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Bioengineering

मेकानो-नोड-पोर सेंसिंग: मल्टी-पैरामीटर सिंगल-सेल विस्कोस्टिक माप के लिए एक रैपिड, लेबल-फ्री प्लेटफॉर्म

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64665
Automatic Translation
*1, *2, 1, 3, 1,3, 1,2
1Graduate Program in Bioengineering, University of California, Berkeley and University of California, San Francisco, 2Department of Mechanical Engineering, University of California, Berkeley, 3Department of Electrical Engineering and Computer Sciences, University of California, Berkeley
* These authors contributed equally

Summary

यहां प्रस्तुत इलेक्ट्रॉनिक्स-आधारित माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म का उपयोग करके एकल कोशिकाओं को यांत्रिक रूप से फेनोटाइप करने की एक विधि है जिसे मेकानो-नोड-पोर सेंसिंग (मेकानो-एनपीएस) कहा जाता है। यह मंच कोशिकाओं के लोचदार और चिपचिपे बायोफिज़िकल गुणों दोनों को मापते हुए 1-10 कोशिकाओं / सेकंड के मध्यम थ्रूपुट को बनाए रखता है।

Abstract

सेलुलर यांत्रिक गुण विभिन्न प्रकार की जैविक प्रक्रियाओं और बीमारियों में शामिल हैं, स्टेम सेल भेदभाव से लेकर कैंसर मेटास्टेसिस तक। इन गुणों को मापने के लिए पारंपरिक तरीके, जैसे परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) और माइक्रोपिपेट एस्पिरेशन (एमए), समृद्ध जानकारी कैप्चर करते हैं, जो सेल की पूर्ण विस्कोस्टिक प्रतिक्रिया को दर्शाते हैं; हालाँकि, ये विधियाँ बहुत कम थ्रूपुट द्वारा सीमित हैं। उच्च-थ्रूपुट दृष्टिकोण, जैसे कि वास्तविक समय की विकृति साइटोमेट्री (आरटी-डीसी), केवल सीमित यांत्रिक जानकारी को माप सकते हैं, क्योंकि वे अक्सर एकल-पैरामीटर रीडआउट तक सीमित होते हैं जो केवल सेल के लोचदार गुणों को दर्शाते हैं। इन विधियों के विपरीत, मेकानो-नोड-पोर सेंसिंग (मेकानो-एनपीएस) एक लचीला, लेबल-मुक्त माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म है जो मध्यम थ्रूपुट वाले सेल के बहु-पैरामीटर विस्कोस्टिक माप प्राप्त करने में अंतर को पाटता है। एक प्रत्यक्ष धारा (डीसी) माप का उपयोग कोशिकाओं की निगरानी के लिए किया जाता है क्योंकि वे एक माइक्रोफ्लुइडिक चैनल को पारगमन करते हैं, उनके आकार और वेग को एक संकीर्ण कसना के माध्यम से मजबूर करने से पहले, दौरान और बाद में ट्रैक करते हैं। इस जानकारी (यानी, आकार और वेग) का उपयोग प्रत्येक सेल के अनुप्रस्थ विरूपण, विरूपण के प्रतिरोध और विरूपण से वसूली को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। सामान्य तौर पर, यह इलेक्ट्रॉनिक्स-आधारित माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफ़ॉर्म कई विस्कोस्टिक सेल गुण प्रदान करता है, और इस प्रकार सेल की यांत्रिक स्थिति की अधिक पूर्ण तस्वीर प्रदान करता है। क्योंकि इसके लिए न्यूनतम नमूना तैयार करने की आवश्यकता होती है, एक सरल इलेक्ट्रॉनिक माप (उच्च गति वाले कैमरे के विपरीत) का उपयोग करता है, और मानक नरम लिथोग्राफी निर्माण का लाभ उठाता है, इस मंच का कार्यान्वयन सरल, सुलभ और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए अनुकूलनीय है। इस प्लेटफ़ॉर्म के लचीलेपन, उपयोगिता और संवेदनशीलता ने कोशिकाओं की एक विविध श्रृंखला पर अद्वितीय यांत्रिक जानकारी प्रदान की है, जिसमें बुनियादी विज्ञान और नैदानिक निदान में कई और अनुप्रयोगों की क्षमता है।

Introduction

एकल कोशिकाएं गतिशील, विस्कोस्टिक सामग्रीहैं 1. आंतरिक और बाहरी प्रक्रियाओं की एक भीड़, (उदाहरण के लिए, माइटोसिस की शुरुआत या बाह्य मैट्रिक्स [ईसीएम] की रीमॉडेलिंग), उनकी संरचना और संरचना 2,3,4 को प्रभावित करती है, जिसके परिणामस्वरूप अक्सर अलग-अलग बायोफिज़िकल गुण होते हैं जो उनकी वर्तमान स्थिति के पूरक होते हैं। विशेष रूप से, यांत्रिक गुणों को सेलुलर विकास, शरीर विज्ञान और विकृति विज्ञान के महत्वपूर्ण बायोमार्कर के रूप में दिखाया गया है, जो मूल्यवान मात्रात्मक जानकारी प्रदान करता है जो कैननिकल आणविक और आनुवंशिक दृष्टिकोण 5,6,7 को पूरक कर सकता है। उदाहरण के लिए, ली एट अल ने हाल ही में दवा प्रतिरोधी और दवा-उत्तरदायी तीव्र प्रोमाइलोसाइटिक ल्यूकेमिया कोशिकाओं के बीच यांत्रिक अंतर का वर्णन किया, जबकि अलग-अलग व्यक्त साइटोस्केलेटन से जुड़े जीन 8 को उजागर करने के लिए आरएनए-सेक का भी उपयोगकिया। एकल-कोशिका यांत्रिकी और सेलुलर फ़ंक्शन के बीच जटिल अंतःक्रिया को समझकर, मेकेनोटाइपिंग में बुनियादी विज्ञान और नैदानिक निदान को बदलने में व्यापकअनुप्रयोग हैं।

एकल-कोशिका यांत्रिकी को मापने के लिए सबसे व्यापक रूप से अपनाया जाने वाला उपकरण परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) है। जबकि एएफएम सेलुलर यांत्रिक गुणों के एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन, स्थानीय माप को सक्षम बनाता है, यह <0.01 कोशिकाओं / एस10 के थ्रूपुट तक सीमित रहता है। वैकल्पिक रूप से, ऑप्टिकल स्ट्रेचर, जो निलंबित एकल कोशिकाओं11 को फंसाने और विकृत करने के लिए दो डाइवर्जेंट लेजर बीम का उपयोग करते हैं, <1 सेल / एस12 के मामूली उच्च थ्रूपुट तक सीमित हैं। माइक्रोफ्लुइडिक प्रौद्योगिकियों में हालिया प्रगति ने तेजी से, एकल-सेल, यांत्रिक मूल्यांकन12,13 के लिए उपकरणों की एक नई पीढ़ी को सक्षम किया है। येतकनीकें संकीर्ण कसना चैनल 14,15, कतरनी प्रवाह16, या हाइड्रोडायनामिक स्ट्रेचिंग17 को 10-1,000 कोशिकाओं / एस18 के थ्रूपुट पर कोशिकाओं को जल्दी से विकृत करने के लिए नियोजित करती हैं। जबकि इन दृष्टिकोणों की माप दर पारंपरिक तकनीकों की तुलना में काफी तेज है, वे अक्सर सीमित यांत्रिक रीडआउट (पूरक तालिका 1) के लिए उच्च-थ्रूपुट क्षमताओं का व्यापार करते हैं। उपरोक्त सभी रैपिड माइक्रोफ्लुइडिक विधियां बुनियादी, एकल-पैरामीटर मैट्रिक्स पर ध्यान केंद्रित करती हैं, जैसे कि पारगमन समय या विकृति अनुपात, जो केवल सेल के लोचदार गुणों को दर्शाते हैं। हालांकि, एकल कोशिकाओं की आंतरिक विस्कोस्टिक प्रकृति को देखते हुए, कोशिकाओं के एक मजबूत और गहन यांत्रिक लक्षण वर्णन के लिए न केवल लोचदार घटकों बल्कि चिपचिपे प्रतिक्रियाओं पर भी विचार करने की आवश्यकता होती है।

मेकानो-नोड-पोर सेंसिंग (मेकानो-एनपीएस) 2,8 (चित्रा 1 ए) एक माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म है जो एकल-सेल मेकेनोफेनोटाइपिंग के साथ मौजूदा सीमाओं को संबोधित करता है। यह विधि एक साथ कई बायोफिज़िकल मापदंडों के माप को सक्षम करती है, जिसमें सेल व्यास, सापेक्ष विकृति और विरूपण से वसूली का समय शामिल है, जिसमें 1-10 कोशिकाओं / सेकंड का मध्यम थ्रूपुट होता है। यह तकनीक नोड-पोर सेंसिंग (एनपीएस) 19,20,21,22,23,24 पर आधारित है, जिसमें एक माइक्रोफ्लुइडिक चैनल को स्थानांतरित करने वाले सेल द्वारा उत्पादित मॉड्यूलेटेड करंट पल्स को मापने के लिए चार-बिंदु जांच माप का उपयोग करना शामिल है, जिसे व्यापक क्षेत्रों द्वारा विभाजित किया गया है, जिसे "नोड्स" कहा जाता है। मॉड्यूलेटेड करंट पल्स सेल का एक परिणाम है जो खंडों (यानी, "छिद्र") और नोड्स में धारा के प्रवाह को आंशिक रूप से अवरुद्ध करता है, जिसमें उत्तरार्द्ध की तुलना में पूर्व में अधिक प्रवाह अवरुद्ध होता है। मेकानो-एनपीएस में, एक खंड, "संकुचन चैनल", सेल व्यास की तुलना में संकरा है; नतीजतन, एक सेल को पूरे चैनल को स्थानांतरित करने के लिए विकृत करना होगा (चित्रा 1 बी)। सेल व्यास को उप-स्पंदन के परिमाण से निर्धारित किया जा सकता है जब सेल संकुचन चैनल से पहले नोड-छिद्रों को स्थानांतरित करता है (आंकड़े 1 बी, सी)। यहां, जब कोशिका छिद्र में होती है, तो वर्तमान गिरावट, छिद्र में कोशिका के आयतन अनुपात केसमानुपाती होती है, वीसेल / वीपोर 2,8,19। सेल कठोरता को एटीसी द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, नाटकीय रूप से बड़े उप-स्पंदन की अवधि जब सेल संकुचन चैनल को पारगमन करता है (आंकड़े 1 बी, सी)। एक कठोर सेल को चैनल को स्थानांतरित करने मेंनरम 2,8 की तुलना में अधिक समय लगेगा। अंत में, सेल "रिकवरी", विरूपण के बाद अपने मूल आकार और आकार में लौटने की सेल की क्षमता, उत्पादित उप-दालों की श्रृंखला द्वारा निर्धारित की जा सकती है क्योंकि सेल संकुचन चैनल के बाद नोड-छिद्रों को स्थानांतरित करता है (आंकड़े 1 बी, सी)। रिकवरी का समय, एफटीआर, वह समय है जो सेल को निचोड़ने से पहले, वर्तमान उप-दालों को पिछली उप-दालों के परिमाण में लौटने में लगता है। कुल मिलाकर, माइक्रोफ्लुइडिक चैनल को स्थानांतरित करने वाले सेल के रूप में उत्पादित मॉड्यूलेटेड वर्तमान दालों को रिकॉर्ड किया जाता है और प्रासंगिक एकल-सेल यांत्रिक मापदंडों (चित्रा 1 डी) 2,8 को निकालने के लिए विश्लेषण किया जाता है।

इस इलेक्ट्रॉनिक्स-आधारित माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म की प्रजनन क्षमता और उपयोग में आसानी पहले प्रदर्शित की गईहै। इसके अतिरिक्त, मंच एकल-सेल मेकेनोटाइपिंग के लिए प्रवेश के लिए एक कम बाधा प्रस्तुत करता है। मानक नरम लिथोग्राफी माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को बनाने के लिए नियोजित है। माप हार्डवेयर में एक साधारण मुद्रित सर्किट बोर्ड (पीसीबी), बिजली की आपूर्ति, प्रीएम्पलीफायर, डेटा अधिग्रहण बोर्ड (डीएक्यू), और कंप्यूटर सहित सस्ती घटक शामिल हैं। अंत में, उपयोगकर्ता के अनुकूल कोड डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए उपलब्ध है, जो सीधे कार्यान्वयन को सक्षम करता है। यह मेकेनोटाइपिंग तकनीक गैर-घातक और घातक स्तन और फेफड़ों के उपकला कोशिका लाइनों की आबादी को अलग कर सकती है, प्राथमिक मानव स्तन उपकला कोशिकाओं में उपवंशों के बीच भेदभाव कर सकती है, और साइटोस्केलेटल गड़बड़ी और अन्य औषधीय एजेंटोंके प्रभावों को चिह्नित कर सकती है। कुल मिलाकर, यह मंच एकल कोशिकाओं के मेकेनोफेनोटाइपिंग के लिए एक प्रभावी दृष्टिकोण है।

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Protocol

1. डिजाइन डिवाइस ज्यामिति

  1. आकार और पुनर्प्राप्ति खंडों की चौड़ाई चुनें ताकि यह मापी जाने वाली सबसे बड़ी कोशिकाओं के व्यास से अधिक व्यापक हो, लेकिन पर्याप्त सिग्नल-टू-शोर अनुपात (एसएनआर) भी बनाए रखता है। विभिन्न सेल लाइनों के लिए विभिन्न आकार और पुनर्प्राप्ति खंड चौड़ाई के उदाहरणों के लिए पूरक तालिका 2 देखें।
  2. मेकेनोटाइपिंग से गुजरने वाली कोशिकाओं के औसत आकार में 30% -40% तनाव लागू करने के लिए संकुचन खंड की चौड़ाई चुनें। तनाव को इस प्रकार Equation 1परिभाषित किया गया है, जहां डी सेल व्यास है और डब्ल्यूसी संकुचन चैनल चौड़ाई 2,8 है। विभिन्न सेल लाइनों के लिए विभिन्न संकुचन खंड चौड़ाई के लिए पूरक तालिका 2 देखें।
    नोट: यदि कोई काफी अलग व्यास वाले सेल प्रकारों या स्थितियों की तुलना करना चाहता है, तो प्रत्येक सेल प्रकार / स्थिति के लिए विशिष्ट संकुचन खंड चौड़ाई के साथ अलग-अलग डिवाइस डिज़ाइन का उपयोग किया जाना चाहिए।
  3. प्रत्येक अद्वितीय डिवाइस ज्यामिति के लिए एक संदर्भ डिवाइस डिज़ाइन करें। यह डीई, माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के आकार छिद्र खंड के प्रभावी व्यास को निर्धारित करने के लिए आवश्यक है।
    नोट: संदर्भ डिवाइस प्राथमिक डिवाइस के समान ज्यामिति का उपयोग करता है। एकमात्र संशोधन यह है कि संकुचन खंड को आकार छिद्र खंड की चौड़ाई के बराबर होना चाहिए ताकि ज्ञात आकार के पॉलीस्टाइनिन मोतियों के साथ अंशांकन की अनुमति मिल सके। संकुचन को चौड़ा करने से पॉलीस्टाइनिन मोतियों को अंशांकन के दौरान संकुचन चैनल को बंद करने से रोका जा सकता है। अंशांकन प्रक्रिया को आगे चरण 4.1 और 5.3.1 में वर्णित किया गया है। अंशांकन को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल काउंटर का उपयोग करके भी प्राप्त किया जा सकता है, इस मामले में, किसी संदर्भ उपकरण की आवश्यकता नहीं है। इस प्रक्रिया को चरण 4.2 में वर्णित किया गया है।
  4. चैनल ऊंचाई चुनें ताकि संकुचन खंड2 के भीतर प्रतिबंध के बिना ब्याज की सबसे बड़ी कोशिकाएं पूरी तरह से लम्बी हो सकें। सुनिश्चित करें कि चैनल की ऊंचाई एचमिनट Equation 2 से बड़ी है (यह मानता है कि सेल गोलाकार पूर्व-विरूपण है, और यह कि आइसोमेट्रिक विरूपण विरूपण के दौरान चैनल की लंबाई और ऊंचाई के साथ होता है)।
    नोट: एक वर्तमान उप-स्पंदन के परिमाण को देखते हुए, Equation 3एचमिन जितना बड़ा होगा, समग्र एसएनआर उतना ही कम होगा।
  5. चुने हुए चैनल चौड़ाई के साथ कंप्यूटर-एडेड डिज़ाइन सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके एक फोटोमास्क डिज़ाइन और बनाएं। एक उदाहरण फ़ाइल पूरक फ़ाइल 1 में प्रदान की गई है। नकारात्मक मास्टर से छीलने के बाद पॉलीडिमेथिलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) संकोचन के लिए माइक्रोफ्लुइडिक मास्क डिजाइन को 1.5% तक स्केल करें।
    नोट: उपकरणों की एक सरणी को एक मास्क पर शामिल किया जा सकता है जब तक कि समग्र सरणी वेफर के आकार से अधिक न हो (पूरक चित्रा 1 ए)।
  6. इलेक्ट्रोड के साथ एक फोटोमास्क डिजाइन और बनाएं जिसका उपयोग माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस करंट (चित्रा 1 डी) के चार-बिंदु जांच माप करने के लिए किया जाएगा। एक उदाहरण फ़ाइल पूरक फ़ाइल 1 में प्रदान की गई है।
    नोट: इलेक्ट्रोड की एक सरणी को एकल मास्क पर शामिल किया जा सकता है जब तक कि सरणी ग्लास स्लाइड (पूरक चित्रा 1 बी) के आकार से अधिक न हो।

2. उपकरणों को गढ़ना (चित्रा 2)

  1. ग्लास सब्सट्रेट पर इलेक्ट्रोड पैटर्न तैयार करें।
    1. स्पिन कोट, पैटर्न, और उत्पाद डेटा शीट के अनुसार एक सादे ग्लास स्लाइड पर एक सकारात्मक फोटोरेसिस्ट प्रक्रिया। इस कार्यविधि का एक उदाहरण अनुपूरक फ़ाइल 2 में उल्लिखित है।
    2. धातु का जमाव, लिफ्ट-ऑफ और सोने की नक्काशी करें।
      1. स्लाइड पर 75 A Ti, 250 A PT, और 250 AU की पतली फिल्म का जमाव करें। इलेक्ट्रॉन-गन वाष्पीकरण का उपयोग करके इस प्रक्रिया का एक उदाहरण पूरक फ़ाइल 3 में उल्लिखित है।
      2. अतिरिक्त धातु का उठाव करने के लिए स्लाइड को एसीटोन में 15 मिनट के लिए डुबोएं।
      3. एक फ्यूम हुड में, इलेक्ट्रोड के क्षेत्र पर सोने के टुकड़े गिराने के लिए एक डिस्पोजेबल पिपेट का उपयोग करें जो माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के संपर्क में आएगा, जैसा कि पूरक चित्र 2 में दिखाया गया है। स्लाइड पर कहीं और एटचेंट छोड़ने से बचने के लिए सतर्क रहें।
        सावधानी: सोने के थिंग से त्वचा और आंखों में जलन हो सकती है। वाष्प ों को सांस न लें, और निगलना न करें। देखभाल के साथ संभालें, उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनें, और स्थानीय निपटान नियमों के अनुसार कचरे को छोड़ दें।
      4. डिआयनाइज्ड (डीआई) पानी से स्लाइड को धोएं और इसे सूखे नाइट्रोजन (एन2) के साथ सुखाएं।
    3. यदि एक ही ग्लास स्लाइड पर कई इलेक्ट्रोड मुद्रित होते हैं, तो स्लाइड को अलग-अलग चिप्स में बदल दें।
      1. पैटर्न इलेक्ट्रोड सीमाओं के साथ स्लाइड स्कोर करने के लिए ग्लास कटिंग टूल का उपयोग करें।
      2. स्लाइड को अलग-अलग चिप्स में विभाजित करने के लिए स्कोर के साथ ग्लास तोड़ें।
    4. माइक्रोस्कोप के तहत इलेक्ट्रोड का नेत्रहीन निरीक्षण करें। सुनिश्चित करें कि व्यक्तिगत इलेक्ट्रोड विद्युत रूप से खुले नहीं हैं या इलेक्ट्रोड एक साथ छोटे नहीं हैं।
  2. चैनलों के लिए एक नकारात्मक मास्टर मोल्ड बनाएं।
    1. स्पिन कोट, पैटर्न, और उत्पाद डेटा शीट के अनुसार एक एसयू -8 एपॉक्सी प्रतिरोध को पॉलिश सिलिकॉन वेफर पर रोकते हैं। इस कार्यविधि का एक उदाहरण अनुपूरक फ़ाइल 2 में उल्लिखित है।
    2. एक प्रोफाइलोमीटर का उपयोग करके फीचर ऊंचाइयों को मापें और माइक्रोस्कोप के तहत सुविधाओं का निरीक्षण करें (पूरक चित्र 3)। सुनिश्चित करें कि वांछित ज्यामिति अच्छी तरह से परिभाषित हैं।
  3. नरम लिथोग्राफी के साथ पीडीएमएस चैनलों को मोल्ड करें।
    1. डिस्पोजेबल कप में 10: 1 द्रव्यमान अनुपात पर एक इलास्टोमर और एक क्रॉसलिंकर का वजन करके पीडीएमएस तैयार करें।
      नोट: व्यास में 3 के साथ एक वेफर के लिए, पीडीएमएस का 30 ग्राम पर्याप्त है।
    2. पीडीएमएस को डिस्पोजेबल कांटे के साथ 30 सेकंड के लिए सख्ती से मिलाएं, जब तक कि पीडीएमएस बुलबुले के साथ अपारदर्शी न हो।
    3. लगभग 30-90 मिनट के लिए एक वैक्यूम कक्ष में पीडीएमएस को डी-गैस करें, या जब तक पीडीएमएस पारदर्शी न हो जाए जिसमें कोई बुलबुले न हों।
    4. एसयू -8 मास्टर मोल्ड के साथ वेफर को डिस्पोजेबल पेट्री डिश में रखें और वेफर के केंद्र पर पीडीएमएस डालें।
    5. पीडीएमएस और वेफर युक्त पेट्री डिश को वैक्यूम चैंबर में रखें और लगभग 30 मिनट के लिए डी-गैस दें, या जब तक पीडीएमएस में कोई बुलबुले न रहें।
    6. पीडीएमएस को ओवन में या गर्म प्लेट पर 2 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें।
    7. एक तेज ब्लेड के साथ, एसयू -8 नकारात्मक मास्टर से पीडीएमएस को काटें और हटा दें।
    8. एक तेज ब्लेड का उपयोग करके अलग-अलग मोल्डों में ढाले गए पीडीएमएस स्लैब को डाइस करें
    9. डिस्पोजेबल बायोप्सी पंच का उपयोग करके इनलेट और आउटलेट एक्सेस छेद को कोर करें। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, प्रत्येक पीडीएमएस स्लैब के लिए एक नए पंच का उपयोग करें। एक तेज पंच चिकनी धार वाले छेद पैदा करता है, कणों को कम करता है जो संकुचन चैनल को बाधित कर सकते हैं।
      नोट: एक्सेस होल का व्यास टयूबिंग के बाहरी व्यास से थोड़ा कम होना चाहिए। उदाहरण के लिए, यदि 1/32 इंच के बाहरी व्यास के साथ पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन (पीटीएफई) ट्यूबिंग का उपयोग कर रहे हैं, तो 1.5 मिमी छेद को छिद्रित किया जाना चाहिए।
  4. पीडीएमएस चैनलों के लिए एक ग्लास / इलेक्ट्रोड सब्सट्रेट बांधें।
    1. मेथनॉल (≥99.8%) के साथ इलेक्ट्रोड ग्लास स्लाइड को साफ करें। सूखे एन 2 के साथसुखाएं।
    2. पीडीएमएस डिवाइस को स्कॉच टेप के साथ साफ करें, इसके बाद आइसोप्रोपिल अल्कोहल (आईपीए) और विआयनीकृत पानी (डीआई; 18 एम / सेमी2) के साथ कुल्ला करें। सूखे एन 2 के साथसुखाएं। फिर, स्कॉच टेप से एक बार फिर से साफ करें।
    3. ग्लास सब्सट्रेट को प्रीफैब्रिकेटेड इलेक्ट्रोड और तैयार पीडीएमएस मोल्ड (फीचर साइड अप) के साथ प्लाज्मा क्लीनर में रखें।
    4. दोनों को 2 मिनट (100-300 मीटर टॉर, 30 डब्ल्यू) के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा के संपर्क में रखें।
    5. पीडीएमएस मोल्ड को फीचर साइड के साथ पूर्वनिर्मित इलेक्ट्रोड के साथ ग्लास सब्सट्रेट पर फेस-डाउन रखें।
      नोट: प्लाज्मा-उपचारित पीडीएमएस और ग्लास के संपर्क में आने के बाद बॉन्डिंग तात्कालिक होती है; नतीजतन, आगे संरेखण संशोधन संभव नहीं होगा। संरेखण को सुविधाजनक बनाने के लिए, डीआई पानी में मेथनॉल के 2: 1 कमजोर पड़ने के 20 μL को प्लाज्मा-उपचारित ग्लास सतह पर पाइप किया जा सकता है। मेथनॉल समाधान उपचारित ग्लास और पीडीएमएस के बीच एक भौतिक बाधा के रूप में कार्य करता है, जिससे संरेखण समायोजन की अनुमति मिलती है। मेथनॉल का उपयोग करते समय, घोल को वाष्पित करने और बॉन्डिंग प्रक्रिया को पूरा करने के लिए संरेखित और मैट डिवाइस को 2 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें।
    6. एक माइक्रोस्कोप के तहत बंधुआ डिवाइस का नेत्रहीन निरीक्षण करें। सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोड और चैनल ज्यामिति ठीक से संरेखित हैं।

3. कोशिकाओं को मापें (चित्रा 1 डी)

  1. दबाव स्रोत, पीसीबी, बेंचटॉप हार्डवेयर और डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर तैयार करें।
    1. क्लैंप का उपयोग करके माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस को पीसीबी से कनेक्ट करें। पीसीबी का एक उदाहरण पूरक फ़ाइल 4 (जीईआरईआर फाइलें) और पूरक फ़ाइल 5 (योजनाबद्ध, बोर्ड और पीसीबी भागों की सूची फ़ाइलें) में प्रदान किया गया है।
      1. माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस पर इलेक्ट्रोड संपर्क पैड के साथ क्लैंप के स्प्रिंग-लोडेड पिन को संरेखित करें और पीसीबी पर छेद के साथ क्लैंप के हेडर पिन को संरेखित करें।
      2. पीसीबी छेद में क्लैंप के हेडर पिन को मजबूती से डालें, जिससे सुनिश्चित हो सके कि स्प्रिंग-लोडेड पिन इलेक्ट्रोड संपर्क पैड के साथ संरेखित रहें।
    2. इलेक्ट्रॉनिक हार्डवेयर सेट अप करें और कनेक्ट करें।
      1. बिजली आपूर्ति के दो आउटपुट पोर्ट को पीसीबी के आपूर्ति वोल्टेज पोर्ट से डबल केले प्लग-टू-बेयोनेट नील-कॉन्सेलमैन (बीएनसी) महिला एडाप्टर और एक बीएनसी केबल के साथ कनेक्ट करें।
      2. बिजली की आपूर्ति चालू करें। बीएनसी के आंतरिक कंडक्टर से जुड़े आउटपुट को +15 वी पर सेट करें और अन्य आउटपुट को -15 वी पर सेट करें। सर्किट को पावर देने के लिए दोनों आउटपुट सक्षम करें।
      3. बिजली आपूर्ति के आउटपुट पोर्ट के तीसरे हिस्से को बीएनसी केबल के साथ पीसीबी के इनपुट वोल्टेज पोर्ट से कनेक्ट करें। आउटपुट को वांछित लागू वोल्टेज पर सेट करें, लेकिन प्रयोग शुरू होने तक इसे सक्षम न करें।
      4. पीसीबी के आउटपुट वर्तमान पोर्ट को बीएनसी केबल के साथ वर्तमान प्रीएम्पलीफायर के इनपुट से कनेक्ट करें।
      5. वर्तमान प्रीएम्पलीफायर के आउटपुट को बीएनसी केबल के साथ डेटा अधिग्रहण प्रणाली के बीएनसी टर्मिनल ब्लॉक पर एक एनालॉग इनपुट से कनेक्ट करें। वैकल्पिक रूप से, उच्च आवृत्ति हस्तक्षेप को फ़िल्टर करने के लिए बीएनसी केबल के अनुरूप एनालॉग लो-पास फ़िल्टर कनेक्ट करें।
        नोट: एसएनआर को बेहतर बनाने के लिए, पीसीबी और डिवाइस को एक मोटी धातु के बाड़े के भीतर रखा जा सकता है। सभी बीएनसी केबलों और फ्लूडिक टयूबिंग को बाड़े में ड्रिल किए गए छेदों के माध्यम से रूट किया जा सकता है।
    3. व्यक्तिगत कंप्यूटर (PC) पर आवश्यक सॉफ़्टवेयर स्थापित और सेट करें
      1. पावर ऑन करें और दबाव नियंत्रक को पीसी से कनेक्ट करें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार किसी भी आवश्यक दबाव नियंत्रक सॉफ्टवेयर स्थापित करें।
      2. PC पर MATLAB और डेटा अधिग्रहण उपकरण बॉक्स स्थापित करें। सुनिश्चित करें कि डेटा अधिग्रहण सिस्टम के लिए आवश्यक ड्राइवर स्थापित हैं ताकि MATLAB डेटा अधिग्रहण टूलबॉक्स इंटरफ़ेस इसका पता लगा सके।
      3. https://github.com/sohnlab/node-pore-sensing-public से शामिल डेटा अधिग्रहण स्क्रिप्ट, "एनपीएस.एम", डाउनलोड करें।
    4. डेटा अधिग्रहण स्क्रिप्ट खोलें और कॉन्फ़िगर करें.
      1. डेटा अधिग्रहण सत्र प्रारंभ करने के लिए सही मान सेट करें, जिसमें विक्रेता ID, DAQ की डिवाइस ID और एनालॉग इनपुट चैनल संख्या (शामिल स्क्रिप्ट में पंक्तियाँ 34-36) शामिल हैं.
        नोट: डिवाइस आईडी फ़ंक्शन "daq.getDevices" या "daqlist" का उपयोग करके पाया जा सकता है।
      2. अधिग्रहण के लिए वांछित नमूना दर सेट करें (शामिल स्क्रिप्ट में लाइन 23)। इष्टतम परिणामों के लिए, इसे कम से कम 10 kHz पर सेट किया जाना चाहिए।
  2. सेल निलंबन तैयार करें।
    1. 1x फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (PBS) में 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) का समाधान तैयार करें, और 0.22 μm फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर करें।
    2. पसंद की सेल लाइन के उपयुक्त सेल-कल्चर प्रोटोकॉल के अनुसार कोशिकाओं को कल्चर और तैयार करें। 1-5 x 105 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता पर 1x PBS में 2% FBS के तैयार समाधान में कोशिकाओं को निलंबित करें। प्रयोगों की अवधि के लिए कोशिकाओं को बर्फ पर रखें।
  3. कोशिकाओं के भौतिक गुणों को मापें।
    1. ट्यूबिंग में सेल नमूना लोड करें और इसे डिवाइस इनलेट से कनेक्ट करें।
      1. रेजर ब्लेड या तेज चाकू से पीटीएफई ट्यूबिंग के 30 सेमी काट लें।
      2. ट्यूबिंग के एक छोर को एक ल्यूर लॉक सिरिंज से संलग्न करें। ट्यूबिंग के दूसरे छोर में सेल नमूना खींचने के लिए सिरिंज का उपयोग करें।
      3. सावधानी से टयूबिंग को डिवाइस के इनलेट में डालें।
      4. ट्यूबिंग के विपरीत छोर को माइक्रोफ्लुइडिक दबाव नियंत्रक से कनेक्ट करें।
        नोट: दबाव नियंत्रक में तरल बैकफ्लो को रोकने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक दबाव नियंत्रक और टयूबिंग के बीच एक फिल्टर जोड़ा जा सकता है।
    2. प्रयोग चलाएँ.
      1. दबाव नियंत्रक सॉफ्टवेयर पर वांछित निरंतर ड्राइविंग दबाव सेट करें और नमूने को डिवाइस भरने की अनुमति दें।
        नोट: दबाव आमतौर पर 2-21 kPa है। प्रवाह की गति स्पष्ट रूप से परिभाषित दालों की अनुमति देने के लिए पर्याप्त धीमी होनी चाहिए, लेकिन पर्याप्त थ्रूपुट की अनुमति देने के लिए पर्याप्त तेज होनी चाहिए।
        1. यदि माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों में बुलबुले बनते हैं, तो डेड-एंड फिलिंग का उपयोग करें: डिवाइस आउटलेट को प्लग करें और गैस-पारगम्य पीडीएमएस के माध्यम से हवा को बाहर निकालने के लिए इनलेट पर कम दबाव लागू करें। चैनल में बुलबुले छोड़ने से एक अस्थिर वर्तमान आधार रेखा होगी और सटीक माप को रोका जा सकेगा।
        2. यदि मलबा माइक्रोफ्लुइडिक चैनल को बंद कर देता है, तो ड्राइविंग दबाव लागू करते समय पीडीएमएस डिवाइस के शीर्ष पर हल्के से दबाकर, दबाव को चालू और बंद करके या ट्यूबिंग को हटाकर और इसे फिर से डालकर उच्च दबाव को "स्पंदित" करके हटा दें। यदि मलबा बना रहता है, तो एक नए डिवाइस पर स्विच करना आवश्यक हो सकता है।
      2. बिजली की आपूर्ति पर वोल्टेज नॉब को घुमाकर वांछित वोल्टेज सेट करें और ऑन बटन दबाकर वोल्टेज को सक्षम करें।
        नोट: वोल्टेज आमतौर पर 1-5 वी होता है। पर्याप्त एसएनआर के लिए आवश्यक सबसे कम वोल्टेज चुनें। तुलना करने के लिए सभी स्थितियों में एक ही वोल्टेज का उपयोग किया जाना चाहिए।
      3. वर्तमान प्रीएम्पलीफायर चालू करें और संवेदनशीलता (ए / वी) को यथासंभव कम सेट करें; वैकल्पिक रूप से, प्रीएम्पलीफायर को ओवरलोड किए बिना या डीएक्यू के अधिकतम एनालॉग इनपुट वोल्टेज को पार किए बिना लाभ (वी / ए) को यथासंभव उच्च सेट करें। इस अध्ययन में, संवेदनशीलता को 10-7 ए / वी पर सेट किया गया था।
        नोट: उचित संवेदनशीलता / लाभ मूल्य लागू वोल्टेज के साथ-साथ माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के बेसलाइन प्रतिरोध दोनों पर निर्भर करेगा।
      4. डेटा अधिग्रहण स्क्रिप्ट NPS.m शुरू करने के लिए MATLAB रिबन मेनू में हरे रंग का रन बटन दबाएं और डेटा का नमूना लेना और सहेजना शुरू करें।
      5. प्रयोग को समाप्त करने के लिए, डेटा अधिग्रहण स्क्रिप्ट को रोकने के लिए आकृति विंडो के निचले बाएँ कोने में स्टॉप बटन दबाएं। ऑन बटन दबाकर पावर सप्लाई आउटपुट को अक्षम करें। दबाव नियंत्रक सॉफ़्टवेयर में दबाव स्रोत को शून्य दबाव पर सेट करें।
      6. इस बिंदु पर, प्रयोग को निम्नलिखित में से एक या अधिक करने के लिए रोका जा सकता है:
        1. वर्तमान डिवाइस को एक नए के साथ बदलें।
        2. अधिक सेल नमूने के साथ ट्यूबिंग को फिर से लोड करें।
          नोट: नमूना क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए, विभिन्न प्रकार या स्थितियों की कोशिकाओं को मापने के लिए नए उपकरणों का उपयोग करें।
        3. पीसीबी से डिवाइस को अनक्लैम्प करें और माइक्रोस्कोप के तहत चैनल की स्थिति की जांच करें। एक ही डिवाइस का उपयोग करके प्रयोग को फिर से शुरू करने के लिए, ध्यान रखा जाना चाहिए कि हवा के बुलबुले पेश न करें। डिवाइस इनलेट में डालने के दौरान ट्यूबिंग के अंत में सेल के नमूने को रखने के लिए सिरिंज प्लंजर पर कोमल दबाव लागू करना आवश्यक हो सकता है।

4. माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस को कैलिब्रेट करें

  1. विकल्प 1: संदर्भ उपकरणों में पॉलीस्टाइनिन मोतियों को मापें।
    1. एक पॉलीस्टाइनिन मोती का आकार चुनें जो आकार चैनल से छोटा है।
    2. सेल प्रयोगों के दौरान उपयोग किए जाने वाले फ़िल्टर किए गए पीबीएस और एफबीएस समाधान में 1.5% ट्वीन और पॉलीस्टाइनिन मोती जोड़ें, 1-3 x 105 मोतियों / एमएल की एकाग्रता पर।
    3. चरण 1.3 में वर्णित संदर्भ डिवाइस का उपयोग करके, अनुभाग 3 में उल्लिखित प्रयोग के साथ आगे बढ़ें, और प्रयोग के दौरान उपयोग किए गए समान वोल्टेज को लागू करें। धारा 5 में वर्णित डीई की गणना करने के लिए मोतियों के आकार के छिद्रों और मोतियों के ज्ञात व्यास को स्थानांतरित करने के रूप में उत्पादित वर्तमान बूंद के औसत परिमाण का उपयोग करें।
  2. विकल्प 2: स्वतंत्र रूप से एक अलग माप डिवाइस के साथ सेल आकार को मापें।
    1. चरण 4.1 में प्रोटोकॉल का पालन करने के बजाय, नमूने में कोशिकाओं के औसत आकार को मापने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल आकार माप उपकरण का उपयोग करें। इस मामले में, कोई संदर्भ डिवाइस की आवश्यकता नहीं है। धारा 5 में वर्णित डीई की गणना करने के लिए कोशिकाओं के आकार छिद्र और मापा औसत सेल व्यास को स्थानांतरित करने के रूप में उत्पादित औसत वर्तमान गिरावट का उपयोग करें।

5. सेल फेनोटाइप निकालने के लिए डेटा का विश्लेषण करें

नोट: डेटा प्रोसेसिंग को MATLAB कमांड-लाइन इंटरफ़ेस प्रोग्राम फ़ाइल mNPS_procJOVE.m at https://github.com/sohnlab/NPS-analysis-JOVE का उपयोग करके किया जा सकता है। अधिक निर्देशों के लिए अनुपूरक फ़ाइल 6 देखें।

  1. डेटा को प्रीप्रोसेस करें (चित्रा 3 ए)।
    1. डीएक्यू द्वारा प्राप्त कच्चे डेटा के लिए वर्तमान-से-वोल्टेज प्रीएम्पलीफायर में उपयोग किए जाने वाले लाभ मूल्य को लागू करके मापा विद्युत प्रवाह की गणना करें।
    2. कच्चे वर्तमान माप के लिए आयताकार स्मूथिंग फ़ंक्शन और / या कम-पास फ़िल्टर लागू करके उच्च आवृत्ति शोर को हटा दें। फिर, फ़िल्टर किए गए डेटा को कम नमूना दर पर पुन: नमूना करें। इसके अलावा, इस कम नमूना दर पर संबंधित टाइमस्टैम्प डेटा की गणना करें।
    3. असममित न्यूनतम-वर्ग स्मूथिंग26 जैसी विधि लागू करके एक फिट किए गए बेसलाइन करंट सिग्नल की गणना करें।
    4. बाद के डेटा बिंदुओं के बीच अंतर लेकर प्रीप्रोसेस्ड वर्तमान डेटा के अनुमानित पहले व्युत्पन्न (अंतर संकेत) की गणना करें।
  2. सेल घटनाओं की पहचान करें और सबपल्स डेटा निकालें (चित्रा 3 बी)।
    1. प्रीप्रोसेस्ड डेटा की जांच करके उम्मीदवार सेल घटनाओं की खोज करें। सेल घटनाओं को अस्वीकार करें जो अन्य सेल घटनाओं (यानी, संयोग घटनाओं) के साथ ओवरलैप करते हैं (पूरक चित्रा 4), एक खराब बेसलाइन फिट प्रदर्शित करते हैं, या एक अप्रत्याशित या गलत पल्स आकार होता है (उदाहरण के लिए, जहां चैनल में एक क्लॉग मौजूद हो सकता है)।
    2. प्रत्येक सेल इवेंट के लिए सबपल्स डेटा निकालें।
      1. प्रत्येक नोड-पोर सेगमेंट समग्र सिग्नल पल्स (आंकड़े 1 बी, सी) के भीतर एक संबंधित उप-स्पंदन के रूप में दिखाई देगा। अंतर संकेत स्थानीय न्यूनतम मान तक पहुंचने पर टाइमपॉइंट की गणना करके प्रत्येक सबपल्स की शुरुआत की पहचान करें। अंतर संकेत स्थानीय अधिकतम मान तक पहुंचने पर टाइमपॉइंट की गणना करके प्रत्येक सबपल्स के अंत की पहचान करें।
      2. प्रारंभ और समाप्ति समय बिंदुओं के बीच बीत चुके समय के रूप में प्रत्येक उप-स्पंदन की चौड़ाई निर्धारित करें। प्रारंभ और समाप्ति समय बिंदुओं के बीच सभी डेटा बिंदुओं के लिए मापा धारा और बेसलाइन धारा के बीच अंतर के औसत की गणना करके प्रत्येक उप-स्पंदन के आयाम का निर्धारण करें।
  3. सबपल्स डेटा के आधार पर प्रत्येक सेल इवेंट के लिए सेल मेकेनोफेनोटाइप निर्धारित करें।
    1. डेब्लोइस और बीन24 द्वारा परिभाषित समीकरण के आधार पर सेल व्यास डी निर्धारित करें:
      Equation 4
      जहां 3I/I साइज़िंग सबपल्स में बेसलाइन करंट के लिए सबपल्स आयाम का औसत अनुपात है, डीई चैनल का प्रभावी व्यास है (चरण 4 में मापा जाता है), और एल नोड-पोर चैनल की कुल लंबाई है।
      1. De को ज्ञात व्यास के कणों के एक सेट (या तो कोशिकाओं या मोतियों, चरण 4 देखें) द्वारा उत्पादित औसत YI/I की गणना करके निर्धारित किया जाता है, d के रूप में ज्ञात व्यास का उपयोग करके, और De के लिए समीकरण 1 को हल करके।
    2. विरूपण के लिए सेल के प्रतिरोध की मात्रा निर्धारित करें।
      1. ज्ञात खंड लंबाई और प्रत्येक उप-पल्स की मापी गई अवधि का उपयोग करके, साइज़िंग सबपल्स में औसत सेल वेग की गणना करके द्रव वेग यूप्रवाह निर्धारित करें।
      2. किम एट अल.2 द्वारा परिभाषित पूरे सेल विकृति सूचकांक (डब्ल्यूसीडीआई) का निर्धारण करें:
        Equation 5
        जहां एलसी संकुचन खंड की लंबाई है, एचचैनल चैनल ऊंचाई है, और ए टीसी संकुचन उपपल्स की अवधि है।
    3. विरूपण से सेल के पुनर्प्राप्ति समय की पहचान करें, जिसे साइज़िंग सबपल्स 2 से औसत आयाम के 8% के भीतर आयाम के साथ पहले रिकवरी सबपल्स के रूप में परिभाषित कियागया है।
    4. संकुचन खंड के भीतर सेल के अनुप्रस्थ विरूपण की गणना करें।
      1. किम एट अल.2 द्वारा परिभाषित संकुचन खंड (डीई, सी) के प्रभावी व्यास की गणना करें: Equation 6जहां डब्ल्यूसी संकुचन खंड की चौड़ाई है और डब्ल्यूएनपी अन्य सभी खंडों की चौड़ाई है।
      2. डेब्लोइस और बीन24 द्वारा परिभाषित समीकरण का उपयोग करके संकुचन के भीतर सेल के समकक्ष गोलाकार व्यास डीसी की गणना करें:
        Equation 7
        जहां 3Ic/Ic संकुचन उपपल्स में बेसलाइन धारा के लिए उप-आयाम का अनुपात है और Lc संकुचन खंड की लंबाई है।
      3. किम एट अल.2 द्वारा वर्णित सेल की लम्बाई लंबाई एलविकृति की गणना करें:
        Equation 8
      4. अंत में, सेल के अनुप्रस्थ विरूपण δ विकृति की गणनाकरें, जिसे किम एट अल.2 Equation 9द्वारा परिभाषित किया गया है।

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Representative Results

यहां प्रस्तुत मेकेनोटाइपिंग प्लेटफॉर्म मध्यम थ्रूपुट के साथ एकल कोशिकाओं के बायोफिज़िकल गुणों को मापने के लिए एक सरल और बहुमुखी दृष्टिकोण है। कोशिकाओं को निरंतर दबाव-संचालित प्रवाह का उपयोग करके माइक्रोफ्लुइडिक चैनल (चित्रा 1 ए) के माध्यम से प्रवाहित किया जाता है। जैसे-जैसे कोशिकाएं पारगमन करती हैं, माइक्रोफ्लुइडिक चैनल की लंबाई और उत्पादित वर्तमान दालों को डेटा अधिग्रहण हार्डवेयर का उपयोग करके दर्ज किया जाता है। अधिग्रहित सिग्नल (चित्रा 1 बी, सी) को तब प्रासंगिक एकल-सेल यांत्रिक गुणों को निकालने के लिए MATLAB पर कस्टम सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके संसाधित किया जाता है। चित्रा 1 डी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का एक ग्राफिकल अवलोकन प्रस्तुत करता है।

उपकरणों को बनाने के लिए, एक नकारात्मक मास्टर मोल्ड शुरू में बनाया जाता है और पीडीएमएस (चित्रा 2) डालने के लिए उपयोग किया जाता है। पूरक चित्र 3 में दिखाए गए सफल मास्टर मोल्डों में चिकनी, ऊर्ध्वाधर साइडवॉल और माइक्रोफ्लुइडिक चैनल (चित्रा 4 एआई) में कोई दोष नहीं होता है। इस प्रारंभिक मास्टर मोल्ड को बनाने में सावधानी बरतनी चाहिए क्योंकि, खराब निर्मित वेफर्स (पूरक चित्रा 3) में, कोई भी दोष बाद के सभी पीडीएमएस कास्ट (चित्रा 4एआईआई) में स्थानांतरित हो जाएगा, जिससे वे अनुपयोगी हो जाएंगे। सफल पीडीएमएस कास्ट को तब पैटर्न इलेक्ट्रोड (चित्रा 1 ए) के साथ ग्लास स्लाइड से प्लाज्मा-बॉन्ड किया जाता है।

प्रयोगों के लिए, वर्तमान माप को सक्षम करने के लिए एक डिवाइस के इलेक्ट्रोड पैड पीसीबी (चित्रा 1 डी) से जुड़े होते हैं। ट्यूबिंग, जिसमें एक सेल नमूना होता है, फिर डिवाइस इनलेट में डाला जाता है और एक माइक्रोफ्लुइडिक प्रवाह नियंत्रक से जुड़ा होता है, जिससे माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के माध्यम से कोशिकाओं का दबाव-संचालित प्रवाह सक्षम होता है। महत्वपूर्ण रूप से, एक प्रयोग के दौरान वर्तमान माप का एक लाइव रीडआउट प्रदर्शित किया जाता है। यह उपयोगकर्ताओं को यह सुनिश्चित करने में सक्षम बनाता है कि उनका डिवाइस इच्छित रूप से काम कर रहा है। सफल सेल पारगमन घटनाओं में आसानी से अलग-अलग उप-दलहन शामिल हैं (चित्रा 4बी)। जटिलताएं, जैसे कि क्लॉगिंग, प्रयोग के दौरान हो सकती हैं और असामान्य नाड़ी आकृतियों वाली घटनाओं के लाइव रीडआउट द्वारा पहचानी जा सकती हैं (चित्रा 4बीआईआई)।

डेटा विश्लेषण के लिए, प्रत्येक सेल पारगमन घटना के लिए निकाले जाने वाले महत्वपूर्ण सिग्नल पैरामीटर चित्रा 1 बी में विस्तृत हैं और चरण 5.2.2 में वर्णित हैं। कच्चे सिग्नल में शोर को फ़िल्टर करने और महत्वपूर्ण घटकों को निकालने के लिए पर्याप्त एसएनआर होना चाहिए (चित्रा 3 ए)। गंभीर रूप से, प्रत्येक नोड से वर्तमान सिग्नल वृद्धि काफी मजबूत होनी चाहिए जैसे कि अंतर संकेत ∂I / ∂t (चित्रा 3 बी) से सबप्लांस को आसानी से पहचाना जा सके।

मापा डब्ल्यूसीडीआई और पुनर्प्राप्ति समय का उपयोग कोशिकाओं या स्थितियों के बीच सीधी तुलना करने के लिए किया जा सकता है। विशेष रूप से, डब्ल्यूसीडीआई सेल कठोरता का एक सापेक्ष संकेतक है जो लोचदार मापांक (पूरक चित्रा 5) के व्युत्क्रमानुपाती है; इस प्रकार, डब्ल्यूसीडीआई का एक बड़ा मूल्य एक नरम यांत्रिक फेनोटाइप से मेल खाता है। उदाहरण के लिए, चित्रा 5 ए में, घातक एमसीएफ -7 कोशिकाओं में गैर-घातक एमसीएफ -10 ए कोशिकाओं की तुलना में अधिक डब्ल्यूसीडीआई वितरण होता है, यह दर्शाता है कि घातक एमसीएफ -7 कोशिकाएं अपने गैर-घातक एमसीएफ -10 ए समकक्षों की तुलना में नरम हैं। यह कई अनुभवजन्य अध्ययनों के अनुरूप है जिन्होंने कैंसर कोशिकाओं को उनके गैर-घातक समकक्षों की तुलना में नरम दिखायाहै। इसी तरह, चित्रा 5 बी में, लैट्रंकुलिन के साथ इलाज किए गए एमसीएफ -10 ए और एमसीएफ -7 कोशिकाएं डब्ल्यूसीडीआई में वृद्धि दिखाती हैं। लैट्रनकुलिन एक शक्तिशाली औषधीय एजेंट है जो एक्टिन साइटोस्केलेटन28 को बाधित करता है। नतीजतन, इस दवा के साथ इलाज की जाने वाली कोशिकाओं में एक अधिक डब्ल्यूसीडीआई का निरीक्षण करना सुसंगत है, और इस प्रकार एक नरम फेनोटाइप है। अंत में, चित्रा 5 सी में, डब्ल्यूसीडीआई की तुलना दो मानव स्तन उपकला कोशिका उपवंशों, ल्यूमिनल उपकला (एलईपी) और मायोएपिथेलियल (एमईपी) के बीच की जाती है। इस तुलना में, एक बार फिर दो प्राथमिक सेल प्रकारों को अलग करने वाला एक अलग डब्ल्यूसीडीआई वितरण है, यह दर्शाता है कि एलईपी कोशिकाएं एमईपी कोशिकाओं की तुलना में नरम हैं। डब्ल्यूसीडीआई से परे, सेल चिपचिपाहट का सापेक्ष संकेतक प्रदान करने के लिए रिकवरी समय भी निर्धारित किया जा सकता है। एक लंबा पुनर्प्राप्ति समय एक अधिक चिपचिपा फेनोटाइप इंगित करता है। चित्रा 5 डी रिकवरी समय प्रस्तुत करता है, जिसे आंकड़े 5 ए-सी में प्रत्येक स्थिति के लिए तीन अलग-अलग श्रेणियों में विभाजित किया गया है। अनुपचारित एमसीएफ -10 ए और एमसीएफ -7 में कोशिकाओं का एक बड़ा अनुपात होता है जो तुरंत ठीक हो जाते हैं (एटीआर = 0), जो उनके लैट्रनकुलिन उपचारित समकक्ष की तुलना में कम चिपचिपाहट का संकेत देता है।

डब्ल्यूसीडीआई और रिकवरी समय एकल-कोशिका लोच और चिपचिपाहट के सापेक्ष मैट्रिक्स हैं। इसलिए, यहां प्रस्तुत विधि रुचि के कई नमूनों के बीच अंतर प्रतिक्रिया को चिह्नित करने के लिए सबसे उपयुक्त है। अपने वर्तमान रूप में, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल परिभाषित यांत्रिक मापदंडों का पूर्ण परिमाणीकरण प्रदान नहीं करता है, जैसे कि यंग का मापांक।

Figure 1
चित्रा 1: मेकेनोटाइपिंग प्लेटफॉर्म का अवलोकन। (ए) माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस की छवि। (बी) चैनल ज्यामिति, एक एकल सेल पारगमन घटना से एक प्रतिनिधि वर्तमान पल्स के साथ। Inp छिद्र में प्रवेश करने वाली कोशिका से वर्तमान गिरावट का प्रतिनिधित्व करता है, और त्रिभुजIc संकुचन में प्रवेश करने वाली कोशिका से वर्तमान गिरावट का प्रतिनिधित्व करता है। टीपी कोशिका को छिद्र को स्थानांतरित करने के लिए आवश्यक समय का प्रतिनिधित्व करता है,ए टीसी संकुचन चैनल को स्थानांतरित करने के लिए कोशिका के लिए आवश्यक समय का प्रतिनिधित्व करता है, और एटीआर सेल को ठीक करने के लिए आवश्यक समय का प्रतिनिधित्व करता है। (सी) सेल पारगमन घटना से वास्तविक वर्तमान पल्स। (डी) प्रायोगिक वर्कफ़्लो: (1) कोशिकाओं को पीबीएस में निलंबित कर दिया जाता है और (2) निरंतर दबाव के साथ माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के माध्यम से संचालित किया जाता है। चूंकि कोशिकाएं माइक्रोफ्लुइडिक चैनल को पार करती हैं, (3) वर्तमान दालों को डेटा अधिग्रहण हार्डवेयर का उपयोग करके मापा जाता है। (4) वर्तमान दालों का विश्लेषण कई एकल-कोशिका यांत्रिक गुणों को निकालने के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: डिवाइस निर्माण का अवलोकन। (A) नकारात्मक मास्टर मोल्ड (1) फोटोलिथोग्राफी का उपयोग करके गढ़े जाते हैं। (2) पीडीएमएस को तब नकारात्मक मास्टर मोल्डों पर डाला जाता है। (3) मोल्ड किए गए उपकरणों को काटा जाता है, जिसमें इनलेट और आउटलेट छेद छिद्र होते हैं। (बी) इसके साथ ही, ग्लास स्लाइड (1) धातु इलेक्ट्रोड बनाने के लिए पैटर्न किए जाते हैं। (2) ई-बीम वाष्पीकरण का उपयोग स्लाइड पर धातु जमा करने के लिए किया जाता है, इसके बाद वांछित धातु इलेक्ट्रोड को पीछे छोड़ते हुए अतिरिक्त धातु को हटाने के लिए (3) लिफ्ट-ऑफ प्रक्रिया होती है। (सी) पीडीएमएस डिवाइस और धातु इलेक्ट्रोड के साथ ग्लास को तब निर्माण प्रक्रिया को पूरा करने के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा का उपयोग करके एक साथ जोड़ा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: डेटा प्रोसेसिंग और विश्लेषण। (A) कच्चे वर्तमान डेटा (बाएं) को आयताकार स्मूथिंग फ़ंक्शन और लो-पास फ़िल्टर लागू करके प्रीप्रोसेस्ड (दाएं) किया जाता है, इसके बाद कम नमूना दर पर रीसैंपलिंग की जाती है। बेसलाइन करंट सिग्नल को बाद में असममित कम से कम वर्ग स्मूथिंग26 के साथ फिट किया जाता है। (बी) प्रत्येक उप-स्पंदन के प्रारंभ और अंत में समय बिंदुओं को क्रमशः स्थानीय न्यूनतम और अधिकतम के रूप में पहचाना जाता है, अंतर संकेत ∂I/ ∂t (बाएं) में। प्रत्येक उप-स्पंदन के लिए , चौड़ाई 3 को प्रारंभ और अंत के बीच बीते हुए समय द्वारा निर्धारित किया जाता है, और आयाम 1 को मापा धारा और आधारभूत धारा के बीच औसत अंतर द्वारा निर्धारित किया जाता है। निकाले गए उप-पल्स डेटा को आयताकार संकेत (दाएं) के रूप में दर्शाया जा सकता है; प्रत्येक उपपल्स डिवाइस ज्यामिति में एक खंड से मेल खाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: निर्माण और प्रयोग के दौरान सफल और त्रुटिपूर्ण परिणामों के उदाहरण। (A) दो अलग-अलग नकारात्मक-मास्टर मोल्डों से लिए गए संकुचन खंडों के पीडीएमएस कास्ट की छवियां। (i) चिकनी साइडवॉल, अच्छी तरह से परिभाषित ज्यामिति और कोई ध्यान देने योग्य दोष के साथ एक अच्छी तरह से निर्मित चैनल का एक उदाहरण है। (ii) संकुचन चैनल (लाल आयताकारों में उल्लिखित) में महत्वपूर्ण दोषों के साथ एक खराब निर्मित चैनल का एक उदाहरण है, जो या तो पूरी तरह से या आंशिक रूप से कण प्रवाह को बाधित करेगा (स्केल बार = 150 μm)। (ख) डाटा अधिग्रहण के दौरान एनपीएस एम द्वारा सृजित फ़िल्टर्ड करंट दालों के उदाहरण। (i) एक सफल सेल घटना का उदाहरण, जहां एक सेल चैनल को इच्छित रूप से स्थानांतरित करता है। (ii) डिवाइस के "भरा हुआ" होने पर उत्पादित वर्तमान दालों का उदाहरण। इस मामले में, मलबा चैनल के दूसरे छिद्र में सेल प्रवाह को बाधित करता है। यह कोशिका घटनाओं की ओर जाता है जो दूसरे आकार की नाड़ी के माध्यम से "कटी हुई" (लाल रेखा द्वारा इंगित) दिखाई देती हैं। "कट ऑफ" के बाद धारा (नीली रेखाओं द्वारा इंगित) में कमी कणों (मलबे या कोशिकाओं) के कारण होती है जो रुकावट के चारों ओर बन रहे हैं और इसलिए वर्तमान प्रवाह के एक बड़े हिस्से को अवरुद्ध कर रहे हैं। धारा में एक तेज नीचे की ओर स्पाइक (हरे आयत द्वारा इंगित) एक कण को दर्शाता है जो रुकावट के चारों ओर पारगमन करने में सक्षम है और इसलिए, केवल अस्थायी रूप से धारा के एक बड़े हिस्से को अवरुद्ध करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: विभिन्न स्थितियों के बीच डब्ल्यूसीडीआई और सेल रिकवरी के उदाहरण। (ए) दो स्तन उपकला कोशिका लाइनों, गैर-घातक एमसीएफ -10 ए, और घातक एमसीएफ -7 के बीच डब्ल्यूसीडीआई वितरण। (बी) एमसीएफ -10 ए या एमसीएफ -7 का डब्ल्यूसीडीआई , जहां प्रत्येक सेल प्रकार का इलाज नहीं किया गया था, लैट-ए के साथ इलाज किया गया था, और लैट-बी के साथ इलाज किया गया था। (सी) दो प्राथमिक मानव स्तन उपकला उपवंशों के बीच डब्ल्यूसीडीआई वितरण: मायोएपिथेलियल (एमईपी) और ल्यूमिनल एपिथेलियल (एलईपी) कोशिकाएं। (D) A, B और C के बीच चार स्थितियों के अनुरूप पुनर्प्राप्ति समय को देखने में आसानी के लिए निर्धारित किया गया था। सभी स्थितियों में एन = 99 कोशिकाओं का नमूना आकार था। यह आंकड़ा किम एट अल.2 की अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1: माइक्रोफ्लुइडिक चैनल और इलेक्ट्रोड दोनों के लिए डिवाइस सरणी के उदाहरण। पारदर्शिता मास्क के रूप में दर्शाए गए दोनों चित्रों को उन क्षेत्रों में सफेद (पारदर्शी का प्रतिनिधित्व करने वाले) के साथ डिज़ाइन किया जाना चाहिए जहां फोटोरेसिस्ट को यूवी के संपर्क में लाया जाएगा और उन क्षेत्रों में काले रंग से जहां इसे यूवी एक्सपोजर से अवरुद्ध किया जाएगा। (ए) माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों की एक सरणी, जिसमें प्रति "डिवाइस" (आयत) दो समानांतर चैनल होते हैं, जो सी वेफर में 3 पर व्यवस्थित होते हैं। सबसे दाईं ओर डिवाइस को "रेफरी" के रूप में लेबल किया गया है और अंशांकन में उपयोग के लिए चरण 1.3 में वर्णित के रूप में डिज़ाइन किया गया है। (बी) इलेक्ट्रोड की एक सरणी, जिसमें प्रति डिवाइस दो इलेक्ट्रोड होते हैं, जैसे कि (ए) से डिवाइस में दोनों चैनल (बी) से प्रत्येक इलेक्ट्रोड डिजाइन पर संरेखित होंगे। इस सरणी को ग्लास स्लाइड में 2 इंच x 3 के लिए व्यवस्थित किया गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 2: इलेक्ट्रोड डिजाइन के क्षेत्रों को दर्शाने वाले योजनाबद्ध और सोने को सही ढंग से कैसे दूर किया जाए (चरण 2.1.2.3)। सोने की शीर्ष परत को माप इलेक्ट्रोड से हटा दिया जाना चाहिए, या माप के दौरान बायोफॉलिंग और इलेक्ट्रोलिसिस होगा। हालांकि, सोना संपर्क पैड पर रहना चाहिए, क्योंकि नरम सोना पोगो पिन कनेक्टर के पिन के साथ एक बेहतर विद्युत कनेक्शन प्रदान करता है। (ए) योजनाबद्ध दिखा रहा है कि माइक्रोफ्लुइडिक चैनल (नीले रंग में) पैटर्न धातु (काले) के साथ कैसे प्रतिच्छेद करता है। जैसा कि संकेत दिया गया है, धातु माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के लंबवत और सीधे इसके नीचे माप इलेक्ट्रोड हैं, जहां सोने को उकेरा जाना चाहिए, जबकि चैनल के किनारे बड़े धातु आयताकार संपर्क पैड हैं, जहां सोना रहना चाहिए। (बी) योजनाबद्ध दिखाना कि पैटर्न वाली धातु पर सोने की परत कहां लागू की जानी चाहिए, साथ ही साथ इसे कहां नहीं। हरा क्षेत्र इंगित करता है कि जहां नक़्क़ाशी आवश्यक है, पीला क्षेत्र इंगित करता है कि नक़्क़ाशी कहाँ हो सकती है और डिवाइस की प्रभावशीलता को प्रभावित नहीं करेगी, और लाल क्षेत्र इंगित करता है कि सोना कहाँ अंकित नहीं किया जाना चाहिए। (सी) योजनाबद्ध एक विशिष्ट, सफलतापूर्वक अंकित डिवाइस दिखा रहा है। पीला उन क्षेत्रों को इंगित करता है जहां सोना अभी भी मौजूद है, और ग्रे उन क्षेत्रों को इंगित करता है जहां प्लैटिनम परत उजागर हुई है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 3: सफलतापूर्वक और खराब निर्मित संकुचन चैनलों की छवियां। (ए) दो अलग-अलग एसआई वेफर्स से नकारात्मक मास्टर मोल्डों पर संकुचन चैनलों की छवियां। (i) एक अच्छी तरह से निर्मित मास्टर मोल्ड का एक उदाहरण जो एक आदर्श पीडीएमएस चैनल का उत्पादन करेगा जैसे कि चित्र 4 एआई में दिखाया गया है। (ii) खराब रूप से निर्मित मास्टर मोल्ड का एक उदाहरण, जिसका उपयोग चित्र 4 एआई में दिखाए गए पीडीएमएस चैनल को बनाने के लिए किया गया था। लाल आयताकारों में उल्लिखित क्षेत्र चित्र 4 एआई में इंगित दोषों के अनुरूप हैं, जो मास्टर मोल्ड से पीडीएमएस माइक्रोचैनल (स्केल बार = 150 μm) में दोषों के हस्तांतरण को प्रदर्शित करते हैं। (बी) पीडीएमएस संकुचन चैनलों के क्रॉस-सेक्शन की छवियां, विभिन्न मोल्डों की ऊंचाई और चौड़ाई दिखाती हैं। इन क्रॉस-सेक्शन को प्रवाह की दिशा के लंबवत पीडीएमएस संकुचन चैनल को काटकर अधिग्रहित किया गया था। (i) (एआई) में दिखाए गए वेफर का उपयोग करके बनाई गई एक अच्छी तरह से निर्मित पीडीएमएस मोल्ड का एक उदाहरण, जो चिकनी ऊर्ध्वाधर साइडवॉल का प्रदर्शन करता है। (ii) (एआईआई) में दिखाए गए वेफर का उपयोग करके बनाए गए खराब गढ़े गए पीडीएमएस मोल्ड का एक उदाहरण तिरछी साइडवॉल (स्केल बार = 20 μm) का प्रदर्शन करता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 4: एक संयोग सेल घटना का उदाहरण (जब एक से अधिक सेल एक बार में चैनल को स्थानांतरित कर रहे हैं)। प्रोटोकॉल के खंड 5 में चरण 5.1.1-5.1.3 के अनुसार सिग्नल संसाधित किया गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 5: डब्ल्यूसीडीआई और लोचदार मापांक 20,29,30,31,32,33,34,35 के बीच संबंध। (ए) माइक्रोपिपेट एस्पिरेशन बनाम इस तकनीक द्वारा मापे गए जुरकट, एमसीएफ 7, और एमसीएफ 10 ए कोशिकाओं की तुलना। डब्ल्यूसीडीआई कॉर्टिकल तनाव के व्युत्क्रमानुपाती है। (बी) प्रकाशित एएफएम डेटा बनाम इस तकनीक द्वारा मापी गई एमसीएफ 7 और एमसीएफ 10 ए कोशिकाओं की तुलना। (ग) प्रकाशित एएफएम डेटा बनाम इस तकनीक द्वारा मापी गई ए549 और बीईएएस-2बी कोशिकाओं की तुलना। कई सेल प्रकारों में, डब्ल्यूसीडीआई लोचदार मापांक के व्युत्क्रमानुपाती है। इस आंकड़े को किम एट अल.2 की अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 1: एकल-सेल मेकेनोटाइपिंग तकनीकों के उदाहरण और वे मेकानो-एनपीएस की तुलना कैसे करते हैं। तकनीकों को थ्रूपुट 12,2,36,37 बढ़ाने के क्रम में सूचीबद्ध किया गया है। यांत्रिक जानकारी से तात्पर्य है कि क्या डिवाइस प्रत्येक सेल के लोचदार और चिपचिपे यांत्रिक गुणों दोनों को माप सकता है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 2: विभिन्न सेल लाइनों के लिए आकार, संकुचन और वसूली खंड चौड़ाई का उदाहरण। एमईपी और एलईपी प्राथमिक मानव स्तन उपकला कोशिकाओं के दो वंशों को संदर्भित करते हैं, जहां एमईपी मायोएपिथेलियल कोशिकाओं को संदर्भित करता है और एलईपी ल्यूमिनल उपकला कोशिकाओं 2,8 को संदर्भित करता है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: AutoCAD डिजाइन उदाहरण। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: फोटोलिथोग्राफी प्रसंस्करण के लिए उदाहरण प्रोटोकॉल। फोटोरेसिस्ट या एसयू -8 एपॉक्सी को पैटर्न करने और संसाधित करने के लिए दो उदाहरण प्रोटोकॉल उल्लिखित हैं। पहला इलेक्ट्रोड निर्माण के लिए बलिदान परत के रूप में कार्य करने के लिए ग्लास स्लाइड पर सकारात्मक फोटोरेसिस्ट के आवेदन का वर्णन करता है। दूसरा पीडीएमएस माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों को ढालने के लिए राहत संरचनाओं को बनाने के लिए सिलिकॉन वेफर पर एसयू -8 एपॉक्सी के आवेदन का वर्णन करता है। इन प्रोटोकॉल को निर्माता से एमएफ -321 और एसयू 8 3000 डेटा शीट से अनुकूलित किया गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 3: इलेक्ट्रॉन बीम वाष्पीकरण का उपयोग करके 75 ए टी, 250 ए पीटी, और 250 ए एयू के पतले फिल्म जमाव के लिए उदाहरण प्रोटोकॉल। इलेक्ट्रॉन बीम बाष्पीकरणकर्ता का उपयोग करके 75 A Ti, 250 A PT, और 250 AU के पतले फिल्म जमाव प्रदर्शन के लिए एक उदाहरण प्रोटोकॉल को रेखांकित किया गया है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 4: GERBER फ़ाइलें कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 5: योजनाबद्ध, बोर्ड और PCB भागों की सूची फ़ाइलें कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 6: MATLAB कमांड-लाइन इंटरफ़ेस। इस फ़ाइल में MATLAB कमांड-लाइन इंटरफ़ेस26 का उपयोग करडेटा प्रोसेसिंग के लिए विस्तृत निर्देश शामिल हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस मेकेनोटाइपिंग तकनीक का उपयोग करके एकल कोशिकाओं के यांत्रिक गुणों को मापने में तीन चरण होते हैं: डिवाइस निर्माण, डेटा अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण। प्रत्येक चरण के भीतर, उल्लेखनीय पहलू हैं जो प्रयोगात्मक परिणामों को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित कर सकते हैं। डिवाइस निर्माण के दौरान, सटीक और दोहराने योग्य परिणामों के लिए लगातार चैनल ज्यामिति और डिवाइस-टू-डिवाइस एकरूपता आवश्यक है। विशेष रूप से, प्रत्येक डिवाइस की साइडवॉल अपेक्षाकृत चिकनी होनी चाहिए (चित्रा 4 एआई), और प्रतिकृति उपकरणों में चैनल की ऊंचाई तुलनीय होनी चाहिए। दोषों वाले किसी भी उपकरण जो आंशिक रूप से सेल प्रवाह को बाधित करते हैं, विशेष रूप से संकुचन चैनल (चित्रा 4एआई) में छोड़ दिया जाना चाहिए। चैनल ज्यामिति में समझदार दोषों वाले उपकरणों का उपयोग करने से गलत और अपरिवर्तनीय परिणाम होंगे। डेटा अधिग्रहण के दौरान, यह महत्वपूर्ण है कि उपयोगकर्ता डेटा संग्रह के दौरान चैनल में एक क्लॉग की उपस्थिति को पहचान सकता है। एक उदाहरण स्क्रिप्ट, "एनपीएस.एम" (https://github.com/sohnlab/node-pore-sensing-public पर उपलब्ध), वर्तमान माप प्रदर्शित करता है, जिससे उपयोगकर्ता वास्तविक समय में चैनल की स्थिति और सेल पारगमन घटनाओं की निगरानी कर सकता है। एक क्लॉग की दालों की विशेषता चित्र 4 बी में दिखाई गई है। संकुचन चैनल के भीतर एक क्लॉग जो अभी भी कुछ कोशिकाओं को प्रवाह करने की अनुमति देता है, विशेष रूप से संबोधित करने के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि कोशिकाओं को रुकावट के स्थान पर बढ़े हुए तनाव का अनुभव होगा, जिसके परिणामस्वरूप गलत डब्ल्यूसीडीआईएस होंगे। अंत में, डेटा विश्लेषण के दौरान, उपयोगकर्ताओं को विश्लेषण एल्गोरिथ्म के लिए इनपुट के रूप में सटीक थ्रेसहोल्ड चुनने में मेहनती होना चाहिए। यदि थ्रेसहोल्ड बहुत अधिक सेट किए गए हैं, तो कार्यक्रम छोटी कोशिकाओं द्वारा उत्पादित घटनाओं की पहचान नहीं करेगा, परिणामों को तिरछा करेगा और मापा सेल आबादी को गलत तरीके से प्रस्तुत करेगा।

इन महत्वपूर्ण चरणों से परे, प्रोटोकॉल के अतिरिक्त पहलू हैं जिन्हें विभिन्न सेल प्रकारों या स्थितियों का अध्ययन करते समय समायोजन की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, इस तकनीक को उन नमूनों पर लागू करना जो पहले अध्ययन किए गए लोगों की तुलना में काफी छोटे हैं, संकीर्ण संकुचन चैनलों की आवश्यकता होती है। संकरे चैनलों को बनाने के लिए अधिक महंगी निर्माण पद्धतियों की आवश्यकता हो सकती है, जैसे कि इलेक्ट्रॉन बीम लिथोग्राफी38। इसके अतिरिक्त, क्योंकि Δ I/I ~ YVसेल / YVसंकुचन (जहां Vसेल और Vसंकुचन क्रमशः विकृत सेल और चैनल की मात्रा हैं),संकरे चैनलों के परिणामस्वरूप अधिक आधारभूत प्रतिरोध होता है और SNR19 में कमी आती है। अंत में, संकीर्ण चैनल क्लॉगिंग के जोखिम को बढ़ा सकते हैं, जिससे प्रयोगात्मक निष्पादन अधिक चुनौतीपूर्ण हो जाता है। इस विशेष समस्या को संभावित रूप से अधिक इनलेट फ़िल्टर का उपयोग करके कम किया जा सकता है।

इस तकनीक की एक सीमा स्थैतिक संकुचन चैनल है, जो कोशिकाओं की आबादी पर केवल एक औसत तनाव लागू कर सकता है। अलग-अलग आकार वाली कोशिकाओं की विकृति की तुलना करने के लिए, या विभिन्न लागू उपभेदों पर एकल सेल आबादी की जांच करने के लिए, अलग-अलग संकुचन चैनल चौड़ाई वाले कई उपकरणों को नियोजित किया जाना चाहिए। मंच अपनी पीडीएमएस दीवारों द्वारा भी सीमित है, जो कठोरता की सीमा को प्रतिबंधित करता है जिसे यह माप सकता है। उदाहरण के लिए, कुछ बहुत कठोर पौधों की कोशिकाएं पीडीएमएस दीवारों की तुलना में कठोर होती हैं जो उन्हें39,40 विकृत करने की उम्मीद होगी। इसके अलावा, संकुचन चैनल के माध्यम से ऐसे कठोर कणों को धक्का देने के लिए आवश्यक दबाव पीडीएमएस और ग्लास स्लाइड के बीच बंधन की ताकत को दूर कर सकता है, जिससे डिलेमिनेशन हो सकता है। हालांकि, इन सीमाओं को दूर करने के लिए, कोई माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों को ग्लास या सिलिकॉन जैसी कठोर सामग्रियों में बना सकता है। इन मामूली बाधाओं के बावजूद, यह मंच कोशिकाओं के मध्यम-थ्रूपुट यांत्रिक माप के लिए आदर्श बना हुआ है। ऑप्टिकल स्ट्रेचर या एएफएम जैसे अन्य तरीकों की तुलना में, यह तकनीक उच्च थ्रूपुट को सक्षम करती है। आरटी-डीसी जैसे अन्य मध्यम से उच्च-थ्रूपुट माइक्रोफ्लुइडिक प्रौद्योगिकियों की तुलना में, यह तकनीक एकल कोशिकाओं के चिपचिपे और लोचदार दोनों गुणों को मापकर अधिक बायोफिज़िकल गुणों की जांच करने में सक्षम है। अंत में, सरल प्रयोगात्मक सेटअप, जटिल प्रकाशिकी के विपरीत सस्ती इलेक्ट्रॉनिक्स का उपयोग करके, इस तकनीक को एक अत्यधिक सुलभ तकनीक बनाता है।

कुल मिलाकर, यह मेकेनोटाइपिंग तकनीक कई संभावित अध्ययनों और अनुप्रयोगों के लिए एक उपकरण के रूप में बहुत वादा करती है। यह पहले प्राथमिक नमूनों सहित सेल प्रकारों के एक विविध सेट पर लागू किया गया है, और सेलुलर विस्कोस्टिक गुणों 2,8 पर साइटोस्केलेटल और परमाणु घटकों के प्रभाव को मापने में इसकी प्रभावशीलता दिखाई है। इसके अलावा, क्योंकि इस प्लेटफ़ॉर्म2 के साथ स्क्रीनिंग के बाद कोशिकाएं व्यवहार्य रहती हैं, शोधकर्ताओं के पास डाउनस्ट्रीम विश्लेषण करने का अवसर होता है। यह प्लेटफ़ॉर्म अपस्ट्रीम माइक्रोफ्लुइडिक सेल सॉर्टिंग के साथ युग्मन के लिए भी आदर्श है, जो खुद को परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं को मापने जैसे अनुप्रयोगों के लिए उधार देता है। आगे देखते हुए, यह मंच एकल-कोशिकाओं के मल्टीवेरिएबल यांत्रिक माप के लिए एक प्रतिस्पर्धी और बहुमुखी उपकरण बना हुआ है, जिसमें सेल व्यवहार41 को समझने, रोग की प्रगति42 का निर्धारण करने और दवा प्रतिक्रिया43 की निगरानी में अनुप्रयोग हैं। मौलिक वैज्ञानिक अनुसंधान से परे, यह तकनीक एक नैदानिक उपकरण के रूप में भी बहुत वादा करती है, विशेष रूप से तेजी से नैदानिक स्क्रीनिंग के लिए एक कम लागत वाला, बेंचटॉप मंच। इसके अलावा, कम बिजली की आवश्यकताओं और माप से पहले नमूना तैयार करने की न्यूनतम आवश्यकता को देखते हुए, यह तकनीक विशेष रूप से कम संसाधन वातावरण के लिए उपयुक्त है, जहां सुलभ नैदानिक उपकरणों की बहुत आवश्यकता होतीहै।

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Disclosures

एल.एल.एस. के पास अमेरिकी पेटेंट संख्या 11,383,241 है: "मेकानो-नोड-पोर सेंसिंग", जे किम, एस हान और एल एल सोहन, 12 जुलाई, 2022 को जारी किए गए।

Acknowledgments

इस शोध को एनआईबीआईबी 1 आर 01ईबी 024989-01 और एनसीआई 1 आर 01 सीए 190843-01 से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। ए एल और आर आर को एच 2 एच 8 एसोसिएशन ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था। केएलसी को नेशनल साइंस फाउंडेशन ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप और सिबेल स्कॉलर फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone J.T. Baker 5356-05 Purity (GC)  ≥ 99.5% (https://us.vwr.com/store/product/6057739/acetone-99-5-vlsi-j-t-baker)
Aluminum Foil n/a n/a
Analog Low-Pass Filter ThorLabs EF504 ≤240 kHz Passband, Coaxial BNC Feedthrough (https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=EF504#ad-image-0)
Biopsy Punch Integra Miltex 33-31AA-P/25 1mm, Disposable, with Plunger (https://mms.mckesson.com/product/573313/Miltex-33-31AA-P25)
Blade n/a n/a
BNC Cable Pomona Electronics 2249-C-12 https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/2249-C-12/603323?utm_adgroup=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&utm_source=google&utm_
medium=cpc&utm_campaign=
Shopping_Product_Cable%20Assemblies_NEW&utm_term=
&utm_content=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&gclid=Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO2sErQqnVJ
pj5OXVObuTI8ZUf1ZeIn7zvzGnx
mCWdePrG6SdEJMF3X6ubUaAs
w-EALw_wcB
Cleanroom Polyester Swab Thermo Fisher Scientific 18383 https://www.fishersci.com/shop/products/texwipe-cleantip-alpha-polyester-series-swabs-6/18383
Current Preamplifier DL Instruments 1211 https://www.brltest.com/index.php?main_page=product_info&products_
id=1419
Custom PCB (w/ components) n/a n/a see Supplemental files 4 and 5
DAQ Terminal Block National Instruments BNC-2120 https://www.ni.com/en-in/support/model.bnc-2120.html
DAQ to BNC-2110 cable  National Instruments SHC68-68-EPM https://www.ni.com/en-in/support/model.shc68-68-epm.html
Data Acquisition Board (DAQ) National Instruments PCI-6251 https://www.ni.com/docs/en-US/bundle/pci-6251-feature/page/overview.html
Dessicator Thermo Fisher Scientific 5311-0250 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/5311-0250
Female BNC To Banana Plug Adapter Pomona Electronics 72909 https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/72909/1196318
Fetal Bovine Serum (FBS) VWR 89510-186 https://us.vwr.com/store/product/18706419/avantor-seradigm-select-grade-usda-approved-origin-fetal-bovine-serum-fbs
Glass Cutter Chemglass CG-1179-21 https://chemglass.com/plate-glass-cutters-diamond-tips
Gold Etchant TFA Transene NC0977944 https://www.fishersci.com/shop/products/NC0977944/NC0977944
Hot Plate Thermo Fisher Scientific SP131825 
Isopropyl Alcohol Spectrum Chemical I1056-4LTPL Purity (GC)  ≥99.5% (https://www.spectrumchemical.com/isopropyl-alcohol-99-percent-fcc-i1056)
Metal Hardware Enclosure Hammond Manufacturing EJ12126 https://www.digikey.com/en/products/detail/hammond-manufacturing/EJ12126/2423415
Methanol Sigma-Aldrich 34860 Purity (GC)  ≥99.8% (https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/substance/methanol320467561)
MF-321 Developer Kayaku Advanced Materials n/a https://kayakuam.com/products/mf-321/
MICROPOSIT S1813 Positive Photoresist DuPont n/a https://kayakuam.com/products/microposit-s1800-g2-series-photoresists/
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010049 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010049?SID=srch-hj-10010049
Photomask Fineline Imaging n/a Photomask are custom ordered from our CAD designs (https://www.fineline-imaging.com/)
Plain Glass Microscope Slide Fisher Scientific 12-553-5B Material: Soda Lime, L75 x W50 mm, Thickness: 0.90–1.10 mm 
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-001 https://harrickplasma.com/plasma-cleaners/expanded-plasma-cleaner/
Plastic Petri Dish Thermo Fisher Scientific FB0875712 100 mm (https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-raised-ridge-100-x-15mm/FB0875712)
Pressure Controller Fluigent MFCS-EZ https://www.fluigent.com/research/instruments/pressure-flow-controllers/mfcs-series/
Pressure Controller Software Fluigent MAESFLO
Programming & Computation Software MATLAB R2021b for data acquisition and analysis (https://www.mathworks.com/products/matlab.html)
PTFE Tubing Cole Parmer 06417-31 0.032" ID x 0.056" (https://www.coleparmer.com/i/masterflex-transfer-tubing-microbore-ptfe-0-032-id-x-0-056-od-100-ft-roll/0641731)
Scepter 2.0 Handheld Automatic Cell Counter Millapore Sigma PHCC20060 https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/mm/phcc20060
Silicon Wafer Wafer World 2885 76.2 mm, Single Side Polished (https://www.waferworld.com/product/2885)
Spin Coater n/a n/a
SU-8 3025 Negative Photoresist Kayaku Advanced Materials n/a https://kayakuam.com/products/su-8-2000/
SU8 Developer Kayaku Advanced Materials n/a https://kayakuam.com/products/su-8-developer/
Sygard 184 Polydimethlysiloxane Dow Chemical 4019862 https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/
Tape Scotch 810-341296 https://www.staples.com/Scotch-Magic-Tape-810-3-4-x-36-yds-1-Core/product_130567?cid=PS:GS:SBD:PLA:OS&gclid=
Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO
2sErRwzrrgjU0NjFkDkne1xm
vT7ekS3tdzvAgiMDwPoxocgH
VTQZi7vJgaAvQZEALw_wcB
Titanium, Platinum, Gold n/a n/a
Triple Output Power Supply Keysight E36311A https://www.newark.com/keysight-technologies/e36311a/dc-power-supply-3o-p-6v-5a-prog/dp/15AC9653
UV Mask Aligner Karl Suss America MJB3 Mask Aligner 

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 190
मेकानो-नोड-पोर सेंसिंग: मल्टी-पैरामीटर सिंगल-सेल विस्कोस्टिक माप के लिए एक रैपिड, लेबल-फ्री प्लेटफॉर्म
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