Här presenteras en metod för att mekaniskt fenotypa enstaka celler med hjälp av en elektronikbaserad mikrofluidisk plattform som kallas mechano-node-pore sensing (mechano-NPS). Denna plattform upprätthåller måttlig genomströmning av 1-10 celler / s samtidigt som man mäter både de elastiska och viskösa biofysiska egenskaperna hos celler.
Cellulära mekaniska egenskaper är involverade i en mängd olika biologiska processer och sjukdomar, allt från stamcellsdifferentiering till cancermetastaser. Konventionella metoder för att mäta dessa egenskaper, såsom atomkraftsmikroskopi (AFM) och mikropipettaspiration (MA), fångar rik information, vilket återspeglar en cells fullständiga viskoelastiska svar; Dessa metoder begränsas dock av mycket låg genomströmning. Metoder med hög genomströmning, till exempel RT-DC (Deformerability Cytometry i realtid), kan bara mäta begränsad mekanisk information, eftersom de ofta är begränsade till avläsningar med en parameter som bara återspeglar en cells elastiska egenskaper. I motsats till dessa metoder är mekano-nod-poravkänning (mekano-NPS) en flexibel, etikettfri mikrofluidisk plattform som överbryggar klyftan för att uppnå viskoelastiska mätningar med flera parametrar av en cell med måttlig genomströmning. En likströmsmätning (DC) används för att övervaka celler när de passerar en mikrofluidisk kanal och spårar deras storlek och hastighet före, under och efter att de tvingas genom en smal förträngning. Denna information (dvs. storlek och hastighet) används för att kvantifiera varje cells tvärgående deformation, motståndskraft mot deformation och återhämtning från deformation. I allmänhet ger denna elektronikbaserade mikrofluidiska plattform flera viskoelastiska cellegenskaper och därmed en mer komplett bild av en cells mekaniska tillstånd. Eftersom det kräver minimal provberedning, använder en enkel elektronisk mätning (i motsats till en höghastighetskamera) och utnyttjar standard mjuklitografitillverkning, är implementeringen av denna plattform enkel, tillgänglig och anpassningsbar till nedströmsanalys. Denna plattforms flexibilitet, användbarhet och känslighet har gett unik mekanisk information om ett brett spektrum av celler, med potential för många fler applikationer inom grundvetenskap och klinisk diagnostik.
Enstaka celler är dynamiska, viskoelastiska material1. En mängd interna och externa processer (t.ex. mitos eller ombyggnad av den extracellulära matrisen [ECM]), påverkar deras struktur och sammansättning 2,3,4, vilket ofta resulterar i distinkta biofysiska egenskaper som kompletterar deras nuvarande tillstånd. I synnerhet har mekaniska egenskaper visat sig vara viktiga biomarkörer för cellulär utveckling, fysiologi och patologi, vilket ger värdefull kvantitativ information som kan komplettera kanoniska molekylära och genetiska tillvägagångssätt 5,6,7. beskrev till exempel nyligen de mekaniska skillnaderna mellan läkemedelsresistenta och läkemedelsresponsiva akuta promyelocytiska leukemiceller, samtidigt som de använde RNA-seq för att avslöja differentiellt uttryckta cytoskelettassocierade gener8. Genom att förstå det komplexa samspelet mellan encellsmekanik och cellulär funktion har mekanofenotypning bredare tillämpningar för att omvandla grundvetenskap och klinisk diagnostik9.
Det mest använda verktyget för att mäta encellsmekanik är atomkraftmikroskopi (AFM). Medan AFM möjliggör en högupplöst, lokaliserad mätning av cellulära mekaniska egenskaper, förblir den begränsad till en genomströmning på <0,01 celler / s10. Alternativt är optiska bårar, som använder två divergerande laserstrålar för att fånga och deformera suspenderade enstaka celler11, begränsade till marginellt högre genomströmningar av <1 cell / s12. De senaste framstegen inom mikrofluidisk teknik har möjliggjort en ny generation enheter för snabb, encellig, mekanisk bedömning12,13. Dessa tekniker använder smala förträngningskanaler 14,15, skjuvflöde16 eller hydrodynamisk sträckning17 för att deformera celler snabbt vid genomströmningar av 10-1 000 celler / s18. Även om mäthastigheten för dessa metoder är betydligt snabbare än konventionella tekniker, handlar de ofta med hög genomströmningskapacitet för begränsade mekaniska avläsningar (tilläggstabell 1). Alla ovannämnda snabba mikrofluidiska metoder fokuserar på grundläggande mätvärden med en parameter, såsom transittid eller deformerbarhetsförhållanden, som endast återspeglar en cells elastiska egenskaper. Med tanke på den inneboende viskoelastiska naturen hos enskilda celler kräver emellertid en robust och grundlig mekanisk karakterisering av celler att man inte bara överväger elastiska komponenter utan också viskösa svar.
Mechano-node-pore sensing (mechano-NPS)2,8 (figur 1A) är en mikrofluidisk plattform som hanterar befintliga begränsningar med encells mekanofenotypning. Denna metod möjliggör mätning av flera biofysiska parametrar samtidigt, inklusive celldiameter, relativ deformerbarhet och återhämtningstid från deformation, med en måttlig genomströmning på 1-10 celler / s. Denna teknik är baserad på nod-poravkänning (NPS)19,20,21,22,23,24, vilket innebär att man använder en fyrpunktssondmätning för att mäta den modulerade strömpulsen som produceras av en cell som passerar en mikrofluidisk kanal som har segmenterats av bredare regioner, kallade “noder”. Den modulerade strömpulsen är ett resultat av att cellen delvis blockerar strömflödet i segmenten (dvs “porer”) och noder, med mer ström blockerad i den förra än i den senare. I mekano-NPS är ett segment, “sammandragningskanalen”, smalare än en celldiameter; Följaktligen måste en cell deformeras för att passera hela kanalen (figur 1B). Celldiametern kan bestämmas av storleken på den subpuls som produceras när cellen passerar nodporerna före sammandragningskanalen (figur 1B,C). Här, |ΔInp|, det aktuella fallet när cellen är i poren, är proportionellt mot cellens volymförhållande till poren, V-cellen / V-poren 2,8,19. Cellstyvhet kan bestämmas av ΔTc, varaktigheten av den dramatiskt större subpuls som produceras när cellen passerar sammandragningskanalen (figur 1B,C). En styvare cell tar längre tid att passera kanalen än en mjukare 2,8. Slutligen kan cellens “återhämtning”, cellens förmåga att återgå till sin ursprungliga storlek och form efter deformation, bestämmas av serien av subpulser som produceras när cellen passerar nodporerna efter sammandragningskanalen (figur 1B, C). Återhämtningstiden, ΔTr, är den tid det tar för de aktuella subpulserna att återgå till storleken på de tidigare subpulserna, innan cellen pressas. Sammantaget registreras och analyseras de modulerade strömpulser som produceras som en cell som passerar den mikrofluidiska kanalen för att extrahera de relevanta encelliga mekaniska parametrarna (figur 1D)2,8.
Reproducerbarheten och användarvänligheten av denna elektronikbaserade mikrofluidiska plattform har tidigare visats25. Dessutom presenterar plattformen en låg barriär för inträde för encells mekanofenotypning. Standard mjuk litografi används för att tillverka mikrofluidiska enheter. Mäthårdvaran består av billiga komponenter, inklusive ett enkelt kretskort (PCB), strömförsörjning, förförstärkare, datainsamlingskort (DAQ) och dator. Slutligen finns användarvänlig kod tillgänglig för datainsamling och analys, vilket möjliggör enkel implementering. Denna mekanofenotypningsteknik kan skilja populationer av icke-maligna och maligna bröst- och lungepitelcellinjer, skilja mellan underlinjer i primära humana bröstepitelceller och karakterisera effekterna av cytoskeletala störningar och andra farmakologiska medel 2,8. Sammantaget är denna plattform ett effektivt tillvägagångssätt för mekanofenotypning av enskilda celler.
Mätning av de mekaniska egenskaperna hos enskilda celler med hjälp av denna mekanofenotypningsteknik består av tre steg: tillverkning av enheter, datainsamling och dataanalys. Inom varje steg finns det anmärkningsvärda aspekter som kan påverka de experimentella resultaten avsevärt. Under enhetstillverkningen är konsekventa kanalgeometrier och enhetlighet mellan enheter avgörande för exakta och repeterbara resultat. Mer specifikt bör sidoväggarna på varje enhet vara relativt släta (bild …
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av anslag från NIBIB 1R01EB024989-01 och NCI 1R01CA190843-01. A. L. och R. R. stöddes av ett H2H8 Association Graduate Research Fellowship. K. L. C. stöddes av ett National Science Foundation Graduate Research Fellowship och ett Siebel Scholar Fellowship.
Acetone | J.T. Baker | 5356-05 | Purity (GC) ≥ 99.5% (https://us.vwr.com/store/product/6057739/acetone-99-5-vlsi-j-t-baker) |
Aluminum Foil | n/a | n/a | |
Analog Low-Pass Filter | ThorLabs | EF504 | ≤240 kHz Passband, Coaxial BNC Feedthrough (https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=EF504#ad-image-0) |
Biopsy Punch | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | 1mm, Disposable, with Plunger (https://mms.mckesson.com/product/573313/Miltex-33-31AA-P25) |
Blade | n/a | n/a | |
BNC Cable | Pomona Electronics | 2249-C-12 | https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/2249-C-12/603323?utm_adgroup=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&utm_source=google&utm_ medium=cpc&utm_campaign= Shopping_Product_Cable%20Assemblies_NEW&utm_term= &utm_content=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&gclid=Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO2sErQqnVJ pj5OXVObuTI8ZUf1ZeIn7zvzGnx mCWdePrG6SdEJMF3X6ubUaAs w-EALw_wcB |
Cleanroom Polyester Swab | Thermo Fisher Scientific | 18383 | https://www.fishersci.com/shop/products/texwipe-cleantip-alpha-polyester-series-swabs-6/18383 |
Current Preamplifier | DL Instruments | 1211 | https://www.brltest.com/index.php?main_page=product_info&products_ id=1419 |
Custom PCB (w/ components) | n/a | n/a | see Supplemental files 4 and 5 |
DAQ Terminal Block | National Instruments | BNC-2120 | https://www.ni.com/en-in/support/model.bnc-2120.html |
DAQ to BNC-2110 cable | National Instruments | SHC68-68-EPM | https://www.ni.com/en-in/support/model.shc68-68-epm.html |
Data Acquisition Board (DAQ) | National Instruments | PCI-6251 | https://www.ni.com/docs/en-US/bundle/pci-6251-feature/page/overview.html |
Dessicator | Thermo Fisher Scientific | 5311-0250 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/5311-0250 |
Female BNC To Banana Plug Adapter | Pomona Electronics | 72909 | https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/72909/1196318 |
Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-186 | https://us.vwr.com/store/product/18706419/avantor-seradigm-select-grade-usda-approved-origin-fetal-bovine-serum-fbs |
Glass Cutter | Chemglass | CG-1179-21 | https://chemglass.com/plate-glass-cutters-diamond-tips |
Gold Etchant TFA | Transene | NC0977944 | https://www.fishersci.com/shop/products/NC0977944/NC0977944 |
Hot Plate | Thermo Fisher Scientific | SP131825 | |
Isopropyl Alcohol | Spectrum Chemical | I1056-4LTPL | Purity (GC) ≥99.5% (https://www.spectrumchemical.com/isopropyl-alcohol-99-percent-fcc-i1056) |
Metal Hardware Enclosure | Hammond Manufacturing | EJ12126 | https://www.digikey.com/en/products/detail/hammond-manufacturing/EJ12126/2423415 |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Purity (GC) ≥99.8% (https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/substance/methanol320467561) |
MF-321 Developer | Kayaku Advanced Materials | n/a | https://kayakuam.com/products/mf-321/ |
MICROPOSIT S1813 Positive Photoresist | DuPont | n/a | https://kayakuam.com/products/microposit-s1800-g2-series-photoresists/ |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010049?SID=srch-hj-10010049 |
Photomask | Fineline Imaging | n/a | Photomask are custom ordered from our CAD designs (https://www.fineline-imaging.com/) |
Plain Glass Microscope Slide | Fisher Scientific | 12-553-5B | Material: Soda Lime, L75 x W50 mm, Thickness: 0.90–1.10 mm |
Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | https://harrickplasma.com/plasma-cleaners/expanded-plasma-cleaner/ |
Plastic Petri Dish | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | 100 mm (https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-raised-ridge-100-x-15mm/FB0875712) |
Pressure Controller | Fluigent | MFCS-EZ | https://www.fluigent.com/research/instruments/pressure-flow-controllers/mfcs-series/ |
Pressure Controller Software | Fluigent | MAESFLO | |
Programming & Computation Software | MATLAB | R2021b | for data acquisition and analysis (https://www.mathworks.com/products/matlab.html) |
PTFE Tubing | Cole Parmer | 06417-31 | 0.032" ID x 0.056" (https://www.coleparmer.com/i/masterflex-transfer-tubing-microbore-ptfe-0-032-id-x-0-056-od-100-ft-roll/0641731) |
Scepter 2.0 Handheld Automatic Cell Counter | Millapore Sigma | PHCC20060 | https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/mm/phcc20060 |
Silicon Wafer | Wafer World | 2885 | 76.2 mm, Single Side Polished (https://www.waferworld.com/product/2885) |
Spin Coater | n/a | n/a | |
SU-8 3025 Negative Photoresist | Kayaku Advanced Materials | n/a | https://kayakuam.com/products/su-8-2000/ |
SU8 Developer | Kayaku Advanced Materials | n/a | https://kayakuam.com/products/su-8-developer/ |
Sygard 184 Polydimethlysiloxane | Dow Chemical | 4019862 | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
Tape | Scotch | 810-341296 | https://www.staples.com/Scotch-Magic-Tape-810-3-4-x-36-yds-1-Core/product_130567?cid=PS:GS:SBD:PLA:OS&gclid= Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO 2sErRwzrrgjU0NjFkDkne1xm vT7ekS3tdzvAgiMDwPoxocgH VTQZi7vJgaAvQZEALw_wcB |
Titanium, Platinum, Gold | n/a | n/a | |
Triple Output Power Supply | Keysight | E36311A | https://www.newark.com/keysight-technologies/e36311a/dc-power-supply-3o-p-6v-5a-prog/dp/15AC9653 |
UV Mask Aligner | Karl Suss America | MJB3 Mask Aligner |