com essa plataforma2, os pesquisadores têm a oportunidade de realizar análises a jusante. Esta plataforma também é ideal para acoplamento com a classificação de células microfluídicas a montante, prestando-se a aplicações como a medição de células tumorais circulantes. Olhando para o futuro, essa plataforma continua sendo uma ferramenta competitiva e versátil para medições mecânicas multivariáveis de células únicas, com aplicações na compreensão do comportamento celular 41, determinação da progressãoda doença 42 e monitoramento da resposta a medicamentos43. Além da pesquisa científica fundamental, essa técnica também é uma grande promessa como uma ferramenta clínica, especificamente uma plataforma de bancada de baixo custo para triagem diagnóstica rápida. Além disso, dados os baixos requisitos de energia e a necessidade mínima de preparação da amostra antes da medição, essa técnica é particularmente adequada para ambientes com poucos recursos, onde instrumentos de diagnóstico acessíveis são extremamente necessários44.
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Disclosures
L. L. S detém a patente dos EUA nº 11.383.241: "Mechano-node-pore sensing", J. Kim, S. Han e L. L. Sohn, emitida em 12 de julho de 2022.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada por bolsas do NIBIB 1R01EB024989-01 e NCI 1R01CA190843-01. A. L. e R. R. foram apoiados por uma bolsa de pesquisa de pós-graduação da H2H8 Association. K. L. C. foi apoiado por uma National Science Foundation Graduate Research Fellowship e uma Siebel Scholar Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | J.T. Baker | 5356-05 | Purity (GC) ≥ 99.5% (https://us.vwr.com/store/product/6057739/acetone-99-5-vlsi-j-t-baker) |
| Aluminum Foil | n/a | n/a | |
| Analog Low-Pass Filter | ThorLabs | EF504 | ≤240 kHz Passband, Coaxial BNC Feedthrough (https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=EF504#ad-image-0) |
| Biopsy Punch | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | 1mm, Disposable, with Plunger (https://mms.mckesson.com/product/573313/Miltex-33-31AA-P25) |
| Blade | n/a | n/a | |
| BNC Cable | Pomona Electronics | 2249-C-12 | https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/2249-C-12/603323?utm_adgroup=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&utm_source=google&utm_ medium=cpc&utm_campaign= Shopping_Product_Cable%20Assemblies_NEW&utm_term= &utm_content=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&gclid=Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO2sErQqnVJ pj5OXVObuTI8ZUf1ZeIn7zvzGnx mCWdePrG6SdEJMF3X6ubUaAs w-EALw_wcB |
| Cleanroom Polyester Swab | Thermo Fisher Scientific | 18383 | https://www.fishersci.com/shop/products/texwipe-cleantip-alpha-polyester-series-swabs-6/18383 |
| Current Preamplifier | DL Instruments | 1211 | https://www.brltest.com/index.php?main_page=product_info&products_ id=1419 |
| Custom PCB (w/ components) | n/a | n/a | see Supplemental files 4 and 5 |
| DAQ Terminal Block | National Instruments | BNC-2120 | https://www.ni.com/en-in/support/model.bnc-2120.html |
| DAQ to BNC-2110 cable | National Instruments | SHC68-68-EPM | https://www.ni.com/en-in/support/model.shc68-68-epm.html |
| Data Acquisition Board (DAQ) | National Instruments | PCI-6251 | https://www.ni.com/docs/en-US/bundle/pci-6251-feature/page/overview.html |
| Dessicator | Thermo Fisher Scientific | 5311-0250 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/5311-0250 |
| Female BNC To Banana Plug Adapter | Pomona Electronics | 72909 | https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/72909/1196318 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-186 | https://us.vwr.com/store/product/18706419/avantor-seradigm-select-grade-usda-approved-origin-fetal-bovine-serum-fbs |
| Glass Cutter | Chemglass | CG-1179-21 | https://chemglass.com/plate-glass-cutters-diamond-tips |
| Gold Etchant TFA | Transene | NC0977944 | https://www.fishersci.com/shop/products/NC0977944/NC0977944 |
| Hot Plate | Thermo Fisher Scientific | SP131825 | |
| Isopropyl Alcohol | Spectrum Chemical | I1056-4LTPL | Purity (GC) ≥99.5% (https://www.spectrumchemical.com/isopropyl-alcohol-99-percent-fcc-i1056) |
| Metal Hardware Enclosure | Hammond Manufacturing | EJ12126 | https://www.digikey.com/en/products/detail/hammond-manufacturing/EJ12126/2423415 |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Purity (GC) ≥99.8% (https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/substance/methanol320467561) |
| MF-321 Developer | Kayaku Advanced Materials | n/a | https://kayakuam.com/products/mf-321/ |
| MICROPOSIT S1813 Positive Photoresist | DuPont | n/a | https://kayakuam.com/products/microposit-s1800-g2-series-photoresists/ |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010049?SID=srch-hj-10010049 |
| Photomask | Fineline Imaging | n/a | Photomask are custom ordered from our CAD designs (https://www.fineline-imaging.com/) |
| Plain Glass Microscope Slide | Fisher Scientific | 12-553-5B | Material: Soda Lime, L75 x W50 mm, Thickness: 0.90–1.10 mm |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | https://harrickplasma.com/plasma-cleaners/expanded-plasma-cleaner/ |
| Plastic Petri Dish | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | 100 mm (https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-raised-ridge-100-x-15mm/FB0875712) |
| Pressure Controller | Fluigent | MFCS-EZ | https://www.fluigent.com/research/instruments/pressure-flow-controllers/mfcs-series/ |
| Pressure Controller Software | Fluigent | MAESFLO | |
| Programming & Computation Software | MATLAB | R2021b | for data acquisition and analysis (https://www.mathworks.com/products/matlab.html) |
| PTFE Tubing | Cole Parmer | 06417-31 | 0.032" ID x 0.056" (https://www.coleparmer.com/i/masterflex-transfer-tubing-microbore-ptfe-0-032-id-x-0-056-od-100-ft-roll/0641731) |
| Scepter 2.0 Handheld Automatic Cell Counter | Millapore Sigma | PHCC20060 | https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/mm/phcc20060 |
| Silicon Wafer | Wafer World | 2885 | 76.2 mm, Single Side Polished (https://www.waferworld.com/product/2885) |
| Spin Coater | n/a | n/a | |
| SU-8 3025 Negative Photoresist | Kayaku Advanced Materials | n/a | https://kayakuam.com/products/su-8-2000/ |
| SU8 Developer | Kayaku Advanced Materials | n/a | https://kayakuam.com/products/su-8-developer/ |
| Sygard 184 Polydimethlysiloxane | Dow Chemical | 4019862 | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Tape | Scotch | 810-341296 | https://www.staples.com/Scotch-Magic-Tape-810-3-4-x-36-yds-1-Core/product_130567?cid=PS:GS:SBD:PLA:OS&gclid= Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO 2sErRwzrrgjU0NjFkDkne1xm vT7ekS3tdzvAgiMDwPoxocgH VTQZi7vJgaAvQZEALw_wcB |
| Titanium, Platinum, Gold | n/a | n/a | |
| Triple Output Power Supply | Keysight | E36311A | https://www.newark.com/keysight-technologies/e36311a/dc-power-supply-3o-p-6v-5a-prog/dp/15AC9653 |
| UV Mask Aligner | Karl Suss America | MJB3 Mask Aligner |
References
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